EVALUACI ÓN PRELI MI N AR DE MODELOS DE I N FECCI ÓN
CRUZADA POR
Fu sa r iu m
sp., AI SLADOS DE PROCESOS
PATOLÓGI COS EN PLAN TAS, AN I MALES Y HUMAN OS
N ATHALI E CAMACHO RAMÍ REZ
JULI E AN DREA GI L GÓMEZ
TRABAJO DE GRADO
Present ado com o requisit o parcial para opt ar al t ít ulo de
MI CROBI ÓLOGO AGRÍ COLA Y VETERI N ARI O y
MI CROBI ÓLOGO I N DUSTRI AL
DI RECTOR
María Xim ena Rodríguez, Ph.D.
CODI RECTOR
Claudia Marcela Parra Giraldo, M.Sc.
PON TI FI CI A UN I VERSI DAD JAVERI AN A
FACULTAD DE CI EN CI AS
CARRERA DE MI CROBI OLOGÍ A AGRÍ COLA Y VETERI N ARI A
CARRERA DE MI CROBI OLOGÍ A I N DUSTRI AL
EVALUACI ÓN PRELI MI N AR DE MODELOS DE I N FECCI ÓN
CRUZADA POR
Fu sa r iu m
sp., AI SLADOS DE PROCESOS
PATOLÓGI COS EN PLAN TAS, AN I MALES Y HUMAN OS
N ATHALI E CAMACHO RAMÍ REZ
JULI E AN DREA GI L GÓMEZ
APROBADO
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _
Maria Xim ena Rodríguez
Claudia Marcela Parra
Direct or
Codirect or
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _
Silvia
Rest repo
Melva
Linares
EVALUACI ÓN PRELI MI N AR DE MODELOS DE I N FECCI ÓN
CRUZADA POR
Fu sa r iu m
sp., AI SLADOS DE PROCESOS
PATOLÓGI COS EN PLAN TAS, AN I MALES Y HUMAN OS
N ATHALI E CAMACHO RAMÍ REZ
JULI E AN DREA GI L GÓMEZ
APROBADO
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _
I ngrid Schuler
Janet h Arias Palacios
N OTA DE ADVERTEN CI A
Art ículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
A m i Ángel de la Guarda, m i herm ana por ser m i guía, com pañía y
cóm plice de m i vida y m is sueños.
Julie Andrea Gil Góm ez
Pep, Nacit o, Nereli y Pauli, gracias por su apoyo incondicional en
t odas las fases de est a t esis, sin ust edes nada hubiera sido posible.
AGRADECI MI EN TOS
A nuestros padres por su apoyo incondicional y por creer siem pre
en nosot ras.
A Claudia Parra por abrirnos las puert as del laborat orio de
m icología, por la confianza y el apoyo dado para la realización de
est e t rabaj o.
A Maria Xim ena Rodríguez por la excelent e guía, con la cual se
culm inó est e t rabaj o.
A Julián Am aya y Pilar Mont oya por t oda la dedicación y
colaboración sin la cual est e t rabaj o no habría culm inado nunca.
A Gisela Cast rillón Moreno por su asesoría en el análisis est adíst ico.
A Pedro Cam acho y Lina Góm ez por sus aport es en la redacción.
TABLA DE CON TEN I DO
Página
Resum en
xiii
Abst ract
xiv
1. I nt roducción
1
2. Marco
teórico
4
2.1. Generalidades
de
Fusarium sp. 4
2.2.
Caract eríst icas m orfológicas de
Fusarium sp. 5
2.3.
Taxonom ía del género
Fusarium
6
2.4. Pat ogenicidad
de
Fusarium
sp. 7
2.4.1.
Fusarium sp., fit opat ógeno
7
2.4.1.1.
Tom at e com o especie suscept ible a infección por
Fusarium sp.
10
2.4.2.
Fusarium sp., pat ógeno hum ano y anim al
11
2.5. Fact ores
de
virulencia
12
2.5.1.
Fact ores de virulencia no enzim át icos
12
2.5.2.
Fact ores de virulencia enzim át icos
14
2.5.2.1. Querat inazas
16
2.6. Hongos
querat inofílicos
17
3. Just ificación
19
3.1.
Form ulación del problem a
19
3.2. Just ificación
20
4. Obj et ivos
22
4.1. Obj et ivo
general
22
4.2. Obj et ivos
específicos
22
5.
Materiales y m étodos
23
Página
5.2.
Procesam ient o de m at erial veget al
24
5.3.
Tom a y procesam ient o de m uest ras anim ales
26
5.4.
Realización de cult ivos m onospóricos
27
5.5.
I dent ificación t axonóm ica de los aislam ient os
28
5.6.
Preservación de las cepas aisladas
29
5.6.1.
Conservación de hongos en agua dest ilada est éril
29
5.6.2.
Conservación en aceit e m ineral est éril
29
5.6.3.
Conservación en papel filt ro est éril
30
5.7.
Ensayos de pat ogenicidad cruzada
31
5.7.1. Act ividad
fit opat ógena
32
5.7.1.1. Preparación del inóculo
32
5.7.2.
