LA AGREGACIÓN CELULAR EN LA PRODUCCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS EN CULTIVOS VEGETALES IN VITRO

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PALABRAS CLAVE / Agregación Celular / Compartamentalización / Diferenciación / Metabolitos Secundarios / Recibido: 16/05/2007. Modificado: 17/09/2007. Aceptado: 18/09/2007.

Gabriela Trejo-Tapia. Doctora en Ciencias, Centro de Investigación y Estudios Avanzados, Ins-tituto Politécnico Nacional (CINVESTAV-IPN), México. Investigadora, Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi-IPN), México. Dirección: Departamento de Biotecnología, CeProBi-IPN. Km. 8.5 Carretera Yautepec-Jojutla. Colonia San Isidro. Yautepec, Morelos, México 62731. e-mail: gttapia@ipn.mx

Mario Rodríguez-Monroy. Doctor en Ciencias, Universidad Autónoma de México. Investigador, CeProBi-IPN, México. e-mail: mrmonroy@ipn.mx

LA AGREGACIÓN CELULAR

EN LA PRODUCCIÓN DE METABOLITOS

SECUNDARIOS EN CULTIVOS

VEGETALES IN VITRO

GABRIELA TREjO-TAPIA y MARIO RODRíGUEz-MONROy

as plantas son fuente de una amplia variedad de compuestos químicos, conocidos como metabolitos secundarios, que son utilizados como fármacos, pesti-cidas, colorantes, saborizantes y fragan-cias, entre otros. Comúnmente, estos com-puestos se extraen de plantas silvestres o cultivadas, lo que tiene una serie de des-ventajas. Su acumulación en las plantas es baja y lenta, ya que está regulada espacial y temporalmente. Es decir, ocurre en cé-lulas, órganos y tejidos específicos, en fases determinadas del ciclo de vida de la planta, bajo condiciones estaciónales o de estrés (Verpoorte et al., 2002). Puede existir alta variabilidad entre poblaciones e inclusive entre individuos. En el caso de plantas silvestres, su explotación comercial está basada en la recolección de material en su hábitat natural, frecuentemente in-cluyendo la raíz, lo que ha provocado que muchas estén amenazadas o en peligro de extinción.

La producción del Taxol®,

compuesto de alta demanda por su activi-dad citotóxica, y la del alcaloide vinblasti-na, potente antileucémico, son ejemplos de fármacos que se obtienen de plantas cuya demanda es difícil de abastecer. Para prepa-rar 1kg de Taxol, se necesita la corteza de 1000 árboles de Taxus brevifolia L. (Kieran

et al., 1997). Asimismo, para obtener 1g de vinblastina, se necesita media tonelada de hojas secas de Catharanthus roseus (L.) G. Don (Sottomayor et al., 2004).

El cultivo masivo de cé-lulas vegetales se ha propuesto como una alternativa biotecnológica para el desarro-llo de sistemas de producción de metabo-litos secundarios (Sharp y Doran, 2001). Sin embargo, después de más de 40 años de investigación y desarrollo tecnológico, los casos exitosos que justifican técnica y económicamente su operación a nivel comercial son limitados, pudiéndose citar entre ellos la producción de shikonina por células de Lithospermum erythrorhizon y

de Taxol por células de Taxus spp. (Zhao

et al., 2005).

El cultivo de células y te-jidos vegetales se basa en el principio de to-tipotencia celular, que establece que a partir de cualquier célula de una planta es posible regenerar un individuo completo. Mediante esta herramienta, es posible obtener cultivos de células no diferenciadas, como callos y suspensiones celulares, además de cultivos de órganos como brotes y raíces. Los sis-temas que operan a nivel comercial usan principalmente cultivos de células en sus-pensión (Zhao et al., 2005) aunque también se reporta un proceso que opera con raíces transformadas (Guillon et al., 2006).

