CAPÍTULO I RESULTADOS
RESULTADOS
En la primera etapa de trabajo de esta tesis doctoral estudiamos por primera vez la presencia de la PC-PLC en los sinaptosomas de la corteza cerebral de rata y realizamos la caracterización de esta actividad enzimática. Los sinaptosomas o terminales sinápticas (obtenidos como se describió en la sección Materiales y Métodos) contienen mitocondrias y pueden mantenerse metabólicamente activos por seis horas luego de su obtención, dependiendo de las condiciones de incubación.
Con el fin de hallar las condiciones óptimas para ensayar la actividad de la PC-PLC se midió la generación de [14C]-DAG a partir de la [14C]-DPPC en función del tiempo, en presencia de distintas concentraciones de agentes tensioactivos (deoxicolato de sodio y Triton X-100) y se estudió el efecto de los cationes divalentes Ca2+ y Mg2+. Asimismo, se estudió el aporte porcentual de la actividad de la PC-PLC a la generación de DAG en las terminales sinápticas de la corteza cerebral, discriminándose entre el DAG proveniente de la vía PLC de aquel generado por la vía de la PLD, y se describieron los parámetros cinéticos KM y Vmáx para la PC-PLC.
Se estudió también la localización de esta fosfolipasa en la membrana plasmática sinaptosomal y en dominios especializados de la membrana.
I. 1. EFECTO DE LOS AGENTES TENSIOACTIVOS EN LA GENERACIÓN DE
DAG A PARTIR DE LA PC.
Diversos detergentes se han utilizado para evaluar la actividad de las fosfolipasas debido a que pueden favorecer la accesibilidad al sustrato y aumentar la disponibilidad de los sitios activos de la enzima, favoreciendo la medición de estas actividades enzimáticas.
La generación de DAG a partir de la PC se estudió en presencia de distintas concentraciones del detergente no iónico Triton X-100 y de deoxicolato de sodio (DOC) utilizando como sustrato dipalmitoil fosfatidilcolina radiomarcada ([14C]-DPPC) y DPPC no
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marcada como se describe en detalle en la sección Materiales y Métodos. El efecto de estos agentes tensioactivos en la generación de DAG se muestra en la Figura 14. Cabe señalar que previo a la realización del ensayo se evaluó la eficiencia de la incorporación de la [14C]-DPPC en las microdispersiones de sustrato para cada condición, la cual fue cercana al 100% en todos los casos.
Figura 14. Efecto de agentes tensioactivos en la generación de DAG a partir de la PC. Los Syn (150 µg de proteína) se incubaron en buffer Tris 0,1 M (pH 7,2-7,4) en presencia de distintas concentraciones de Triton X-100 y DOC. La reacción enzimática se llevó a cabo por 20 min a 37°C, las microdispersiones del sustrato fueron preparadas de forma tal de lograr 45.000 dpm de [14C]-DPPC y 0,125
mM de DPPC por ensayo como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados se expresan como dpm DAG x (mg proteína x 20 min)-1 y se compararon con la condición control. *p< 0,05; **p<0,01; *** p<0,001.
El Triton X-100, a todas las concentraciones ensayadas, estimuló la formación de DAG con respecto a la condición control (donde se midió la formación de DAG en ausencia de detergentes). La mayor generación de DAG se produjo en presencia de Triton X-100 0,1%. A esta concentración la formación de DAG se incrementó en un 330% respecto a la condición control. Sin embargo, en presencia de la mayor concentración ensayada para este detergente (0,5%) el efecto estimulatorio fue menor, ya que la formación de DAG se incrementó sólo en un 135% con respecto al control.
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Por su parte, el DOC en las concentraciones de 0,05 y 0,1% solo incrementó la formación de DAG en un 50 y 70% con respecto a la condición control, respectivamente. En base a estos resultados los siguientes experimentos se realizaron en presencia de Triton X-100 en una concentración de 0,1%.
I. 2. EFECTO DE LOS IONES Ca
2+Y Mg
2+EN LA GENERACIÓN DEL DAG.
Para hallar las condiciones óptimas de ensayo y caracterizar la actividad de la PC- PLC se estudió el efecto de cationes divalentes sobre la generación de DAG a partir de la PC (Figura 15).
Figura 15. Efecto de los iones Ca2+ y Mg2+ en la generación de DAG a partir de la PC. Los Syn se
resuspendieron en buffer Tris 0,1 M (pH 7,2-7,4) y se evaluó la generación de DAG en presencia de los iones endógenos (condición control), de EDTA 5 mM o luego del agregado de Ca2+ 2 mM y Mg2+ 1 mM. La
reacción enzimática se llevó a cabo durante 20 min a 37°C, en presencia de 45.000 dpm de [14C]-DPPC,
0,125 mM de DPPC y Triton X-100 0,1%. Los resultados se expresan como dpm DAG x (mg proteína x 20 min)-1 y se compararon con el control. *p< 0,05; **p<0,01.
El agregado de Ca2+ 2 mM al buffer de ensayo inhibió la formación de DAG en un 73% mientras que el Mg2+ 1 mM la inhibió en un 50%. En la condición donde se agregó Mg2+ 1 mM y ATP 250 µM (condición que favorece la actividad de proteínas quinasas) también fue inhibida la formación de DAG en un 50%. Cabe destacar que el agregado de
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EDTA 5 mM (quelante de calcio y magnesio) no modificó la generación de DAG con respecto a la condición control.
Basándonos en los resultados obtenidos los ensayos realizados para la caracterización de la actividad de la PC-PLC fueron llevados a cabo en presencia de Triton X-100 al 0,1% y sin el agregado de cationes exógenos. Todos los ensayos fueron realizados al pH fisiológico 7,2-7,4.
I. 3. CONTRIBUCIÓN DE LAS VÍAS DE LA PC-PLC Y DE LA PLD/PAP2 EN
LA GENERACIÓN DE DAG A PARTIR DE LA PC.
I. 3. 1. Contribución de la PC-PLC y de la PLD en sinaptosomas obtenidos de la
corteza cerebral de ratas adultas.
La Figura 16 muestra la generación de DAG a partir de PC en los Syn de ratas adultas (4 meses) luego de 5 y de 20 min de incubación con el sustrato radiomarcado. La formación de DAG en 20 min de reacción enzimática fue 0,8 veces superior a la generación observada en 5 min de incubación con el sustrato radiomarcado.
Figura 16. Generación de DAG en función del tiempo. Los Syn (150 µg de proteína) se incubaron en buffer Tris 0,1 M (pH 7,2-7,4) a 37°C en presencia de 45.000 dpm de [14C]-DPPC, DPPC 0,125
mM y una concentración final de Triton X-100 de 0,1%. Se evaluó la formación de [14C]-DAG a los 5
y a los 20 min. Los resultados se expresan como dpm DAG/mg proteína.
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Como se mencionó anteriormente, la PC de las membranas puede ser hidrolizada por la PLD generando colina y PA, el cual seguidamente puede ser desfosforilado a DAG por la acción de la PAP2. Asimismo, la acción de la PLC específica para PC también es capaz de generar DAG a partir de PC (junto con la liberación de fosfocolina). Debido a los dos posibles orígenes enzimáticos del DAG, fueron necesarias diversas estrategias experimentales para discriminar el aporte porcentual de ambas vías enzimáticas.