Primer aislamiento de bacterias quitinolíticas, usando el CMBQ reactivado

Se prepararon 6 tubos (16x100 mm) con 4.5 mL de medio de cultivo para bacterias ruminales quitinolíticas y 0.05 g de quitina pura como única fuente de carbono (Ch­FR; Cuadro 3). Los tubos de cultivo se esterilizaron 20 min a 121 ºC y se incubaron 24 h a 39 ºC para asegurar su esterilidad y anaerobiosis. Cada tubo se inoculó con 0.01 g del CMBQ y se incubó 7 d a 39 ºC liberando el gas producido cada 24 h, se trasfirieron 0.5 mL del cultivo y se depositaron en tubos de cultivo con 4.5 mL de medio Ch­FR y se incubaron 7 d; se repitió una vez el proceso descrito. Se obtuvieron seis consorcios bacterianos: BQT1, BQT2, BQT3, BQT4, BQT5, BQT6, que se depositaron individualmente en seis frascos serológicos con 50 mL medio de cultivo Ch­FR y se incubaron 48 h a 39 ºC. Los frascos se congelaron 24 h a 0 ºC antes de ser liofilizados, lo cual se hizo en una liofilizadora (LABCONCO; USA) a ­40 °C y un vacío de 133X10­3 _{mBar. Las muestras se liofilizaron 72 h, hasta obtener un}

producto libre de humedad.

5.3.1 Comparación de la degradación de quitina pura entre los seis consorcios bacterianos obtenidos del CMBQ

Se comparó la degradación de quitina pura comercial (SIGMA; USA) entre los seis consorcios bacterianos liofilizados para seleccionar aquél con mayor degradación de quitina y continuar el proceso de aislamiento de bacterias quitinolíticas. Se prepararon 7 viales (100 mL) con 20 mL de medio de cultivo para bacterias quitinolíticas (Ch­FR) y 0.2 g de quitina como fuente de carbono a un pH de 6.5 (Cuadro 3). Los viales se esterilizaron 20 min a 121 ºC y se incubaron 24 h a 39 ºC para asegurar esterilidad. Cada vial se inoculó con 0.05 g del liofilizado de BQT1, BQT2, BQT3, BQT4, BQT5, BQT6 y CMBQ, se incubó 48 h a 39 °C hasta una concentración final de 109_{bacterias mL}­ 1 _{de medio de}

de cultivo (18x150 mm) con 8.9 mL de medio de cultivo Ch­FR más 0.1 g de quitina se ajustó el pH del medio a 6.5 con 2.5 mL de Na2CO3 100 mL­1al 8% y

HCl 4N para alcalinizar ó acidificar el medio de cultivo. Los tubos de cultivo inoculados se incubaron 72 h a 39 ºC, tomando muestras (había tubos para cada 24 h de fermentación) cada 24 h para calcular el porcentaje de degradación de quitina, y el pH se midió con un potenciómetro (Orion, modelo 710A; México) calibrado a pH 4 y 7.

5.3.2 Determinación del porcentaje de degradación de quitina

Cada 24 h de fermentación se recuperó por filtración en papel Whatman No. 541 la quitina no degradada presente en los medios de cultivo. Los filtros de papel Whatman con el residuo se deshidrataron 24 h en una estufa a 60 °C, se dejaron 24 h en un secador y se pesaron en una balanza analítica. Por diferencias entre peso inicial y final se calculó el porcentaje de degradación de MS en cada muestra:

Peso inicial – Peso final Peso inicial

El diseño estadístico fue completamente al azar, se hizo un análisis de varianza de los datos con GLM y la comparación de medias se hizo con la prueba de Tukey (SAS, 1998).

5.3.3 Conteo de bacterias totales

El conteo bacteriano se realizó con una cámara Petroff­Hausser y un microscopio de contraste marca Zeizz a una magnificación de 1000X. El conteo de bacterias se hizo en el cuadro central de la cámara Petroff­Hausser con un área de 0.05 mm2 _{y una profundidad de 0.02 mm (Madigan et al., 2004). La}

concentración de bacterias mL­1 _{de medio de cultivo se calculó con la siguiente}

formula:

Concentración de bacterias = (Promedio) (factor de dilución) (2x107₎

5.3.4 Evaluación de la viabilidad y concentración de bacterias en el consorcio bacteriano BQT1

Como resultado de la comparación en la degradación de quitina pura entre los seis consorcios bacterianos quitinolíticos aislados (BQT1 – BQT6) se seleccionó al BQT1 para continuar su caracterización y aislamiento de bacterias quitinolíticas, debido a que mostró el mayor porcentaje de degradación de la MS de quitina. En un matraz Erlenmeyer de bola (1000 mL) se prepararon 300 mL de medio de cultivo anaerobio (Ch­ FR; Cuadro 3) y se esterilizó 20 min a 121 ºC. El medio de cultivo (4.5 mL) se vertió, con flujo de CO2, en tubos (16x100 mm) esterilizados que contenían 0.05 g de quitina, se

inocularon con 0.05 g del consorcio BQT1 y se incubaron 48 h a 39 ºC, con el fin de rehabilitar las bacterias quitinolíticas. La concentración de bacterias por 0.1 g de liofilizado se calculó con la técnica del NMP (Harrigan y McCance, 1979), usando tres repeticiones y diluciones de 10­1 _{a 10}­13_{. Los tubos}

inoculados con BQT1 se incubaron a 39 ºC y el crecimiento microbiano se monitoreo cada 24 h por 72 h. Se consideró como crecimiento positivo a todos los tubos que presentaron turbidez.

5.3.5 Comparación de la degradación de quitina pura y caparazón de camarón por BQT1 a diferentes pH

Para determinar el efecto del pH en la degradación de quitina ó caparazón de camarón se prepararon medios de cultivo con un pH inicial de 6.0, 6.5 y 7.0 y se inocularon con el consorcio BQT1 a una concentración inicial de 109

las 72 h de fermentación. Los tubos de cultivo a pH 6.0, 6.5 y 70 se prepararon de la siguiente manera: 45 tubos de cultivo con 0.1 g de quitina y 45 tubos con 0.1 g de caparazón de camarón cada uno. El pH de los tubos de cultivo se ajustó a 6.0 y 6.5 con HCl 4N y a 7.0 con NaOH 4 N.

El diseño experimental fue completamente al azar y con los datos de pH, porcentaje de degradación de quitina pura y porcentaje de degradación de caparazón de camarón se hizo un análisis de coeficiente de correlación y regresión lineal con los procedimientos CORR y REG. Los datos se analizaron con el procedimiento GLM y la comparación de medias se hizo con la prueba de Tukey (SAS, 1998; Johson y Kuby, 1999).

5.4 Segundo aislamiento de bacterias quitinolíticas usando el consorcio