Los cultivos de células no diferenciadas presentan velocidades de creci-miento mayores a los de células diferencia-das u órganos (raíces y brotes); además, los procesos de transferencia de masa son más eficientes y pueden desarrollarse cultivos con densidades celulares más elevadas, lo que re-presenta ventajas para el desarrollo, control

RESUMEN

El cultivo de células vegetales es una alternativa biotecnoló-gica para la producción de metabolitos secundarios. Sin embar-go, la productividad de los sistemas in vitro es menor a la ob-tenida de plantas. En esta revisión se ilustra la diferenciación y compartamentalización celular como eventos necesarios para la síntesis de metabolitos secundarios en las plantas. Se discute la inducción de la agregación celular en los cultivos in vitro como una de las estrategias para favorecer la acumulación de estos compuestos químicos. Este efecto positivo podría ser explicado

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y manipulación de procesos a escala industrial. Sin embargo, la falta de diferenciación celular en los cultivos puede ocasionar que la concentración del metabolito en el cultivo sea me-nor que en la planta. Por ello, la pro-ductividad del sistema in vitro puede ser menor tanto en biorreactor como en matraz y, en consecuencia, el pro-ceso no es económicamente rentable (Verpoorte et al., 2002) y el uso de suspensiones celulares agregadas o poco diferenciadas podría representar una de las limitantes para el desarro-llo comercial de sistemas biológicos en biorreactores.

En las plantas, la diferenciación consiste en el conjunto de procesos moleculares, bioquímicos

de los alcaloides indólicos. Estos compuestos se encuentran princi-palmente en plantas de las familias Apocinaceae, Loganiaceae, Rubia-ceae y NissaRubia-ceae y se caracterizan por la presencia de los núcleos indó-lico e iridoide, los cuales provienen de la triptamina y la secologanina (Roberts y Strack, 1999).

La biosíntesis de los alcaloides indólicos es sumamente compleja y todavía no se conocen todas las en-zimas involucradas, ni los mecanis-mos que regulan su biosíntesis. Uno de los estudios más completos es el correspondiente a la biosíntesis del alcaloide bisindólico vinblastina en

C. roseus. La vinblastina resulta de la condensación de los alcaloides cata-Figura 1. Esquema de un corte transversal de hoja de

Catharan-thus roseus ilustrando la compartamentalización de las enzimas de la ruta de biosíntesis del alcaloide bisindólico vinblastina. TDC: triptofano descarboxilasa, STR: estrictosidina sintasa, D4H: deacetoxi-vindolina-4-dioxigenasa, DAT: 4-O-deacetilvindolina-4-O-acetiltransferasa.

Figura 2. Compartamentalizacion celular de la ruta de biosíntesis de la vinblastina. TDC: triptofano descarboxilasa, STR: estric-tosidina sintasa, D4HH deacetoxi-vindolina-4-dioxigenasa, DAT: 4-O-deacetilvindolina-4-O-acetiltransferasa. Fuentes: Roberts y Strack (1999), Collu et al. (2002).

y fisiológicos mediante los cuales una célula meristemática adquiere propiedades metabó-licas, estructurales y/o funcionales diferentes a las de la célula progenitora. Entre otros cambios, se presentan: 1) el desarrollo de organelos como los plástidos para realizar la fotosíntesis (cloroplastos) o vacuolas en donde se biosintetizen y acumulen metabo-litos secundarios, 2) la formación de pared celular secundaria característica de las célu-las que constituyen el tejido vascular, 3) la organización de las células para constituir los diferentes tejidos y órganos de la planta, y 4) la especialización para la biosíntesis y/o acumulación de metabolitos (St-Pierre et al., 1999; De-Luca y St-Pierre, 2000).

La producción y acumu-lación de metabolitos secundarios es una expresión de un estado particular de diferen-ciación celular, el cual es influenciado por un número de factores; diferentes clases de metabolitos secundarios requieren diferentes grados de diferenciación celular o tisular. La formación de gradientes físicos o bio-químicos debidos a la organización celular es también un factor importante. Por ejemplo, la acumulación de isoprenoi-des depende de la diferenciación de plástidos, debido a que la mayoría de las enzimas de la ruta de biosíntesis se localizan en estos organelos. En otros casos es necesario el desarrollo de órganos de almacenamiento, como los pelos glandulares y las células la-ticíferas en el caso de los alcaloides (Samanani y Facchini, 2006).

Como alternativa a las suspen-siones celulares se ha considerado el uso de sistemas in vitro diferenciados como son brotes o raíces, que si bien presentan rendimientos mejores a los de las células en suspensión, desde el punto de vista tecnológico su cul-tivo a gran escala es más complejo y costoso (Verpoorte et al., 2002); por ello se ha buscado promover la dife-renciación de cultivos de células en

suspensión para incrementar la producción de metabolitos secundarios. Tal es el caso del establecimiento de cultivos clorófilos, es decir, con cloroplastos funcionales (Taya et al., 1995; Kino-Oka et al., 2001). Pero las alternativas más exploradas han sido la se-lección de líneas celulares con agregados de “mayor” tamaño y el desarrollo de agrega-dos con células “especializadas” (Jianfeng

et al., 1998a). El objetivo del presente tra-bajo es mostrar la complejidad anatómica y biosintética que representa para la planta la acumulación de metabolitos secundarios, así como revisar el papel de la agregación ce-lular en los cultivos in vitro para la produc-ción de estos compuestos.

