Proteínas

Aislamiento de proteínas totales

Se siembran células RWPE-1 (500.000 células/pocillo), LNCaP (300.000 células/pocillo) y PC3 (300.000 células/pocillo) en placas P-6. Tras los diferentes tratamientos, las células se lavan con PBS, a 4 ºC y se levantan con un raspador. Se centrifugan a 500 x g, a 4 ºC, durante 5 min. El precipitado se resuspende con tampón lisis 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5); 1 mM de EDTA; 0,5 M de NaCl; 2 mM de PMSF; 5 µg/ml de inhibidores de proteasas (aprotinina, leupeptina y pepstatina), durante 30 min en hielo y con agitación ocasional. Tras la incubación, se centrifugan a 4.000 x g, 5 min a 4 ºC y se recoge el sobrenadante que se guarda a -80 ºC para su posterior utilización. La concentración de proteínas obtenida se valora mediante el método de Bradford.

Aislamiento de citosoles y núcleos

Se siembran células PC3 (300.000 células/pocillo) en placas P-6. Una vez realizados los diferentes tratamientos, las células se lavan con PBS a 4 ºC, se levantan con un raspador y se centrifugan a 500 x g a 4 ºC durante 5 min. A continuación, se emplea un kit comercial NE-PER® _{Nuclear and Cytoplasmic}

Extraction Reagents de Thermo Scientific. Una vez eliminado el PBS se añade a

cada muestra 50 µl de tampón de extracción citoplasmática I (CER I), y se mantienen a 4 ºC durante 10 min, con agitación ocasional. Tras la incubación, se añaden 2,3 µl de tampón de extracción citoplasmática II (CER II), y se deja a 4 ºC, durante 1 min. La suspensión de células se centrifuga a 16.000 x g, 5 min a 4 ºC, obteniéndose en el sobrenadante el extracto citosólico. A continuación, el precipitado se resuspende en 25 µl de tampón de extracción nuclear (NER), y se incuba a 4 ºC durante 40 min, con agitación cada 5 min. Tras este periodo, se centrifuga a 16.000 x g, 10 min, obteniendo el sobrenadante que corresponde con la fracción nuclear. Ambas fracciones se guardan a -80 ºC para su posterior utilización. La concentración proteica se valora utilizando el método de Bradford.

Inmunodetección de proteínas

Las proteínas totales aisladas (20-50 µg) se mezclan con tampón de carga que contiene, 50 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 10% v/v de glicerol, 3% p/v de SDS, 0,01% de azul de bromofenol y 0,7 M de β-mercaptoetanol, y se desnaturalizan durante 5 min, a 95º C. A continuación, se separan por electroforesis utilizando geles de acrilamida/bisacrilamida en geles al 8%, 10% ó 12%, en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), a temperatura ambiente. Finalmente, se transfieren a una membrana de nitrocelulosa durante toda la noche, a 4 ºC y 25 V o a 70 V, durante 1,5 h. La membrana se incuba, 5 min, con

una solución con rojo Ponceau al 0,25% mezclada con TCA al 5% para verificar la correcta transferencia de proteínas del gel a la membrana, y a continuación, se lava para retirar el exceso con PBS.

La membrana se incuba con el tampón de bloqueo TBS (pH 7,6) o PBS, 5% leche desnatada y 0,05% Tween-20, para evitar las uniones inespecíficas a la misma, durante 1 h a temperatura ambiente. Tras el bloqueo se incuba con el anticuerpo primario durante 1-2 h a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4 ºC. Transcurrido el tiempo, la membrana se lava con PBS y se incuba con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con peroxidasa de rabano (1:4.000), 1 h a temperatura ambiente. Por último, se lava de nuevo la membrana y se incuba con el sustrato de la peroxidasa del sustrato de quimioluminiscencia, durante 1 min. A continuación, se expone la membrana con películas fotográficas CURIX. El análisis densitométrico de las bandas se realiza con el programa Quantity One (BioRad). Los datos se normalizan con la cantidad de β-actina, utilizada como control de carga. Las concentraciones de los anticuerpos primarios, así como el anticuerpo secundario correspondiente aparecen en la siguiente tabla:

Anticuerpo 1º Dilución 1º Anticuerpo 2º

STAT3 (F-2) 1:100 Ratón p-STAT3 (F-2) 1:100 Ratón β-catenina 1:2.000 Ratón Bcl2 (100) 1:1.000 Ratón Bax (N-20) 1:500 Conejo EGFR (sc-3) 1:1.000 Conejo HER-2 (sc-284) 1:500 Conejo

p-HER2 (Tyr1248) 1:1.000 Conejo

p-EGFR (Tyr1173) 1:500 Ratón PKC-α (C-20) 1:500 Conejo PKC-βI (C-16) 1:500 Conejo PKC-βII (C-18) 1:500 Conejo PKC-ζ (C-20) 1:500 Conejo PKC-δ 1:250 Ratón TACE (C-15) 1:500 Conejo p-Src (Tyr416) 1:2.000 Conejo p44/42 (Erk1/2) 1:1.000 Conejo p-p44/42 (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) 1:1.000 Ratón p53 1:2.000 Conejo GHRH 1:100 Conejo p-GHRH-R 1:2.000 Conejo SVs (SV1-SV2-SV4) 1:2.000 Conejo MMP9 1:5.000 Conejo MMP2 1:2.000 Conejo PCNA 1:10.000 Ratón E-cadherina 1:2.000 Ratón

