Señalización apoptótica

Se han descrito dos vías generales que conducen a la muerte apoptótica. Clásicamente, la llamada vía endógena o intrínseca se activa principalmente por estímulos provenientes del interior celular desencadenando señales apoptóticas que concurren en la mitocondria. En cambio, la vía exógena o extrínseca se inicia con estímulos provenientes del exterior celular y que se transmiten a través de los receptores de muerte (DR).

En la Figura I62 se muestra un esquema de las dos vías descritas que demuestra que confluyen en la activación de las caspasas.

Figura I62. Esquema cascada apoptótica. Fuente: (Joza et al., 2002).

5.2.2.3.1. Vía intrínseca: mitocondria

La principal diferencia entre la vía intrínseca y la extrínseca es la participación de la mitocondria en el proceso de señalización, tal y como describiremos a continuación. Se describe como vía intrínseca la señalización que tiene como elemento principal la mitocondria y todas las proteínas que actúan sobre ella, tanto apoptóticas como antiapoptóticas para regular el proceso funcional clave de éste orgánulo celular: la permeabilización de la membrana externa mitocondrial. Los eventos moleculares que activan esta permeabilización se centran en las proteínas de la familia de Bcl-2 (Figura I63). Las proteínas proapoptóticas Bax y Bak parecen determinantes en la formación de aperturas en la membrana mitocondrial externa, ya que su ausencia bloquea completamente esta vía tras una gran variedad de estímulos apoptóticos (Wei et al., 2001). En condiciones basales, Bak es una proteína transmembrana situada en la membrana mitocondrial externa, mientras que Bax puede encontrarse en el citosol y en la periferia de la mitocondria. Tras el estímulo apoptótico, Bax y Bak sufren cambios conformacionales generalmente provocados por la interacción con miembros de la familia BH3-only: Bid truncado, Bad, Bim,…que son activados transcripcionalmente o mediante modificaciones postraduccionales. Las oligomerizaciones de Bax y/o Bak resultan en la permeabilización de la membrana mitocondrial externa. Los componentes

antiapoptóticos de la familia de Bcl-2 tienen como mecanismo principal inhibir esta oligomerización acomodando en su bolsillo hidrofóbico el dominio BH3 de las proapoptóticas, resultando finalmente en un bloqueo de la permeabilización.

Tras la permeabilización mitocondrial, proteínas del espacio intermembrana son liberadas al citosol (citocromo c, AIF, Omi, Smac/Diablo y EndoG). El principal causante de los procesos apoptóticos por debajo de la mitocondria es el transportador de electrones de la cadena respiratoria, citocromo c. Al margen de su función principal en la fosforilación oxidativa, al ser liberado al citosol, citocromo c se une a monómeros de la proteína APAF-1 (factor activador de proteasas apoptóticas 1). Esta interacción permite un cambio conformacional de APAF-1, mediado por ATP, que permite su oligomerización con la procaspasa 9 para formar el complejo llamado Apoptosoma. El apoptosoma permite la activación de la caspasa 9 que podrá procesar caspasas ejecutoras como la 3, 6 y 7, que posteriormente serán las responsables de la proteolización específica de sustratos vitales para la célula, conduciéndola a la muerte (Revisado en (Danial and Korsmeyer, 2004; Spierings et al., 2005).

Figura I63. Vía de señalización apoptótica intrínseca. Fuente: (Danial and Korsmeyer, 2004).

5.2.2.3.2. Vía extrínseca: receptores de muerte

Los receptores de muerte situados en la membrana plasmática son los encargados de transmitir las señales apoptóticas externas de los ligandos de muerte (Ashkenazi and Dixit, 1998). Como se refleja en la Figura I62, las vías intrínseca y extrínseca se conectan a través de proteínas específicas, pues existe una coordinación entre ambas (Khosravi-Far and Esposti, 2004).

Los receptores de muerte (DR) pertenecen a la superfamilia de receptores del TNF, relacionada en fenómenos de apoptosis, proliferación y diferenciación. Los DRs son proteínas transmembrana integrales, mayoritariamente de tipo I (su extremo N-terminal es extracelular y el C-terminal, intracelular). Poseen un dominio extracelular conservado compuesto entre 2 y 6

repeticiones de dominios ricos en cisteínas (CRD), una región transmembrana y una región intracelular conservada de unos 80 aa denominada dominio de muerte (DD, ‘death domain’). A través del DD se podrán reclutar proteínas adaptadoras que iniciarán la señalización apoptótica (Curtin and Cotter, 2003). Actualmente se han caracterizado 8 DRs pertenecientes a la superfamilia del receptor del TNF: CD95 (DR2, APO-1, Fas), TNFR1 (DR1, CD120a, p55 y p60), DR3 (APO-3, LARD, TRAMP, WSLT), TRAILR1 (DR4, APO-2), TRAILR2 (DR5, KILLER, TRICK2), DR6, EDAR y p75NTR_{. Los ligandos que activan estos receptores, a excepción de la neurotrofina}

NGF, son moléculas relacionadas estructuralmente que pertenecen a la superfamilia del TNF. Así, se ha descrito en la bibliografía que CD95L se une a CD95, TNFα y linfotoxina α se unen a TNFR1, TL1A y TWEAK se unen a DR3 y, finalmente, TRAIL se une a DR4 y DR5. Además, existen también una serie de receptores que, aún uniéndose a estos ligandos, no tienen región intracelular que pueda transmitir señalización intracelular. Se denominan receptores señuelo (DcRs, ‘decoy receptors’) y de momento se han descrito 4: DcR1 (TRAILR3), DcR2 (TRAILR4), DcR3 y OPG (osteoprotegrina) (Revisado en (Curtin and Cotter, 2003; Lavrik et al., 2005)).

