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(1)

DEPART"ENT-O

TITULO

DEL TRABAJO

DE

SERVICIO SOCIAL

MATRfCULA:

90337358

L4

OBTENCIÚN

DEL

GRADO

DE:

LIC. EN

BIOLOGÍA

ASESORES:

(2)

I

INTRODUCCI~N.

I

El desarrollo industrial ha generado un importante volumen de aguas residuales, que llegan a contener pesticidas, metales pesados y otras sustancias tóxicas para los seres vivos. En algunos casos estas sustancias pueden ser degradadas por tratamientos fisicos, quimicos o biológicos, y otras, sin embargo permanecen en el ambiente, por lo que se hace necesario conocer su impacto ecológico por medio de pruebas biológicas conocidas como bioensayos.

Los bioensayos se basan principalmente en la característica de los organismos para reaccionar a las condiciones ambientales, estas pruebas son indispensables en la

determinación de toxicidad y en el establecimiento de criterios y normas que regulen el ingreso al ambiente de sustancias tóxicas, sin perjudicar a los ecosistemas. El uso de los bioensayos se incrementa cada vez mas, ya que existe la tendencia de utilizarlos para complementar los análisis físico-químicos. Los bioensayos nos proporcionan además información de la disponibilidad, interacción y efectos de las sustancias con la comunidad biótica, y son usados para la detección y evaluación de la toxicidad de desechos industriales y el tratamiento de los mismos. En este tipo de pruebas, se utilizan microcrustáceos, bacterias, nematodos y algas; dentro de estas últimas, Chlorella vulgaris es una de las especies de agua dulce más utilizadas. c

Para el establecimiento de un método de prueba y evaluar toxicidad, con cualquier oyganismo, se requiere de la utilización de sustancias que nos permitan establecer la

- sensibilidad de los organismos y demostrar la reproducibilidad de los resultados obtenidos

en el laboratorio. Por este motivo, es que son utilizados los ttjxicos de referencia, considerados de gran utilidad para establecer un control de calidad adecuado. Los tóxicos de referencia nos permiten determinar la validez de los datos generados por el laboratorio y nos proporcionan una medida general de la reproducibilidad del método.

En el laboratorio de Bioensayos del CENICA, sé esta implementando un método de evaluación de toxicidad con Chlorella vulgaris, el cual permite establecer la toxicidad con base en la inhibición del crecimiento, para lo cual se requieren datos sobre la sensibilidad del alga.

El presente proyecto, pretende evaluar la sensibilidad del organismo utilizando dos tóxicos de referencia, Fenol (C6

H5

OH) y Dicromato de Potasio

(K2

Cr2 0 7 ) ; también se pretende

evaluar que tanto afectan

l a s

condiciones de cultivo sobre la sensibilidad del organismo.

CIzlorella vulgaris es un alga .verde de agua dulce, unicelular, eucariótica, sus

células son pequeñas y redondas, presentan un cloroplasto único en forma de taza, la reproducción es únicamente asexual. El núcleo se divide para formar 2, 4, 8 ó 16 células con núcleo y citoplasma, que se rodean de pared celular y forman una espora inmóvil (autoespora); que es liberada al desmoronarse la pared de la célula madre (Northen, 1968).

(3)

’,

usada en estudios metabólicos y como indicador de la contaminación ambiental (Rachlin ( j & Grosso, 1993; Chang and Wonq, 1991).

D

i Chlorel/u vulgaris en Japón es producida comercialmente y usada como suplemento

nutritivo para el hombre, tiene un alto valor vitamínico, de minerales y fibra, es rica en : proteínas y complejo B (‘Tamaru, 1999).

Ch. vulguris ha sido utilizada como especie prueba en ensayos de laboratorios de CETESB, pero a pesar de ser ampliamente utilizada en ensayos de toxicidad, estudios realizados por CETESB, consideran que el género Clzlorellu es menos sensible

a

contaminantes que otros géneros ya utilizados, como Selenastrum.

