Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Citrus limetta sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Y PARASITOLOGÍA. CI. “Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de. CI EN. Citrus limetta sobre el crecimiento de Listeria. DE. monocytogenes”. TESIS. BIÓLOGO - MICROBIOLÓGO. AUTOR: Br. Jackson Ivan Briceño Muñoz ASESOR: Dr. Pedro Estuardo Mercado Martínez. BI. BL. IO. TE. CA. PARA OBTENER EL TÍTULO DE. TRUJILLO – PERÚ 2016. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE. G. LO. DR. ORLANDO GONZÁLES NIEVES. IC. AS. TRUJILLO. AS. BI. O. RECTOR. CI EN. CI. DR. RUBÉN VERA VÉLIZ. DE. VICE-RECTORA ACADÉMICO. VICE-RECTOR ADMINISTRATIVA. BI. BL. IO. TE. CA. DR. WEYDER PORTOCARRERO CÁRDENAS. DR. ESTEBAN ILICH ZERPA PROFESOR SECRETARIO GENERAL. ii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS. G. LO. DR. MARCO SALAZAR CASTILLO. IC. AS. BIOLÓGICAS. CI EN. CI. AS. BI. O. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. DR. SANTOS ENRIQUE PADILLA SAGASTEGUI. BIOLÓGICAS. DRA. EVA VILLANUEVA TARAZONA. BI. BL. IO. TE. CA. DE. PROFESOR SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS. DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. iii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CERTIFICACIÓN DEL ASESOR. AS. El que suscribe, Dr. Pedro Mercado Martínez, en calidad de profesor asesor de la tesis:. IC. Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Citrus limetta sobre el. O. LO. G. crecimiento de Listeria monocytogenes.. BI. CERTIFICA:. AS. Que la investigación ha sido desarrollada de conformidad con los objetivos propuestos en su perfil académico y que el informe ha sido revisado y acoge las. CI. observaciones y sugerencias alcanzadas.. CI EN. Por ello, autorizo al Br. Jackson Ivan Briceño Muñoz para continuar con los. BI. BL. IO. TE. CA. DE. procedimientos según sus fines.. Dr. Pedro Mercado Martínez ASESOR. iv. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. AS. Señores miembros del jurado dictaminador:. IC. En cumplimiento con las disposiciones reglamentarias vigentes para la. G. obtención de grados y títulos de las Escuela Académica Profesional de Microbiología. LO. y Parasitología, Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de. BI. O. Trujillo, someto a vuestra consideración y criterio el presente informe de tesis titulado: “Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Citrus limetta sobre el. AS. crecimiento de Listeria monocytogenes” con la cual pretendo cumplir con los. Trujillo, Julio del 2016. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. requisitos para optar el título de Biólogo-Microbiólogo.. Br. Jackson Ivan Briceño Muñoz.. v. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. O. Dr. Icela Rodríguez Haro. LO. G. IC. AS. MIEMBROS DEL JURADO. CI EN. CI. AS. BI. PRESIDENTE. SECRETARIO. BI. BL. IO. TE. CA. DE. Ms. C. Eduardo Muñoz Ganoza. Dr. Pedro Mercado Martínez VOCAL. vi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN. AS. Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran que. IC. el presente informe de tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales,. AS. BI. O. LO. G. siendo APROBADO por UNANIMIDAD.. CI. Dr. Icela Rodríguez Haro. Ms. C. Eduardo Muñoz Ganoza SECRETARIO. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. PRESIDENTE. Dr. Pedro Mercado Martínez VOCAL vii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA. IC. para lograr mis objetivos, y por su infinita bondad y amor.. AS. A Dios, por haberme permitido llegar hasta este punto, dándome salud. LO. G. A mis familiares:. O. Mamá y Papá, por su apoyo incondicional en cada paso que he dado. BI. en la vida y darme esa fuerza que me ayuda a seguir adelante.. AS. Cecilia, Jorge y Luis Jesús, por darme la fuerza y la alegría para seguir. CI. adelante.. CI EN. A mis amigos, Lizbeth, Yuli, Iris, Gabriel, Rosita, por el día a día, por su paciencia, sus ocurrencias, sus consejos, su cariño, por permitirme. BI. BL. IO. TE. CA. DE. compartir estos años a su lado, por ser mi familia cercana.. viii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTO. AS. Un cordial agradecimiento a mi asesor de tesis Dr. Pedro Mercado. IC. Martínez por su apoyo y guía en la investigación. LO. G. A los miembros del jurado, quienes aportaron con su amplia. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. experiencia en esta investigación.. ix. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN Los aceites esenciales de cítricos no sólo representan una alternativa en la. AS. conservación de alimentos frescos, sino que además son reconocidos como. IC. sustancia seguras (GRAS) por la FDA y se ha encontrado que son inhibidores. G. contra una gama de bacterias Gram-positivas y Bacterias Gram-negativas. La. LO. presente investigación tiene como objetivo determinar la concentración. O. mínima inhibitoria del aceite esencial de Citrus limetta sobre el crecimiento de. BI. Listeria monocytogenes. Para ello se obtuvo el aceite esencial a partir de la. AS. cáscara del fruto de Citrus limetta, mediante la técnica de Hidrodestilación tipo Clevenger. Luego se determinó el tiempo de generación (Tg) de un cultivo de. CI. Listeria monocytogenes proporcionado por el Laboratorio de Fisiología y. CI EN. Genética Microbiana de la Universidad Nacional de Trujillo. Para determinar la Concentración Mínima inhibitoria (CMI) se utilizó de la técnica de dilución. DE. en Caldo dónde se incubó únicamente por el tiempo de generación de la bacteria. Se evaluaron cuatro clones del cultivo de Listeria monocytogenes. La. CA. CMI fue 10 g/mL para los cuatro clones. Por lo tanto el aceite esencial de. TE. cáscara de Citrus limetta “lima” tiene la capacidad de inhibir el crecimiento de. BL. IO. Listeria monocytogenes.. BI. Palabras clave: aceite esencial, concentración mínima inhibitoria, Listeria monocytogenes.. x. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONTENIDO AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO………….ii. AS. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS…...............iii. G. IC. CERTIFICACIÓN DEL ASESOR…………………………………………………..iv. LO. PRESENTACIÓN.........................................................................................................v. BI. O. MIEMBROS DEL JURADO.......................................................................................vi. AS. APROBACIÓN..........................................................................................................vii. CI. DEDICATORIA........................................................................................................viii. CI EN. AGRADECIMIENTO ................................................................................................ix RESUMEN ..................................................................................................................x. DE. CONTENIDO .............................................................................................................xi. CA. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................1 MATERIAL Y MÉTODO……....................................................................................7. TE. RESULTADOS ..........................................................................................................11. IO. DISCUSIÓN ..............................................................................................................13. BL. CONCLUSIÓN …....................................................................................................16. BI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................17 ANEXOS....................................................................................................................23. xi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. I.. INTRODUCCIÓN. Las enfermedades transmitidas por alimentos siguen siendo un gran problema. AS. para la salud pública, estas enfermedades están asociadas a virus, bacterias, toxinas y. IC. otras sustancias.. G. Las bacterias que se han relacionado frecuentemente con enfermedades. LO. transmitidas por alimentos incluyen diversas especies como Salmonella enterica,. O. Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Vibrio cholerae, Shigella. BI. spp., Campylobacter spp., Yersinia enterocolitica, Aeromonas hydrophila y. CI. AS. Clostridium spp 1.. CI EN. Las bacterias del género Listeria son pequeños bacilos Gram positivos, ubicuos, no formadores de esporas, anaerobios facultativos, con un crecimiento óptimo entre 30 y 37 ° C. 2. . Listeria incluye oficialmente seis especies: Listeria. DE. monocytogenes, Listeria ivanovii, Listeria innocua, Listeria seeligeri, Listeria. CA. welshimeri, Listeria grayi 3. Entre ellos, L. monocytogenes el agente causante de la listeriosis, una de las enfermedades transmitidas por los alimentos más graves en todo. TE. el mundo 4, además reconocida como una de las enfermedades zoonóticas emergentes. BL. IO. en las últimas dos décadas5.. BI. Listeria monocytogenes llega a ocasionar cuadros clínicos muy graves en el. hombre, como septicemia, gastroenteritis, meningitis y encefalitis. El grupo de mayor riesgo comprende a los recién nacidos, individuos inmunocomprometidos, mujeres embarazadas y adultos de la tercera edad. La tasa de incidencia de listeriosis es baja. 1. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. comparada con otros patógenos como Salmonella spp. y Shigella spp; sin embargo, es alarmante la elevada tasa de mortalidad, que puede variar entre 20 y 30%6.. AS. Los alimentos son la principal ruta de adquisición del patógeno y, por lo tanto,. IC. el tracto gastrointestinal es el primer sitio de entrada de L. monocytogenes al hospedero. G. . Esta bacteria es capaz de atravesar las tres barreras fisiológicas presentes en los seres. LO. humanos: intestinal, hemato-encefálica y placentaria. Al cruzar la barrera intestinal, la. O. bacteria se absorbe desde el lumen intestinal, atravesando las células epiteliales y si el. BI. sistema inmune no es capaz de controlar eficientemente la infección, la bacteria. AS. seguirá multiplicándose y la infección puede diseminarse al torrente sanguíneo y a los ganglios linfáticos. Tras el ingreso al torrente sanguíneo, la mayoría de las bacterias. CI EN. CI. alcanza el hígado y el bazo, donde puede replicarse en el interior de macrófagos o células epiteliales. Si la replicación de L. monocytogenes no es controlada por una. DE. efectiva respuesta inmune innata, la bacteria escapa y continúa replicándose7.. L. monocytogenes se distribuye ampliamente en el medio ambiente así como. CA. en una variedad de alimentos crudos, cocidos y procesados 8,9. L. monocytogenes tiene. TE. la capacidad de sobrevivir muy bien bajo temperaturas de congelación y otras condiciones de crecimiento adversas, como por ejemplo, alta concentración de sal, una. IO. amplia gama de pH 10, baja actividad de agua y pueden formar biopelículas11. Por otra. BL. parte, L. monocytogenes ha mostrado resistencia a un número de desinfectantes,. BI. incluyendo etanol e hipoclorito de sodio12. Estos agentes químicos son ineficaces en la reducción del número de L. monocytogenes.. 2. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. El control de L. monocytogenes en los alimentos y en las instalaciones de procesamiento de alimentos implica un esfuerzo permanente de la industria. IC. supervivencia y crecimiento de L. monocytogenes en los alimentos13.. AS. alimentaria. Estos están destinados a desarrollar nuevos métodos para prevenir la. G. A menudo, los conservantes químicos tales como agentes antimicrobianos. LO. sintéticos se utilizan en la industria alimentaria para prevenir el crecimiento de. O. microbios que disminuyen la vida útil del alimento o aquellos causantes de. BI. enfermedades. Sin embargo, las preocupaciones sobre la seguridad de estos productos. AS. químicos han aumentado junto con la demanda del consumidor de alimentos procesados de forma natural. Es por eso, que existe un creciente interés en los. CI. antibacterianos naturales provenientes de plantas, animales y microorganismos, donde. CI EN. a menudo participan en los mecanismos de defensa14. Ejemplos típicos de estos antibacterianos son bacteriocinas15, ácidos orgánicos, aceites esenciales, quitosanos,. DE. entre otros16. La mayoría de ellos son considerados compuestos GRAS (generalmente. CA. reconocidos como seguros).. TE. En los últimos años, la atención se está desplazando hacia el uso de los aceites. IO. esenciales de plantas como alternativas de antimicrobianos en los alimentos17. Los aceites esenciales son líquidos oleosos con componentes volátiles aromáticos,. BL. generados por el metabolismo secundario de las plantas y son extraídos de diferentes. BI. partes como flores, semillas, brotes, hojas, ramas, maderas, frutos y raíces18.. 