En esta introducción nos centraremos exclusivamente en la señalización apoptótica iniciada por el complejo CD95/CD95L, ya que es el receptor de muerte en el cual se basa parte del trabajo de esta tesis, además de ser el mejor estudiado y caracterizado como modelo de señalización apoptótica mediada por receptor de muerte.

CD95 fue caracterizado desde su descubrimiento en 1989 (Trauth et al., 1989; Yonehara et al., 1989), como una molécula de la superficie celular que llevaba a la muerte a linfocitos cuando era estimulado por su ligando, CD95L o bien por anticuerpos contra el receptor que emulaban la acción del ligando. La parte extracelular de CD95 contiene 3 dominios CRD que, mediante puentes disulfuro internos, adquiere la conformación adecuada para que el receptor pueda unirse consigo mismo y además el ligando CD95L se una a él (Golstein, 2000) (Figura I64).

Figura I65. Sucesión de etapas para activar la señalización a través del sistema CD95/CD95L. Fuente: (Algeciras-Schimnich et al., 2002).

Se ha demostrado que trímeros de CD95L pueden unirse a trímeros preformados de CD95, dando lugar a pequeñas estructuras llamadas SPOTS (‘signaling protein oligomerization transduction structures’) en un proceso independiente de caspasas (Siegel et al., 2004), pero es necesaria la formación de hexámeros de CD95L/CD95 (microagregaciones) para que se forme el complejo intracelular llamado DISC (‘death-inducing signalling complex’) y se desencadene la señalización apoptótica (Holler et al., 2003) (Figura I65). El DISC es el complejo multiproteico formado en la parte intracelular del receptor CD95 con la proteína adaptadora FADD y la procaspasa 8. Dichas uniones homotípicas suceden a través de los dominios DD de CD95 y FADD, y posteriormente, con la unión de DEDs entre FADD y procaspasa 8. La activación de la caspasa 8 parece seguir un modelo de activación por proximidad, por el cual, altas

concentraciones locales de procaspasa 8 permiten una autoproteólisis inicial y un posterior corte en trans que resulta en la formación de un heterotetrámero constituido por dos subunidades largas (p18) y dos subunidades pequeñas (p10). Una vez activa, la caspasa 8 será liberada al citosol donde propagará la cascada apoptótica. La procaspasa 10 también puede formar parte del DISC, donde será procesada igual que la caspasa 8. De todas maneras, parece que la caspasa 10 no es necesaria para la transmisión de la señal apoptótica y no puede desempeñar las mismas funciones que la caspasa 8 (Sprick et al., 2002).

El ensamblaje del DISC puede diferir entre tipos celulares, y modular la eficiencia de inducción de la apoptosis. Clásicamente se distinguen dos tipos de señalizaciones por debajo de CD95. La señalización de tipo I se caracteriza por tener un alto nivel de formación del DISC y generar altas concentraciones de caspasa 8 activa. Ésta, como caspasa iniciadora que es, será suficiente para cortar y activar otras caspasas efectoras, como caspasa 3, 6 y 7. En cambio, la señalización de tipo II se desarrolla cuando la cantidad de CD95 es menor y se generan niveles muy bajos de caspasa 8 activa. Para la transmisión de la señalización se requiere una amplificación de señal que vendrá dada por la mitocondria. Así, los niveles de caspasa 8 activos serán suficientes para cortar la proteína soluble Bid, miembro BH3-only de la familia de Bcl-2, generando tBid (Bid truncado). tBid se desplazará a la membrana mitocondrial y causará agregación de proteínas proapoptóticas de la familia de Bcl-2, como Bax y/o Bak, induciendo la permeabilización de la membrana y la liberación de citocromo c, principalmente. A partir de aquí, la señalización acontece de la misma manera descrita que en la vía intrínseca descrita en el apartado anterior, 5.2.2.3.1, generándose el apoptosoma y activándose la caspasa iniciadora 9, que posteriormente activará las caspasas efectoras que conducirán a la proteólisis de sustratos vitales para la célula (Revisado en (Scaffidi et al., 1999b; Barnhart et al., 2003; Peter and Krammer, 2003; Lavrik et al., 2005)).

Finalmente, nos queda por mencionar que se han descrito un importante número de proteínas que parecen ser reclutadas en el DISC a través de interacciones directas con alguno de sus componentes originales. La principal es la proteína antiapoptótica FLIP, que será descrita con detalle en próximos apartados, pero también destacan las proteínas Daxx, FAP-1, FLASH, RIP, FAF1, Dap3,… (Revisado en (Peter and Krammer, 2003)). Algunas de estas proteínas serán descritas más detalladamente en aparatos siguientes.