Proceso de refinación del aceite de oliva

Para realizar la refinación al aceite de oliva, primero se realiza una depuración o desgomado, en la que se eliminan los fosfolípidos fundamentalmente. Más tarde se realiza una neutralización en la que se produce la eliminación de la acidez libre y una vez neutralizado se produce la decoloración en la que eliminan las sustancias que dan el color al aceite que son las clorofilas y los carotenos. El penúltimo paso es la desodorización del aceite en la que aplicando calor y una corriente de vapor se eliminan los compuestos que dan un sabor y un olor desagradable al aceite. Por último, se procede a la winterización en la que se eliminan los triglicéridos de punto de fusión más elevado, haciendo que el aceite se mantenga líquido a temperaturas más bajas (Aceite de las Valdesas, 2022).

21 6. EXTRACCIÓN DE FITOESTEROLES DEL ACEITE VEGETAL.

El primer paso en todos los métodos de análisis de fitoesteroles es su extracción a partir del aceite vegetal, separándolos del resto de la matriz, que es extraordinariamente compleja. Los fitoesteroles tienen poca solubilidad en alimentos grasos, fácil reactividad y alto punto de fusión. Para la separación de moléculas biológicas se tiene que tener en cuenta factores como: tamaño, densidad, difusividad, forma, polaridad, solubilidad, carga electrostática y volatilidad de los compuestos sometidos a separación. Se pueden utilizar enfoques tradicionales de extracción de fitoesteroles, como la destilación molecular, la cromatografía sobre gel de sílice, la extracción líquido-líquido y sólido-líquido, aunque conducen a baja pureza en el producto final que se obtiene. En este caso, nosotros seguiremos una ruta de extracción de fitoesteroles en aceites vegetales para su posterior separación y análisis. En esta ruta de extracción de fitoesteroles en aceites vegetales utilizaremos el destilado de desodorización en aceite comestible (Dikshit et al.,2019)

En los últimos años se han utilizado técnicas convencionales como son:

extracción soxhlet, la maceración, el calentamiento a reflujo, la percolación o la hidrodestilación (Ferdosh et al., 2018). El aspecto negativo de estas técnicas es la potencial toxicidad para los seres humanos y el medio ambiente de los disolventes orgánicos utilizados. Por ello pondremos especial énfasis en técnicas avanzadas de extracción de fitoesteroles, que son menos tóxicas para los seres humanos y más respetuosas para el medio ambiente.

A continuación, se presentan y discuten las técnicas de extracción encontradas en bibliografía empleadas más recientemente.

6.1 Procedimientos de extracción.

En un estudio realizado a partir de aceite de soja desodorizado, mezclan el aceite con hexano y gel de sílice formando una especie de pasta a la cual se le realiza una extracción soxhlet, utilizando hexano en la que los lípidos menos polares (tocoferoles) quedan disueltos en este disolvente. Luego a la pasta que queda rica en lípidos polares (que contiene los fitoesteroles y/o sus ésteres retenidos

22 sobre el gel de sílice) se le realiza una extracción con acetato de etilo, y queda una fracción de lípidos polares que más tarde será sometida a una saponificación en la que se separará la materia saponificable de la insaponificable, en esta última están presentes los fitoesteroles (Kasim et al., 2010).

En este caso, las semillas de girasol se les eliminaron la humedad en un horno y posteriormente se les hizo la extracción soxhlet en hexano. Cuando obtenemos el aceite, se hace una saponificación utilizando KOH, la materia insaponificable resultado de la saponificación se sometió a cromatografía en capa fina y cuando los analitos se separaron, se raspó las bandas correspondientes a los fitoesteroles y se disolvieron en diclorometano (Fernández-Cuesta et al., 2010).

En muestra la aceituna se trituró ésta en un molino y luego la pasta se centrifuga en un decantador de dos fases. El aceite se saponificó con KOH y se separó la fracción saponificable de la insaponificable en la que se encuentran los fitoesteroles. Por último, los esteroles de la fracción insaponificable se separan por cromatografía en capa fina de gel de sílice (Tekayaet al., 2012).

Se extrajeron fitoesteroles en otra ocasión en aceite de canola, que es extraído del fruto por diferentes métodos (extracción con solventes, prensado en caliente y prensado en frío). En este estudio se analizan la variación de fitoesteroles dependiendo del tipo de extracción de aceite a las semillas de canola. Al aceite de canola se le añadió un estándar interno y un conjunto de disolventes y se le realizó una extracción en fase sólida (SPE) en columnas que contenían sílice activada (Mirzaee et al., 2013).