I noculación de plánt ulas
33
5.7.3. Act ividad
pat ógena
sobre t ej ido anim al y hum ano
35
5.7.3.1.
Modelo
in vit ro
de pat ogenicidad anim al y
hum ano
36
5.8. Análisis
est adíst ico
38
6.
Result ados y discusión
39
6.1.
Origen de los aislam ient os
39
6.2.
Modelo de infección en plant as
47
6.3.
Modelo de infección hum ano y anim al
53
6.4.
Fusarium sp., com o m odelo m ult ihospedero
64
7. Conclusiones
66
8.
Recom endaciones
68
9.
Referencias
69
Í N DI CE DE TABLAS
Página
Tabla 6 .1 .
Aislam ient os de Fusarium
sp. de origen
hum ano
39
Tabla 6 .2 .
Procesam ient o de m uest ras provenient es de
lesiones en anim ales
41
Tabla 6 .3 .
Aislam ient os a part ir de m at erial veget al
45
Tabla 6 .4 .
Crecim iento en cent ím et ros y área baj o la
curva de los aislam ient os de Fusarium sp., en
ensayo fit opat ógeno
50
Tabla 6 .5 .
Prueba de Duncan para aislam ient os en
ensayo fit opat ógeno
51
Tabla 6 .6 .
Prueba cualit at iva y cuant it at iva de act ividad
pat ógena de Fusarium
sp. sobre t ej idos
querat inizados
54
Tabla 6 .7 .
Prueba de rango m últ iple de Duncan para
t rat am ient os de querat ina
55
Tabla 6 .8 .
Prueba de rango m últ iple de Duncan para
agrupam ient o de aislam ient os según
degradación de querat ina
60
Tabla 6 .9 .
Prueba de Duncan para degradación de
querat ina
62
Tabla 6 .1 0 .
Prueba de agrupam ient o de Duncan de los
aislam ient os en relación con la degradación
de casco
63
Tabla 6 .1 1 .
Prueba de agrupam ient o de Duncan de los
aislam ient os en relación con la degradación
de pelo
Página
Í N DI CE DE FI GURAS
Página
Figura 5 .1 .
Cortes transversales
25
Figura 5 .2 .
Lavado y desinfección de cortes
t ransversales
25
Figura 5 .3 .
Punt os de siem bra y crecim ient o de agent es
fit opat ógenos
25
Figura 5 .4 .
Desprendim ient o de conidios para
suspensión
27
Figura 5 .5 .
Cult ivos m onospóricos
28
Figura 5 .6 .
Discos de Agar- Micelio para conservación
en agua dest ilada
29
Figura 5 .7 .
Conservación en aceit e m ineral
30
Figura 5 .8 .
Met odología conservación en papel filt ro
31
Figura 5 .9 .
Cum plim ient o de los post ulados de Koch en
plánt ulas de t om at e y clavel
32
Figura 5 .1 0 .
Procedim ient o inoculación de plánt ulas
34
Figura 5 .1 1 .
Re- aislam ient o de cepas, prueba
fit opat ógena
35
Figura 5 .1 2 .
Mét odo de peso seco
37
Figura 5 .1 3 .
Mont aj e de m edios sólidos, prueba sobre
t ej ido querat inizado
38
Figura 6 .1 .
Porcent aj e de frecuencia de aislam ient o de
hongos en m uest ras de anim ales
44
Figura 6 .2 .
Cont rol negat ivo prueba progresión de la
enferm edad
48
Figura 6 .3 .
Prueba de colonización de plantas de
Página
Í N DI CE DE AN EXOS
Página
Anexo 1
Hoj as de vida de los aislam ient os de Fusarium
sp.
81
Anexo 2
Unidades de área baj o la curva de las 10
réplicas del progreso de la enferm edad de los
aislam ient os de Fusarium
sp. en plánt ulas de
t om at e
147
Anexo 3
Agrupam ient o de Duncan de área baj o la curva
de los aislam ient os de Fusarium sp.
148
Anexo 4
Agrupam ient o de Duncan de réplicas en
ensayo fit opat ógeno
150
Anexo 5
Análisis est adíst ico del com port am ient o de los
aislam ient os de Fusarium
sp. en prueba de
degradación
in vit ro de t ej idos querat inizados.
151
Anexo 6
Análisis est adíst ico de la degradación de Casco
por aislam ient os de
Fusarium
sp. en pruebas
in vit ro.
155
Anexo 7
Análisis est adíst ico de la degradación de pelo
por aislam ient os de
Fusarium
sp. en pruebas
in vit ro.
RESUM EN
Fusarium
es un género de hongos de dist ribución universal, que se
com port a com o
fit opat ógeno. Algunas especies del género son
querat inofílicas y querat inolít icas, confiriéndole la capacidad de
colonizar t ej idos de hum anos y anim ales, convirt iéndose así en
agent es pat ógenos de est os hospederos.
