II. COMPETENCIAS:
Reconoce bacilos ácido alcohol resistente en montajes permanentes.
Aplica la colocación de Ziehl neelsen en preparados no patogénicos y fundamenta dicha coloración.
III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. Materiales:
a. De Laboratorio:
Láminas con montajes semipermanentes de BAAR.
06 Beaker de 250 mL limpios.
01 Asa bacteriológica en anillo.
Set de Tinción de Ziehl Neelsen (Fucsina fenicada de Ziehl, Alcohol ácido y Azul de metileno).
Aceite de inmersión.
100 mL de Lejía.
06 Microscopios ópticos.
Mecheros de alcohol o bunsen.
b. Del alumno (Individual):
Barreras de bioseguridad personal: Guantes descartables, mascarilla descartable y toca o gorro.
01 Marcador indeleble.
01 fosforo o encendedor.
c. Del Alumno (grupal):
10 baja lengua.
Muestra de esputo negativa.
Caja de láminas portaobjeto.
3.2. Procedimiento: 3.2.1. Toma de Muestra:
1. Dar al paciente el recipiente rotulado o etiquetado con sus datos. 2. Indicar al paciente que se enjuague la boca antes de emitir la muestra.
3. Explicar al paciente que es necesario obtener una muestra del tracto respiratorio inferior y que no es válida la saliva. Para ello habrá que indicar al paciente que inspire profundamente, retenga el aire por un instante breve y posteriormente elimine las secreciones con un golpe intenso de tos.
4. Una vez obtenida la primera muestra, lo ideal es que se procesen de forma inmediata y que no pasen más de dos horas desde su obtención hasta la llegada al laboratorio.
5. Si las muestras de esputo llegasen al laboratorio a una hora que no permita procesarlas en el día, se debe introducir cada uno de los envases en una bolsa de polietileno que se anudará fuertemente sobre la tapa del mismo. Posteriormente las muestras se introducirán en una caja de plástico que se colocará en un lugar fresco, seco y protegido de la luz.
Registro de la muestra: Una vez que la muestra de esputo está en el laboratorio, es importante
anotar en una libreta los datos del paciente, la fecha de recepción y características de la muestra, así como el resultado del examen. De esta manera se puede obtener un registro y control del número de casos de tuberculosis en la zona.
3.2.2. Preparación de la muestra para ser teñida
1. Rotular el portaobjetos con el nombre del paciente o sus iniciales y el nº de identificación de la muestra. No utilizar bolígrafo o rotulador, dado que se decoloran durante el proceso. Recuerde que los portaobjetos deben ser siempre nuevos, nunca reutilizados.
2. Colocarse guantes desechables (o domésticos en caso de no tener desechables) y mascarilla antes de comenzar a manipular la muestra.
3. En caso de disponer de mecheros de gas o de alcohol, abrir el envase que contiene la muestra por detrás de la llama del mechero, para protegerse de posibles aerosoles (la llama debe quedar entre el envase y la persona que está manipulando la muestra).
4. Con la ayuda de una varilla o palillo de madera, tomar la muestra desde el envase. Las partes más purulentas y densas del esputo son las que deben utilizarse, ya que son las que con mayor probabilidad contendrán bacterias.
5. Para tomar la muestra con mayor facilidad se puede partir uno de los extremos de la varilla y tomar el esputo con esta parte astillada o quebrada. Para cada muestra se empleará siempre una varilla o palillo diferente, para no producir contaminaciones cruzadas entre las muestras. 6. Extender la muestra sobre la parte central del portaobjetos, teniendo cuidado de que no resulte
una extensión demasiado densa o demasiado fina, lo que dificultaría la visualización y, por tanto, el diagnóstico. Repetir el proceso para cada una de las muestras a estudiar.
7. Dejar secar las preparaciones a temperatura ambiente (hasta que no se encuentren completamente secas no se podrán teñir). Una vez que estén complemente secas podrán ser teñidas para su análisis en el microscopio como se explica en el siguiente punto.
8. Las varillas y resto del material desechable que se haya empleado durante el proceso, se debe tirar en un contenedor o frasco que contenga fenol al 5% o hipoclorito de sodio al 1%. Si se han utilizado guantes domésticos, una vez terminada la preparación de todas las muestras sumergir las manos enguantadas en una solución de hipoclorito de sodio al 1% para desinfectarlos antes de quitárselos.
9. Limpiar (desinfectar) la superficie de trabajo con papel empapado en hipoclorito de sodio al 1% o fenol al 5%. En caso de haber cubierto la superficie, desechar el material.
3.2.3. Tinción de Ziehl-Neelsen
Los bacilos tuberculosos resisten la decoloración con alcohol–ácido (bacilos ácido-alcohol resistentes o BAAR), por lo que las tinciones ácido-alcohol resistentes (tinción de Ziehl-Neelsen) son adecuadas para su visualización microscópica. Los pasos para realizarla son los siguientes: 1. Una vez que las muestras de esputo están secas, deben fijarse pasándolas 2 o 3 veces por
encima de la llama de un mechero, con cuidado de no calentarlas demasiado.