Se extraen fitoesteroles (Brasicasterol, ergosterol, 24-metilen-colesterol, campesterol, campestanol, estigmasterol, Δ7-campesterol, Δ5,23-estigmastadienol, clerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-estigmastadienol, Δ7-estigmastenol, Δ7-avenasterol) en aceites comestibles. Se utiliza un patrón interno que en este caso es el α-colestanol y se realiza una saponificación haciendo uso de KOH. A la fracción insaponificable se le realiza una extracción líquido-líquido en un embudo de decantación con un disolvente orgánico (García-Llatas,2021).

23 En otro estudio se procedió a la extracción de fitoesteroles (campesterol, estigmasterol, β-sitosterol) de diferentes tipos de aceites. Para ello se realizó primero una saponificación con KOH. Más tarde la fracción insaponificable se extrajo con hexano y agua destilada y el sobrenadante se secó con nitrógeno.

Se realizó posteriormente una derivatización utilizando bis-trimetilsililtrifluoroacetamida (BSTFA) (Zhang et al., 2020)

Esta vez, (Luana et al. 2018) propusieron saponificación del aceite de oliva por un método asistido con ultrasonido utilizando KOH para extraer los fitoesteroles (Estigmasterol, β-sitosterol). Más tarde se produjo sobre la materia insaponificable una extracción líquido-líquido utilizando éter dietílico.

También se determinaron fitoesteroles (stigmasterol, β-sitosterol) de una muestra de aceite vegetal comestible. Para ello primero se le realizó al aceite una saponificación asistida con ultrasonidos utilizando KOH y más tarde se le realizó una extracción líquido-líquido con hexano (Zhang et al., 2019)

6.2 Extracción por destilación molecular.

La destilación molecular o destilación de ruta corta es una técnica que permite separar compuestos termolábiles a una temperatura más baja que el punto de ebullición utilizando condiciones de alto vacío. La ventaja que tiene esta técnica es que la temperatura de calentamiento (a presión reducida) puede ser mucho más pequeña que el punto de ebullición del líquido a presión estándar. A continuación, se detallará un estudio que empleó dicha técnica (Laboao, 2022).

Se recuperaron fitoesteroles de aceite desodorizado de soja utilizando el método de la destilación molecular. Primero se realizó una saponificación en la que se eliminaros ácidos grasos y se separaron al mismo tiempo los fitoesteroles que estaban unidos a ácidos grasos, quedando libres. A este producto se le realiza la destilación molecular para eliminar más ácidos grasos que puedan quedar libres y se observó un enriquecimiento de fitoesteroles del aceite desodorizado inicial que fue de 3,5 veces. Al producto de la destilación molecular, en el que están presentes tocoferoles y fitoesteroles, se le añade una mezcla de etanol y agua, en la que se forma un lodo rico en fitoesteroles que se filtra. En el filtrado quedan contenidos los tocoferoles (Ito et al., 2005).

24 6.3 Cristalización en disolvente.

Un enfoque para purificar fitoesteroles del destilado desodorizado del aceite de soja, se basa en la diferencia de solubilidad y la polaridad de disolventes para realizar una cristalización del soluto en un disolvente.

Un ejemplo de esta técnica, fue el uso de la cristalización en disolvente en aceite de soja desodorizado de semillas cultivadas en la India, que son sometidas a un refinado químico. De ahí se obtuvo el destilado desodorizado del aceite de soja.

En uno de los métodos de esta memoria, al desodorizado del aceite de soja se le realiza una saponificación. La materia insaponificable será sometida a un proceso de cristalización utilizando agua y hexano. Luego se filtró para obtener la mezcla cruda de fitoesteroles. A esta mezcla cruda de se le hizo una cristalización adicional con la misma cantidad de hexano y agua que al desodorizado del aceite de soja y se filtró una vez más (Khatoon et al., 2009).

Por otra parte, se hizo uso de la técnica de cristalización por disolvente para la extracción de fitoesteroles del desecho desodorizado del aceite de soja. Se sometió a la muestra a una descomposición catalítica con una disolución alcalina para transformar los ésteres (de ácidos grasos) de esteroles en fitoesteroles libres. Luego se añadió una mezcla de acetona y etanol para cristalizar los fitoesteroles y al enfriar cristalizaron y se filtraron a vacío para recuperarlos (Yang et al.,2010).