Kraus y Hutchinson (1975, citados, por Little et. al., 1976), mencionan a Chlorella

vulgaris en ensayos de toxicidad con componentes de petróleo solubles en agua, ellos encontraron que algunas veces los efectos de inhibición iniciales desaparecen y el crecimiento es normal, aquí resulta evidente el escape (la alta volatilidad) de compuestos del medio prueba.

Chlorella vuZgaris es bastante competitiva, en el laboratorio de BiGnsayos. se utiliza para alimentar a las dafnias (Duphniu mugnu Straus); su posición taxonómica según Dawes ( 199 1) es:

División Chlorophyta Clase Chlorophyceae Orden Chlorococcales Familia Oocystaceae

Género Chlorella Especie

Ch.

vulgaris

Fases de crecimiento de un cultivo algal (Figura 3):

1.

2.

3.

4.

5.

Fase de adaptación. En esta etapa no hay crecimiento, dura aproximadamente un día y el color del cultivo es casi transparente.

Fase exponencial. En esta etapa se da el crecimiento de manera exponencial (3 a 5 días) y el color del cultivo se toma verde claro.

Fase final del crecimiento exponencial. Esta etapa se alcanza aproximadamente a los cinco días y es la más importante, porque la densidad del cultivo es alta y se tienen solamente células nuevas, el color del cultivo es verde obscuro.

Fase estacionaria. En esta etapa se mantiene dos o tres días; se caracteriza porque no hay producción de células nuevas y únicamente aumentan de tamaño.

(4)

FIGUKA 3. Patrón característico de crecimiento mostrado por un alga unicelular en un cultivo de volumen limitado; cinco fases de crecimiento.

Células/ L

1

Fase estacionaria

d

/

Fase exponencial

I

Fase de adaptación

Edad del cultivo (días)

I

OBJETIVOS

GENERALES

U

ESPECIFICOS.

Evaluar la sensibilidad de Chlorella vulgaris utilizando dos tóxicos de referencia: Peno1 (C6

Hj

OH) y Dicromato de Potasio (K2 cr2 0 7 ) .

o Establecer si la sensibilidad de C'lzlorellu vulgaris se mantiene constante en condiciones estándares de cultivo.

L

I

METODOLOGL4 UTILIZADA.

I

Para la realización de los bioensayos se utilizó la Norma CETESB L5.020.

1. Material.

Cámara de Neubauer para eonteo celular. Matraces aforados de 100,200 y I O00 mL. Matraces erlenmeyer de 125 y 1000 mL. Parafilm.

(5)

Probetas graduadas de 1 O0 mL. Yropipetas

e Tapones de algodon cubiertos con gasa. Termómetro.

Tubos de centrífuga con tapa.

**Nota. Todo material que entre en contacto con la sustancia tóxica, debe ser químicamente inerte, de preferencia vidrio.

2.

Equipo.

Autoclave. Balanza analítica.

Cámara de flujo laminar. Centrifuga.

Espectrofotómetro.

incubadora con agitación e iluminación de lamparas fluorescentes (

l u z

fría). Medidor de pH.

Microscopio óptico.

3. Reactivos.

c

-

Acetona (C3H60).

-

Ácido Bónco (H3B03).

-

Ácido nítrico (HN03).

-

Ácido Sulfúrico (H 2SO.r).

-

Agar.

-

Cloruro de Calcio (CaC1QEO). - Cloruro de Sodio (NaCl).

-

Cloruro Manganoso (MnC12.4H20).

-

Dicromato de Potasio

(K2

Cr2 0 7 ) .

-

EDTA disódico

-

Fenol (C6 Hj OH).

-

Fosfato de Potasio dibásico

(K2

H p 0 4 ) .

-

Fosfato de Potasio monobásico (W PO4).

-

Hidróxido de Potasio (KOH).

-

Nitrato de Cobalto (Co (N03)2.6H20).