Diferenciación Celular y Biosíntesis de Metabolitos Secundarios: Los Alcaloides Indólicos

Para ejemplificar la es-trecha relación entre la biosíntesis de un metabolito secundario y la diferenciación celular en las plantas, se presenta el caso

rantina y vindolina; ésta última, a su vez, es sintetizada en seis pasos a partir del alcaloi-de tabersonina. Mientras que la catarantina se encuentra en cualquier órgano de la plan-ta, la vindolina es sintetizada únicamente en las hojas y tallo (De-Luca y Cutler, 1987; De-Luca y St-Pierre, 2000).

La distribución celular de algunas de las enzimas involucradas en la biosíntesis de los alcaloides indólicos ha sido estudiada en plantas de C. rosesus (St-Pierre et al., 1999). Las enzimas triptofano descarboxilasa (TDC) y estrictosidina sinta-sa (STR) se localizan en las células epidér-micas de tallos, hojas y botones florales, y en el protodermo y células corticales que ro-dean el meristemo apical de la punta de las raíces. Por su parte, las enzimas desacetoxi-vindolina-4-hidroxilasa (D4H) y acetilvindo-lina 4-O-acetiltransferasa (DAT) están res-tringidas a células especializadas conocidas como laticíferas e idioblastos de hojas, tallos y botones florales. Los estudios (St-Pierre

et al., 1999; Samanani y Facchini, 2006) muestran la separación espacial de la ruta de biosíntesis de vindolina en células particulares de hoja, tallo y flores, e indican que la ruta temprana, la que va a la triptamina, ocurre en las ca-pas epidérmicas de hojas y tallos in-maduros, mientras que las etapas tar-días correspondientes a la biosíntesis de vindolina se localizan en células laticíferas e idioblastos (Figura 1).

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nes celulares formadas por células individua-les o agregados “pequeños”. Los agregados tienden a sedimentar más fácilmente que las células libres, lo que dificulta mantenerlos en suspensión, o debido a su adhesión llegan a obstruir las tuberías en los biorreactores, por mencionar algunas dificultades de índole tecnológica.

Las células que confor-man una suspensión “fina” son relativamente similares y resulta difícil que en cada una de ellas se lleven a cabo todos los procesos necesarios para la biosíntesis de metabolitos secundarios antes mencionados: síntesis de intermediarios, condensación, transporte y acumulación (Figura 3b). Por ello se plantea que la formación de agregados o el cultivo de órganos puede ser una alternativa más atractiva para la síntesis y acumulación de metabolitos secundarios.

La influencia de la agrega-ción y el tamaño de los agregados celulares en la acumulación de metabolitos secun-darios se han estudiado en varias especies, tanto en matraz como en biorreactor (Tabla I). Estos agregados se caracterizan por me-dir varios milímetros e incluso centímetros de diámetro; son esféricos, de superficie lisa, cohesivos y presentan cierto grado de diferenciación celular o tisular (Figura 3c). En condiciones óptimas, las células que los conforman pueden proliferar sin perder su vacuola, lo que muestra claramente la

nece-sidad de transporte de intermediarios entre los distintos organelos celulares. Lo anterior muestra en su conjunto que la biosíntesis de la vinblastina requiere células de diferentes tipos y con determinadas características (Fi-gura 1) además de la especialización intrace-lular que involucra a múltiples compartimen-tos celulares (Figura 2; Roberts y Strack, 1999; St-Pierre et al., 1999).

Figura 3. Agregados de Uncaria tomentosa. a: suspensión celu-lar con agregados de distinto tamaño, b: agregado no-morfogé-nico, c: agregado morfogéno-morfogé-nico, d: esquema de la organización celular del agregado morfogénico.

