CONSERVACIÓN
DEL MICROSCOPIO
Una vez estudiados los componentes del microscopio y las principales caracterís- ticas ópticas del mismo repasaremos las instrucciones básicas para el correcto manejo y conservación de este instru- mento.
El microscopio debe situarse en una super- ficie completamente horizontal, exenta de vibraciones y movimientos. Los oculares deben quedar a la altura de los ojos del observador. Cuando se hace uso de un microscopio hay que tener en cuenta que se está utilizando un instrumento de preci- sión, y que como tal debe ser manipulado con extremo cuidado. En el caso de que
sea necesario transportarlo, el microscopio debe asirse por la base o por la columna y nunca por el tubo o platina, ya que podrían dañarse los engranajes de los tornillos de enfoque u otros elementos mecánicos del mismo. El polvo es un gran enemigo de la óptica. En caso de que las lentes de los objetivos, oculares o conden- sadores se ensucien, deben limpiarse suavemente con papel de lente o con un pincel limpio. También la exposición a dife- rentes agentes químicos puede dañar las lentes y otros componentes del micros- copio. En los periodos en los que no se esté usando, el microscopio debe ser protegido del polvo mediante el empleo de una funda o estuche.
Respecto a los objetivos, éstos deben estar colocados en el revólver en orden progresivo de aumento y nunca debe tocarse con la mano la lente que sobre- sale de ellos. Asímismo, es necesario evitar que las preparaciones utilizadas choquen con los objetivos, puesto que se podría dañar la preparación o el propio objetivo. Para ello, siempre que se suba o baje la platina haciendo uso del tornillo macro- métrico se debe mirar la preparación direc- tamente (no a través de los oculares). En ningún caso deben forzarse los elementos mecánicos del microscopio. Los mandos de desplazamiento de la platina, de los tornillos de enfoque y del condensador tienen un recorrido limitado por lo que si se fuerzan pueden dañarse los engranajes que accionan.
La primera operación que se debe realizar cuando se va a usar un microscopio es adaptar la distancia entre los oculares a la distancia interpupilar del usuario. Con ello se consigue una total fusión de las imágenes de ambos oculares y se reducen los efectos de la fatiga tras una observa- ción prolongada. La postura correcta durante la observación microscópica consiste en permanecer sentado en una postura cómoda con los ojos ante los 48
oculares, mientras se acciona con una mano el tornillo micrométrico para realizar continuos enfoques y con la otra se desplaza la preparación mediante los torni- llos de desplazamiento del portaobjetos. No se debe olvidar que la muestra a observar tiene tres dimensiones y, por tanto, la función de reenfocar continua- mente con el tornillo micrométrico no es otra que la de enfocar sucesivamente los distintos planos de las estructuras de la muestra.
Procedimiento de enfoque
A continuación, se detallan una serie de pasos para conseguir un enfoque correcto y seguro, evitando posibles accidentes que pudieran deteriorar la preparación o incluso el microscopio. Se debe comenzar el proceso de enfoque colocando la platina en su posición más baja. Para ello debe girarse el tornillo macrométrico en sentido horario hasta el final de su recorrido. A continuación, puede colocarse la muestra en la platina, sujetándola con las pinzas del portaobjetos. Es preciso asegurarse de que el portaobjetos está en la posición correcta, es decir, el portaobjetos debe estar situado en posición inferior, con el cubreobjetos en la parte superior (véase Cuadro 2.3). La muestra a observar debe encontrarse en el centro de la abertura de la platina. Si la preparación no estuviese centrada, se debe hacer uso de los torni- llos de desplazamiento del portaobjetos en el plano horizontal para situar la prepara- ción en la posición adecuada. Una vez que la preparación esté centrada se debe girar el revólver portaobjetos para seleccionar el objetivo de menor aumento. Mirando la preparación directamente, se girará el tornillo macrométrico en sentido antiho- rario con el fin de acercar el objetivo a la preparación, sin llegar a tocarla. A partir de este momento, se debe mirar a través de los oculares mientras se hace
descender la platina lentamente, accio- nando el tornillo macrométrico en sentido horario, hasta que la imagen aparezca más o menos enfocada. Tras haber realizado un enfoque grueso puede realizarse un enfoque fino accionando el tornillo micro- métrico hasta que puedan apreciarse con nitidez los detalles de la imagen. El ajuste continuo del tornillo micrométrico durante la observación de la preparación nos permitirá observar detalles situados en distintos planos de profundidad. Una vez conseguido un buen enfoque de una zona concreta de la preparación, se pueden explorar otras regiones de la misma haciendo uso de los tornillos de desplaza- miento horizontal. Para realizar una explo- ración sistemática y ordenada se puede seguir el recorrido que se muestra en la Figura 2.5.