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En la actualidad, existen muchos informes sobre la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales, y el uso de los aceites esenciales como agentes antimicrobianos. AS. en productos alimenticios17, 19.. IC. El género Citrus pertenece a la subfamilia Aurantioideae, que es una de las 7. G. subfamilias de la familia Rutaceae20. El género incluye especies como C. sinensis. LO. (naranja dulce), C. maxima (pomelo), C. limetta (lima), C. limon (limón) y C.. O. reticulata (mandarina) que son cultivados en zonas tropicales y subtropicales del. BI. mundo21.. AS. C. limetta, conocido comúnmente como lima dulce, es un fruto comestible del. CI. norte del Perú22, 23. El fruto es pequeño, entre ovalada y esférica, con una cáscara de. CI EN. color amarillo verdoso, rico en polifenoles, flavonoides, flavanonas y flavonas24. Esta fruta se utiliza típicamente para el consumo humano, y también se ha utilizado para el. DE. control del colesterol y la regulación inflamación, así como trastornos digestivos y como un modulador de la presión arterial25, 24. C. limetta se compone de cáscara de 8-. CA. 10%, que generalmente es un subproducto sin ningún uso, convirtiéndose en un. TE. problema ambiental26.. IO. Del aceite esencial de la cáscara de C. limetta se identificaron monoterpenos. BL. como α-pineno, β-pineno, sabineno, β-mirceno, p-cimeno, limoneno, γ-terpineno,. BI. acetato nerilo, β-bisaboleno y α-bergamotene27,28. Además se estimó la concentración mínima inhibitoria (MIC) del Limoneno y γ-terpineno contra Pseudomonas putida, obteniendo buenos resultados29,30. 4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Es por ello que en la presente investigación se propuso evaluar la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial extraído de la cascara de Citrus limetta sobre Listeria monocytogenes, para ser considerado como una alternativa de control para. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. esta bacteria de gran importancia en enfermedades transmitidas por alimentos.. 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. OBJETIVO GENERAL: Determinar la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Citrus. IC. AS. limetta sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes.. LO. G. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:. 1. Determinar la fase logarítmica media y el tiempo de generación de Listeria. BI. O. monocytogenes.. 2. Medir el efecto inhibitorio del aceite esencial de Citrus limetta sobre el. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. crecimiento de Listeria monocytogenes.. 6. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. II.. MATERIAL Y MÉTODO. 1. MATERIAL BIOLÓGICO. AS. En el presente estudio se utilizó un cultivo de Listeria monocytogenes. IC. proporcionado por el Laboratorio de Fisiología y Genética Microbiana,. LO. Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo.. G. Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Ciencias. O. Frutos de Citrus limetta de áreas de cultivo del distrito de Cascas, provincia. AS. BI. Gran Chimú, La Libertad. 2. PROCEDIMIENTO. CI. a. Recolección de la muestra. CI EN. Se colectó 10 Kg de fruto de “lima” de áreas de cultivo del distrito de Cascas, La Libertad y fueron transportados a la Universidad Nacional. DE. de Trujillo. Luego fue certificado taxonómicamente por el Herbario Antenor Orrego (HAO), del Museo de Historia Natural y Cultura de. CA. la Universidad Privada Antenor Orrego, como Citrus limetta Risso. TE. (Anexo 3). BI. BL. IO. Se realizó una selección de los frutos que se encontraban en buen estado y presentaban las mismas características.. b. Extracción del aceite esencial (A.E.) de C. limetta “lima” De los frutos de C. limetta seleccionados se extrajo la cáscara y se dejó secar a T° ambiente (25°-28°C) aproximadamente por 96 horas.. 7. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. El aceite esencial se obtuvo a partir de la cáscara de C. limetta por el método de Hidrodestilación Directa tipo Clevenger y luego se purificó (deshidratación) MgSO4. La obtención se realizó en el Laboratorio de. AS. Instrumentales del departamento de Ingeniería Química de la. G. IC. Universidad Nacional de Trujillo.. LO. c. Preparación de solución Stock del aceite esencial. O. Se determinó la densidad del aceite esencial de C. limetta para. BI. preparar una solución de 40 mg de A.E./ml sulfóxido de dimetilo. AS. (DMSO). El DMSO se utilizó para disolver el aceite. Después, se tomó una alícuota de 1 mL de esta solución y se diluyó en 9 ml de. CI EN. CI. Caldo de Enriquecimiento Selectivo de Fraser (Merck Millipore®) para obtener una solución Stock de 4 mg A.E../mL. La solución Stock. DE. se almacenó a -20 ° C.. d. Obtención de la curva de crecimiento de L. monocytogenes. CA. A partir de un cultivo puro de L. monocytogenes se obtuvo el. TE. crecimiento en 99 ml de Caldo de Enriquecimiento Selectivo de Fraser. BI. BL. IO. (Merck Millipore®) a 100 RPM, 37° C durante 24 horas, y se determinó la concentración de la población microbiana cada 2 horas por el método de recuento en placa. Con estos recuentos se obtuvo la curva de crecimiento y por consiguiente el tiempo de generación.. 