TABLA I

ESTUDIOS qUE RELACIONAN EL TAMAñO DE AGREGADO CELULAR CON LA PRODUCCIóN DE METABOLITOS SECUNDARIOS EN MATRACES Y BIORREACTOR

Planta Metabolito Sistema de cultivo Diámetroa Referencia

Camptotheca acuminata Camptotecina Matraces

Biorreactor airlift (5L) 2-4mm2-4mm Yu et al. (2005)

Carthamus tinctorius Colorante rojo Matraces >1,0mm Hanagata et al. (1993)

Catharanthus roseus Alcaloides indólicos Matraces

Tanque agitado (3L) 3-7mm0,053-0,108µm Zhao Keβler et al.et al. (2001) (1999)

Cinchona ledgeriana quinina y quinidina Matraces 3-6mm Hoekstra (1993)

Catharanthus rosesus Ajmalicina Matraces 8mm Montiel et al. (2007)

Daucus carota Antocianinas Matraces 1mm Madhusudhan y Ravishankar

(1996)

Fragaria ananassa Antocianinas Matraces 390µm Edahiro y Seki (2006)

Hypericum perforatum Hipericina, pseudohipericina

e hiperforina MatracesBiorreactor de columna ≥1mm Karppinen et al. (2006)

Rhodiola sachalinensis Salidrósidos Matraces

Airlift (1 y 10L) 2-5mm5mm Jianfeng et al. (1998a, b)

Rhodiola rosea Salidrósidos Matraces >1cm György et al. (2005, 2006)

Salvia officinalis Acido ursólico Matraces

Tanque agitado (1L) <100µm<100µm Bolta et al. (2003)

Saussurea medusa Jaceosidina e hispidulina Matraces 2-4mm Zhao et al. (2003),

Fu et al. (2005) Saussurea medusa Flavonoides Airlift (2L) 5-10mm Yuan et al. (2004)

Tagetes patula Tiofeno Matraces 11-13mm Hulst et al. (1989)

Uncaria tomentosa Alcaloides oxindólicos Matraces 5mm Trejo et al. (2005)

Vaccinium pahalae Antocianinas Matraces 0,018-0,232µm

<0,279µm Pèpin Meyer et al.et al. (1999) (2002)

Vitis vinifera Antocianinas Matraces <50µm qu et al. (2006)

a Diámetro en el que se reporta el mayor contenido de metabolito secundario.

La Agregación Celular como Alternativa para la Acumulación de Metabolitos Secundarios en Cultivos

In Vitro

Las suspensiones vegeta-les están formadas por célu-las meristemáticas, es decir células no diferenciadas, que no se separan después de la división y forman agregados multicelulares de diferente tamaño y forma (Figura 3a, Meyer et al., 2002). La ten-dencia natural a agregarse está regulada por la cohe-sividad de la pared celular y permite la comunicación célula-célula, que a la vez puede favorecer el transporte de intermediarios, necesario para la biosíntesis de metabolitos secun-darios, como se indicó anteriormente.

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suspensio-integridad. Este tipo de agregados son con-siderados como un grupo de células “auto-inmovilizadas”.

Hoekstra (1993) propuso el cultivo de agregados de Cinchona ledge-riana Moens. de 3-6mm de diámetro para la producción de quinina y quinidina. Los agregados de 2-4mm de Rhodiola sachali-nensis A. Bor. acumularon hasta diez veces más salidrósidos que agregados de tamaño menor (Jianfeng et al., 1998a, b). Inclusi-ve, en un reactor tipo airlift, suspensiones de agregados de 3-7mm acumularon seis veces más metabolitos que las suspensiones finas. Por otro lado, los agregados de C. ro-seus de 3-7mm de diámetro produjeron dos veces más alcaloides que las suspensiones finas (Zhao et al., 2001). En otro estudio la producción de jaceosidina e hispidulina en

Saussurea medusa fue mayor en agregados de 2-4mm de diámetro (Fu et al., 2005). Se observó una relación directa entre el tamaño de los agregados de Fragaria ananassa R. y la producción de antocianinas; la línea “agre-gada” produjo 95% más antocianinas que la “fina” (Edahiro y Seki, 2006). En contraste, las células aisladas de Salvia officinalis L. produjeron 50 veces más ácido ursólico (ter-peno) que los agregados (Bolta et al., 2003).

Los estudios anteriores muestran que, efectivamente, el grado de agregación y el tamaño de los agregados celulares influyen en el nivel de producción de metabolitos secundarios. Sin embargo, no es claro de qué manera afectan la fisiología y el metabolismo de las células. ¿Por qué agregados “más grandes” (≥1mm) producen más metabolitos secundarios que agrega-dos “pequeños” (<1mm)?. La mayoría de las explicaciones apuntan en dos sentidos: 1) la agregación influye sobre las condicio-nes locales de las células que conforman un agregado celular, y 2) está relacionada con la morfogénesis.

