Se siguieron los Procedimientos de validación de métodos analíticos, GL 2/98, del programa de Cooperación Internacional sobre Armonización de Requisitos Técnicos para el Registro de Medicamentos Veterinarios (VICH, 1998).
Se elaboraron unas soluciones estándares de concentración conocida de CFQ en suero y en leche. Las áreas de los picos cromatográficos obtenidas en función de los valores de dichas concentraciones, permitieron la realización de las rectas de calibración, a partir de las cuales se pudieron calcular los valores de precisión y exactitud del método empleado. Se elaboraron soluciones stock de CFQ en agua, las cuales se mantuvieron fraccionadas en tubos herméticos y congelados a – 20°C. La tabla 13 muestra los valores de concentraciones de estas soluciones, identificadas numéricamente del 1 al 9.
El stock n° 1 se elaboró teniendo en cuenta la pureza de la CFQ sulfato (82,7 % p/p), sustancia provista por Intervet International, y la precisión de la balanza analítica (Ohaus Adventurer AR2140; sensibilidad: 0,0001 g) utilizada para pesar dicha sustancia por única vez. De tal forma que se pesaron 0,0321 g (32,1 mg) de sustancia, que corresponden a
26,547 mg de CFQ. Esta cantidad se disolvió en 25 ml de agua ultra pura, obteniéndose una concentración final de 1062 µg/ml.
La tabla 14 muestra la elaboración de los estándares de CFQ en plasma y en leche, partiendo de las soluciones stock, así como las concentraciones finales.
Tabla 13: Elaboración y concentraciones finales de las soluciones stock de cefquinoma (CFQ) en agua. Identificación del stock N° de stock empleado Volumen utilizado del stock (ml) Volumen final de la dilución (ml) Concentración CFQ (µg/ml) 1 - - 25 1061,868 2 1 3 5 637,121 3 1 2 5 424,747 4 1 1 5 212,374 5 1 3 25 127,424 6 1 3 50 63,712 7 6 2 10 12,742 8 6 2 50 2,548 9 6 1 50 1,274
Tabla 14: Elaboración y concentraciones finales de las soluciones estándares de cefquinoma en suero y leche caprino.
Volumen de suero o leche (ml) [§]
N° de stock empleado
Volumen del stock agregado a [§] (ml)
Concentración del estándar de CFQ en suero o leche (µg/ml) 0,5 1 0,250 353,956 * 0,5 1 0,100 176,978 * 0,5 2 0,050 57,920 * 0,5 2 0,025 30,339 0,5 3 0,025 20,226 0,5 4 0,025 10,113 0,5 5 0,025 6,068 0,5 6 0,025 3,034 0,5 6 0,010 1,249 0,5 7 0,025 0,607 0,5 8 0,025 0,121 0,5 8 0,015 0,074 0,5 9 0,015 0,037
(*): Sólo utilizados para leche.
Los intervalos de concentraciones empleados para la elaboración de las rectas de calibración, para suero y leche, se muestran en la tabla 15. Debido a las amplias diferencias de concentraciones (entre la mayor y la menor) y con el objeto de no incluir un
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sesgo en el cálculo del coeficiente de regresión, se emplearon diferentes intervalos para leche o suero, según correspondiera.
Tabla 15: Intervalos de concentraciones empleados para la construcción de las rectas de calibración, en suero y leche caprino.
Concentraciones (µg/ml)
Bajas Altas Superiores Total
Suero 0,037 – 1,249 1,249 – 30,339 - 0,037 - 30,339
Leche 0,037 – 1,249 1,249 - 30,339 30,339 - 353,956 0,037 - 353,956
Para la validación del método analítico se utilizaron los criterios de linealidad, precisión (variaciones inter-día e intra-día), exactitud, límite de detección y cuantificación.
Linealidad
Indica la relación lineal que existe entre los valores de una variable independiente, en este caso las concentraciones patrones de CFQ y la variable de respuesta como es el caso de las áreas cromatográficas.
Se evaluó este criterio tanto para suero como para leche, en el intervalo de concentraciones comprendidos entre 0,037 y 30,34 µg/ml y entre 0,037 y 353,96 µg/ ml para cada matriz, respectivamente.
Los diferentes patrones fueron inyectados en el HPLC seis veces por día, en tres días diferentes.
Se realizó un análisis de regresión lineal sobre un gráfico de coordenadas cartesianas, indicándose este atributo mediante el coeficiente de determinación r2.
Precisión y exactitud
La precisión refleja la proximidad entre las diferentes medidas individuales de una misma concentración. Se describe por el coeficiente de variación:
Precisión % desvío estándar media x 100
El cálculo se realizó, contemplando los resultados de las áreas cromatográficas, luego de inyectar en el HPLC cada una de las concentraciones de CFQ dieciocho veces en un total de tres días (seis por día), de modo de determinar la variación inter-día o reproducibilidad.
Además se calculó la variación intra-día, o repetibilidad, luego de inyectar cada dilución de CFQ dos veces seguidas, tres veces en el día (con un período de espera, entre dos inyecciones continuas, de aproximadamente cuatro horas).
Se considera que para cada nivel de concentración estos valores no deben ser superiores al 15%, excepto para el límite de cuantificación que puede ser de hasta el 20%.
Por otra parte, la exactitud describe la proximidad de los resultados obtenidos a partir del método analítico respecto del valor verdadero. Surge de la relación entre la concentración experimental de CFQ y la teórica.
Exactitud % Concentración experimental Concentración teórica x 100
El denominador de la fórmula es el valor que teóricamente deben tener los estándares luego de su elaboración (ej. 0,037 µg/ml), mientras que la concentración experimental surge de la aplicación de las ecuaciones de la recta de calibrado.
Una exactitud del 100 % es cuando tanto las concentraciones experimentales como las teóricas son iguales, y el valor de este criterio debe encontrarse entre el 80 y 120 % para ser aceptable (VICH / GL2, 1998).
Límite de detección y cuantificación
Las dos expresiones se relacionan con la sensibilidad del método analítico.
El límite de cuantificación se corresponde con la concentración más baja que puede cuantificarse empleando el método validado. Se consideró a este límite teniendo como premisa que debe ser reproducible con una precisión menor o igual de 20 % y una exactitud entre el 80 y 120 %.
Se estableció al límite de detección como la mínima concentración que la técnica es capaz de detectar sin repetir (o con gran variabilidad en la repetición) los resultados.
Recuperación
La recuperación del método extractivo se calculó con las áreas bajo la curva de cinco concentraciones distintas tanto en suero como en leche (20,226 - 10,113 - 6,068 - 0,121 - 0,037 g/ml), cada una de las cuales fueron inyectadas tres veces en HPLC.
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Los porcentajes medios de recuperación y su desvío estándar fueron calculados por comparación de las ABC obtenidas tras la extracción de CFQ a partir del suero (y leche), y las ABC que correspondían a cada concentración de acuerdo a las ecuaciones de las rectas de linealidad de la CFQ en agua.
Estos valores se determinaron sólo para establecer la bondad del método extractivo y no para el cálculo de las concentraciones, ya que las rectas de calibración utilizadas para dicho cálculo fueron confeccionadas en suero y/o leche y, por lo tanto, no fue necesario corregir los resultados con el valor de la recuperación.
III.2.2.2.- Etapa V: Determinación de la concentración inhibitoria mínima de