Serología microbiana

Objetivo específico

• Conocer los tipos de metabolismo bacteriano utilizando las pruebas bioquímicas. • Realizar las pruebas catalasa, oxidasa y coagulasa para identificar bacterias.

Descripción

El metabolismo es el conjunto de reacciones que ocurren en los seres vivos, que incluye procesos de obtención de energía, tales como, descomposición de moléculas orgánicas en los quimiótrofos (catabolismo) o la captación de luz para el caso de los fotótrofos. Asimismo, se encuentran las de síntesis de material celular a partir de nutrientes esenciales (anabolismo). Todas las reacciones metabólicas son catalizadas por enzimas que en su mayoría son intracelulares, aunque hay también extracelulares, sobre todo hidrolíticas, que son liberadas por la célula para catalizar reacciones fuera de esta.

Es posible conocer las características metabólicas de los microorganismos por su inoculación en medios de cultivo con diversos sustratos que puedan ser utilizados como fuentes de energía, carbono, donadores de electrones, así como de otros nutrientes esenciales necesarios para su crecimiento.

Existen numerosas pruebas bioquímicas con medios de cultivo adicionados de indicadores de pH para detectar la producción de ácido, con inhibidores selectivos como bilis, cianuro o con colorantes, sulfuros, etc; que facilitan la determinación de diferentes actividades metabólicas. Las actividades que se evalúan con mayor frecuencia son: capacidad para fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa), para catabolizar aminoácidos y urea, la producción de enzimas hidrolíticas específicas de tipo endo o exo como oxidasas, reductasas, amilasas, lipasas, catalasa y coagulasa.

La importancia que tienen estas pruebas bioquímicas para la identificación de especies bacterianas en áreas de alimentos, clínica y ambiental, se han desarrollado sistemas bioquímicos miniaturizados (Api), Micro ID, Microgen que se realizan en forma más rápida y segura pero que mantienen los criterios de evaluación de las pruebas bioquímicas convencionales.

Los microorganismos pueden ser separados e identificados de acuerdo a una gran variedad de razones, tales como: Determinación de patógenos responsables de enfermedades infecciosas, selección y aislamiento de cepas de microorganismos fermentativos necesarios para la producción industrial de alcoholes, solventes, vitaminas, ácidos orgánicos, antibióticos e enzimas industriales, aislamiento y desarrollo de cepas microbianas que puedan ser utilizadas para la producción de alimentos y mejoramiento de su sabor como son el yogurt, quesos y productos lácteos y por ultimo comparación de actividades bioquímicas con propósitos taxonómicos.

Las pruebas bioquímicas sirven para detectar propiedades fisiológicas y bioquímicas, debido a que éstas demuestran la existencia de ciertas enzimas en las vías metabólicas, que son reflejo de la expresión de un determinado gen en el DNA bacteriano. La suma total de todas las reacciones químicas es definida como metabolismo celular, y las transformaciones bioquímicas que ocurren dentro y afuera de la célula se encuentran gobernadas por catalizadores biológicos llamados enzimas. Las enzimas son proteínas muy específicas que realizan sólo una reacción química en el metabolismo de la bacteria.

Las complejas reacciones químicas que debe efectuar un microorganismo son producto de la acción colectiva de grupos enzimáticos, que llevan a cabo la síntesis o degradación de cierto sustrato, por ejemplo, la oxidación de la glucosa hasta dióxido de carbono y agua es producto de enzimas encargadas de la glicólisis, el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria. Las enzimas son producidas en la célula, pero de acuerdo al lugar donde efectúan su acción se pueden clasificar en endoenzimas y exoenzimas. Las primeras son intracelulares y su función está relacionada con las reacciones de degradación y síntesis de sustratos en el interior de la célula, en tanto que las exoenzimas son excretadas a través de la pared celular con el fin de producir los cambios necesarios en los nutrientes del medio ambiente y así permitir el ingreso de éstos a la célula.

Según sus propiedades, las pruebas bioquímicas se pueden clasificar en: Enzimas extracelulares como: hidrólisis del almidón, hidrólisis de los lípidos, hidrólisis de la caseína, hidrólisis de la gelatina y en Enzimas intracelulares como: fermentación de los carbohidratos, producción de sulfuro de hidrógeno, reducción de los nitratos, reacción de la catalasa, test de la ureasa, test de la oxidasa, test de la coagulasa, hidrólisis

de la sangre, Pruebas IMVIC, (Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer, Utilización del Citrato)y Agar tres azúcares. Un ejemplo es la Prueba del indol la cual se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en las bacterias y nos permite distinguir E. coli (indol +) de los otros coliformes (indol -). Esta enzima degrada el aminoácido triptófano a indol, que es el compuesto que se detecta en este ensayo