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. e. Preparación del inóculo de L. monocytogenes para determinar CMI Se aislaron colonias en el medio Agar Oxford (Merck Millipore®) que. AS. representaron cada una, una repetición. En el presente trabajo se. IC. realizaron cuatro repeticiones. G. Se sembró L. monocytogenes en Caldo de Enriquecimiento Selectivo. LO. de Fraser (Merck Millipore®) e incubó a 37°C y 100 RPM para obtener. O. un cultivo en fase logarítmica inicial (7 horas). Se lavó el cultivo con. BI. NaCl (0.85%) tres veces y se resuspendió en 10 ml de la misma. AS. solución hasta obtener una turbidez equivalente al tubo N°0.5 del. CI. Nefelómetro de MacFarland (1.5x108 UFC/ml). Se diluyó al centésimo. CI EN. la suspensión bacteriana en NaCl (0.85%) para obtener una concentración de 1.5x106 cel/ml.. DE. f. Determinación de la concentración mínima inhibitoria. CA. Se realizó por la técnica de dilución en caldo30 en pocillos de microcultivo de 2 ml de volumen. Se sirvió 800 µl de Caldo de. BI. BL. IO. TE. Enriquecimiento Selectivo de Fraser (Merck Millipore®) en 12 pocillos y para el primer pocillo se adicionó 800 µL (3200 µg E.O) de solución Stock del aceite esencial de C. limetta para obtener una concentración de 1600 µg/ml. Del primer pocillo se tomó 800 µl y se realizaron diluciones hasta el onceavo pocillo para obtener las concentraciones 800; 400; 200, 100; 50; 25; 12.5; 6.25; 3.125; 1.5625 µg/ml. Luego se completó el mililitro para cada pocillo con 200 µL de 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. inóculo (3x105 células) de manera que las concentraciones finales de aceite esencial fueron: 1280; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5; 1.25 µg/ml.. AS. El doceavo pocillo se completó con 200 µl de inóculo (3x105 células),. IC. que sirvió de control.. G. Se incubaron los 12 sistemas a 37° C por el tiempo de generación. LO. (obtenido en la curva de crecimiento). Luego, se tomó una alícuota (0.1. O. mL) de cada sistema y se realizó tres diluciones al décimo. Las dos. BI. últimas diluciones se sembraron por superficie en Agar Oxford a 37°. AS. por 24 horas, para determinar las UFC/ml.. CI. Los sistemas completaron su incubación por 24 horas y se verificó el. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. crecimiento con la aparición de turbidez.. 10. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. III.. RESULTADOS. AS. En el presente trabajo se obtuvieron los siguientes resultados:. IC. 1. La Fase logarítmica media fue a las 7 horas de incubación y el tiempo. G. de generación es de 55 minutos para el cultivo de Listeria monocytogenes. O. LO. proporcionado por Laboratorio de Fisiología y Genética Microbiana. (Fig. 01). BI. Figura 01. Curva corregida de la fase logarítmica de crecimiento de Listeria. AS. monocytogenes.. Fase Logarítmica. CI EN. CI. 1.00E+13. 1.00E+12. y = 8E+06e0.7066x. DE. UFC/mL. 1.00E+11. 1.00E+10. CA. 1.00E+09. TE. 1.00E+08. IO. 1.00E+07. 0. 2. 4. 6. 8. 10. 12. 14. 16. 18. Horas. BI. BL. 1.00E+06. Tiempo de generación: 55 minutos. 11. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2. La concentración mínima de aceite esencial de cáscara de Citrus limetta que se necesitó para inhibir el crecimiento de los cuatro clones de. AS. Listeria monocytogenes evaluados, fue de 10 µg/mL. (Fig. 02). IC. Figura 02. Población microbiana de cuatro clones de Listeria monocytogenes en. BI. O. LO. G. diferentes concentraciones de aceite esencial de la cascara de Citrus limetta. UFC/ml. AS. 1.00E+07. 1.00E+04. DE. 1.00E+03. CI EN. 1.00E+05. CI. 1.00E+06. CA. 1.00E+02. TE. 1.00E+01. 1.25. 2.5. 5. [10 … 1280] (ug/ml). repetición 1. repetición 2. repetición 3. repetición 4. BI. BL. IO. 1.00E+00. 12. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IV.. DISCUSIÓN. Las plantas producen una gran variedad de fitoquímicos que demuestran una. AS. diversidad de propiedades medicinales que incluyen efectos antimicrobianos. Los principales fitoquímicos presentes en plantas son los aceites esenciales, compuestos. G. IC. fenólicos, alcaloides, polipéptidos, y poliacetilenos31.. LO. Los aceites esenciales han demostrado propiedades antimicrobianas contra una. O. serie de bacterias Gram negativas y Gram positivas, el uso de estos antimicrobianos. BI. naturales reduce la aparición de resistencia por parte de las bacterias y puede ser. AS. utilizados como un aditivo para el control de patógenos en alimentos32, 33.. CI. Para medir el efecto antimicrobiano de los aceites esenciales se determina la. CI EN. concentración mínima inhibitoria (CMI) que se define como la concentración en la que se evita el crecimiento visible de bacterias bajo las condiciones de crecimiento. DE. definidas. Las técnicas más comúnmente utilizadas son la dilución en agar y dilución en caldo son. La técnica de dilución en caldo utiliza un medio líquido medio contiene. CA. concentraciones crecientes geométricamente (típicamente una serie de diluciones. TE. dobles) del agente antimicrobiano, que es inoculado con un número definido de células bacterianas34. Además la técnica de dilución en agar o difusión en disco puede reducir. IO. la eficiencia del aceite esencial por la precipitación de este en los pocillos o en los. BL. discos35. Es por eso que este estudio se utilizó la técnica de microdilución en caldo. BI. para medir la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial obtenido de la cáscara de Citrus limetta “lima” sobre el crecimiento de L. monocytogenes. El CMI que ese encontró en este estudio fue de 10 µg/mL, mientras que Gomes et al, 201336. 13. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. encontró un MIC de 3, 91 ug/ml, lo que no concuerda con el resultado ya que el método utilizado por el autor fue el de dilución en agar.. AS. La actividad antimicrobiana de los aceites esenciales radica en la presencia compuestos orgánicos de bajo peso molecular con grandes diferencias en la actividad. IC. antimicrobiana. Estos compuestos activos pueden dividirse en cuatro grupos: terpenos,. LO. G. terpenoides, fenilpropenos, y "otros". En los cítricos la composición química generalmente es de 90% de terpenos, 5% de compuestos oxigenados y menos del 1%. BI. O. de compuestos no volátiles como los pigmentos37. Lota et al, 200238 determinó los componentes químicos del aceite esencial de la cáscara de distintas variedades de. AS. Citrus limetta, encontrando como principal componente el limonene (monoterpeno). CI. en un rango entre 40.3 a 94.4%, además encontraron otros componentes como β-. CI EN. pinene entre un 0.3% a 19.2%, γ-terpinene entre un 4.6 a 15.6 % y geranial entre un 4% a 6%, se encontraron también otros compuestos como linalol y p-cymene con. DE. porcentanjes menores a 0.5%.. CA. Por otro lado Colecio et al, 200837 determinó que en la composición química del aceite esencial, obtenido de la cáscara de una variedad de Citrus limetta, había de. TE. limonene 74.4%, de bergamol 8.23%, y de β-pinene 7.62%.. IO. El D- limonene es el terpeno más abundante con propiedades contra bacterias. BL. Gram positivas como Listeria monocytogenes. El limonene pertenece a la familia de. BI. hidrocarburos monoterpenos cíclicos, que se acumula en la membrana plasmática bacteriana debido a su característica de hidrofóbico provocando una pérdida de la integridad de la membrana y la disipación de la fuerza motriz protónica39. Además produce especies reactivas tóxicas como los ROS(especies reactivas del oxígeno)40 14. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. que causan daño oxidativo en una variedad de macromoléculas celulares como DNA, proteínas y lípidos. Se ha encontrado que la toxicidad del limonene es significativamente mayor que la de otros monoterpenos o disolventes con. AS. hidrofobicidad similar. Es por eso la importancia del uso de este monoterpeno presente. IC. en un gran porcentaje en frutos del género Citrus para la inhibición del crecimiento de. G. bacterias Gram positivas, como se demostró en este estudio y con concuerdan con las. LO. investigaciones de Bassolé y otros41 utilizaron aceites comerciales y obtuvieron una. O. CMI de 2,0 % para P. aeruginosa y para S. aureus 0,12 %; para el aceite de cítricos la. AS. BI. CMI fue de 2,0 % para P. aeruginosa y para S. aureus 0,25 %.. Además los compuestos químicos de los aceites esenciales de los cítricos son. CI. altamente volátiles, inclusive a temperatura ambiente. Otros factores que pueden. CI EN. afectar en la volatilización del aceite esencial son la humedad, la concentración de los compuestos y la presión. Por ello en presente trabajo se consideró que una vez obtenido. DE. el aceite se debe conservar en congelación (-20°C) y el tiempo de exposición al. CA. patógeno no debe ser muy prolongado cuando se determine el CMI42. La exposición del cultivo de Listeria monocytogenes a las diferentes. TE. concentraciones de aceite esencial de Citrus limetta fue durante 55 minutos, tiempo. IO. que representa lo que requiere la bacteria para duplicar su población (Tg, tiempo de. BI. BL. generación).. 15. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. V.. CONCLUSIÓN. La concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de la cáscara de Citrus. AS. limetta “ lima”, obtenida en este trabajo, inhibe el crecimiento de Listeria. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. monocytogenes a través de la muerte bacteriana.. 16. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. VI.. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1. Lund BM. Microbiological Food Safety for Vulnerable People. Int J Environ Res. AS. Public Health 2015; 12(8):10117-32.. IC. 2. Farber JM, Peterkin PI. Listeria monocytogenes, a Food-Borne Pathogen.. G. Microbiol Rev 1991; 55(3): 476-511. LO. 3. Schmid MW, Ng EY, Lampidis R, Emmerth M, Walcher M, Kreft J, et al.. O. Evolutionary history of the genus Listeria and its virulence genes. Syst Appl. BI. Microbiol 2005; 28(1): 1-18.. AS. 4. McLauchlin J, Mitchell RT, Smerdon WJ, Jewell K. Listeria monocytogenes and listeriosis: a review of hazard characterisation for use in microbiological risk. CI. assessment of foods. Int J Food Microbiol 2004; 92(1): 15-33.. CI EN. 5. Cossart P, Lebreton A. A trip in the "New Microbiology" with the bacterial pathogen Listeria monocytogenes. FEBS Lett 2014; 588(15): 2437-45.. DE. 6. Pusztahelyi T, Szabó J, Dombrádi Z, Kovács S, Pócsi I. Foodborne Listeria monocytogenes: A Real Challenge in Quality Control. Scientifica 2016; doi:. CA. 10.1155/2016/5768526.. TE. 7. Burke TP, Portnoy DA. SpoVG Is a Conserved RNA-Binding Protein That. IO. Regulates Listeria monocytogenes Lysozyme Resistance, Virulence, and. BL. Swarming Motility. MBio 2016; 7(2): 1-10. BI. 8. Feldhusen F. The role of seafood in bacterial foodborne diseases. Microbes Infect 2000; 2(13): 1651-60.. 9. Basti AA, Misaghi A, Zahraei T, Kamkar A. Bacterial pathogens in fresh, smoked and salted Iranian fish. Food Control 2006; 17: 183–188.. 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 10. Pan Y, Breidt F Jr, Kathariou S. Resistance of Listeria monocytogenes biofilms to sanitizing agents in a simulated food processing environment. Appl Environ Microbiol 2006; 72(12): 7711-7.. AS. 11. Doijad SP, Barbuddhe SB, Garg S, Poharkar KV, Kalorey DR, Kurkure NV, et al.. Sources.. PLoS. One. 2015;. 10(9):. e0137046.. doi:. G. Different. IC. Biofilm-Forming Abilities of Listeria monocytogenes Serotypes Isolated from. LO. 10.1371/journal.pone.0137046.. O. 12. Van der Veen S, Abee T. Mixed species biofilms of Listeria monocytogenes and. BI. Lactobacillus plantarum show enhanced resistance to benzalkonium chloride and. AS. peracetic acid. Int J Food Microbiol 2011; 144(3): 421-31.. CI. 13. Ivanek R, Gröhn YT, Tauer LW, Wiedmann M. The cost and benefit of Listeria. CI EN. monocytogenes food safety measures. Crit Rev Food Sci Nutr 2004; 44(7-8): 51323.. 14. Gyawali R, Ibrahim S. Natural products as antimicrobial agents. Food control. DE. 2014; 46: 412 – 29. CA. 15. Arqués JL, Rodríguez E, Nuñez M, Medina M. Combined effect of reuterin and lactic acid bacteria bacteriocins on the inactivation of food-borne pathogens in. TE. milk. Food Control 2011; 22: 457 – 461.. IO. 16. Rabiey S, Hosseini H, Rezaei M. Use Carum copticum essential oil for controlling. BL. the Listeria monocytogenes growth in fish model system. Braz J Microbiol 2014;. BI. 45(1):89-96.. 17. Bassolé IH, Juliani HR. Essential oils in combination and their antimicrobial properties. Molecules 2012; 17(4): 3989-4006.. 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Streptozotocin-Induced Diabetic Rats. ISRN Endocrinol 2011; 2011:869273. doi: 10.5402/2011/869273. 26. Fernandez-Lopez J, Fernandez-Gines JM, Aleson-Carbonell L, Sendra E, Sayas-. AS. Barbera E, Perez-Alvarez JA. Application of functional citrus by-products to meat. IC. products. Trends Food Sci Tech 2004; 15: 176-185.. G. 27. Hérent MF, De Bie V, Tilquin B. Determination of new retention indices for quick. LO. identification of essential oils compounds. J Pharm Biomed Anal 2007; 43(3): 886-. O. 92.. BI. 28. Talon M, Gmitter Jr. FG. Citrus Genomics. International Journal of Plant. AS. Genomics. 