2. Colocar las preparaciones en las varillas de metal sobre las que se vayan a realizar la tinción. 3. Cubrir la preparación con el reactivo FUCSINA FENICADA y calentar hasta que emita vapores
pero sin dejar que el colorante hierva (evitar que haga burbujas).
4. Dejar enfriar unos segundos y repetir otras 2 veces el calentamiento y luego Lavar con agua. 5. Decolorar con alcohol-ácido (alcohol-clorhídrico al 3%) hasta decolorar completamente la
lámina (los microorganismos AAR, no se decoloran, permaneciendo de color rojo-fucsia). 6. Lavar con agua y luego cubrir la preparación con el reactivo AZUL DE METILENO durante 30
segundos (tanto el fondo de la preparación como los microorganismos no AAR quedan teñidos de azul). Lavar con agua y dejar secar la preparación en posición vertical y visualizar en el microscopio con el objetivo 100X (aceite de inmersión).
IV. RESULTADOS:
V. FUNDAMENTACIÓN:
Los bacilos tuberculosos se observan como filamentos o bastones finos, ligeramente curvados de color
fucsia sobre fondo azul. Para no repetir campos microscópicos, se deben recorrer las preparaciones en líneas rectas (de izquierda a derecha o de arriba abajo, por ejemplo).
Para saber si la muestra de esputo es válida (del tracto
respiratorio inferior) se deben observar leucocitos polimorfonucleares (PMN) y células epiteliales. La muestra es adecuada para el diagnóstico si presenta más de 25 PMN y menos de 10 células epiteliales por campo a 100 aumentos.
Se deben examinar sistemáticamente 100 campos
microscópicos y contar el nº de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) identificados en cada uno.
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
1. Organización Mundial de la Salud. Manual de bioseguridad en laboratorios. 3ª edición. Ginebra.2005. 2. Suárez A. Actualización de la Doctrina, Normas y procedimientos para el Control de la Tuberculosis en
Perú. Lima; 2000.
3. Pío A., Chaulet P., Tuberculosis Handbook. WHO/TB/98253. Geneve; 1998. Observación:
Aumento: Coloración: Disposición:
I. INTRODUCCIÓN:
Los bacteriófagos son virus que fueron descubiertos de forma independiente por los microbiólogos Frederick W. Twort en 1915 y Félix d’Hérelle en 1917. Siendo esta la última clase principal de virus en ser descubierta; este tipo de virus constituye un sistema simple y de gran abundancia en la naturaleza. En esencia, los bacteriófagos se encuentran de manera ubicua en el ambiente y en el lugar en que se encuentre su célula huésped. Un bacteriófago es un virus que se multiplica en bacterias y probablemente cada tipo de bacteria es portadora de un fago. Los bacteriófagos se encuentran dónde están sus hospedadores, para muchas bacterias del grupo entérico, las aguas residuales son una fuente de fagos, así como la leche es la fuente de fagos para Streptococcus lactis.
Los índices de crecimiento son muy rápidos una vez que se añade el virus sobre la bacteria huésped, ya que la partícula vírica ingresa a la célula y se multiplica hasta que la bacteria estalla y libera nuevas partículas formadas. El tiempo que tardan los virus en lisar a una bacteria varía entre 13 y 40 minutos y el número de partículas virales producidas en cada microorganismo varía entre 120 y 400. La acción de los fagos sobre las bacterias sensibles es la lisis bacteriana, la cual puede evidenciarse en medio líquido (los cultivos en caldo turbios pueden aclararse en cuestión de horas, como resultado de la acción lítica) o en medio sólido, generalmente en medio sólido se evidencia por la aparición de calvas o placas líticas.
El tamaño de la placa lítica depende de: La concentración de nutrientes (metabolismo bacteriano), la acumulación de inhibidores, la concentración de agar (a mayor concentración, la difusión es más lenta y el tamaño de la placa lítica es menor). Las dimensiones de las partículas fágicas (las pequeñas difunden más rápidamente) y la velocidad de replicación fágica. Una placa lítica contiene entre 106 a 109 partículas
fágicas, a veces más. De una placa lítica aislada se puede obtener una línea pura de fago.
La fagoterapia es un tratamiento basado en la actividad bactericida de los bacteriófagos (fagos), virus específicos de las bacterias. Los fagos reconocen la superficie de la célula bacteriana con alta especificidad, inyectan su ADN o ARN, y se multiplican y ensamblan dentro de la bacteria, para finalmente romper la célula y liberar su progenie, que infectará nuevas células bacterianas. El número de fagos crece de forma exponencial, por lo cual su mayor efecto es en el sitio de infección. Además, la selección de nuevos fagos es un proceso relativamente rápido.
La terapia con fagos se propuso desde el descubrimiento de los mismos y se ha desarrollado en países como República de Georgia, Polonia, Rusia, y la antigua Alemania del este; sin embargo, después del boom del descubrimiento de la penicilina y otros antibióticos, la investigación en fagoterapia en Europa occidental y América fue abandonada. En los últimos años, con el incremento en la frecuencia de aparición de cepas multirresistentes y panresistentes a antibióticos, los investigadores han retomado el interés en el desarrollo de fagoterapia y su implementación para el control de la contaminación e infecciones bacterianas en diversos campos.