En el caso de que se desee observar la preparación con un objetivo de mayor aumento, sólo es necesario situar la zona de interés en el centro del campo visual y, sin mover la platina, girar el revólver hasta colocar el objetivo deseado en posición (la mayoría de los microscopios disponen de unos topes en el revólver que producen un leve chasquido cuando el objetivo ocupa la posición correcta entre el ocular y el objeto). Como normalmente los objetivos son parafocales, al observar la preparación con un objetivo de mayor aumento sólo será necesario realizar un ajuste fino del enfoque girando ligeramente el tornillo
Figura 2.5. Recorrido a seguir para la exploración sis- temática de las distintas muestras de un portaobjetos.
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micrométrico. Hay que recordar que el objetivo 100x (banda blanca) es un obje- tivo de inmersión, y por lo tanto, no se debe hacer uso de éste sin emplear aceite de inmersión (véase el apartado siguiente). Si se intenta enfocar con este objetivo sin seguir el procedimiento adecuado, existe una alta probabilidad de que se dañen la preparación y el objetivo.
Una vez terminada la observación de las muestras y antes de retirar la preparación es preciso cambiar sucesivamente los objetivos, hasta colocar el de menor aumento. A continuación debe hacerse descender la platina hasta el final de su recorrido, tras lo cual se puede retirar el portaobjetos.
Enfoque con objetivos de inmersión
La mayoría de los objetivos permiten trabajar con aire como medio de separa- ción entre la lente y el cubreobjetos (obje- tivos secos). Sin embargo, los objetivos de inmersión precisan un medio de separa- ción cuyo índice de refracción se asemeje más al de la lente (por ejemplo aceite de cedro), que el del aire. La reducción de la diferencia entre el índice de refracción del medio y el de la lente conlleva un aumento de la apertura numérica del objetivo. A continuación se detallan los pasos que han de seguirse en el empleo de los obje- tivos de inmersión:
1. Localización del área objeto de estudio.
Para enfocar la muestra con un objetivo de inmersión debe partirse de una situa- ción en la que la preparación se encuentre perfectamente situada y enfocada con el objetivo que precede al de inmersión en el revólver. La zona de la muestra que inte- resa observar debe situarse cuidadosa- mente en el centro del campo visual. De otra forma será sumamente difícil localizar las estructuras a estudiar ya que el campo
visual y la distancia frontal (distancia que separa la lente de la preparación) son muy reducidos. Asimismo, deben regularse cuidadosamente el grado de iluminación, la altura del condensador y la apertura del diafragma iris, parámetros que son deter- minantes cuando se usan objetivos de gran aumento.
2. Aplicación del aceite.
Antes de aplicar el aceite de inmersión debe girarse el revólver hasta colocarlo en una situación intermedia entre el objetivo de inmersión y el siguiente de menor aumento. De esta forma se consigue dejar espacio suficiente para aplicar el aceite en la zona a observar. Con el revólver en esta posición puede aplicarse una gota de aceite de inmersión directamente sobre el cubreojetos, en el lugar de la muestra que se quiere observar. En cuanto a la elección del tipo de aceite a emplear es importante seguir las recomendaciones del fabricante del objetivo.
3. Colocación del objetivo 100x.
Una vez aplicada la gota de aceite sobre la preparación puede girarse suavemente el revólver hasta colocar el objetivo de inmersión. Éste no debe tocar la prepara- ción y sí la gota de aceite. La gota debe haber conservado la convexidad y no extenderse por la preparación.
