Vía de la exocitosis granular

La vía de la exocitosis granular, o degranulación, se desencadena a través del balance de señales de activación e inhibición que recibe la célula efectora por sus receptores de superficie. Supone la liberación de gránulos citotóxicos preformados que contienen moléculas encargadas de inducir la muerte de las células diana (Figura 1.9) (110, 169). Es un proceso muy regulado, que depende del establecimiento de unos contactos especializados entre ambas células, generando una estructura tridimensional dinámica conocida como sinapsis inmunológica (172, 173). La movilización de los gránulos citotóxicos a esta interfaz es un proceso rápido que supone:

1- La reorganización del citoesqueleto de actina y la formación de unas agrupaciones supramoleculares de activación (SMAC; del inglés, Supramolecular Activation Cluster) (166, 172). En ellas, las moléculas de adhesión como LFA-1 y CD2 conforman la periferia del SMAC; mientras que los receptores de activación conforman el centro del SMAC (165, 174, 175).

2- La traslocación del centro organizador de microtúbulos (MTOC; del inglés,

Microtubule Organizing Center) hacia la zona de unión, creando una red de microtúbulos que

permite la polarización de los gránulos hacia la sinapsis. (166, 169)

3- La exocitosis de los gránulos a la zona de contacto y la fusión con la membrana plasmática (166, 169)

Diversas proteínas se han implicado en la regulación del proceso. Es el caso de WASP (del inglés, Wiskott-Aldrich Syndrome Protein), que interviene en la reorganización de la actina (176). La proteína AP-3 (del inglés, Adaptor Protein 3) está implicada en el desplazamiento de los gránulos por la red de actina (177), Rab27a en su liberación (178), Munc1 3-4 en su fusión con la membrana plasmática (179) y, finalmente, la esfingomielinasa ácida en la expulsión direccional del contenido (180).

Dentro de los componentes de los gránulos citotóxicos (Tabla 1.3), la proteína formadora de poros (perforina) y las serin-proteasas (granzimas) son los principales agentes que intervienen en la lisis celular.

 La perforina es una proteína homóloga al factor C9 del complemento que forma el complejo de ataque a la membrana (MAC; del inglés, Membrane Attack Complex) (181). Dentro de su estructura destacan: un dominio N-terminal responsable de su actividad lítica, un dominio central de anclaje a la membrana, un dominio tipo EGF (del inglés, Epidermal Growth Factor) y un dominio C2 C-terminal de unión a Ca2+ _{que determina su activación (182).}

Tabla 1.3 Principales componentes de los gránulos citotóxicos. Adaptada de Antón et al. 2018 (1).

Molécula Función

Perforina Formación de poros

Granzimas Proteasas de serina

Granulisina Agente antimicrobiano

Calreticulina Inhibidor de la perforina

Catepsina C Activación de las granzimas

Serglicina Unión a granzimas

Catepsina B Degradación de la perforina

Serpinas Inhibidores de granzimas

Esfingomilinasa ácida Degradación esfingomielina/exocitosis granular

Catepsina D Proteasa

Catepsina L Proteasa

Receptor de manosa 6-fosfato Tráfico de proteínas

ATPasa-H+ Acidificador de los gránulos

Arilsulfatasa Degradación de polisacáridos

β-Hexosamidasa Degradación de polisacáridos

β-glucoronidasa Degradación de polisacáridos

CD63 Marcador lisosomal

CD107a (Lamp-1) Marcador lisosomal. Estabilización de la

membrana plasmática durante la

degranulación.

Dentro de las células efectoras, la perforina se mantiene inactiva ya que el dominio C2 no queda expuesto a la unión de Ca2+ _{(183). También en los gránulos citotóxicos, el pH ácido}

(pH ≤5), (184) y la intervención de la calreticulina como chaperona, mantienen la conformación inactiva de la proteína (185). Una vez liberada al exterior, la perforina encuentra un pH neutro y una gran concentración de Ca2+_{. Su unión al dominio C2 induce un cambio de conformación en}

la proteína. De este modo los monómeros de perforina pueden ensamblarse a la membrana, y entre sí, para formar un poro (183).

