ATP Daño en células β NMN NAD+ +PRPP Nampt Nmnat ESTREPTOZOTOCINA NICOTINAMIDA Daño mitocondrial
Daño del ADN
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II. 3. Análisis Histomorfométrico
II. 3. A. Obtención de las muestras para histomorfometría del hueso
Se disecaron los fémures de cada rata para analizar la microarquitectura metafisaria. Los huesos se fijaron en formalina neutra tamponada (NBF) durante 72 hs y luego se descalcificaron en sucesivos lavados con una solución de EDTA (Biopack, Buenos Aires, Argentina) 10 %, pH = 7,0 durante aproximadamente 3 semanas a temperatura ambiente. Las muestras fueron incluidas en parafina. Para llegar a incluir los fémures en parafina se usó un tren de deshidratación formado por dos pasajes sucesivos de 1h de duración en cada uno de los siguientes solventes: alcohol 70º, alcohol 96º, alcohol 100º xileno y finalmente parafina I y
parafina II. Se hicieron cortes de 5 μm de espesor con un micrótomo Leica SM 2000 R, los cortes
se recogieron en un baño de flotación y se los dejó secar durante 48 hs a 56ºC.
Los cortes de los preparados embebidos en parafina se sumergieron en xilol para eliminar la parafina, luego se pasaron por una serie de alcoholes (100º, 96º y 70º) para rehidratarlos, y a continuación se realizaron las siguientes coloraciones:
• Hematoxilina - Eosina (H - E).
• Histoquímica de fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP).
• Azul Alcián.
a)Tinción con Hematoxilina - Eosina. La hematoxilina es un colorante catiónico o básico, y por esta razón tiñe estructuras ácidas (basófilas) en tonos azul y violáceo, como por ejemplo los núcleos celulares. El colorante eosina tiñe componentes básicos (acidófilos) en tonos de color rosa (gracias a su naturaleza aniónica o ácida), como la mayoría de las proteínas al pH de la tinción. Los cortes desparafinados e hidratados se sumergieron en hematoxilina por 5 minutos, se lavaron con agua corriente, luego se introdujeron en eosina por 30 segundos y finalmente se lavaron con agua destilada. Posteriormente se pasaron por una serie de alcoholes (70º, 96º y 100º) para deshidratarlos, se los introdujo en xilol y finalmente se montaron con bálsamo sintético para montaje (Biopur, Argentina).
Figura III. 3.1. Imágenes de cortes histológicos teñidos con Hematoxilina y Eosina, a diferentes aumentos. Ot: Osteocito; MO: medula ósea; Ht: hueso trabecular. Cartílago de crecimiento doble flecha.
Figura III. 3. 2. Imágenes de cortes histológicos teñidos utilizando la histoquímica de TRAP, a diferentes aumentos. Las flechas indican la zona TRAP+
b) Tinción histoquímica para fosfatasa ácida tartratoresistente (TRAP). En los cortes histológicos se determinó la presencia de células con actividad positiva de fosfatasa ácida tartrato resistente. La reacción involucra una sustitución nucleofílica con un reactivo acoplante en la cual se forma un precipitado violáceo en las células que presentan actividad TRAP. Para esto se preparó una solución que contiene Fast Garnet GBC en Metilglicol acidificada con HCl, a la cual se le agregó nitrito de sodio gota a gota y a temperatura ambiente para producir la diazotación que permitirá formar la sal de diazonio altamente reactiva que será sustituída con el
α-naftol liberado por la enzima a partir de naftol AS-BI. La reacción enzimática se lleva a cabo en presencia de tartrato de sodio para aumentar la especificidad de la reacción, en buffer citrato pH 4,9. Recién a partir de este momento se pusieron los cortes ya desparafinados e hidratados en la solución termostatizada durante 60 minutos a 37ºC. Luego se lavaron con agua destilada, se contra colorearon con Fast Green durante 10 minutos, se enjuagaron con agua destilada y se montaron los preparados en glicerina.
Figura III. 3. 3. Imágenes de cortes histológicos teñidos con Azul Alcián, a diferentes aumentos. Las flechas indican la placa de crecimiento.
c) Tinción de Azul Alcián pH 2.5. A este pH, el azul alcián tiñe las mucinas altamente sulfatadas sintetizadas por los condrocitos de la placa de crecimiento, las cuales se van a ver de color azul. Los cortes desparafinados e hidratados se tiñeron con solución de Azul Alcián durante 4 hs. Luego se lavaron con agua corriente durante 10 minutos. Los preparados se contracolorearon con Eosina (30 segundos). Posteriormente se pasaron por una serie de alcoholes (70º, 96º y 100º) para ser deshidratardos, se los introdujo en xilol y finalmente se montaron con bálsamo sintético.
Una vez teñidos, los preparados fueron fotografiados con una cámara digital Nikon Coolpix 4500 en un microscopio Nikon Eclipse E400. Las imágenes se analizaron con el programa ImageJ (http://www.macbiophotonics.ca) utilizando un plugin para incorporar una escala micrométrica.
II. 3. B. Histomorfometría ósea
En las imágenes fotográficas de cortes teñidos con H-E, se determinó el área de hueso trabecular en la espongiosa primaria femoral, definido como: área trabecular sobre área total (trabéculas más médula ósea). Los resultados se expresaron como porcentajes (%).
Se calculó la densidad osteocítica contando el número de osteocitos por unidad de área de hueso trabecular. Los resultados se expresaron como número de osteocitos/mm2.
Usando imágenes de histoquímica de fosfatasa ácida tartrato resistente, se calculó el
área con actividad TRAP/área total de hueso en los 250 μm proximales al cartílago de
En las fotos de la tinción de Azul Alcián se cuantificó la altura del cartílago de crecimiento.
II. 4. Análisis estadístico
Los resultados se expresan como la media ± SEM y se obtienen a partir de al menos tres experimentos independientes que se realizan por triplicado. Las diferencias entre grupos se establecen mediante Oneway ANOVA con test Tukey post-hoc. Para datos con distribución no normal se utiliza el test no paramétrico Kruskal Wallis con test de Dunn post-hoc, usando el programa estadístico GraphPad In Stat version 3.00 (Graph Pad Software, San Diego, California, USA). Se considera significativo p < 0,05.