Tamaño de los Agregados y Procesos de Transferencia de Masa

Las diferencias en la pro-ducción de metabolitos secundarios obser-vada entre los agregados y las suspensiones “finas” han sido analizadas considerando problemas de difusión de nutrientes. Es de-cir, el tamaño de los agregados influye en los procesos de transferencia de masa, ya que las células localizadas en el interior de

un agregado de un tamaño relativamente grande no están expuestas de manera simi-lar a los nutrientes, iluminación, O2 y otros

factores microambientales en comparación a las células localizadas en la periferia (Hulst

et al., 1989; Pépin et al., 1999; Meyer et al., 2002). De los factores mencionados, la di-fusión del O2 ha recibido la mayor atención,

lo que podría ser consecuencia de la impor-tancia que tiene el O2 como nutriente para

el desarrollo de cultivos aeróbicos, como lo son las células vegetales en suspensión (Kie-ran et al., 1997). El O2 se constituye como

un nutriente fundamental en los procesos de oxidación y para la obtención de energía por parte de las células; sin embargo, es consi-derado como un nutriente limitante en los cultivos en suspensión debido a su baja solu-bilidad en agua, de apenas 8mg·l-1.

Como consecuencia de lo anterior, las células del centro de un agrega-do “grande” pueden llegar a estar limitadas en su disponibilidad de O2, generando una

condición de estrés y como la acumulación de metabolitos secundarios. O bien, pue-de inhibirse la producción pue-del compuesto, si está asociada al O2. Con la finalidad de

probar esta hipótesis se ha determinado para una serie de líneas celulares el perfil de con-centración de O2 en función del diámetro del

agregado, así como el diámetro crítico (dcrit;

Tabla II). Este parámetro se define como el diámetro máximo para la respiración ilimi-tada a través del agregado y se calcula la ecuación 1 (Hulst et al., 1989) como

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donde dcrit : diámetro crítico, De : coeficiente

de difusión efectiva de O2 (m2·s-1), cs :

con-centración de O2 en la superficie del

agre-gado (mol·m-3), c

eq : concentración de O2 en

el equilibrio (mol·m-3), y OUR: velocidad de

consumo de O2 (mol·m-3).

Hulst et al. (1989) esta-blecieron líneas celulares de Tagetes patula

con agregados de 1,0 a 12,8mm de diámetro y observaron que a partir de los 3,0mm, la producción de tiofeno (metabolito con activi-dad insecticida) fue proporcional al aumento del diámetro del agregado. Incluso, la canti-dad de tiofeno excretada al medio dependió del tamaño del agregado. Los agregados de 1mm no excretaron los metabolitos, mientras que los de 1,4-5,4mm, lo hicieron en niveles

de 8-40µmol·cm-3 de células, representando

hasta el 90% del total producido. Este resul-tado lo atribuyeron a que en los agregados de ese tamaño, las células del centro estaban limitadas en su disponibilidad de O2 y por lo

tanto “estresadas”. Se determinó que en un agregado de 1mm de diámetro, la concentra-ción de O2 en el centro es solo de 30% en

comparación a la superficial, y es cercana a cero en agregados de 3mm. Es decir, en los agregados más productivos las células están limitadas por O2.

De manera contraria, en suspensiones de C. roseus cultivadas en un biorreactor tipo tanque agitado, la produc-ción de ajmalicina (alcaloide indólico) está inhibida en agregados con diámetro >250µm (Keβler et al., 1999). Previamente se demos-tró que existe una correlación positiva entre la concentración de O2 disuelto y la

produc-ción del alcaloide (Schlatmann et al., 1995), por lo que se propuso que el comportamien-to de los agregados “grandes” (≥1000µm) podría explicarse en base a problemas de difusión de O2. Calcularon que un agregado

de 250µm está formado por más de 1500 cé-lulas y que el dcrit era de 3,8mm. Es decir,

las células que conformaban esos agregados de 250µm no deberían estar limitadas por O2. Entonces, la limitación de este nutriente

no explica la disminución en la acumulación de ajmalicina.