También se puede realizar una extracción de fitoesteroles del aceite desodorizado de soja. Los ésteres de esteroles se saponifican y quedan libres junto con los fitoesteroles que ya de por sí estaban libres, y se esterifican todos con metilo. Los fitoesteroles quedaron como ésteres metílicos de ácidos grasos.

Más tarde se hizo una cristalización en disolvente utilizando agua-éter de petróleo como solvente (Yan et al., 2012).

6.4 Cromatografía en contracorriente de alta velocidad.

Esta técnica utiliza la fuerza centrífuga para retener la fase estacionaria y es un tipo de técnica cromatográfica de partición líquido-líquido Cromlab (2022). Esta separación tiene como base el coeficiente de partición de los compuestos entre

25 las dos fases. Básicamente, dos fases líquidas inmiscibles entre sí se mezclan para formar un sistema bifásico y se separan múltiples veces, los solutos individuales se aíslan en base a los diferentes coeficientes de reparto de cada compuesto en dicho sistema de doble fase. Una de estas dos fases es la fase líquida estacionaria y la otra es la fase líquida móvil. La fase móvil se va decantando a la salida de la celda y va pasando a otra celda, así sucesivamente.

Las ventajas de este método son las siguientes: Es un método económico, es una técnica muy eficiente, es rápida y se pueden utilizar gran cantidad de solventes (Sneha, 2019).

A continuación, se expondrán algunos ejemplos de estudios en los que se ha empleado este método, cada uno de ellos tiene un determinado sistema bifásico en la que se emplearán diferentes tipos de solventes, una velocidad de rotación determinada y un caudal determinado en la columna.

Podemos utilizar la cromatografía a contracorriente para purificar β-sitosterol, a partir de una mezcla de esteroles de una fuente vegetal, a esta mezcla se le realiza una cromatografía a contracorriente de alta velocidad para aislar el β-sitosterol de los demás fitoesteroles (Zhou et al., 2002).

También se puede usar cromatografía en contracorriente para extraer fitoesteroles de la semilla neem. La semilla de neem seca se molió y 50 g del polvo se maceraron 3 veces con una mezcla de hexano. Esto generó 15 g de aceite soluble en hexano. Al aceite soluble en hexano se le realizó un proceso de saponificación con hidróxido de potasio, en el que se aislaron los ácidos grasos. A la fracción insaponificable se le aplicó cromatografía en contracorriente de alta velocidad para aislar los fitoesteroles aún más de la fracción insaponificable (Gossé et al.,2005)

6.5 Extracción por fluidos supercríticos.

Un fluido supercrítico (SF) define el estado de una sustancia en el que la temperatura y la presión se elevan por encima de sus valores críticos. Los SF poseen las propiedades tanto de un gas como de un líquido y, por lo tanto, existen como un fluido en lugar de un gas o un líquido (Uddinet al., 2015). Una

26 ventaja de la extracción con el CO2, es que este se libera a la atmósfera y con él se puede trabajar en condiciones suaves de temperatura. Esta técnica es sobre todo utilizada para extraer con SF el aceite de semillas oleaginosas teniendo la peculiaridad de que se producen mínimas pérdidas de fitoesteroles en la extracción del aceite de la semilla oleaginosa.

En este caso, se realizó la extracción por fluidos supercríticos (SC-CO2) para la extracción de aceite de semillas de tomate, ajustando el caudal, la temperatura y la presión. El aceite de las semillas de tomate se saponificó con KOH y los fitoesteroles presentes en la fracción insaponificable se analizaron posteriormente (Eller et al., 2010).

Otro ejemplo del empleo de esta metodología en aceite de diferentes tipos de arroces puede encontrarse en bibliografía. Posterior a la extracción por fluido supercríticos se realizó al aceite una saponificación utilizando KOH y la fracción insaponificable se analizó más tarde (Mingyai et al., 2018).

6.6 Procesos enzimáticos.

Las enzimas hacen uso de su estereoselectividad y especificad para catalizar reacciones químicas, lo que puede ser muy útil para la recuperación y aislamiento de fitoesteroles. Esto quedará patente en algunos de los estudios que se expondrán a continuación.

Un buen ejemplo es el uso de una reacción enzimática para purificar fitoesteroles y tocoferoles de aceite de soja desodorizado mediante una reacción enzimática.