4. Enfoque de la preparación.
Para conseguir enfocar la preparación debe girarse cuidadosamente el tornillo micrométrico. Recuerde que la distancia que separa al objetivo del portaobjetos es mínima, por lo que un leve ajuste debe ser suficiente si la preparación estaba bien enfocada. En el caso de que sea necesario realizar un rastreo de la preparación deben accionarse con suma delicadeza los torni- llos de desplazamiento del portaobjetos en la platina, ya que el campo de visión que se obtiene con los objetivos de grandes aumentos es muy reducido, por lo que un movimiento brusco de la platina produciría la pérdida de la localización deseada. 50
5. Retirada de la preparación.
Una vez que ha finalizado la observación debe colocarse de nuevo el revólver en la posición intermedia entre el objetivo de inmersión y el que le precede. A conti- nuación puede bajarse la platina, retirar el portaobjetos y colocar el objetivo de menor aumento, con lo que el microscopio queda preparado para recibir una nueva prepara- ción. Es necesario recordar que para no dañar la preparación o el propio objetivo, nunca debe retirarse la preparación cuando esté montado el objetivo de inmersión. El objetivo de inmersión debe limpiarse con un papel de óptica inmediatamente después de usarlo. Es importante no dejar que el aceite se seque sobre el objetivo. En ningún caso deben emplearse disol- ventes para limpiar el objetivo.
Ajuste de la iluminación
Para aprovechar al máximo las caracterís-
ticas funcionales del microscopio es impor- tante regular correctamente la iluminación. En una primera toma de contacto con el microscopio es aconsejable comprobar que los haces de luz procedentes de la fuente de iluminación llegan al objetivo. Para este propósito puede colocarse un papel en la platina, entre la preparación y el objetivo, y comprobar si se proyecta sobre él un punto de luz. Algunos micros- copios poseen un diafragma de campo que permite cerrar el cono de luz. Si se cierra el diafragma se observará que dismi- nuye el diámetro del punto luminoso. Una vez comprobado el buen funciona- miento de la fuente de iluminación, conviene realizar los ajustes de iluminación de Köhler. August Köhler diseñó en 1874 un protocolo mediante el cual se consiguen unas condi- ciones óptimas de iluminación, obtenién- dose un campo visual uniformemente ilumi- nado y una imagen brillante y sin reflejos. A continuación se describen los pasos a seguir en el protocolo de Köhler (Fig. 2.6). En pri-
Cuadro 2.3. Causas más frecuentes de problemas en el enfoque
En algunas ocasiones pueden encontrarse problemas con el enfoque de una preparación. Estos problemas, que suelen aparecer cuando se emplean objetivos de gran aumento, se deben con fre- cuencia a alguna de los siguientes causas:
La preparación está al revés. Se ha colocado el cubreobjetos hacia abajo, hacia la platina. Aunque puede que a pocos aumentos no se detecte, resultará imposible enfocar con objetivos con un aumento superior al de 10x, dado que a partir de estos aumentos la distancia focal de los objeti- vos es tan corta que hace imposible enfocar la muestra a través del grosor del portaobjetos. Siempre que se coloque una preparación en la platina se debe comprobar la posición del cubre- objetos pasando suavemente el dedo por su borde. De esta forma se evitará este común acciden- te que puede dar lugar a la rotura de la preparación, de la lente frontal del objetivo o incluso pro- ducir daños en los elementos mecánicos del enfoque.
El cubreobjetos no tiene el grosor adecuado. Este problema es muy similar al anterior. Para los objetivos de mayor aumento es importante que el grosor del cubreobjetos sea el especificado en el exterior del cilindro. El valor estándar del grosor del cubreobjetos para casi todos los objetivos es de 0.17mm. Este problema puede darse también cuando se han colocado inadvertidamente dos cubreobjetos superpuestos en la preparación o cuando la muestra es demasiado gruesa.
El revólver portaobjetivos no ha encajado correctamente en su nueva posición. Una vez enfoca- da la preparación a pocos aumentos puede resultar imposible observarla a mayor aumento. Puede ser debido a que el revólver portaobjetivos no ha encajado correctamente en su nueva posición al cambiar a un objetivo de mayor aumento. Para evitar este problema debe comprobarse que se pro- duzca un chasquido o sonido característico al cambiar de un objetivo a otro.