Agregación y Morfogénesis

Como se discutió en la sección anterior, la limitación de O2 no

ex-plica en todos los casos las diferencias ob-servadas en el nivel de metabolitos secun-darios en función del tamaño del agregado, por lo que se ha intentado determinar si la agregación celular de los cultivos in vitro

implica un proceso de diferenciación celu-lar. Para ello se busca generar “agregados compactos” o compact callus aggreggates

(CCA) y tratar de evidenciar la formación de estructuras morfogénicas que pudieran asociarse con la producción de metabolitos secundarios.

Los estudios histológicos de los agregados de C. ledgeriana (Hoeks-tra, 1993), R. sachalinensis (Jianfeng et al., 1998a, b) y C. roseus (Zhao et al., 2001) permitieron conocer que no solo estaban formados por células meristemáticas, como ocurre en las suspensiones “finas” (Figura 3). En particular, los agregados de R. sa-chalinesis presentaron en su centro tejido de parénquima y en las capas periféricas células meristemáticas rodeadas por una capa epidérmica. Mientras los agregados de C. ledgeriana y C. roseus presentaron tejido vascular, los agregados compactos de S. medusa productores de jaceosidina mostraron potencial para regenerar plantas (Fu et al., 2005). En agregados compactos TABLA II

DIáMETRO CRíTICO (mm) DE ALGUNOS CULTIVOS DE CéLULAS VEGETALES

Especie Metabolito Diámetro

crítico Referencia Catharanthus roseus Alcaloides indólicos 3,8 Keβler et al. (1999)

Tagetes patula Tiofeno 3,0 Hulst et al. (1989)

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de Hypericum perforatum L. se observó la acumulación de hipericinas, compuestos con actividad antidepresora, en las células de la superficie del agregado durante la etapa tar-día de crecimiento (Song et al., 2007). Es-tos antecedentes muestran que el grado de agregación y compactación están relaciona-dos con la morfogénesis.

El desarrollo de líneas celulares con las características antes des-critas ha sido resultado principalmente de la manipulación de los componentes del medio de cultivo y el tipo de explante. Por ejemplo, 1) la sustitución del ácido 2,4-di-clorofenoxiacético por una auxina más débil como el ácido α-naftalenacético o el ácido 3-indol acético (Hulst et al., 1989; Hoeks-tra, 1993; Chang et al., 2006), 2) la susti-tución de la citocinina cinetina por 6-ben-cilaminopurina (Hoekstra, 1993; Zhao et al.,2001), 3) la modificación en la relación auxina/citocinina (Hoekstra, 1993), 4) el au-mento en la concentración de nitrato, y 5) la modificación en la concentración de otros componentes del medio de cultivo como vi-taminas o sacarosa (Zhao et al., 2001). En lo que al explante se refiere, en la especie

Calophyllum inophyllum Linn. el uso de nodos/internodos favoreció el desarrollo de agregados compactos en comparación a hoja (Pawar et al., 2007), mientras que en R. sa-chalinensis, se formaron a partir de explan-tes de cotiledones y no de tallos u hojas (Wu et al., 2003).

Recientemente Montiel et al. (2007) reportaron que la expresión del gen Agl12 de Arabidopsis thaliana en sus-pensiones celulares de C. roseus promueve el desarrollo de agregados globulares con células tipo parénquima. En estos agregados la producción del alcaloide ajmalicina fue mayor que en las suspensiones no transfor-madas. El gen Agl12 actúa al nivel de la expresión de genes que codifican para dos enzimas de la ruta de biosíntesis de alcaloi-des, la geraniol-10-hidroxilasa (G10H) y la 1-deoxi-D-xilulosa 5-fosfato sintasa (DXS),

las cuales están involucradas en la biosínte-sis de la secologanina (precursor terpénico). Estos resultados muestran que los factores de transcripción involucrados en la diferen-ciación a tejidos u órganos pueden constituir una nueva herramienta de la ingeniería me-tabólica para diseñar cultivos in vitro capa-ces de producir metabolitos secundarios.

Combinación de la Agregación con otras Estrategias

Los trabajos reseñados mostraron que la agregación promueve la producción de metabolitos secundarios. Sin embargo, esto no ha sido suficiente para de-sarrollar bioprocesos económicamente ren-tables. Por ello, se ha recurrido a combinar la agregación con otras estrategias como la

selección de líneas celulares, la elicitación o la adición de precursores. O bien, a utilizar a los agregados como “bio-transformadores”. A continuación se presentan algunos ejemplos.