-

Nitrato de Potasio

(mo3).

-

Nitrato de Sodio (NaNOs).

-

Óxido de Molibdeno (M003).

-

Peptona proteasa.

-

Sulfato Cliprico (CuS04.5H20).'

-

Sulfato de Magnesio (MgS04 :7H2(3 ).

-

Sulfato de Zinc (ZnS0.r. 7H20).

-

Sulfato Ferroso (Fe S04.7H20).

(6)

4. Lavado de material.

Todos los materiales que entren en contacto con las muestras que van a ser usadas en los bioensayos, deben lavarse perfectamente para evitar que tengan residuos que sean potencialmente tóxicos a los organismos de prueba, utilizando el siguiente método:

0 Lavar el material con detergente libre de fosfatos enjuagar dos veces con agua de la

Enjuagar el material con ácido nítrico (HN03) al 30% para eliminar residuos metálicos.

0 Enjuagar con agua desionizada o destilada y escurrir.

Enjuagar con acetona (C3H60) para eliminar residuos orgánicos.

0 Enjuagar con agua desionizada o destilada.

Secar el material en estufa a 105°C. llave.

Después de esta serie de lavados, los materiales son tapados, envueltos en papel y

esterilizados en autoclave durante 15 minutos a 1.01 Kg./cmZ. Estos pasos de lavado se deben efectuar de 24 a 48 horas antes del bioensayo, protegiendo el material de polvo y otros factores.

5. Cultivo y Mantenimiento de Chlorella.

5.1. Medio Sólido.

El medio de cultivo sólido se utiliza para el mantenimiento de Chlorella vulgaris, y además nos sirve como provisión en caso de que se contamine el medio líquido.

Preparación del medio sólido:

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

En un cuarto de litro de agua destilada, se agregan 2.5 g de agar y se dejan hidratar durante 30 minutos.

El agar ya hidratado es puesto en baño malría, y se mantiene con agitaciones constantes hasta que este totalmente disuelto.

A la solución total de agar se adicionan los siguientes nutrientes: nitrato de potasio (KN03) O.O5g, sulfato de magnesio (MgS04.7H20) .005g.

La solución se vuelve a agitar hasta que se torne transparente y se deja enfriar un poco,

cuando este casi fiía y todavía líquida, se adiciona 0.25 g de peptona proteasa.

El medio se coloca. en tubos de cultivo (más o menos a la mitad para que el medio pueda quedar inclinado) que son tapados y esterilizados durante 15 minutos a 1 .O1 Kg./cm, 2.

Ya esterilizado, los tubos de cultivo son colocados en ángulo de 45" para la obtención del m e l o inclinado (Figura 2)

Ya solidificado, procedemos a cultivar tomando una asada de otro cultivo de Chlorella vulgaris, este cultivo es incubado entre 24+2"C e iluminado con lamparas

fluorescentes frias.

(7)

FIGURA 2. Medio de agar inclinado (medio sólido)

Agregar nutrientes, agitar

y casi fiio adicionar peptona

Se mantiene con agitaciones proteasa,

constantes en baAo maria debe quedar transparente

Vaciar en los tubos de cultivo y esterilizar

v

v

durante 15 minutos a 1.01 Kg./crn *

Ya esterilizados, colocar a 45°C y dejar solidificar durante 24 horas.

De un cultivo sólido de Chlorella vulgaris, tomar una asada

y colocarla en zigzag en los nuevos cultivos.

lncubar a 24f2"C e iluminar con lamparas fluorescentes frias.

1

5.2. Medio Líquido.

El medio de cultivo líquido es simple, debido a que no se tiene que interferir o modificar los efectos de la sustancia probada, y se debe disminuir la probabilidad de contaminación por microorganismos; el medio utilizado es el Bold Basal, debido a que el alga es utilizada como alimento de Daphnia magna Straw.

El .medio Bold Basal esta constituido por 1 O soluciones stock de macronutrientes y micronutrientes (Stein, 1973).