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mer lugar se debe colocar una preparación sobre la platina. Acto seguido, es preciso abrir al máximo el diafragma de campo de la fuente de iluminación y el del condensador y colocar este último en el punto más alto de su recorrido. Una vez realizados estos ajus- tes debe seleccionarse el objetivo de menor aumento, regular la intensidad de la luz en un nivel en el que se pueda observar y enfocar la preparación con comodidad (Fig. 2.6A). Una vez que la preparación se encuentre totalmente enfocada es nece- sario reducir al máximo la apertura del diafragma de campo y bajar el condensador hasta que se aprecien los contornos del cír- culo de luz proyectado sobre la preparación con los contornos del diafragma bien defini- dos (Fig. 2.6B). En el caso de que el círculo de luz no se encuentre centrado debe hacerse uso de los tornillos de centrado del condensador hasta conseguir un buen ajuste (Fig. 2.6C). Una vez centrado el cír- culo en la imagen, puede abrirse el dia- fragma de campo hasta que los bordes del diafragma coincidan con los bordes de la imagen (Fig. 2.6D). Realizados estos pasos sólo queda conseguir un buen contraste de la imagen (Fig. 2.6E). En la mayoría de los casos esto se consigue modificando la aper- tura del diafragma hasta alcanzar unas dos terceras partes del diámetro de la apertura del objetivo. Puesto que normalmente los microscopios llevan incorporados objetivos parafocales, para cambiar a objetivos de mayores aumentos sólo es necesario reali- zar pequeños ajustes en la apertura del dia- fragma del condensador y en el ajuste micrométrico del enfoque.
Mediciones
Algunos microscopios cuentan con dispo- sitivos que permiten realizar mediciones y localizar estructuras en las muestras observadas. Los dos sistemas más usados son las escalas graduadas o micrómetros y las retículas de los oculares.
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Los micrómetros consisten en la combi- nación de dos escalas situadas en la platina, perpendiculares entre sí. Cada una de estas escalas consta a su vez de una escala principal (calibrada en milímetros) y una pequeña escala de 9 mm de longitud denominada nonious o escala de Vernier (Fig. 2.7). La escala de Vernier está divi- dida en 10 partes iguales, cada una de las cuales corresponde a 9/10 mm. La lectura de esta escala se realiza anotando el valor de la escala principal entre los que se sitúa el valor cero de la escala nonious. La posi- ción del cero de la escala noniousindicará el valor de la medida en milímetros. A continuación se examinan las líneas de ambas escalas: las que se encuentran alineadas determinan el valor de las décimas de milímetro. En la parte superior derecha de la Figura 2.7 puede compro- barse que el valor cero del nonious se encuentra entre 102 y 103 mm y que a su vez se encuentran alineados el valor 104 de la escala principal con el 2 del nonius,
señalado con la flecha. Por tanto, la cantidad a anotar sería 102,2 mm. De forma análoga, en la parte inferior derecha de la figura se puede observar que el valor ajustado (señalado con la flecha) es 103,5 mm. Si se desea conocer la distancia que existe entre los puntos aybseñalados en la parte izquierda de la figura, es suficiente con calcular la diferencia entre las dos mediciones obtenidas.
Mediante el empleo de estas escalas es
posible determinar también la localización de un punto de interés en una prepara- ción, simplemente anotando las coorde- nadas en las escalas correspondientes. Para ello habría que anotar los valores de cada una de las escalas de la platina una vez que el punto a registrar estuviera situado en el centro del ocular.
Existe un método alternativo para realizar mediciones de las muestras microscó- picas. Los oculares de algunos microsco- pios cuentan con una retícula o micró- metro que consiste en una placa de cristal que tiene grabada una escala. Esta placa se inserta en el ocular y aparece en el mismo plano de la imagen microscópica. Esta característica hace posible que la retí- cula se visualice superpuesta a la imagen aumentada. Las subdivisiones de estas retículas del ocular se encuentran espa- ciadas según un valor fijo, por ejemplo 1/10 mm. Por tanto, es posible medir el tamaño de una preparación calculando el número de subdivisiones de la retícula que ocupa la muestra a observar. El valor obte- nido debe dividirse por el aumento del objetivo para conocer el tamaño real del objeto medido.