Aunque no está claro si la mera formación del poro es capaz de inducir la muerte a las células diana, se ha demostrado que su acción es esencial para poder inducir una respuesta inmune eficaz. Se ha visto que ratones deficientes en perforina no son capaces de mostrar esta respuesta (50, 51) y que, en su ausencia, las granzimas no llegan al citosol (186).Por eso se ha propuesto que las granzimas son las ejecutoras de la muerte celular (187).

 Las granzimas son serín proteasas de los gránulos citotóxicos, aunque también se han descrito en otros tipos celulares. Se conocen un total de 12 granzimas, de las cuales 7 son exclusivas de ratón y una es exclusiva de humanos (Tabla 1.4) (188).

Se sintetizan como zimógenos, por lo que han de proteolizarse para ser activas. Una vez en los gránulos citotóxicos, la catepsina C degrada los aminoácidos GlyGlu de su extremo N- terminal, activándola. Pero gracias al pH bajo de los gránulos, y a la formación de complejos serglicina/granzima (189) se mantienen inactivas. Una vez liberadas, acceden al citosol de la célula diana y proteolizan distintos sustratos induciendo la muerte celular, principalmente por apoptosis (190).

Tabla 1.4 La familia de las granzimas en humanos. Adaptada de Antón et al. 2018 (1).

Granzima Especie Actividad Tipo celular

Granzima A h,m Triptasa Tc, Treg, NK, NKT, GMC, Pne, MfAlv, Plaquetas (h) Granzima B h,m ASPasa Tc, Treg, NK, NKT, MC, MDSC (h), Bas (h), DC,

GMC, linfocito B, Ser, Pne, Quer

Granzima H h Chymasa NK

Granzima K h,m Triptasa Tc, NK, NKT (h), CD56bright Granzima M h,m METasa NK, NKT, Tɣδ

Actividad: especificidad de corte. Especie. h: humano; m: murino. Tipo celular: principales tipos celulares donde se han detectado. Tc, Linfocitos T citotóxicos (Tαβ CD8+, Tɣδ CD8+); NK, células NK; NKT, células NKT; MDSC, Células Supresoras de Origen Mieloide; MC, mastocitos; Treg, Células Treg; Bas, basófilos; Mac, macrófagos; DC, Células Dendríticas; Ser, Células de Sertoli; GMC, Células glándula metrial; Pne, neumocitos; MfAlv, Macrófagos alveolares;

Quer, queratinocitos.

Estas proteínas fueron descritas en un principio por su capacidad de eliminar células alteradas, aunque ahora se conoce que intervienen en otros procesos como la inflamación o la regulación de la supervivencia de linfocitos activados. De hecho, algunos estudios muestran que la granzima A tiene mayor relevancia en procesos inflamatorios. Por otro lado, la funcionalidad de granzimas K, H y M sólo ha sido caracterizada en modelos in vitro, donde pueden inducir muerte celular o inflamación (granzima K y M) (169, 188, 190, 191).

La granzima B es, junto con la granzima A, la más abundante en los gránulos citotóxicos. Además, es la más relevante en la inducción de apoptosis (192). Ejerce su actividad proteasa sobre residuos de ácido aspártico (188), habiéndose identificado diversos sustratos intracelulares y extracelulares. Existen dos vías principales por las que puede inducir la muerte celular:

- Una vía dependiente de caspasas, en la cual proteoliza directamente a la caspasa 3 (modelo murino) o la proteína pro-apoptótica Bid (modelo humano) (193, 194). Como consecuencia, se induce la apoptosis de la célula diana (191).

- Una vía independiente de caspasas y de la vía mitocondrial de la apoptosis, que no está bien caracterizada (169). De hecho, se ha observado que células NK humanas activadas ex vivo (195),o linfocitos Tc específicos de tumor en un modelo murino (196), son capaces de inducir la muerte celular en tumores con resistencia a la apoptosis. Aunque no está claro qué via de muerte celular produce la muerte de estas células, se ha sugerido que la granzima B podría actuar sobre distintos sustratos. Por ejemplo, el inhibidor de DNAsas ICAD, con la consiguiente degradación internucleosomal (197); o las proteínas lamina B (198), ɑ-tubuilina (199) y filamina (200), induciendo la pérdida de la integridad estructural del núcleo en el primer caso, o del citoesqueleto en los otros dos (201).