En la present e invest igación se realizaron aislam ient os de Fusarium
sp. a part ir de plant as y anim ales, ya que, previam ent e, se cont aba
con aislam ient os en hum anos. Se desarrollaron t res m odelos de
infección con t res aislam ient os de cada hospedero, el m odelo de
infección fit opat ógeno con plánt ulas de t om at e y, los m odelos de
infección anim al y hum ano con t ej idos querat inizados ( casco de
vaca y pelo de hum ano) .
Los result ados m ost raron que la presencia de
Fusarium
sp. en
anim ales es m ayor de lo que se encuent ra report ado, y en plantas
se confirm ó su frecuencia. Por ot ro lado, los m odelos de
pat ogenicidad confirm aron t endencias de infección en los
hospederos originales, y al m ism o t iem po dem ost raron la capacidad
de Fusarium
sp. de colonizar ot ros t ej idos.
ABSTRACT
Fusarium
is a fungal genus of universal dist ribut ion which behaves
as phyt opat hogen. Som e species are kerat inophilic and kerat inolit ic,
conferring t he abilit y of hum an and anim al t issue colonizat ion; t his
capacit y m akes Fusarium
a hum an and anim al pat hogen.
Fusarium
sp. isolat es from plant s and anim als were collect ed for
t his st udy, hum an isolat es were recovered from previous st udies.
Three infect ion m odels were developed including t hree isolat es from
each host . Tom at o plant s were used for plant infect ion m odel, and
kerat inized t issues ( bovine hoof and hum an hair) for anim al and
hum an infect ion m odels.
The result s showed t hat
Fusarium
sp. occurrence in anim als is
higher than report ed, and isolat ion frequency in plant s was
confirm ed. The pat hogenicit y m odels confirm ed infect ion t endency
for t he original host , and at t he sam e t im e proved Fusarium
capacit y of colonizing different t issues.
The pat hogenicit y m odels aim ed t o est ablish host cross infect ions
st udies. We perform ed an analysis which showed t hat t here is not a
relat ion bet ween isolat ion origins due t o t heir independent
behavior.
1 . I N TRODUCCI ÓN
Fusarium
es un género de hongos de dist ribución universal.
Usualm ent e se encuent ra com o saprófit o de suelo; sin em bargo, se
ha report ado com o parásit o facult at ivo de num erosos hospederos
en los que se incluyen plant as, anim ales y hum anos.
Algunas especies del género Fusarium
son habit ant es del suelo. Se
reconocen por su im pact o económ ico negat ivo en la agricult ura
m undial, ya que son agent es causales del m archit am iento vascular
y pudrición basal de una gran variedad de plantas. Por ot ro lado, se
ha encontrado que algunas especies de est e género han em ergido
com o pat ógenos oport unist as de hum anos causando enferm edades
disem inadas en pacient es inm unocom prom et idos, quem ados, con
heridas abiert as y en ocasiones se han report ado, t am bién, com o
agent es causales de infecciones en pacient es inm unocom pet ent es.
Ent re las caract eríst icas no enzim áticas asociadas con la virulencia
de este género se destaca su am plia dist ribución, at ribuida a su
capacidad para crecer en gran núm ero de subst rat os y a su eficaz
m ecanism o de dispersión. En el m ism o sent ido se dest aca la
adherencia que le confiere la capacidad de colonizar los t ej idos y la
producción de t oxinas.
dist int os com ponent es ( polisacáridos) present es en las paredes
celulares. Dent ro de ést as, se dest aca la producción de pect inliasas,
celulasas, arabinasas, poligaract uronidasas, ent re ot ras.
Algunas especies del género present an capacidad querat inofílica y
querat inolít ica que les confiere la capacidad de colonizar t ej idos de
hum anos y anim ales y, de est a form a, convert irse en agent es
pat ógenos.
Act ualm ent e se desconoce hasta qué punt o est án conservados
est os fact ores de virulencia en los grupos de hospederos que afect a
Fusarium
. Una de las principales causas es la falt a de est udios y la
ausencia de m odelos que perm it an el análisis sim ult áneo de la
virulencia en plant as y anim ales.
Con la finalidad de cont ribuir al análisis de
Fusarium
com o un
pat ógeno m ult ihospedero, se llevó a cabo est e t rabaj o que consist ió
en realizar diez aislam ient os de cada hospedero a evaluar ( plant a,
anim al y hum ano) y hacer pruebas de inoculación cruzada ent re
nueve aislam ient os ( t res de cada uno de los m odelos de
hospedero) .
2 . M ARCO TEÓRI CO
2 .1 . GEN ERALI DADES DE
Fu sa r iu m
sp.
Fusarium es un género de hongos de dist ribución universal, ubicuos
que se caract erizan por ser hongos m oniliaceos ( hialinos) ,
filam ent osos, usualm ent e saprófit os de suelo, asociados a m at eria
orgánica en descom posición e insect os ( Giani, 1997; Tost i et al.,
2000; Sum m erell et al., 2001) .
Tost i y colaboradores ( 2000) al igual que Sum m erell y
colaboradores ( 2001) , report an el género Fusarium
com o parásitos
facult at ivos de num erosos hospederos, en los que se incluyen
plant as, hum anos y anim ales.