Rhodiola rosea L. es una especie vegetal de interés medicinal que acumula en su rizoma salidrósidos y los gli-cósidos de cinamil-alcohol, rosina, rosavina y rosarina. En cultivos de CCA de R. rosea

se estimuló la producción de rosina y rosa-vina mediante la biotransformación del cina-mil-alcohol (György et al., 2004). Por otro lado, se observó la formación de nuevos compuestos químicos con potencial biológi-co. Al adicionar glucosa al medio de cultivo la capacidad de biotransformación a rosina se duplicó (György et al., 2005, 2006). En otro caso, qu et al. (2006) propusieron que la adición de fenilalanina (30µmol·l-1) y

me-til jasmonato (218µmol·l-1) a agregados de

50µm de V. vinifera estimulaba hasta en cinco veces la producción de antocianinas. En CCA de R. sachalinensis se observó que una mayor relación auxina:citocininas era benéfica tanto para el desarrollo de los agregados como para la producción de los salidrósidos (Xu et al., 1999). Se observó también que la adición al medio de cultivo de sacarosa (100g·l-1) tuvo un efecto positivo

en la síntesis de los compuestos químicos. Los resultados reseñados muestran que la obtención de agregados ce-lulares es una estrategia que favorece la sín-tesis y acumulación de metabolitos secun-darios en los cultivos in vitro. Estos agrega-dos podrían asemejar hasta cierto punto la compartamentalización que se presenta en las plantas y que permite la biosíntesis de compuestos químicos. La combinación de la agregación con otras estrategias, tales como la selección de líneas celulares, la elicita-ción y la adielicita-ción de precursores, constituye una alternativa para desarrollar bioprocesos

in vitro para la producción de compuestos químicos de alto valor agregado.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por la Secretaría de Investigación y Posgrado del IPN (Proyecto SIP 20070118). Los auto-res son becarios COFAA y EDI.

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CELLULAR AGGREGATION IN SECONDARy METABOLITE PRODUCTION IN IN VITRO PLANT CELL CULTURES Gabriela Trejo-Tapia and Mario Rodríguez-Monroy

SUMMARY

effect might be explained as a consequence of the development of morphogenic structures and/or a stress condition induced by oxygen limitation in the interior of the aggregates. Finally, it is shown that the combination of aggregation with other strategies such as selection of cell lines, elicitation or precursor addition constitutes an alternative for the development of bioprocesses based on plant cell cultures for the production of high value chemical compounds.

Plant cell culture represents a biotechnological alternative to direct extraction of whole plant for production of secondary me-tabolites. However, the productivity of in vitro systems is lower than that obtained from plants. This review illustratates cell dif-ferentiation and compartmentalization as necessary events for the biosynthesis of chemical compounds. The induction of in vitro

cell aggregation is discussed as one of the strategies to stimu-late the accumulation of the compounds of interest. This positive

A AGREGAÇÃO CELULAR NA PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS NOS CULTIVOS VEGETAIS

IN VITRO

Gabriela Trejo-Tapia e Mario Rodríguez-Monroy

RESUMO

sitivo poderia ser explicado como conseqüência da formação de estruturas morfogênicas e/ou por uma condição de estresse por limitações de oxigênio ao interior dos agregados. Finalmente, se mostra que a combinação da agregação com outras estra-tégias tais como a seleção de linhas celulares, a elicitação e a adição de precursores constituem uma alternativa para desen-volver bioprocessos a partir de células vegetais in vitro para a produção de compostos químicos de alto valor agregado. O cultivo de células vegetais é uma alternativa biotecnológica

Figure

Figura  2.  Compartamentalizacion  celular  de  la  ruta  de  biosíntesis  de  la  vinblastina

Figura 2.

Compartamentalizacion celular de la ruta de biosíntesis de la vinblastina p.2
Figura  3.  Agregados  de  Uncaria  tomentosa.  a:  suspensión  celu- celu-lar  con  agregados  de  distinto  tamaño,  b:  agregado   no-morfogé-nico,  c:  agregado  morfogéno-morfogé-nico,  d:  esquema  de  la  organización  celular  del  agregado  morfog

Figura 3.

Agregados de Uncaria tomentosa. a: suspensión celu- celu-lar con agregados de distinto tamaño, b: agregado no-morfogé-nico, c: agregado morfogéno-morfogé-nico, d: esquema de la organización celular del agregado morfog p.3

Referencias

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