ROOH, Hidroperóxid
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.3 Proceso de selección
El primer grupo (pacientes diagnosticados con SM) se seleccionó en el Hospital Universitario San Ignacio (Bogotá D.C.), el segundo grupo lo conformaron individuos saludables
(controles) con igual número, distribución por género, edades y de condiciones socioeconómicas similares.
Dado que las variables estudiadas no tuvieron antecedentes de supuesto de normalidad, se seleccionaron 100 pacientes (50 hombres y 50 mujeres) para la realización del estudio. La razón teórica de esta decisión tuvo como base el teorema del límite central cuya aplicación afirma que con tamaños de muestras superiores a 30, los análisis de normalidad de las variables tendrían confiabilidad (Mood, 1980). Se debe recordar también, que al aumentar el tamaño de la muestra se reduce el error estándar de estimación de los parámetros en estudio. Por ello, una muestra de 100 individuos se constituye en un conjunto apropiado para hacer la investigación que se propuso (Mood, 1980).
A los grupos en estudio, se les comunicó acerca de las características e importancia del estudio y se obtuvo su consentimiento por escrito (Anexo I y II), el cual sigue las directrices establecidas por la Legislación Colombiana (previa aprobación del comité de Bioética) (Londoño, et al., 1993). (Anexo III). Se les aplicó una encuesta, en donde se indagó, acerca de los antecedentes médicos, personales y familiares, y se constató que cumplieran con los criterios de inclusión.
Criterios de inclusión Grupo 1
• Pacientes con SM con edades entre 18 y 80 años
• Presentar tres de los cinco factores recomendados por NCEP/ ATP III:
o Obesidad visceral: > 102 cm en hombres y > 88 cm en mujeres o Hipertensión arterial: > 130/85 mm/Hg
o Hipertrigliceridemia: > 150 mg/dL
o HDL-c: ≤ 40 mg/dL en hombres y ≤ 50 mg/dL en mujeres
o Hiperglicemia en ayunas: > 110 mg/dL
Grupo 2 (controles)
• Individuos con edades entre 18 y 80 años que no cumplieron con los criterios del
NCEP/ATP III para definir el SM:
o Glicemia: 70 -110 mg/dL
o Obesidad visceral: < 102 cm en hombres y < 88 cm en mujeres o Triglicéridos: ≤ 150 mg/dL
o HDL-c: Hombres ≥ 40 mg/dL; Mujeres ≥ 50 mg/dL.
5.4 Procedimiento
La determinación de la presencia de HTA y de obesidad se realizó bajo la medición de estas variables al momento de la obtención de la muestra de sangre. La primera se constató mediante un tensiómetro marca Wychallen. La medición del perímetro de cintura se realizó con una cinta métrica paralela al suelo estando el paciente de pie. La cinta se ubicó sobre la piel y alrededor del abdomen entre el borde superior de la cresta iliaca y el margen inferior de la última costilla al final de la espiración, sin compresión significativa.
La muestra de sangre se obtuvo por venopunción del pliegue del codo, estando el paciente con ayuno de 8-12 horas y sin dieta previa habitual, evitando ejercicios extenuantes, estrés, entre otros; se recolectó en tres tubos con anticoagulante EDTA, con heparina y con
acelerador de coagulación (Venojet®) respectivamente. Con el primero, se valoró la
hemoglobina total. El tubo que contenía heparina se centrifugó para separar los glóbulos rojos. Éstos se hemolizaron para determinar las actividades de la CuZn-superóxido dismutasa (CuZn-SOD) y la Selenio-glutatión peroxidasa (Se-GPx); en el plasma, se cuantificó el estado antioxidante total (TAS). Los que contenían acelerador de coagulación se centrifugaron dentro de las dos horas de efectuada la extracción, y en el suero, se valoró la glicemia, el ácido úrico y el perfil lipídico (colesterol total, triglicéridos, HDL-c: contenido de colesterol en las HDL; LDL-c: contenido de colesterol en las LDL, y las apolipoproteínas A-I y B100).