2 .2 . CARACTERÍ STI CAS MORFOLÓGI CAS DE
Fu sa r iu m
sp.
Las característ icas m orfológicas que perm it en la identificación del
género
Fusarium
se det erm inan m acroscópica y
m icroscópicam ent e. Ést as son agrupadas en características
prim arias y secundarias que son ut ilizadas para separar las especies
en los sist em as taxonóm icos exist entes. Ent re las características
prim arias se incluyen la form a de los
m acroconidios, origen y form a
de los m icroconidios, t ipo de conidióforo y por últim o la presencia o
ausencia de clam idiosporas ( posición y núm ero) , m ient ras que, en
las caract eríst icas secundarias, se encuent ran la presencia o
ausencia de esporodoquio, m orfología y pigm ent ación de la colonia
( Nelson et al., 1994; Pardo & Durán, 1999) .
se producen los dos t ipos de esporas ( Moore, 1996; Alexopoulos
et
al., 1996; Agrios, 2005) .
El conidióforo es una part e de la hifa que soport a la célula
conidiógena, que puede ser m onofiálides o polifiálides, ram ificados
o sim ples. Las m onofiálides producen conidios desde una sola
abert ura y en las polifiálides surgen los conidios desde m ás de una
abert ura en la m ism a célula ( Boot h, 1971; Carrillo, 2007) .
Las colonias del género Fusarium
sp
.
crecen rápidam ent e y
presentan diversos colores ( blanco, rosado pálido, roj o, anaranj ado,
púrpura, celest e, verde aceit una, pardo o no present an pigm ent o) ,
aunque en el reverso de la colonia pueden present ar colores pardo
oscuro o negro. El m icelio puede present ar una densidad alt a o
baj a, ya sea algodonoso o com o un fieltro. Los pigm entos que
difunden en el agar suelen variar de color o t ono con el pH.
( Sum m erell et al.
, 2001; Carrillo, 2007) .
2 .3 . TAXON OMÍ A DEL GÉN ERO
Fu sa r iu m
sp.
La t axonom ía del género
Fusarium
ha sido m uy com plicada debido
a que las descripciones iniciales se hicieron con base en
caract eríst icas que varían frecuentem ente según los m edios que se
ut ilizaban. Adicionalm ent e, se debe considerar que est e género
exhibe un im port ant e grado de variación con respect o a la
m orfología m icroscópica y a sus caract erísticas fisiológicas, debido a
la habilidad de
Fusarium
para colonizar diversos hábitats ecológicos
en la m ayoría de las áreas geográficas ( Sam son et al.,
1981;
Nelson et al., 1994) .
Los sistem as taxonóm icos actuales independient e de la corrient e
que sigan, se basan en el t rabaj o de Wollenweber y Reinking
( 1935) . Sin em bargo, las clasificaciones t axonóm icas m ás ut ilizadas
act ualm ent e son la realizadas por Boot h ( 1971) y por de Nelson y
colaboradores ( 1983) . Est e últ im o, reúne los t rabaj os realizados
ant eriorm ent e por ot ros invest igadores, selecciona lo m ej or de cada
sist em a y los com bina de t al form a que reduce el núm ero de
especies, variedades y form as ( Sam son
et al., 1981; Nelson et al.,
1994; Pardo & Durán, 1999) .
2 .4 . PATOGEN I CI DAD DE
Fu sa r iu m
sp.
2 .4 .1 .
Fu sa r iu m
sp.
,
fit opat ógeno
sin em bargo, algunas son capaces de colonizar organism os vivos y
provocar enferm edad. A pesar de t rat arse de un núm ero rest ringido
de especies, los pat ógenos fúngicos t ienen un gran im pact o en la
econom ía m undial ( Agrios et al.,
2005; Di Piet ro & Roncero, 2005) .
Según est im aciones de la FAO, la agricult ura m undial pierde cada
año el 12% de su producción por daños causados por hongos
fit opat ógenos, m ás que por cualquier ot ro agent e ( Agrios et al.,
2005; Di Piet ro & Roncero, 2005) .
El género Fusarium
es un habit ant e del suelo de gran im port ancia
económ ica para la agricult ura en el m undo ya que es causant e del
m archit am ient o vascular y pudrición basal ( Monzón & Rodríguez,
2007) .
Fusarium
sp
.
se com port a com o
fit opat ógeno al encont rar la planta
con las características apropiadas de hospedero. Este penetra las
diferent es capas de la cort eza de la raíz hast a alcanzar el sist em a
vascular. Una vez est ablecido, la colonización de la plant a es
llevada a cabo rápidam ent e a t ravés del xilem a, que conlleva a la
sint om at ología caract eríst ica de m archit ez ( Roncero
et al., 2000;
Agrios, 2005) .
durant e uno a varios años se debe, principalm ent e, a la presencia
de clam idosporas. Est as requieren para germ inar fuent es exógenas
de nut rient es, por lo que son m uy sensibles al ant agonism o. Pero
su distribución casi universal indica la om nipresencia de los
m icroam bient es específicos ( Sum m erell, 2001; Agrios, 2005) .
