Antecedentes y Objetivo
2. PARTICIPACIÓN DE LA βIII ESPECTRINA EN EL MANTENIMIENTO DE LA ARQUITECTURA DEL COMPLEJO DE GOLG
Una vez caracterizados los anticuerpos y estar seguros de su especificidad, estudiamos la distribución subcelular de la βIII espectrina en el Golgi de células RPE1. Mediante microscopía confocal realizamos estudios de colocalización con marcadores de los compartimentos
proximales (GM130 y CTR433) y distales (Golgina97 y TGN46) del Golgi (Figura 20). En todas las células el marcaje de βIII espectrina se solapaba con todos los marcadores de Golgi (Figura 20 A) pero colocalizaba más con los marcadores de trans-Golgi y del TGN (Figura 20 B). A parte del marcaje de Golgi, también observamos un marcaje basal citoplasmático y nuclear de intensidad variable dependiendo de la célula que se examinaba.
Figura 20. La βIII espectrina está enriquecida en los compartimentos distales del complejo de Golgi. (A) Colocalización de la βIII espectrina con los diferentes marcadores de Golgi. Las células RPE1 se procesaron para IF usando anticuerpos contra la βIII espectrina y anticuerpos contra el cis- (GM130), medial- (CTR433), trans-Golgi (Golgina97) o contra el TGN (TGN46). Las imágenen solapadas muestran la colocalización de la βIII espectrina con los respectivos marcadores Golgi (píxeles en blanco). Escala Bar, 10 μm. (B) Análisis cuantitativo de las imágenes mostradas en el panel (A) en el que cada columna representa el número de píxeles rojos (βIII espectrina) que se superponen con los píxeles verdes (marcador de Golgi) respecto el total de píxeles rojos.
Estos resultados indican que, si bien la βIII espectrina se encuentra a lo largo de todo el stack
del Golgi, está más enriquecida en los compartimentos distales.
Estudios previos han mostrado que la espectrina parece tener un papel estructural en el Golgi (Beck y col., 1994). Sin embargo, hay pocas evidencias de la que la βIII espectrina interviene en el mantenimiento de la morfología en forma de cinta tan característica del Golgi (Siddhanta y
col., 2003). Con la finalidad de caracterizar el papel de la βIII espectrina en la estructura del Golgi, analizamos si el silenciamiento de la βIII espectrina afectaba a su morfología. Para disminuir la expresión de la βIII espectrina utilizamos el sistema de silenciamiento mediado por siRNAs (ver apartado 4.5 de materiales y métodos para las secuencias de los siRNAs). Analizamos por WB la expresión de la βIII espectrina en los lisados de células RPE1
transfectadas con los diferentes
siRNAs solos (siRNA 9-12) o combinados. Observamos una reducción de los niveles de expresión de la βIII espectrina después de 96 h de silenciamiento (Figura 21 A) siendo el efecto mayor cuando se combinaron los cuatro siRNA (alrededor del 85%; Figura 21 A y B). Por tanto,
decidimos realizar los experimentos de silenciamiento utilizando la combinación de los cuatro siRNA. Como control, utilizamos una combinación de cuatro siRNA que no codificaban para ninguna proteína (siRNA non-targeting). Para comprobar que la disminución de los niveles proteicos de la βIII espectrina era debida a una disminución del ARNm, realizamos PCRs
cuantitativas en tiempo real y obsevamos una disminución del ARNm del 90% en las células silenciadas con los siRNAs de la βIII espectrina (Figura 21 C). Como era de esperar, a nivel de IF observamos que las células silenciadas no presentaban marcaje para la βIII espectrina, aunque tanto el marcaje citoplasmático como el nuclear persistían (Figura 21 D). En estas células, el Golgi estaba fragmentado en grado diverso pero manteniendo siempre su localización
perinuclear (Figura 21 D). Cuantificamos este fenotipo usando el índice de compactación del Golgi que consiste en medir el área y el perímetro de cada Golgi (Bard y col., 2003). Observamos que las células silenciadas tenían un Golgi menos compactado (es decir, más fragmentado) que las células control (Figura 21 E). La fragmentación del Golgi en ausencia de la βIII espectrina también se reprodujo en células HeLa (Figura 21 F, G).
Otro abordaje experimental que utilizamos para determinar qué papel tiene la βIII espectrina en la estructura del Golgi fue microinyectar los anticuerpos anti-βIII espectrina. Microinyectamos la fracción IgG del anticuerpo nº 33 en el citoplasma de células NRK conjuntamente con rojo dextrano para poder identificar aquellas células microinyectadas.