Los fundamentos de las técnicas utilizadas se describen a continuación: GLICEMIA
Técnica: Trinder
Laboratorio: Siemens Fundamento
La glucosa es transformada por la glucosa oxidasa (GOD), en ácido glucónico y peroxido de hidrogeno, el cual, en presencia de peroxidasa (POD), oxida el cromógeno (4- aminofenazona/fenol) convirtiéndolo en un compuesto de color rojo (Quinonimina).
GOD
Glucosa + O2 Acido glucónico + H2O2 POD
H2O2 + Fenol + 4-aminofenazona/fenol Quinonimina coloreada + 2 H2O
ÁCIDO ÚRICO
Técnica: Fossati et al.
Laboratorio: Siemens Fundamento
El ácido úrico es convertido por la uricasa en alantoina y peróxido de hidrogeno, el cual, en presencia de enzima peroxidasa, oxida el cromógeno (4-aminofenazona/ácido 3,5 dicloro-2- hidroxibencenosulfónico) formando un compuesto rojo.
Uricasa
Acido úrico + O2 + 2H2O Alantoína + H2O2 + CO2
2 H2O2 + 4-aminofenazona/ácido 3,5 dicloro – 2 – hidroxibencenosulfónico
Peroxidasa Cromógeno + 2 H2O HEMOGLOBINA Técnica: Cianometahemoglobina Laboratorio: Siemens Fundamento
Los glóbulos rojos reaccionan con el reactivo de Drabkin (cianuro y ferrocianuro potásico), el ferricianuro de potasio oxida la hemoglobina a metahemoglobina, la cual, a su vez, por
medio del cianuro de potasio se convierte en cianometahemoglobina. La intensidad de color de este compuesto se mide fotocolorimétricamente a una longitud de onda de 540nm. Hemoglobina + Ferrocianuro de potasio Metahemoglobina
Metahemoglobina + Cianuro de potasio Cianometahemoglobina (compuesto coloreado).
ANTIOXIDANTES TOTALES (TAS) Técnica: Millar, N.J, 1993.
Laboratorio: Randox Fundamento
El (2,2 – azino –di [3-etilbenzotiazolin sulfonato]) ABTS se incuba con peroxidasa
(metamioglobina) y H2O2 para originar el radical catión ABTS+. Éste desarrolla coloración
verde- azulada relativamente estable, que se mide a 600 nm. La presencia de oxidantes en la muestra genera supresión de ésta coloración, proporcional a la concentración de antioxidantes.
HX-Fe III + H2 X- (FeIV = 0) + H2O
ABTS + X-(fe IV = 0 ) ABTS + + HX – Fe III HX-Fe III = metamioglobina
X- (FeIV =0) =ferrilmioglobina
ABTS = 2,2- Azino-di-(3-etilbenztiazolina sulfonato)
CuZn-SUPERÓXIDO DISMUTASA Técnica: Wooliams JA.
Fundamento
Este método emplea xantina y xantina oxidasa (XOD) para generar radicales superóxidos que reaccionen con 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenol)-5-phenyltetrazolium clorido (I.N.T.) para originar el colorante rojo formazán. La CuZn-SOD presente en la muestra compite con el INT por los radicales superóxido, y por tanto, inhibe la producción del colorante formazán. La actividad de la enzima es medida por el grado de inhibición de esta reacción:
XOD
Xantina Ácido úrico + O2-
O2
-
INT Colorante de formazán
SOD
2 O2- + 2H+ O2 + H2O2
GLUTATIÓN PEROXIDASA- Se Técnica: Plagia, D.E y Valentine, W.N
Laboratorio: Randox Ltd. Fundamento
En presencia de la glutatión reductasa (GR) y de NADPH, el glutatión oxidado (GSSG) es inmediatamente convertido a la forma reducida con una oxidación concomitante de NADPH
a NADP+. Se mide la disminución de la absorbancia a 340 nm.
GPx
2GSH (Glutatión) + ROOH ROH + GSSG + H2O GR
CONVERSIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE CuZn-SOD Y DE Se- GPx (U/L) A GRAMOS DE HEMOGLOBINA (U/gHb)
Las actividades de las enzimas antioxidantes eritrocitarias CuZn-SOD y la Se-GPx se relacionaron con los gramos de hemoglobina existentes (U/gHb).