Las especies F. avenaceum , F. culm orum , F. gram inearum , F. poae,
F. sem it ect um , F. sporot richioides y F. t ricinct um
se encuent ran en
cereales;
F. nygam ai, F. subglut inans y
F. vert icillioides en m aíz;
F.
thapsinum
y
F. chlam ydosporum
en sorgo; m ient ras que
F.
nygam ai y
F. fuj ikuroi se hallan en arroz. En legum bres se observan
F. chlam ydosporum
y
F. t um idum
( Marasas, 1984; Carrillo, 2007) .
F. solani se ha report ado com o pat ógeno en varias especies
veget ales; ent re ést as se encuent ran: t om at e, papa, pim ent ón,
alfalfa, berenj ena, espárragos, m aní, soj a, apio, pim ient a y fríj ol
( Marasas, 1984; Carrillo, 2007) . Por su part e, F. oxysporum
se ha
report ado en algunos cult ivos en los que se dest acan: algodón,
t om at e, tabaco, m elón, garbanzo, plát ano, caña de azúcar, clavel y
café, ent re ot ros ( Nelson
et al., 1994; Agrios et al.
, 2005) .
La infección de
Fusarium
en clavel por Fusarium oxysporum
f. sp.
diant hi
(
Fod
) , así com o la infección en t om at e por F. oxysporum
f.
sp.
lycopersici, y F. solani son las m ás est udiadas y se ut ilizan com o
m odelo de pat ogenicidad del género en plant as ( Di Piet ro &
Roncero, 2005) .
2 .4 .1 .1 . Tom at e com o especie suscept ible de infección
por
Fu sa r iu m
sp.
Fusarium oxysporum
f. sp.
lycopersici,
es un fit opat ógeno de gran
im port ancia ya que las plant as de t om at e afect adas present an
sínt om as de m archit ez, clorosis y necrosis foliar com o consecuencia
de la invasión de est e pat ógeno por el sist em a vascular. Los
sínt om as usualm ent e son visibles en las hoj as basales com o un
am arillam ient o unilat eral, que post eriorm ent e se ext iende por t oda
la plant a. Al realizar un cort e t ransversal o longit udinal en los tallos
enferm os o en la base de los pecíolos se observa necrosis y tinción
de los vasos del xilem a. Las condiciones ópt im as para el desarrollo
de est a infección son: hum edad relat iva alt a, aire y suelo cálido así
com o t em perat uras que oscilen alrededor de 28º C. ( Donoso &
Mont ealegre, 2003; Herrera, 2005) .
basal y una const ricción del t allo a lo largo de la m ancha. Ocurre
una podredum bre en las raíces secundarias. Se present a
principalm ent e en plant as que han alcanzado la fruct ificación. Al
realizar un cort e longit udinal de los t allos se evidencia en la
m édula, una podredum bre seca de aspecto corchoso que supera en
longit ud a la m ancha ext erna ( González et al.,
1998; Herrera,
2005) .
2 .4 .2 .
Fu sa r iu m
sp.
,
pat ógeno hum ano y anim al
Especies del género
Fusarium
han em ergido com o pat ógenos
oport unist as en hum anos, causando enferm edades disem inadas en
pacient es inm unocom prom et idos, quem ados y con heridas abiertas.
Sin em bargo, en ocasiones se han report ado t am bién com o agent e
causal de infecciones en pacient es inm unocom pet ent es. De ahí que
su im port ancia haya crecido exponencialm ent e ( Hennequin et al.
,
1997; Mayayo, 1999) .
Las especies de
Fusarium
m ás com unes que se han asociado a
pat ologías son:
F. solani, F. oxysporum y
F. vert icillioides (
= F.
m oniliform e) . I gualm ent e exist en ot ras especies que afect an en
m enor grado, ent re las cuales est án
F. proliferatum , F.
subglut inans, F. aquaeduct uum , F. dim erum , F. incarnat um , F.
nygam ai, F. clam ydosporum , F. sacchari y F. ant ophilum
( De Hoog
et al.
, 2000) .
sist ém icas se pueden producir por la disem inación del
m icroorganism o desde la puert a de ent rada. En la m ayoría de las
ocasiones est a disem inación est á condicionada por el est ado
inm unológico del huésped, aunque t am bién se han descrit o ot ros
factores de virulencia, com o la producción de t oxinas y enzim as
( Curt is, 1996; Monzón & Rodríguez, 2007) .
Las pat ologías a las cuales se ha asociado Fusarium
sp. son:
int oxicación alim ent aria, int oxicación por granos, querat it is,
infecciones en la piel, m icet om a, onicom icosis, ot it is, infección
int ranasal invasiva, absceso cerebral, endocardit is y enferm edades
disem inadas ( Nelson et al., 1994; Di Piet ro & Roncero, 2005) .
2 .5 . FACTORES DE VI RULEN CI A
2 .5 .1 .