En este estudio lo primero que se planteó fue partir del desodorizado del aceite de soja y a este se la realizó una destilación molecular para recuperar los fitoesteroles, entre otros compuestos. Luego se le añadió la enzima Candida rugosa y los fitoesteroles se convertieron a ésteres (de ácidos grasos) de esteroles (acilesteroles). Luego los fitoesteroles se recuperaron como acilesteroles (Watanabe et al., 2004).

27 A continuación, se muestra una tabla resumen de la extracción de fitoesteroles en aceites vegetales. Los diferentes métodos de análisis, se van a explicar en más detalle en los siguientes apartados.

28 Tabla 6.1 Tabla resumen de extracción de fitoesteroles en aceites vegetales y diferentes métodos de análisis

Muestra Nº de

Sin especificar Extracción Soxhlet Saponificación y cromatografía en

Aceituna Sin especificar Trituración de aceituna en un

29

fitoesteroles en técnicas de extracción: 774 y 940 mg fitoesteroles/100 g de aceite

--- (Mirzaee et

30

Sin especificar --- Saponificación y posterior destilación

31

campesterol, 34,3% Beta-sitosterol

Sin especificar --- Descomposición catalítica y posterior cristalización (0,81 %), campesterol (27,72

%), estigmasterol (23,69 %) y β-sitosterol (44,72 %).

32

CG FID Fracción insaponificable:

La fracción insaponificable estuvo constituida por 62,92% de β-sitosterol, 19,17% Δ7-estigmasterol, 15,65% Δ7 avenasterol, 1,18% 4-metilcolest-7-enol, y los compuestos minoritarios son 0,80%

Δ5 campesterol y 0,20% colesterol.

---

Saponificación CG FID 12,30 mg fitoesteroles/ g de aceite.

Composición fitoesteroles del producto final extraido: 33 % de β-sitosterol, 22 % de cicloartenol, 10,4–11 % de estigmasterol, 10–11 % de cicloartenol, 5,2–5,6 % de colesterol, 4,8–5,2 % de campesterol, 0,7–1 % de colestanol y 0,3–0,5 % de brasicasterol

---

(Eller et al., 2010)

33

Saponificación CG FID Media fitoesteroles en

diferentes tipos de arroz:

8,78±0,28 mg fitoesteroles / g de aceite

* CG: Cromatografía de gases; FID: Detector de ionización de llama; HPLC: Cromatografía de líquidos; UV: Detector ultravioleta; SPE: Extracción en fase sólida

34 7. ANÁLISIS DE FITOESTEROLES.

En el análisis de fitoesteroles esta memoria se centrará sobre todo en CG y HPLC porque son las dos técnicas analíticas más importantes en el análisis de fitoesteroles.

7.1 Análisis por cromatografía de gases (CG).

Los fitoesteroles pueden analizarse por CG, sobre todo con detectores como el detector de ionización de llama (FID) o el espectrómetro de masas (MS), este último nos aportará información estructural de los fitoesteroles. Para el análisis de fitoesteroles con CG, la mayoría de veces se realiza una derivatización, en la que los fitoesteroles se transforman en derivados hidrofóbicos adecuados para el análisis por CG. Los fitoesteroles son compuestos termolábiles, por lo que la derivatización hará que mejore su estabilidad térmica, su volatilidad e incluso en algunos casos la sensibilidad en la detección. Esto también a su vez puede ser un inconveniente debido a que se puede producir la pérdida de analitos, más interferencias y además precisa de un tiempo de análisis mayor. Pese a todo lo anterior la CG tiene ventajas, ya que tiene una gran eficacia, se producen picos más estrechos y una mejor separación de los fitoesteroles que con HPLC (García-Llatas, 2021).

Hoy en día es una técnica analítica ampliamente utilizada en investigación, laboratorios universitarios o en la industria debido a su sensibilidad y selectividad.

La instrumentación, básicamente consiste en un inyector, una columna y un detector conectados entre sí. Las columnas empleadas en cromatografía de gases para el análisis de fitoesteroles son las columnas capilares, por tanto, la fase estacionaria es líquida. Es importante resaltar que los analitos o sus productos derivatizados (que es nuestro caso) deben ser térmicamente estables, se separan dependiendo de la volatilidad y además hay que tener en cuenta de que la fase móvil no interacciona con los analitos. Por tanto, los fitoesteroles se separarán dependiendo de la diferencia de volatilidad que presenten unos y otros en esta técnica. Los detectores empleados deben tener una sensibilidad

35 adecuada, buena estabilidad y reproducibilidad, un tiempo de respuesta relativamente rápido y deben ser versátiles (Abelló, 2022)

A continuación, se expondrán dos ejemplos de análisis de fitoesteroles en los que se empleó un CG.