β-actina 1:20.000 (Toda la noche) 1:8.000 (1 h)

Ratón

Inmunocitoquímica

Se siembran 40.000-60.000 células/pocillo sobre cristales tratados y estériles de 12 mm2_{, colocados en placas P-24, y se mantienen durante 24 h para}

que se adhieran. Se realizan los diferentes tratamientos y, a continuación se retira el medio de cultivo de los pocillos y se lavan con PBS. Para fijar las células a los cristales, se utiliza p-formaldehido al 4% (pH 7,4) durante 25 min a temperatura ambiente. Una vez fijadas, se lavan con PBS y se permeabilizan con Tritón X-100 al 0,1% durante 10 min a temperatura ambiente. Finalmente, se lavan con PBS y se procede a la inmunodetección con los anticuerpos específicos. Las células se someten a un bloqueo con BSA al 3%, en PBS a 37 ºC, para prevenir las uniones inespecíficas. Tras el bloqueo, se incuba con los anticuerpos primarios frente a p-GHRH-R y SVs (dilución 1:500) durante 2 h, a 37 ºC, en atmósfera húmeda.

Seguidamente, se realizan lavados con PBS y se incuban con el anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con Alexa 488 durante 1 h en oscuridad y en las mismas condiciones que los anticuerpos primarios. A las muestras que se utilizan como control negativo no se les añade el anticuerpo primario. Una vez finalizada la inmunodetección, los cristales se colocan en un portaobjetos adheridos con líquido de montaje con DAPI (4´,6´-diamino-2-fenilindol) Fluorsave ReagentTM _{de Invitrogen, que se une al DNA y tiñe los núcleos de}

color azul. Las preparaciones se visualizan en un microscopio confocal de fluorescencia Leica TCD SP5 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania) para su posterior análisis.

Zimografía

Se siembran 50.000 células/pocillo en placas P-6. Transcurridas 24 h, se retira el medio, se les añade medio condicionado y se realizan los diferentes tratamientos. Una vez finalizados, el medio secretado se recoge y se guarda a – 80 ºC hasta su uso.

A continuación, se realiza una electroforesis de acrilamida/bisacrilamida SDS-PAGE al 10% con 3 µg de proteínas, cuyo gel se copolimeriza con 0,1% de gelatina (Sigma Aldrich). Posteriormente, se realizan cuatro lavados del gel para conseguir eliminar el SDS: dos de 30 min cada uno, con Tris- HCl 50 mM (pH 7,4) y 2,5% de Tritón X-100 y dos lavados de 10 min cada uno, con Tris-HCl 50 mM. Una vez finalizados, el gel se incuba toda la noche a 37 ºC, en agitación, con un tampón de incubación que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), CaCl2 10

mM, NaCl 0,15 M, 0,1% de Tritón X-100 y 0,02% de azida sódica. Después de la incubación, los geles se tiñen durante 30 min con 0,25% de azul Coomassie R- 250, y se destiñen con la solución de destinción que contiene 7,5% de ácido acético y 20% de metanol, apareciendo las bandas blancas sobre un fondo azul, donde las enzimas han degradado la gelatina. El análisis densitométrico de la actividad de las metaloproteasas 2 y 9 se realiza con el programa Quantity One (BioRad).

ELISA para valorar VEGF

Se siembran 40-80.000 células/pocillo en placas P-24. Una vez finalizados los diferentes tratamientos, se recoge el medio de cultivo y se procede a cuantificar los niveles de VEGF165. Para ello, se emplea un kit de ELISA (R&D system), donde se incuba el anticuerpo primario en una placa de 96 pocillos, durante toda la noche a temperatura ambiente, para que se adhiera a la base. A continuación se lava con PBS y Tween-20 al 0,05%; los lavados se deben repetir después de cada uno de los pasos del ELISA. A continuación, se procede al bloqueo de las uniones inespecíficas incubando, durante 1 h, con BSA al 1% en PBS. Para cuantificar los niveles de expresión se realiza una curva patrón cuyo rango oscila entre 0-4.000 pg/ml siguiendo las indicaciones del fabricante. Una vez finalizado el bloqueo y los sucesivos lavados, se añaden las diluciones conocidas del patrón y las muestras a analizar. Todos los ensayos se

realizan por duplicado. Tras 2 h de incubación, se lavan los pocillos y se añade el anticuerpo secundario conjugado con biotina, que reconocerá a la isoforma

VEGF165, durante 2 h. A continuación y en ausencia de luz, se añade el complejo

estreptavidina-peroxidasa durante 20 min. Una vez finalizado este tiempo, se añade la solución sustrato de la enzima peroxidasa durante 1 h, que contiene H2O2 y ABTS (2,2´-acinobis-[3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico]) que

permite visualizar la reacción. La absorbancia se mide a 405 nm en un espectofotómetro.