Fact ores de virulencia no enzim át icos
Una caract eríst ica asociada con la virulencia de Fusarium sp
.,
es su
am plia dist ribución at ribuida a la capacidad para crecer en gran
núm ero de subst rat os y a su eficaz m ecanism o de dispersión,
donde el vient o y la lluvia son el m edio m ás im port ant e para su
disem inación. Se ha dem ost rado que el aire puede llevar los
conidios hast a 400 Km . de dist ancia ( Agrios, 2005; Monzón &
Rodríguez, 2007) .
causas de virulencia. Sin em bargo, Drut s ( 1993) dem ost ró que la
germ inación no siem pre es prerrequisit o para la adherencia. Los
recept ores de las células del hospedero para las adhesinas de
algunos hongos j uegan un papel im port ant e. Est e es el caso de la
fibronect ina, t rom bina, lect inas y fact or G, esenciales para que el
m icroorganism o se establezca en el t ej ido ( Mitola et al., 2001) .
Por ot ro lado su capacidad para adherirse al m at erial plást ico com o
cat ét eres y lent es de cont act o, t am bién represent a un fact or de
virulencia. Est a int eracción se ha det erm inado m ediant e la
observación con m icroscopio electrónico. El hongo se adhiere a los
cat ét eres, pero no invade la pared de éstos. Por el contrario, se
adhieren, penet ran y proliferan dent ro de los lent es de cont act o
( Monzón & Rodríguez, 2007)
.2 .5 .2 .
Fact ores de virulencia enzim át icos
Fusarium
sp. t iene la capacidad de producir enzim as t ales com o
pect inliasas, celulasas, arabinasas, poligaract uronidasas, ent re
ot ras polisacaridasas que pueden alt erar o degradar dist int os
polisacáridos present es en las paredes celulares. Est e com plej o
enzim át ico const it uye un im port ant e fact or de virulencia para
Fusarium
, ya que le perm it e no solo penet rar el t ej ido del
hospedero al m ediar la m aceración tisular y la disgregación de la
est ruct ura de la pared, sino que es un m ecanism o necesario para
obt ención de nut rient es ( Di Piet ro & Roncero, 2005) .
plant a ( Guevara, 1997; Roncero et al., 2000; Di Piet ro & Roncero,
2005) .
Algunos hongos present an capacidad querat inofílica y
querat inolít ica com o un im port ant e fact or de virulencia, ya que les
perm it e colonizar t ej idos de hum anos y anim ales principalm ent e y
de est a form a convert irse en agent es pat ógenos. Est udios
realizados han est ablecido la exist encia de dos t ipos de enzim as.
Aquellas que present an actividad “ endo” ( actúan en los enlaces
cent rales de la m olécula) , capaces de producir m aceración y por
t ant o dest rucción de t ej idos; m ient ras el ot ro t ipo que posee
act ividad “ exo” ( act úan en los enlaces ext ernos de la m olécula) ,
proporcionan nut rient es al pat ógeno a part ir de las sust ancias
péct icas de la pared del hospedero ( I m ai, 1991) .
Las enzim as ext racelulares de hongos derm at ofit os y
querat inofílicos habit ant es del suelo son prot easas neut ras o
alcalinas. Sin em bargo no se ha podido est ablecer una clasificación
adecuada basada en las caract eríst icas de las prot easas purificadas
de hongos querat inofílicos ( Richardson & Edgard, 2000) . Ot ro grupo
de enzim as secret adas por est os hongos son las lipasas y est erasas
( Roncero et al.
, 2000; Kunert , 2000) .
prot eínas solubles ( caseína, gelat ina, albúm ina, hem oglobina,
m ioglobina, et c.) y ot ras insolubles ( querat ina, elast ina, colágeno,
fibrina, fibronect ina et c.) ( I m ai, 1991) .
Los sustratos de queratina son at acados por prot easas no
específicas, y el índice de hidrólisis que present e est a prot eína
depende del cont enido de cist ina, ya que entre m ayor es el
cont enido de dicho am inoácido no esencial ( querat ina dura) es m ás
lent a su descom posición ( I m ai, 1991; Muhsin & Hadi, 2002) .
Ot ro grupo de enzim as que le confieren la capacidad de virulencia a
los hongos querat inofílicos, son las lipasas y las est erasas. La
act ividad de las prim eras se puede determ inar utilizando sustrat os
com o aceite de oliva y Tweens ( particularm ente Tween 60 y 80)
( Brash & Zaldua, 1994) . Para evaluar la presencia de esterasas y
fosfolipasa A, se ut iliza com o sust rat o la t ribut irina, ya que est as
enzim as int ervienen en el clivaj e de est a m olécula. ( Kunert , 1988;
Brash & Zaldua, 1994; Papini, 1996; Kunert , 2000) . En un est udio
realizado por Brasch y Zaldua ( 1994) , se det erm inó que las lipasas
y las fosfolipasas son producidas no sólo en los m edios que
cont ienen lípidos, sino t am bién en m edios con querat ina ( pelo
hum ano, uñas, cascos, plum as, et c.) .
2 .5 .2 .1 . Querat inasas
espinas, cuernos y pezuñas de anim ales; t am bién, es com ponent e
de la lana y la m at riz de los dient es ( Kunert , 2000; Mit ola
et al.,
2001) .