Preparación del medio Bold:

l. En un matraz de 1 litro, adicionar 940 mL de agua destilada.

(8)

4 . El matraz es cubierto con

un

tapón de algodón cubierto con gasa y sellado con

cinta adhesiva, se cubre con papel aluminio y es esterilizado durante 15 minutos a 1 .O1 Kg/ cmz.

Preparación de soluciones stock para medio Bold.

5.5. Siembra y Condiciones de Cultivo.

De acuerdo a la Norma, se determinan' las siguientes condiciones para un cultivo óptimo de Chlorella vulgaris:

I

PARÁMETRO

c0ND1c10ms

I

Temperatura

I

24 "C+ 2°C '

constante para que el C02 no limite el

L a iluminación es proveída por lamparas fluorescentes frías; debido a que el

(9)

y garanticen la disponibilidad constante de C02, acelerando también el crecimiento de las algas, esta aireación se realiza introduciendo al matraz una pipeta esterilizada conectada a una línea de aire (Figura 1). En lo posible, los medios de cultivo deben estar libres de contaminación bacteriana (cultivos axénicos) y deben ser mantenidos en un medio que soporte

un

crecimiento exponencial (aproximadamente de 3 a 5 días), y que tenga un poder lo suficientemente eficiente para evitar variaciones significativas de pH durante el proceso.

Figura. l . Cultivo de Chlorella, medio liquido (esthtico). Células en suspensión por aireaci6n.

Para iniciar el cultivo, se inoculan 1OOmL de medio Bold con una asada del cultivo sólido de Chlorella vulgaris y se deja crecer de 5 a 7 días con temperatura, luz y aireación continuas. Este cultivo va a ser utilizado para inocular los medios que utilizaremos para los bioensayos y para realizar la curva. Cuando el cultivo se torna verde obscuro (fase

exponencial), se toman 50 mL del cultivo y se agregan a otro matraz con medio Bold y es mantenido en las mismas condiciones que el imterior.

5.4. Determinación del número de células presentes en el cultivo algal.

Para determinar el número de células presentes en el cultivo, se utiliza la cámara de Neubauer y se lleva a cabo el siguiente método.

l. Centrifugar el cultivo a 4000 rprn durante 15 minutos. 2. Descartar el sobrenadante

3. Resuspender el centrifugado en agua destilada. 4. Hacer el conteo celular de la siguiente manera:

a) Colocar una gota de muestra en el surco de la cámara. b) Dejar decantar por 5 minutos.

c) Hacer una lectura al microscopio óptico con un aumento de 1 OX.

(10)

J Contar las células presentes en 1/25 del sub-reticulo central de dos retículos de la

cámara. Calcular la media y multiplicar por 25. De esta manera se obtiene el número de células del sub-reticulo central.

J Para la obtención del número de células por mililitro, multiplicar la media (número

de células del sub-reticulo central) por 10,000.

J En caso necesario, contar un niimero mayor de cuadriculas del sub-reticulo, calcular

la media y proceder a calcular como se describe arriba.

6.

Método de evaluación de la sensibilidad de Chlorella vulgaris.

Para estas pruebas de sensibilidad con Chlorella, se realizaron pruebas de corta duración, en ellas se aplica un estímulo que produce una respuesta rápida en el organismo prueba.

El principio de este método, consiste en exponer el cultivo de Chlorella vulgaris a varias concentraciones (expresadas en m a ) del agente tóxico, en este caso: Fenol (C6 Hs

OH) y Dicromato de Potasio (K2 Cr2 (17); por un período de 96 horas, bajo las condiciones de la Norma. Este procedimiento, permite determinar la CE(1)SO; a las 96 horas de prueba.

Este método consta de dos etapas:

1. Prueba preliminar, para establecer el intervalo de concentraciones a ser utilizado en la

2. Prueba definitiva, para determinar la CE(1)SO; a 96 horas *

prueba definitiva.

