Preparación de soluciones

2.1.2.1. Soluciones de caseinato de sodio

El caseinato de sodio (NaCAS) bovino comercial se disolvió en agua destilada con agitación magnética durante 2 h hasta alcanzar la concentración final deseada. Se adicionó entre 0,01–0,02 %P/V de azida sódica como preservante microbiano y el mismo fue guardado en heladera a 4 °C. Para su uso la solución acuosa de NaCAS bovino se agitó 1 h a temperatura (T) ambiente (23-25 ºC). En estas condiciones la misma tieneun pH isoiónico de 6,8.

El NaCAS ovino se obtuvo a partir de caseína (CN) ácida de leches de ovejas de raza Lacaune del sur de Brasil. La leche fue desgrasada por centrifugación a 10.000xg a 4 °C durante 10 min. Luego se acidificó hasta alcanzar pH 4,5 con HCl 1 M bajo agitación constante a 25 °C. Después de permanecer 30 min a 40 °C, la mezcla fue filtrada utilizando papel de filtro Whatman N°40 usando una bomba de vacío. La CN ácida precipitada se lavó con un buffer ácido

acético/acetato de sodio pH 4,5 y luego con agua destilada, posteriormente se disolvió con la adición de NaOH 10 g.L-1 _{hasta alcanzar pH 7,0 y luego nuevamente se precipitó. Se llevaron a}

cabo de esta manera 4 ciclos sucesivos de precipitación, lavado y redisolución. El precipitado final (CN ácida) se lavó con acetona y cloroformo para extraer los glóbulos de grasa remanentes [87-88].

El NaCAS ovino (10 g.L-1) se preparó a partir de la disolución de 1 g de CN ácida ovina en 50 mL de NaOH 0,1 N. La disolución se ajustó a un pH final de 6,8 por adición de pequeños volúmenes de HCl 0,1 N y se llevó el sistema a un volumen final de 100 mL con agua destilada [89-90].

2.1.2.2. Preparación de las micelas de caseína (MC)

La MC se reconstituyeron al 10 %P/V a partir de leche en polvo descremada en una solución buffer TRIS-HCl 0,01 M, CaCl2 0,01 M y pH variable (6,5-8,5). Las mismas se

almacenaron 24 h a 4 °C en la oscuridad para su posterior utilización.

2.1.2.3. Soluciones de ANS

El ANS, como sal de amonio, fue usado sin más purificación. Para las experiencias espectrofluorométricas se preparó una solución acuosa madre 6 mM que se almacenó en la oscuridad a 4 °C.

Su concentración fue determinada por medidas de absorbancia utilizando un coeficiente de absortividad molar ε = 4.950 M-1.cm-1 a 350 nm [91].

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2.1.2.4. Soluciones reguladoras

La composición de las soluciones reguladoras (buffers) dependió de los requerimientos

de la experiencia a realizar. Las mismas se realizaron a partir de la disolución de la droga sólida en agua destilada y se el pH se ajustó con agregados convenientes de soluciones de NaOH 0,1 M y/o HCl 0,1 M. La calibración del electrodo se efectuó con soluciones comerciales reguladoras de pH, teniendo en cuenta la T de trabajo. Los principales buffers utilizados fueron: Imidazol 0,2

M pH 6,8 para ensayos de estabilidad coloidal, TRIS-HCl 0,02 M pH 8 para hidrólisis enzimática, TRIS-HCl 0,01 M, CaCl2 0,01 M y pH variable (6,5-8,5) para ensayos de

coagulación, TRIS-HCl 1,5 M pH 8,8 y 0,5 M pH 6,8 para electroforesis, fosfato 0,212 M, pH 8,2 para determinación de grado de hidrólisis, fosfato 0,2 M, pH 6,6 para la determinación de poder reductor, fosfato 0,005 M pH 7,0 para determinación de la actividad secuestradora del radical ABTS·+.