Catalasa

Los peroxisomas son orgánulos citoplasmáticos muy comunes en forma de vesículas pequeñas de 0,15 a 1,5 um. Delimitadas por una membrana sencilla que usualmente contiene una fina matriz granular, así como las enzimas oxidasas y catalasas. Estas enzimas cumplen funciones de detoxificación celular. La catalasa es una enzima que se encuentra en organismos vivos y cataliza la descomposición del peróxido de hidrogeno (H202) en oxígeno y agua. El peróxido de hidrogeno es un residuo del metabolismo celular de muchos organismos vivos pero por su toxicidad debe transformarse rápidamente en compuestos no peligrosos para las células (oxígeno y agua). La deficiencia de catalasa produce acatalasia, esta enfermedad se caracteriza por la ausencia de catalasa en los glóbulos rojos y se asocia con lesiones orales ulcerantes. Gracias a la existencia de catalasa en los tejidos animales podemos utilizar el agua oxigenada como desinfectante, al aplicarla sobre una herida las bacterias patógenas que son anaeróbicas mueren porque no pueden vivir con oxígeno (que se produce cuando la catalasa actúa sobre el agua oxigenada).

Oxidasa

Prueba de la citocromo c oxidasa: Los citocromos son proteínas que forman parte de algunas cadenas transportadoras de electrones, propias del metabolismo respirador. Esta prueba permite diferenciar bacterias como por ejemplo Entero bacterias (carecen del citocromo c) del género Pseudomonas (poseen citocromo c).

Esta prueba está basada en la identificación de una enzima bacteriana llamada citocromo C oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa. Todas las bacterias aerobias obtienen su energía en forma de ATP a partir del proceso de respiración también llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular bacteriana.

Se utilizan colorantes cromógenos que actúan como aceptadores artificiales de electrones que sustituyen de cierta manera al oxigeno usado por la bacteria, los más usados son: Tetrametil-p-fenilendiamina, Dimetil-p-fenilendiamina y Indofenol.

El reactivo basado en una disolución acuosa de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%, es el más común y recibe el nombre de reactivo de Kovacs. Este reactivo se puede impregnar en discos o fragmentos de papel filtro grueso. En el comercio ya se venden tiras o discos impregnados con el reactivo.

Coagulasa

La coagulasa es una proteína producida por varios microorganismos que permite la conversión del fibrinógeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distinguir entre diferentes tipos de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la muestra contiene Staphylococcus aureus. Esta proteína también es producida por Yersinia pestis. La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se llama estafilotrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en fibrina. Esto hace que se coagule la sangre, está estrechamente relacionada con la superficie de la bacteria S. aureus y puede revestir su superficie con fibrina al entrar en contacto con la sangre.

S.aureus posee dos tipos de coagulasa: endocoagulasa o coagulasa ligada o “clumping factor” que está unida a la pared celular. Esta actúa directamente sobre el fibrinógeno provocando la formación de coágulos o grumos cuando se mezcla una suspensión bacteriana con plasma citratado (test en lámina); exocoagulasa o coagulasa libre que actúa mediante la activación de un factor (CRF), formándose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibrinógeno produciéndose un coágulo de fibrina (test en tubo).

Materiales

• Microscopio • Portaobjetos

• Solución salina estéril • Torundas estériles

• Reactivo de catalasa (agua oxigenada) • Reactivo oxidasa

• Reactivo coagulasa

• Cepas de bacterias en placa • Hojas de bisturí

• Placas de agar nutritivo • Baja lenguas estéril • Asa bacteriológica

Procedimiento Oxidasa

1. Añadir en un papel unas gotas del colorante tetrametil-p-fenilendiamonio (incoloro).

2. Coger con un palillo unas cuantas colonias aisladas en placa de Pseudomona aeruginosa y mezclar con el colorante.

3. El colorante se oxida rápidamente en presencia del citocromo c produciendo formas coloreadas (azul). Si la prueba es negativa no habrá viraje (conviene utilizar controles positivo y negativo).

4. Repetir la prueba con Escharichia coli.

Catalasa

1. Colocar una gota de H2O2 al 3% sobre un portaobjetos

2. Transferir una porción de colonia de Staphylococcus aureus sobre el reactivo realizando una emulsión.

3. Debe tomarse la colonia a partir de un medio sin sangre ya que los eritrocitos tienen actividad de catalasa y pueden falsear los resultados.

4. Detectar la formación de burbujas

5. Esta prueba también puede realizarse en un aislamiento en tubo, simplemente colocando unas gotas de H2O2 dentro del mismo.

Figura 1. prueba de catalasa

6. Repetir la prueba con la cepa Streptococcus sp

7. El desprendimiento de burbujas se considera una prueba positiva. 8. Anotar el resultado Coagulasa

Coagulasa

Prueba en portaobjetos

1. Colocar una gota de la colonia Sthaphilococcus aureus y emulsificar en una gota de plasma de conejo

2. Esperar 1 minuto. 3. Anotar el resultado

4. El resultado es positivo cuando se ve un precipitado en el portaobjetos, ver figura 2 5. Si el resultado es negativo realizar la prueba en tubo.

6. Repetir el procedimiento con una cepa de Staphilococcus epidermidis.

Prueba en tubo

1. Mezclar un asa cargada con el microorganismo obtenido de un cultivo en medio sólido, ó 0,1 mL de un cultivo en un medio líquido, con 0,5 mL de plasma de conejo, contenido en un tubo pequeño de aproximadamente 7 mm de diámetro.