La degradación de la querat ina, es un proceso enzim ático llevado a
cabo por las querat inasas ( Paveia, 1975) . Puede ser evidenciada
m orfológicam ente sobre sustrat os querat ináceos a t ravés de la
expresión de est ruct uras fúngicas especializadas em itidas por los
hongos que los at acan, que son básicam ent e algunas variaciones en
el grosor y m orfología de sus hifas ( Mit ola et al., 2001) .
La degradación de la querat ina es el result ado de la acción de t res
fact ores ligados a la acción enzim át ica: desam inación ( crea un
am bient e alcalino necesario para el aum ent o del at aque al sust rat o,
sulfit olisis y at aque prot eolít ico) , sulfit olisis ( desnat uraliza el
sust rat o quit ando puent es de disulfuro) y proteolisis ( cliva el
sust rat o desnat uralizando los product os solubles) ( Kunert , 1988;
Kunert , 2000) .
2 .6 . HON GOS QUERATI N OFÍ LI COS
sedim entos prot oplasm át icos o algunos derivados de la degradación
parcial de ést a ( Mat hison, 1962; Kunert , 2000; Muhsin & Hadi,
2002) .
Los hongos querat inolít icos m ás act ivos son los derm at ofit os
( part icularm ent e especies de Microsporum
y
Trichophyt on) y los
relacionados con ést os ( Hilm ioglu- Polat et al., 2005) . Aunque
t am bién hongos no derm at ofit os com o
Fusarium
present an una
buena act ividad querat inolit ica. Est os hongos, aislados del suelo
com o saprófit os, digieren querat ina in vit ro al utilizarla com o
sust rat o, y com o pat ógenos invaden t ej idos in vivo. No obst ant e, su
m orfología en la fase de crecim iento parasítico es diferente de la
exhibida en cult ivo ( Kunert , 2000; Muhsin & Hadi, 2002) .
3 . JUSTI FI CACI ÓN
3 .1 . FORMULACI ÓN DEL PROBLEMA
Fusarium
es un género de hongos cosm opolit a. Se encuentra
generalm ent e en el suelo y se ha report ado desde hace varios años
com o pat ógeno de diversos cultivos de im portancia económ ica,
t ales com o el del t om at e y el del clavel, entre otros. I gualm ent e se
ha asociado a infecciones pat ógenas en t ej idos anim ales, incluido el
hom bre. En la lit erat ura se cit an algunas caract eríst icas que
facult an a Fusarium
com o pat ógeno de est os diferent es hospederos,
dent ro de las que se dest acan la producción de enzim as lít icas que
favorecen el proceso de colonización del t ej ido, com o querat inasas,
celulasas, proteasas y pect inasas, entre ot ras. Otra característica
que se dest aca es la capacidad de adapt arse a diversos am bient es y
resist ir condiciones de est rés, ya que produce estructuras de
resistencia com o clam idosporas.
Act ualm ente se desconoce hast a qué punt o est án conservados los
m ecanism os de infección en los diferent es grupos de hospedadores.
Una de las principales causas de est a falt a de conocim ient o es la
ausencia de m odelos fúngicos que perm it an el análisis sim ult áneo
de la virulencia en am bas clases de organism os.
se ha report ado est e peligro, t am poco exist en publicaciones que
descart en est e riesgo.
3 .2 . JUSTI FI CACI ÓN
La present e invest igación com prende la prim era etapa de un
proyect o que busca evaluar la capacidad que t endrían los
aislam ient os de
Fusarium
sp.
de infect ar varios hospederos y
caract erizarlos enzim át ica y m olecularm ent e.
Dent ro de est a prim era et apa se realizó el aislam ient o de 30 cepas
de
Fusarium
sp. provenient es de procesos pat ológicos de plant as,
hum anos y anim ales; y, la evaluación de la capacidad de t res cepas
de cada hospedero para producir infección cruzada ent re los
m ism os. Los m odelos ut ilizados incluyen plánt ulas de t om at e y
t ej idos querat inizados ( pelo hum ano y casco de vaca) .
4 . OBJETI VOS
4 .1 . OBJETI VO GEN ERAL
Evaluar de form a prelim inar la capacidad de producir infección
cruzada de cepas de
Fusarium sp., aislados de procesos pat ológicos
de plant as, hum anos y anim ales.
4 .2 . OBJETI VOS ESPECÍ FI COS
•
Est ablecer un banco de cepas de
Fusarium
a part ir de
derm at om icosis y querat it is en anim ales y m archit am ient o
vascular y pudrición basal en plant as.
•
Recuperar aislam ientos de Fusarium
provenient es de
onicom icosis en hum anos para su est ablecim ient o en el banco
de cepas.
5 . M ATERI ALES Y M ÉTODOS
El proyecto se desarrolló en el Laboratorio de Micología de la
Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana, y en el
invernadero construido en la Calle 146 Nº 54 – 57.
5 .1 . ORI GEN DE LOS AI SLAMI EN TOS DE
Fu sa r iu m
sp.
