PAPEL DE LA PALIPERIDONA EN LOS MECANISMOS COMPENSATORIOS ANTIINFLAMATORIOS/ANTIOXIDANTES.

Gran cantidad de evidencia sugiere que el estrés oxidativo juega un papel fundamental en la fisiopatología de la esquizofrenia. Tanto los altos niveles de radicales libres como el déficit en los sistemas antioxidantes aportan al desarrollo del estrés oxidativo contribuyendo a la enfermedad (Kulak et al., 2013). Se ha observado que compuestos con actividad antioxidante son capaces de atenuar la hiperlocomoción en ratones tratados con PCP, e incluso atenuar los déficits de inhibición prepulso a altas dosis (Shirai et al., 2012), lo cual los convierte en potenciales blancos terapéuticos como adyuvantes en el tratamiento de la enfermedad.

El factor de transcripción nuclear NRF2 regula una de las principales vías antioxidantes. Bajo condiciones normales, la vía antioxidante puede ser activada por múltiples elementos, uno de ellos son las quinasas, en este caso la activación de

PI3K/AKT, la cual induciría un cambio conformacional en KEAP1, la proteína inhibidora de NRF2, y este último quedaría libre y traslocaría al núcleo para inducir la transcripción de genes de enzimas antioxidantes. Bajo condiciones de estrés agudo, AKT presenta un aumento en sus niveles de fosforilación, pero curiosamente no se alteraron los niveles de NRF2 en el núcleo, e incluso los niveles citoplasmáticos de KEAP1 se encuentran elevados. Además no se observaron alteraciones en los niveles de mRNA de las enzimas antioxidantes reguladas por NRF2. Sin embargo, el tratamiento con PALI restableció los niveles proteicos de KEAP1 en el citoplasma, lo que produjo un aumento en los niveles nucleares de NRF2. Por otro lado, una vez en el núcleo NRF2 indujo la transcripción de genes de enzimas antioxidantes, entre ellos, NQO1, SOD, GPx y Catalasa. Además, indujo un aumento en los niveles de mRNA de KEAP1, lo cual podría deberse al mecanismo regulatorio de la vía, en donde KEAP1 ingresa al núcleo para desplazar NRF2 nuevamente hacia el citoplasma. Recientemente, se ha descrito que bajo condiciones de estrés agudo KEAP1 aumenta en citoplasma (Djordjevic et al., 2015), por lo que gran parte de NRF2 secuestrado por KEAP1 podría estar sometido a ubiquitinización para su posterior degradación (Kobayashi et al., 2004).

Cuando los animales se expusieron a estrés crónico, se observó que la vía de activación PI3K/AKT estaba parcialmente bloqueada, a pesar de que los niveles de PI3K estaban significativamente disminuidos, y los niveles de fosforilación de AKT estaban aumentados, lo que puede deberse a que múltiples señales pueden activar AKT (Mahajan et al., 2012). En este caso no se observaron alteraciones ni en los niveles de mRNA ni proteicos de KEAP1, pero sí una disminución en los niveles de mRNA y proteicos de NRF2 en el núcleo; asociado a estas alteraciones se observó una disminución en los niveles de mRNA de las enzimas HO1, SOD y Catalasa. Por su parte, el tratamiento con PALI reestablece los niveles de PI3K y de NRF2 en el núcleo, al igual que los niveles de mRNA de las enzimas alteradas.

La vía del NRF2 también se estudió en el modelo animal de esquizofrenia. La mayoría de los cambios observados en los modelos de estrés no se aprecian en este modelo, pero la administración crónica de PALI indujo un aumento en los niveles y la actividad nuclear del factor NRF2, lo cual conllevó principalmente un aumento de los niveles de mRNA de hemo oxigenasa 1 (HO1) y el restablecimiento de los niveles de

SOD. HO1 es una enzima con propiedades tanto antioxidantes como antiinflamatorias, ya que puede regular el efecto antiinflamatorio de IL10 y viceversa (Lee y Chau, 2002;

Naito et al., 2014).

Estos resultados nos sugieren que PALI estimula la activación de la vía del NRF2. En este sentido, tienen importancia otros elementos de la respuesta inflamatoria que son capaces de regular NRF2. NFκB regula negativamente la vía: se ha observado que NFκB tiene sitios de unión en la región promotora del gen de NRF2 (Nair et al., 2008), e incluso la subunidad p65 puede inhibir la vía mediante la privación de la proteína de unión CREB o reclutando la histona deacetilasa 3 (HDAC3), un co-represor de los elementos de respuesta antioxidante (Liu et al., 2008). Por otro lado, 15d-PGJ2 regula positivamente la vía del NRF2 al poder inducir directamente el cambio conformacional en KEAP1 para dejar libre a NRF2 (Oh et al., 2008). Otra molécula capaz de modular positivamente esta vía es la quimioquina fractalquina (CX3Cl1) (Lastres-Becker et al.,

2014). Dichas vías podrían estar implicadas al menos en parte en los efectos aquí

descritos.