Figura 3. Interpretación de la prueba coagulasa en tubo.

2. Incubar en baño de agua a 37°C y examine periódicamente.

3. Se considera que la prueba es positiva si el plasma es coagulado en 3 a 4 horas, aunque algunas cepas con escasa producción de coagulasa sólo coagulan el plasma después de 24 horas de incubación.

Resultados

Prueba de Oxidasa

1. Tome un cultivo de E. coli y Pseudomonas sp

2. Saque una tira reactiva de Oxidasa y pártala a la mitad

3. En cada mitad de la tira, utilizando un palillo de madera, coloque una o dos colonias de una de las bacterias (una bacteria en cada mitad)

4. Si el papel cambia a un color azul en el transcurso de 10s, la prueba se considera positiva 5. En caso de no cambiar de color o cambiar luego de los 20s, se considera negativa

Prueba de Catalasa

1. Tome un cultivo de S. aureus y Streptococcus sp

2. Asegúrese que los cultivos NO provengan de Agar Sangre 3. Coloque varias colonias sobre un portaobjetos

4. Agregue una gota del reactivo de Catalasa (Peróxido de Hidrógeno al 15%)

5. La formación inmediata de burbujas indicará una reacción positiva, de lo contrario será negativa 6. La formación de burbujas luego de 20 a 30s NO se considerará positiva

Cepa Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Gram Oxidasa Cepa S. aureus S. epidermidis Steptococcus sp.

Tema 4: Antibiogramas

Objetivos específicos

Reconocer la importancia y los pasos para el montaje e interpretación de pruebas de resistencia a los antibacterianos.

Descripción

Las infecciones bacterianas pueden atacar prácticamente cualquier tejido en el cuerpo humano. Dependiendo de su severidad, pueden ser auto limitadas ya que el sistema inmune es capaz de responder efectivamente y resolver el proceso infeccioso. Sin embargo, en muchos casos es necesaria una terapia de apoyo con antibióticos de modo que ataquen a las bacterias patógenas y se pueda resolver más fácil y eficazmente la infección, dado que en muchos casos, podrían comprometer la vida de los pacientes. A pesar de ello, muchas cepas bacterianas han desarrollado mecanismos de resistencia a los distintos antibióticos, principalmente por el abuso en el tratamiento de éstos, así como el poco apego de los pacientes a los esquemas prescritos. Esto genera la proliferación de cepas bacterianas con características selectivas que le favorecen su crecimiento en presencia de ciertos antibióticos, con lo cual el uso del mismo se torna ineficaz.

La resistencia a un antimicrobiano se define como la capacidad de un microorganismo a resistir las concentraciones terapéuticas del medicamento sin alcanzar dosis tóxicas para el paciente.

Para determinar si hay o no resistencia a los antibióticos se han diseñado innumerable cantidad de técnicas, como por ejemplo, el método de Kirby-Bauer. En éste, se colocan sobre un cultivo de la bacteria de interés, discos impregnados de diferentes antibióticos. El antibiótico difunde a través del agar, diluyéndose al alejarse y creando un halo de inhibición alrededor, según sea la sensibilidad de la bacteria al agente. Por tanto, mientras más grande sea el halo, mayor será la sensibilidad de la bacteria a ese antibiótico en particular. Posteriormente se mide con regla el diámetro del halo de inhibición y se compara con lo reportado por el fabricante para determinar el grado de sensibilidad. Cabe destacar que éste método es meramente cualitativo, pues no ofrece manera de conocer la concentración mínima inhibitoria (MIC) del antibiótico.

Éste método siempre debe contar con un control de calidad correspondiente a cepas ATCC (American Type Culture Collection) estandarizadas que generan un halo de tamaño conocido, de modo que se pueda controlar que el método funciona correctamente.

Materiales

• Portaobjetos • Tinción de Gram

• Placas de agar Mueller-Hinton • Cepas ATCC • Hisopos estériles • Soluciones de McFarland 0.5 • Agua destilada • Tubos de ensayo Procedimiento Antibiograma

1. Realice una tinción de gram de las cepas disponibles 2. Seleccione una bacteria para ser trabajada

3. Coloque una a una, colonias de la bacteria seleccionada en un tubo con 3mL de agua destilada hasta alcanzar una turbidez de McFarland 0.5

4. Sumerja una torunda estéril y escurra el exceso de líquido en la pared del tubo 5. Raye en 3 direcciones toda la placa, asegurándose de cubrir toda su superficie

6. Deje secar 5 minutos y, utilizando pinzas, coloque los discos con antibióticos equidistantemente entre ellos y el borde del plato

7. Entre cada cambio de disco sumerja las pinzas en alcohol y quémelas con la lámpara de alcohol 8. Incube a 35°C por 18h

9. Mida el diámetro de la zona de inhibición alrededor de cada uno de los discos con antibiótico

10. Consulte los valores normales de diámetros de inhibición de las cepas ATCC y determine si funcionó adecuadamente

11. Determine si su cepa es suceptible, intermedia o resistente a los antibióticos utilizados

Lectura de Placas

Tema 5: Incógnita prueba práctica