2.1.2.5. Preparación de muestras, soluciones y geles para electroforesis

Las electroforesis se realizaron en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS- PAGE) o en presencia de SDS y tricina (tricina-SDS-PAGE)

2.1.2.5.1. SDS-PAGE

Se prepararon soluciones acuosas stock de acrilamida conteniendo 30 %P/V de

acrilamida y 0,8 %P/V de bis-acrilamida, de buffers TRIS-HCl 1,5 M pH 8,8 y 0,5 M pH 6,8, de buffer de corrida con TRIS 0,025 M, glicina 0,192 M, SDS 0,1 %P/V y pH 8,3, del colorante

conteniendo 0,1 %P/V de azul brillante de Coomassie R250, 45 %V/V de metanol y 10 %V/V de ácido acético.

El gel de corrida estuvo compuesto de acrilamida al 11,68 %V/V y bis-acrilamida 0,32 %V/V solubilizadas en buffer TRIS-HCl 1,5 M pH 8,8, conteniendo SDS 0,1 %V/V. El gel de

concentración contenía acrilamida al 3,8 %V/V, bis-acrilamida 0,2 %V/V solubilizadas en buffer

TRIS-HCl 0,5 M pH 6,8, conteniendo SDS 0,1 %V/V. Los geles mencionados se prepararon en presencia de urea 6 M. La reacción de polimerización fue iniciada por el agregado de 50 μL de APS (preparado en el momento) y 5 μL de TEMED.

El buffer de siembra, para la preparación de muestras para electroforesis estaba

constituido por TRIS-HCl 0,06 M pH 6,8; SDS 2 %V/V, glicerol 20 %V/V, urea 6M, azul brillante de Coomassie R250 0,01 %V/V y β-ME al 1 %V/V.

Materiales y métodos

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Las muestras conteniendo una concentración de proteína entre 0,25 g.L-1 y 1 g.L-1 se disolvieron en 1 mL de buffer de siembra.

2.1.2.5.2. Tricina-SDS-PAGE

Para la preparación de buffer de muestra (no reductor) se prepararon: buffer B (SDS 12

%P/V, glicerol 30 %P/V, azul brillante de Coomassie R250 0,05 % y TRIS-HCl 0,15 M), buffer

B/4 (buffer B diluido con 3 volúmenes de agua) y buffer D (buffer B sin glicerol). El buffer gel

estuvo compuesto por TRIS 3 M, HCl 1 M, SDS 0,3 % a pH 8,45. El buffer ánodo estuvo

compuesto por TRIS 1 M, HCl 0,225 M a pH 8,9. El buffer cátodo estuvo compuesto por TRIS 1

M, tricina 1 M, SDS 1% a pH ~8,25 (pH no corregido). La solución stock AB-3 estuvo

compuesta por acrilamida 48 %P/V y bis-acrilamida 1,5 %P/V. La solución stock AB-6 estuvo

compuesta por acrilamida 46,5 %P/V y bis-acrilamida 3 %P/V.

El gel de separación (16%/6M urea) se preparó a partir de 5 mL de solución stock AB-

6, 5 mL de buffer gel (3x) y 5,4 g de urea para obtener un volumen final de 15 mL. La

polimerización del mismo se inició por el agregado de 50 μL APS 10 % P/V y 5 μL de TEMED. El gel espaciador (10 %) se preparó a partir de 3 mL de solución stock AB-3, 5 mL de buffer gel (3x) y 1,5 g de glicerol para obtener un volumen final de 15 mL. La polimerización del

mismo se inició por el agregado de 75 μL de APS 10 %P/V y 8 μL de TEMED. El gel de concentración (4 %) se preparó a partir de 0,5 mL de solución stock AB-3 y 1,5 mL de buffer gel

(3x) para obtener un volumen final de 6 mL. La polimerización del mismo se inició por el agregado de 45 μL de APS 10 % P/V y 8 μL de TEMED.