En las pruebas preliminares, se comenzó con una concentración de lg/L, y se fue disminuyendo para determinar las concentraciones de las pruebas definitivas, y se realizaron seis tratamientos más un testigo, cada uno con su réplica.

Preparación de soluciones prueba.

Las soluciones prueba fueron prepara+ como se indica en

l a s

siguientes tablas; para Fenol (C6

H5

OH) son de menor concentración que las de Dicromato de Potasio

(

K

2

Cr2 0 7 ) debido a que las células prácticamente se deshacían en

l a s

concentraciones mayores a 100 mg/L:

Tabla de soluciones prueba de Dicromato de Potasio

(

K

2

Cn 0 7 ) :

. _ i . . .~ - " .. ". "" ."

(11)

Tabla de soluciones prueba de fenol (C6

H5

OH):

Concentración Concentración de Volumen de Volumen (mg(L) de solución solución stock agua destilada

stock (mg/L) adicionada ( m u (mL) .O032 0.5 5.6 1 .O056 3.0 3.2 1

.O1

1

i!

1

1.0

1

5.0

.O18 1.8 4.0

.O32 3.2 3.0

.O56 10 5.6 0.5

Control """""" """"""

I

6.0

Volumen de medio Bold

( m u

92.8 92.9 93.0 93.2 92.8 92.9 93.0

El volumen total de cada matraz es de 100 mL, a cada matraz se le agrega 1 mL de células, que equivalen a una concentración inicial de 1 O4 o 1 O6 célulaslmL.

Condiciones de prueba.

Las condiciones para los matraces de prueba son:

Todo lo relacionado al manejo de organismos y materiales en las pruebas, se realiza en la cámara de flujo laminar para evitar contaminación bacteriana. Para determinar el

crecimiento del cultivo durante la prueba, se realiza un conteo celular en el microscopio óptico (con la cámara de Neubauer) y en el espectrofotómetro (absorbancia luminosa 750 nm) al inicio, a las 48 y a las 96 horas de iniciada la prueba. La inhibición del crecimiento se determina a las 96 horas.

Cálculo de la CE(I)so o CESO.

(12)

al control. Estos porcentajes son utilizados para el cálculo de la

CE50,

através del análisis de regresión lineal, conforme Norma CETESB L5.017.

I

ACTIVIDADES

RE14LIZ,4D14S.

I

Las actividades realizadas relacionadas con el servicio social, fueron: Investigación bibliográfica. Durante este período, hubo un gran trabajo debido a que

habla que conocer la biología de los organismos y saber su manejo, cultivo y mantenimiento.

En el laboratorio, se comenzó desde:

Lavar el material que sería utilizado para los bioensayos.

Preparación y esterilización de medios de cultivo, líquido y sólido. Cultivo y mantenimiento de Chlorella vulgaris.

Separación de algas por centrifugación.

Cuantificación de células de Chlorella vulgaris por método espectrofotómetrico. Realización de pruebas expioratorias.

Realización de pruebas definitivas de toxicidad. Captura y análisis de resultados.

Elaboración de informe.

1

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS.

I

Se cumplieron los objetivos y metas propuestas al inicio del proyecto, aunque hay que mencionar que debido a la falta de algunos materiales no fue posible realizar mas

pruebas; pero se conoció la metodología de estas y su aplicación, así como la importancia de los bioensayos.

Además, se conoció sobre la biología, cultivo y mantenimiento de Daphnia magna Straus, como son: preparación de agua reconstituida, limpieza de cultivos, alimentación, obtención de parámetros fisicoquímicos (dureza, alcalinidad, pH, conductividad) y el Método de evaluación de toxicidad aguda con Daphnia magna Straus de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-087-1995-SCFI.

También se realiaron cultivos con la bacteria Bacillus cereus y conteos de colonias en cultivos relacionados con la prueba de Ames.