CuZn-SOD U/L = CuZn-SOD U/gHb g/Hb/dL
Se- GPx U/L = Se- GPx U/gHb g/Hb/dL
TRIGLICÉRIDOS
Técnica: Wahlefild A.W.
Laboratorios: Siemens Fundamento
El glicerol liberado en la hidrólisis de los triglicéridos catalizada por la lipoproteinlipasa (LPL), se convierte mediante la glicerolcinasa (GK), en glicerol-3-fosfato, que se oxida a dihidroxiacetona-P y peróxido de hidrógeno (H2O2), en presencia de la enzima glicerolfosfato oxidasa (GO). Mediante la peroxidasa, el peroxido de hidrogeno oxida el cromógeno (4aminoantipirina/p-clorofenol) originando un compuesto de color rojo.
LPL
Triglicéridos Glicerol + Ácidos grasos GK
Glicerol + ATP Glicerol-3-P + ADP GO
Glicerol-3-P + O2 H2O2 + dihidroxiacetonafosfato PO
COLESTEROL TOTAL Técnica: Kloses Shiumberger.
Laboratorios: Siemens Fundamento
Los ésteres de colesterol (EC) son hidrolizados por la enzima colesterol éster hidrolasa originando colesterol libre (CL) y ácidos grasos. El CL existente, conjuntamente con el producido por la reacción, es oxidado por la colesterol oxidasa, originando ∆4 colestenona y peroxido de hidrogeno. Éste en presencia de peroxidasa, oxida el cromógeno (4aminoantipirina/fenol) compuesto de color rojo.
CE
Colesterol esterificado + H2O Colesterol libre + ácidos grasos
CO
Colesterol + O2 ∆4 colestenona + H2O2
PO
2 H2O2+ 4 aminoantipirina + Fenol Quinonimina + 4 H2O
COLESTEROL- HDL Técnica: Finley, Wamick.
Laboratorios Siemens Fundamento
Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) se separan de los quilomicrones, de las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) por la adición de un reactivo precipitante (ácido fosfotúngstico/cloruro de magnesio) al suero o al plasma. Después de centrifugar, se determinará el contenido de colesterol en la fracción HDL que permanece en el sobrenadante, por el método colorimétrico enzimático descrito anteriormente.
COLESTEROL- LDL
Técnica: Bursntein y Sanoillei
Laboratorio: Siemens Fundamento
Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) se precipitan específicamente mediante la heparina. Tras la centrifugación las HDL y las VLDL permanecen disueltas en el sobrenadante. El colesterol ligado a ellas, se determinará empleando el método de colesterol descrito anteriormente. Para valorar el LDL se utilizará el siguiente cálculo.
LDL colesterol = Colesterol total – colesterol en el sobrenadante.
VLDL-Colesterol
El contenido de colesterol en las VLDL se calculó por la fórmula de Friedewald, et al: TG/5.
APOLIPOPROTEÍNAS A-I y B100 Técnica: Brustolin D. Materna M.
Laboratorio: Siemens Fundamento
Cuando la proteína que se va a analizar (antígeno) reacciona con un anticuerpo específico, se forma rápidamente inmunocomplejos precipitantes en presencia de polietilenglicol. Si los anticuerpos están en exceso, estos precipitantes promueven turbidez que está en relación con la concentración de la proteína en la muestra. La turbidez se medirá fotométricamente a una longitud de onda de 340 nm.
Para la valoración de las muestras se realizó, previamente, una curva de calibración con diversos calibradores. La turbidez se midió fotométricamente a una longitud de onda de 340 nm.
Las valoraciones se realizaron en el instrumento RA50 en el Laboratorio de la Especialización de Bioquímica Clínica. Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá DC.
El control de calidad se ejecutó mediante la utilización de controles normales y anormales de concentración conocida (Sera-Check - Siemens). Éstos son sueros controles liofilizados, estables, diseñados para comprobar la exactitud de los diferentes analitos a valorar, y están
preparados a base de sueros humanos.Para inspeccionar la eficiencia de los instrumentos,
se emplearon calibradores de concentración conocida (Siemens). Todas las valoraciones se realizaron por duplicado (estándares, muestras, controles de calidad).