También observamos una fragmentación del Golgi 5 h después de la microinyección. Como control, microinyectamos la fracción IgG del suero preinmune nº 33. En estas condiciones, el
Figura 21. El silenciamiento de la βIII espectrina fragmenta el complejo de Golgi. (A) Silenciamiento de la βIII espectrina en células RPE1 (izquierda) y células HeLa (derecha). Lisados totales de RPE1 y HeLa transfectadas durante 96 h con siRNAs control (carril 1) o con siRNAs contra la βIII espectrina (mezcla de cuatro, carril 2; los cuatro por separado, carriles 3-6) se procesaron para WB utilizando anticuerpos anti-βIII espectrina y anti-RhoGAP p190 como control de carga. La punta de flecha indica la banda correspondiente a la βIII espectrina que es la que disminuye después del silenciamiento. (B) Cuantificación del resultado de las células RPE1 mostrado en el panel (A), en el cual las columnas representan la ratio obtenida de las respectivas densitometrías de la βIII espectrina y la p190 RhoGAP de cada condición experimental. Los valores son la media ± SEM de tres experimentos independientes. La significación estadística, p ≤ 0.001 (***). (C) Cuantificación del resultado de las células RPE1 mostrado en el panel (A), en el cual las columnas representan la ratio obtenida de los valores obtenidos de la βIII espectrina y GAPDH (utilizado como control). (D) Las células RPE1 control y las silenciadas con los siRNAs contra la βIII espectrina se fijaron a las 96 h después de la transfección. Posteriormente se procesaron para IF usando anticuerpos anti-βIII espectrina y anti-Golgina97. El asterisco muestra las células que no presentan marcaje de βIII espectrina. Los insertos muestran diferentes fenotipos de fragmentación del Golgi en ausencia de βIII espectrina. Escala Bar, 10 μm. (E) Análisis cuantitativo de la fragmentación del Golgi de células RPE1 silenciadas y células control mostradas en el panel (D) midiendo el índice de compactación del Golgi. Los valores son la media ± SEM de tres experimentos independientes La significación estadística, p ≤ 0.001 (***). (F) Células HeLa tratadas como en el panel (D). Posteriormente se fijaron y procesaron para IF usando el marcador de Golgi GM130. Escala Bar, 10 μm. (G) Análisis cuantitativo de la fragmentación del Golgi de células HeLa silenciadas y células control mostradas en el panel (F) midiendo el índice de compactación del Golgi. Los valores son la media ± SEM de tres experimentos independientes La significación estadística, p ≤ 0.05 (*).
Golgi permanecía inalterado y no se distinguía del Golgi de las células vecinas no microinyectadas (Figura 22).
Figura 22. La microinyección de anticuerpos anti-βIII espectrina causa una fragmentación del compejo de Golgi. Células NRK fueron co-microinyectadas con rojo dextrano (para detectar las células positivas) junto con la fracción IgG del suero pre- inmune o post-inmune nº 33. Después de 5 h, las células se fijaron y se procesaron para IF usando anticuerpos anti- GM130 para visualizar el Golgi. Escala Bar, 10 μm.
Todos estos resultados demuestran que la βIII espectrina es necesaria para mantener la
organización estructural del Golgi en forma de cinta o ribbon.
Hemos observado que tanto el silenciamiento de la βIII espectrina como la microinyección de anticuerpos anti-βIII espectrina alteran la morfología del Golgi a nivel de microscopía de epifluorescencia. El siguiente paso fue examinar su efecto a nivel ultraestructural. En las
células control, el Golgi aparecía como una estructura altamente organizada, compuesta por cuatro, cinco o seis cisternas aplanadas y apiladas formando el característico stack o dictiosoma, con pocos perfiles túbulo-vesiculares cerca de las cisternas (Figura 23 A). Por el contrario, las células silenciadas mostraron una estructura del Golgi desorganizada, con las cisternas dilatadas en grado variable, especialmente en la parte distal y un incremento de
perfiles vesiculares muy próximos a las cisternas más distales (Figura 23 B-D), aunque éstas parecían mantener el apilamiento aparentemente normal. También apreciamos una dispersión de los dictiosomas en concordancia con lo observado por microscopía de epifluorescencia. Tenemos que destacar que en la mayoría de las dilataciones de la zona distal del Golgi
aparecieron estructuras de tipo vacuolar con una masa electrodensa en su interior (Figura 23 B y E) adyacentes a las cisternas del Golgi.
Figura 23. La depleción de la βIII espectrina induce la desorganización estructural del complejo de Golgi, una fragmentación y dilatación variable de las cisternas y un incremento de perfiles vesiculares en los compartimentos trans-Golgi. Las células RPE1 control (A) y silenciadas para la βIII espectrina (B-E) se fijaron y procesaron para MET. (C) Imagen panorámica de una célula RPE1 silenciada para la βIII espectrina. (D) Inserto del panel (C). El silenciamiento de la βIII espectrina desorganiza la estructura del Golgi, fragmentándola y dilatando en grado variable las cisternas, especialmente las más distales. La punta de flecha indica vesículas de clatrina. Aumenta también el número de perfiles vesiculares alrededor de las cisternas. (E) En la zona distal del dictiosoma aparecen estructuras vacuolares con un cuerpo electrodenso en su interior (flechas). N, núcleo; G, complejo de Golgi; ER, retículo endoplasmático. Escala Bar, 200 nm.