Otro mecanismo compensatorio importante que recientemente se ha implicado en la esquizofrenia es la polarización microglial. Este mecanismo está en estrecha relación con los niveles de citoquinas presentes en el ambiente, es de esta manera que frente a citoquinas proinflamatorias y estímulos como LPS, IFNγ y TNFα entre otros, la microglía en reposo polariza hacia un fenotipo proinflamatorio (M1); cuando se activan los mecanismos reguladores induciendo la síntesis de otras citoquinas como IL4, IL13, IL10, TGFβ, entre otras, dicha polarización cambia hacia un fenotipo antiinflamatorio (M2). La identificación precisa de estos estados en la microglía es compleja debido a la plasticidad de estas células, capaces de modificar su funcionamiento según el ambiente en que este inmersa. Dentro de los escasos marcadores propuestos para su estudio se encuentra Arginasa I (ArgI), y en los últimos años se ha propuesto el receptor de folato 2 (FOLR2) como marcador de macrófagos antiinflamatorios (Tsuneyoshi et al., 2012).

Nosotros hemos observado que bajo condiciones de estrés agudo, existe un aumento en los niveles de las citoquinas proinflamatorias, por lo que no se observan cambios en los niveles proteicos de los marcadores M2, pero también se induce un aumento de IL4, lo cual puede ser la causa del aumento de los niveles de mRNA de

FOLR2 a pesar de no observarse un posterior cambio a nivel proteico. Por su parte el tratamiento con PALI previno el aumento de las citoquinas proinflamatorias y normalizó la disminución de las antiinflamatorias, además, indujo un aumento en los niveles de mRNA y proteico de ambos marcadores M2. Estos cambios fueron confirmados mediante inmunofluorescencia, en donde hemos demostrado que aumentaba el número de células microgliales que expresaban tanto ArgI como FOLR2. De todas formas, es necesaria la realización de estudios más profundos que confirmen estos resultados no sólo en modelos animales, sino también en humanos, ya sea evaluando la activación de los macrófagos en sangre periférica o el estado de la microglía en cerebros postmorten.

En cambio, bajo condiciones de estrés crónico se mantiene el aumento de algunas de las citoquinas proinflamatorias, pero tanto IL4 como IL10 se encuentran disminuidos, lo cual puede explicar el descenso en los niveles de ArgI. Estas alteraciones fueron normalizadas mediante el tratamiento con PALI.

Por último, en el modelo de esquizofrenia inducido por la infección prenatal, se induce el aumento de las principales citoquinas proinflamatorias, pero no se observan alteraciones en las antiinflamatorias. Sin embargo, los niveles proteicos de los marcadores M2, ArgI y FOLR2, se encuentran disminuidos. Ante el tratamiento con PALI los niveles de citoquinas proinflamatorias se reestablecen, mientras que las antiinflamatorias aumentan, al igual que los niveles de ArgI y FOLR2. El efecto del aumento de las citoquinas antiinflamatorias puede deberse en parte a la polarización antiinflamatoria de esta microglía, ya que para mantener dicha polarización y poder suprimir la respuesta inflamatoria secreta citoquinas antiinflamatorias como IL10, pero también a la acción de HO1 implicada en la regulación positiva de IL10 (Naito et al.,

2014).

Nuestros resultados respecto a la polarización de la microglía hacia un perfil antiinflamatorio M2 están en concordancia con un estudio anterior (Roman et al.,

2012) en el cual se administró una mezcla de RSP y fluoxetina a ratas que

posteriormente fueron sometidas a un test de natación forzada. El análisis de los macrófagos intraperitoneales y de la pleura, posteriormente cultivados, demostró un aumento en los niveles de ArgI en las ratas tratadas. Si bien los autores atribuyen el aumento al antidepresivo, no se debe desestimar el efecto inmunomodulador de RSP.

Por otro lado, recientemente se ha observado que en modelos animales inflamatorios de uveítis autoinmune (EAU) y encefalomielitis alérgica experimental (EAE) los macrófagos activados expresan FOLR2 en las áreas de inflamación, y que tratamientos dependientes de FOLR2, en este caso, el EC0746 (un conjugado antiinflamatorio derivado del ácido fólico) atenuaba los cambios histiopatológicos progresivos de la inflamación (Lu et al., 2014)

Por otro lado, el folato es una vitamina hidrosoluble del complejo de vitaminas B, la cual se ha observado que mejora los síntomas negativos de la esquizofrenia; incluso aberraciones en su metabolismo se relacionan con el aumento de riesgo en desarrollar el síndrome metabólico en aquellos pacientes que usan antipsicóticos atípicos (rev. en

Burghardt y Ellingrod, 2013). Además, en enfermedades psiquiátricas como el autismo

y la esquizofrenia se han detectado autoanticuerpos contra el receptor de folato (Frye

et al., 2013; Ramaekers et al., 2014).

En resumen, los resultados aquí expuestos sugieren que PALI podría modular el sistema antioxidante, no sólo disminuyendo indirectamente los niveles de radicales libres derivados de la respuesta inflamatoria, sino que también mediante la estimulación de la vía del NRF2. Además, mediante la inducción de enzimas antiinflamatorias y la activación de NRF2, estaría contribuyendo a la polarización microglial antiinflamatoria M2.