(13)

Grafica No. 1. Pruebas de evaluaci6n de sensibilidad con Fenol

(C6 H5 OH) utilizando Chlordla vulgaris

1500000

1000000

500000

O

control 0.0032 0.0056 0.01 0.018 0.032 0.056

Concentraciones en mglL

Grhfica No. 2. Pruebas de evaluaci6n de sensibilidad con e n o l

(C6 H5 cm) utilizando Chlorella vulgaris

0.2 - 1 I

control 0.0032 0.00% 0.01 0.018 0.032 0.056

(14)

Grdfica No. 3. Pruebas de evaluaci6n de sensibilidad con Dicromato de Potaslo

(K2 Cr2 07 ) utilizando Chlorella vulgaris.

B

25ooOOO

2000000

-

15oooOO

2 i

m 500000

o

O

3

:

E 1 o m o

a3

z

control 0.032 0.056 0.1 0.18 0.32 0.56

d,

Grafica No. 4. Pruebas de evaluaci6n de sensibilidad con Dicromato de Potasio (K2 Cr2 07 ) utilizando

Chlorella vulgaris.

M 0.15

,

(15)

una de las concentraciones utilizadas con respecto al control considerando el número de células y la absorbancia. Las gráficas 3 y 4 corresponden a las pruebas con Dicromato de Potasio (K2 Cr2 0 7 ) , donde se observa que hay inhibición con respecto al control, se observa también que entre algunas de las concentraciones utilizadas no hay mucha diferencia,

sobretodo en las lecturas de absorbancia, esto probablemente se debe a la presencia de color en el Dicromato (K2 Cr2 0 7 ) o algún manejo inadecuado de la muestra.

Por cuestión de tiempo y material, no fue posible establecer la

CE50,

por lo que el trabajo se continuará en el laboratorio.

Con base en los resultados obtenidos, se concluye:

1. Estas pruebas requieren ser llevadas a cabo en condiciones estandarizadas para poder obtener resultados confiables.

2. Los tóxicos de referencia utilizados, se consideran adecuados para evaluar la sensibilidad de los organismos en este tipo de pruebas.

3. Se debe tener cuidado en el método utilizado para cuantificar los,resultados, ya que ambos métodos tienen sus interferencias. En el caso del método de conteo al

microscopio, depende de la persona que lo realiza, por lo que se recomienda que sea la misma persona la que haga el conteo durante toda la prueba.

En el caso del método espectrofotométrico, la interferencia más importante es el color, ya que en este caso se utiliza Dicromato de Potasio (K2 Cr2 0 7 ) , el cual a concentraciones altas interfiere en los resultados.

Otro problema que se presenta, es que cuando se utiliza fenol (Cs

H5

OH), a veces las células se precipitan y esto altera el resultado al medir absorbancia.

Ambos métodos pueden complementarse, en el microscopio podemos observar el

estado de las células, y de acuerdo a eso determinar en el espectrofotómetro si el incremento en la absorbancia se debe al crecimiento o a células muertas, como en el caso del Fenol.

4. Se recomienda que para la realización de este tipo de pruebas se utilicen métodos estandarizados y se controlen adecuadamente los parámetros ambientales (sobre todo la temperatura) ya que la alteración de estos parámetros modifica notablemente la

(16)

1

CRITERIOS DE EVALUACI~N.

De acuerdo al cumplimiento de los objetivos del trabajo, análisis de resultados y el desempeño y aprovechamiento del alumno en el manejo de conceptos, técnicas analíticas y

manejo de equipo que se requiera utilizar. Además, se realizaron reportes mensuales de actividades ante el Instituto Nacional de Ecología ( INE ).

(17)

I

BIBLIOGRAF~A.

I

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Figure

FIGURA 2. Medio  de  agar  inclinado  (medio  sólido)
Tabla  de  soluciones  prueba  de  Dicromato  de Potasio  ( K 2 Cn  0 7 ) :
Tabla de soluciones  prueba  de  fenol  (C6  H5  OH):

Referencias

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