Regulación de la producción de toxinas en C perfringens.

C. perfringens es el más prolífico productor de toxinas dentro del género Clostridium. Se piensa que las toxinas de las distintas cepas de C. pefringens actúan de forma sinérgica en el desarrollo de la patogénesis, mostrando un alto grado de variabilidad fenótipica y patogénica. Por lo que el entendimiento del control de la expresión de los genes de las toxinas es crítico en la lucha contra las enfermedades causadas por este microorganismo (Frandi, A. et al., 2010).

Los patógenos generalmente tienen mecanismos de control precisos para la producción de toxinas de tal forma que la expresión tiene lugar solo cuando es requerida, como ser: cuando la densidad de la población bacteriana llega a cierto umbral, o cuando la bacteria llega a cierto órgano, tejido o tipo de célula (Frandi, A. et al., 2010). En C. perfringens, Cepa 13 (gangrena gaseosa), el rol principal en la integración de las señales medioambientales con los componentes de virulencia le corresponde al sistema de dos componentes VirR/VirS, donde VirR es el regulador de respuesta y VirS es la proteína sensora anclada en la membrana. El sistema VirR/VirS interviene en la regulación global de la producción de PLC, PFO, la toxina kappa (colagenasa), una sialidasa, una proteasa y una hemaglutinina en C. perfringens. VirR/VirS regula los niveles de ARN mensajeros de plc (PLC), pfoA (PFO) y colA (colagenasa), Figura 10 (Okumura, K. et al., 2008; Cheung, J. K. et al., 2009).

Las secuencias blanco de VirR en las regiones promotoras de los genes regulados directamente están formadas por un par de repeticiones directas imperfectas, separadas por 7 a 8 nucleótidos. Estas repeticiones son conocidas con “VirR box1” (VB1) y “VirR box2” (VB2) y se encuentran dentro de una región core de aproximadamente 50 pares de bases, localizada inmediatamente corriente arriba del elemento -35 de los promotores de los genes regulados por VirR. Tanto VB1 como VB2 son necesarias para mediar la activación transcripcional dependiente de VirR, la mutación de cualquiera de ellos reduce dramáticamente los niveles de expresión de los genes blanco. Se requiere de la unión de VirR a estas cajas para que la ARN polimerasa se posicione eficientemente. Concordante con esto, todos los genes regulados directamente por VirR tienen las dos cajas en la misma posición relativa respecto al promotor y están en la misma cara de la hélice de ADN. El espaciamiento entre VB1 y VB2 así como la cara en la que se encuentran es crucial para la activación transcripcional. Si se modifica la distancia entre VB1 y VB2 mediante la adición o deleción de 5 pares de bases colocando las cajas en

56 caras apuestas de la hélice se reduce pronunciadamente los niveles de expresión de los genes controlados por VirR (Frandi, A. et al., 2010).

Figura 10: Esquema representando la regulación de toxinas mediante el sistema de dos componentes VirR/VirS en C. perfringens Cepa 13 (gangrena gaseosa). Las flechas gruesas grices representan genes codificantes de ARN reguladores. Las flechas gruesas negras representan genes codificantes de proteínas. La regulación positiva se representa con punta de flecha y la negativa con una pequeña barra perpendicular a la dirección de la línea.

El sistema VirR/VirS, sorprendentemente, regula directamente solo cinco genes en C. perfringens a través de VirR: pfoA, vrr, virT, ccp y virU (Figura 10). Sin embargo, este sistema influencia la expresión de muchos otros genes, como ser plc, colA, cpd (codificante de una fosfodieterasa de nucleótidos 2’, 3’-cíclicos), ptp (codificante de una proteína tirosina fosfatasa), ycgJ (proteína hipotética), metB (codificante de una cistationa gamma-liasa), cysK (codificante una cisteína sintasa) y luxS (codificante de la proteína para la producción del autoinductor 2, AI-2) (Figura 10). Para plc, colA, cpd, ptp, y ycgJ-metB-cysK-luxS, es necesario el ARN regulador VR-RNA, codificado por vrr (bajo control de VirR). Existe, por otro lado, otro ARN regulador, virX, el cual controla los niveles de los ARN mensajeros de pfoA, plc, y colA independientemente de la cascada regulatoria de VirR/VirS. Además, la señalización célula-célula mediada por

57 AI-2 (sintetizado por LuxS), juega un importante rol en la producción de toxinas, siendo el sistema que media esta regulación desconocido. El regulón VirR/VirS incluye a otras dos moléculas de ARN regulatorias virT y virU. Dos genes parecen ser controlados por virT (pfoA y ccp), mientras que virU es activo en cuanto a la expresión de pfoA, ccp, vrr y virT (Figura 10). Es claro que VirR/VirS está en la cima de una cascada regulatoria donde directamente estimula la transcripción de varios genes relacionados con la virulencia de C. perfringens, incluyendo tres ARNs regulatorios diferentes, que a su vez son capaces de controlar la expresión de otros genes (Figura 10) (Okumura, K. et al., 2008; Frandi, A. et al., 2010).

Recientemente fue descubierto otro sistema de dos componentes que regula la producción de enzimas extracelulares y virulencia de forma independiente de VirR/VirS. Este regulador se denominó RevR y tienen similaridad de secuencia con PhoB de Clostridium kluyveri (62 % de identidad de aminoácidos) y con YycF de B. subtilis (49 % de identidad). Estos dos reguladores generalmente forman parte de sistemas de transducción de señales de dos componenetes, PhoB/PhoR y YycF/YycG, respectivamente. Pero a diferencia de estos sistemas, no se pudo identificar un gen que codificara para la proteína quinasa sensora ni corriente arriba ni corriente abajo de revR. RevR parece ser un regulador de respuesta huérfano, que sería fosforilado por una quinasa no identificada. Ortólogos de YycF/G (o WalR/K) han sido identificados en muchas bacterias Gram-positivas, incluyendo B. subtilis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae (donde se la conoce como VicK/R). Estas proteínas son esenciales para la supervivencia, controlan funciones vitales como la biosíntesis de mureína y división celular, así como la expresión de factores de virulencia en un gran número de especies bacterianas. Parece ser que RevR en C. perfringens, y su supuesta histidin quinasa sensora, tendría la misma función que los sistemas YycF/G (WalR/K) y PhoB/R en otras bacterias. La deleción del gen revR conduce a una morfología celular similar a la de una mutante en VicKR de Streptococucus pyogenes, sugiriendo la organización genética del gen revR que estaría involucrado en el metabolismo del fosfato. Ratones inyectados con la cepa de C. perfringens mutante en revR desarrollan los síntomas de la enfermedad más tarde que cuando son inyectados con la cepa salvaje Cepa 13, requiriendo eutanasia luego de 6 horas post-infección, comparado con las 3 a 4 horas aproximadamente a las que se lleva a cabo el sacrificio en ratones infectados con la cepa salvaje por presentar síntomas severos de la enfermedad. Las curvas Kaplan-Meier de sobrevida de ratones infectados

58 mostraron que la cepa mutante revR fue significativamente atenuada comparada con la cepa salvaje y la cepa mutante en revR complementada con RevR, quién mostró un comportamiento similar a la cepa salvaje (Hiscox, T. J. et al., 2011).