Analizaremos los fitoesteroles presentes en aceite desodorizado de soja. Se realizó una derivatización y el análisis se llevó a cabo por CG con un Hewlett-Packard 5890 (Avondale, PA) conectado a una columna capilar DB1-ht y como gas portador se utilizó el nitrógeno. Al final se obtuvo una pureza y recuperación del 97,2 % y 86,3 %, respectivamente (Watanabe et al., 2004).

En este segundo estudio también se realizará el análisis de fitoesteroles provenientes de aceite de soja a los que se les ha hecho una derivatización haciendo uso de un CG, con una columna capilar HP-5 para analizar la pureza de los esteroles. Esto dio un resultado de pureza del 91,82% la primera cristalización, 2º 92,73 y 3º 97,17% y un rendimiento en la primera cristalización del 22,95% de fitoesteroles (Yang et al., 2010).

En los dos estudios anteriores los autores no detallan el tipo de detector usado.

A continuación, se detallarán los detectores más utilizados en CG para el análisis de fitoesteroles, que son el detector FID y el de MS y señalaremos estudios en los que se han empleado respectivamente cada uno de ellos.

7.1.1 Cromatografía de gases con un detector de ionización de llama acoplado (CG-FID)

Este detector es considerado universal para compuestos orgánicos, y es el detector más importante de la CG actual, por supuesto es el detector más empleado en CG para el análisis de fitoesteroles. En este detector, la corriente gaseosa que sale de la columna pasa por una llama compuesta de hidrógeno y aire. El detector destruye la muestra que sale por la columna utilizando la llama y se producen en esta combustión iones y partículas cargadas que son responsables del paso de una corriente iónica débil entre dos electrodos (Abelló, 2022).

36 Figura 7.1. Cromatógrafo de gases con un detector de ionización de llama (CG-FID). Fuente:

(LECO, 2022)

A continuación, se expondrán algunos estudios en los que la detección se ha llevado a cabo mediante CG-FID para el análisis de fitoesteroles.

En este caso a los fitoesteroles extraídos del aceite de soja desodorizado se les realizó una derivatización y un posterior análisis con un CG que usa una columna de gel de sílice fundida, un detector FID y un gas portador que es nitrógeno. Se concluyó que el desodorizado del aceite de soja contiene un 9,75%±0,12 % de fitoesteroles libres (campesterol, estigmasterol y β-sitosterol), y con el tratamiento aplicado se convirtió en un producto final enriquecido que contiene 55,5%±0,56% fitoesteroles libres. La recuperación total de fitoesteroles fue del 94±0,19% (Kasim et al., 2010).

En otra muestra como por ejemplo semillas de girasol, los fitoesteroles extraídos del aceite de girasol se someten a una derivatización y posteriormente se realiza el análisis en un CG equipado con un FID, un inyector PTV (vaporización a temperatura programada), una columna capilar HP-5 y el gas portador es el hidrógeno. Se comprobó que el contenido medio de fitoesteroles del aceite fue de 4704 mg/kg de aceite (Fernández-Cuesta et al., 2010).

En otro estudio se analizaron los fitoesteroles del aceite de oliva que se derivatizaron y se analizaron mediante cromatografía de gases con un detector FID y el gas portador fue el helio. El resultado fue que el contenido en fitoesteroles era de 1935,34 mg/kg (Tekayaet al., 2012).

37 Por otro lado, (Mirzaee et al., 2013) emplearon un método CG-FID para analizar una muestra de aceite de canola. Cuando se les realiza la derivatización a estos fitoesteroles, se analizan mediante una columna capilar de sílice fundida, y como gas portador se seleccionó hidrógeno. La media en fitoesteroles (Brasicasterol, campesterol, estigmasterol y Sitosterol) de todos los métodos de extracción del aceite de canola que se siguieron fue aproximadamente de entre 774 y 940 mg/100 g de aceite.

37 Por otro lado, (Mirzaee et al., 2013) emplearon un método CG-FID para analizar una muestra de aceite de canola. Cuando se les realiza la derivatización a estos fitoesteroles, se analizan mediante una columna capilar de sílice fundida, y como gas portador se seleccionó hidrógeno. La media en fitoesteroles (Brasicasterol, campesterol, estigmasterol y Sitosterol) de todos los métodos de extracción del aceite de canola que se siguieron fue aproximadamente de entre 774 y 940 mg/100 g de aceite.