2008; 2008:528361. doi:10.1155/2008/528361.. CI. 29. Oussalah M, Caillet S, Saucier L, Lacroix M. Antimicrobial effects of selected. CI EN. plant essential oils on the growth of a Pseudomonas putida strain isolated from meat. Meat Sci 2006; 73(2): 236-44.. 30. Friedman M, Henika PR, Mandrell RE. Bactericidal activities of plant essential. DE. oils and some of their isolated constituents against Campylobacter jejuni,. CA. Escherichia coli, Listeria monocytogenes, and Salmonella enterica. J Food Prot. 2002; 65(10):1545-60.. TE. 31. Cowan MM. Plant products as antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev. 1999; 12:. IO. 564–82.. BL. 32. Chorianopoulos NG, Evergetis ET, Aligiannis N, Mitakou S, Nychas GJ,. BI. Haroutian SA. Correlation between chemical composition of Greek essential oils and their antibacterial activity against food-borne pathogens. Nat Prod Commun. 2007; 2: 419–26.. 20. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 33. Canillac N, Mourey A. Effects of several environmental factors on the anti-Listeria monocytogenes activity of an essential oil of Picea excelsa. Int J Food Microbiol. 2004; 92: 95–103.. AS. 34. Wiegand I, Hilpert K, Hancock RE. Agar and broth dilution methods to determine. IC. the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat. G. Protoc. 2008;3(2):163-75.. LO. 35. Sánchez JGB, Kouznetsov VV. Antimycobacterial susceptibility testing methods. O. for natural products research. Braz J Microbiol. 2010; 41(2):270-7. BI. 36. Gomes M, Cardoso M, Soares M, Batista L, Machado S, Andrade S, et al .Use of. CI. Sciences. 2014;5(3):299-305. AS. Essential Oils of the Genus Citrus as Biocidal Agents. American Journal of Plant. CI EN. 37. KColecio-Juárez M, Rubio-Núñez R, Botello-Álvarez J, Martínez-González G, Navarrete-Bolaños J, Jiménez-Islas H. Characterization of volatile compounds in the essential oil of sweet lime (Citrus limetta Risso). Chilean JAR. 2012; 72(2):. DE. 275. CA. 38. Lota ML, de Rocca Serra D, Tomi F, Jacquemond C, Casanova J. Volatile components of peel and leaf oils of lemon and lime species. J Agric Food Chem.. TE. 2002;50(4):796-805.. IO. 39. Sikkema J, de Bont JA, Poolman B. Interactions of cyclic hydrocarbons with. BL. biological membranes. J Biol Chem. 1994; 269(11):8022-8.. BI. 40. Chueca B, Pagán R, García-Gonzalo D. Differential Mechanism of Escherichia coli Inactivation by (+)-Limonene as a Function of Cell Physiological State and Drug’s Concentration. Pavelka M, ed. PLoS ONE. 2014;9(4):e94072. doi:10.1371/journal.pone.0094072. 21. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 41. Bassolé IH, Juliani HR. Essential oils in combination and their antimicrobial properties. Molecules. 2012;17(4):3989-4006. 42. Aumo J, Wärna J, Salmi T, Murzin D. Interaction of kinetics and internal diffusion. AS. in complex catalytic three-phase reactions: Activity and selectivity in citral. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. hydrogenation. Chem Eng Sci. 2006; 61(2):814-22.. 22. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. ANEXOS. 23. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 1: Figura 03. Exposición de un clon de Listeria monocytogenes a las diferentes. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. concentraciones de aceite esencial de cáscara de Citrus limetta “lima”. 24. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 2:. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Figura 4. Frutos de Citrus limetta utilizados para la obtención del aceite esencial.. 25. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Anexo 3:. 26. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC AS. Anexo 4. LO. G. DIAGRAMA DE FLUJO. Preparación de solución Stock del aceite esencial. BI. BL I. O. .. EN. Obtención de la curva de crecimiento de L. monocytogenes Caldo Fraser, 24 horas a 37°C. Recuento en placa c/2horas Preparación de inóculo de L. monocytogenes para determinar CMI Caldo Fraser, 7 horas a 37°C (1.5x106 cel/mL). TE CA. (4000 µg/mL). DE. CI. Obtención del aceite esencial (E.O.) de C. limetta “lima” (Hidrodestilación tipo Clevenger). CI AS. BI. O. Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Citrus limetta sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (Dilución en caldo) 27. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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