Los aislamientos de humanos fueron donados por el Laboratorio de
Micología de la Pontificia Universidad Javeriana. 12 de estos
provenían de lesiones de onicomicosis y se encontraban
conservados en agua destilada estéril, y un último aislamiento
provenía de una lesión de queratitis.
A partir de los frascos de conservación se tomó micelio que fue
sembrado en agar papa dextrosa (PDA). Una vez desarrollados los
hongos, se seleccionaron nueve aislamientos provenientes de
onicomicosis que cumplieran con las características de buen
desarrollo de la colonia y presencia de abundantes macro y
microconidias, y el aislamiento proveniente de queratitis.
Para la obtención de los aislamientos de lesiones en animales, se
procesaron un total de 62 muestras provenientes de lesiones que
presentaban sintomatología de infección por hongos en ojos
(opacos y con lagrimeo abundante) y piel (focos rojizos, en
ocasiones con pérdida de pelaje). Estas muestras se obtuvieron de
Los aislamientos de plantas se obtuvieron al procesar un total de 17
muestras de plantas (cinco de estas muestras fueron procesadas de
plantas de clavel, 11 solanáceas y una cucurbitácea); que
presentaban sintomatología típica de marchitamiento vascular y
pudrición basal, características de
Fusarium
sp.
5 .2 . PROCESAMI EN TO MATERI AL VEGETAL
Para el aislamiento en laboratorio del patógeno presente en el
material vegetal con los síntomas característicos de
Fusarium
sp.,
se realizó un lavado superficial del material con agua corriente y se
realizaron 15 cortes transversales de 3-5 mm que incluyeran tejido
sano y afectado. A dichos cortes se les realizó una desinfección
superficial con agua destilada estéril por dos minutos;
posteriormente se sumergieron en hipoclorito de sodio (NaClO) al
2.6% v/v por dos minutos y por último se hicieron tres lavados en
agua destilada estéril por dos minutos (Forero, 2007).
El material vegetal fue secado con papel absorbente estéril y
finalmente se sembraron cinco cortes con inclinación aproximada de
30° por caja de Petri con PDA suplementado con cloranfenicol (50
ppm). Este procedimiento se realizó por triplicado para cada planta,
y fue incubado a temperatura ambiente (22 + 2ºC) por siete días.
Pasado este tiempo, se observaron las estructuras típicas de
Fusarium
sp., y se procedió a realizar cultivos monospóricos de los
mismos (Riveros
et al
., 2001; Ardila & Higuera, 2005; Forero,
[image:40.612.113.299.105.244.2]
[image:40.612.114.297.284.423.2]
(41)Figura 5.1. Cortes transversales
Figura 5.2. Lavado y desinfección de cortes transversales
[image:40.612.114.300.463.600.2]5 .3 . TOMA Y PROCESAMI EN TO DE MUESTRAS AN I MALES
A partir de lesiones cutáneas se tomaron muestras mediante
raspado de piel con bisturí. Después de hacer una desinfección del
área, con alcohol al 70% para remover detritus y contaminantes
secundarios. Los raspados se realizaron en el borde de las lesiones
para aumentar la probabilidad de encontrar el agente causal de la
lesión (Calado
et al.,
2005; Franco, 2006).
Una metodología alterna, utilizada para la obtención de muestras
de lesiones cutáneas, se realizó siguiendo el protocolo de Pulido
(2007), que consiste inicialmente en una desinfección con alcohol al
70% y la toma de la muestra con un hisopo humedecido en agua
estéril y posteriormente con un hisopo seco. Los dos hisopos se
guardaron como una sola muestra.
Para lesiones de queratitis las muestras fueron tomadas mediante
frotis del saco conjuntivo con un hisopo estéril humedecido en agua
estéril (Rosa
et al.
, 2003; Hilmioglu-Polat
et al.,
2005).
Las muestras se transportaron en tubos de ensayo estériles
refrigerados y se sembraron, por triplicado, en PDA suplementado
con cloranfenicol (50 ppm) y agar Sabouraud suplementado con
cloranfenicol (50 ppm), pH 5.6 ± 0.2, y se incubaron a temperatura
ambiente por siete días, con observación macroscópica periódica. El
hongo que se presentaba en todos los puntos de siembra fue
Fusarium
sp., se procedió a la realización de cultivos monospóricos
(Rosa
et al.
, 2003; Calado
et al.,
2005).
5 .4 . REALI ZACI ÓN DE CULTI VOS MON OSPÓRI COS
Los cultivos monospóricos se realizaron mediante una suspensión
de conidios en solución salina 0.85% p/v más Tween 0.1% v/v, con
una concentración mínima de 1.5 x 10
6conidios/mililitro
determinada por recuento en cámara de Neubauer, a partir de la
cual se hicieron diluciones en base diez con un volumen final de
cinco mililitros con el fin de obtener una concentración de 100
esporas por mililitro, de la cual se sembraron 100
μ
L en superficie
en PDA con cloranfenicol (50 ppm) e incubada a 25 + 2°C.
La evaluación y selección de una espora germinada se realizó bajo
observación en estereoscopio a las 12 horas post-siembra y se dejó
incubando nuevamente durante 48 horas, tiempo en el cual el
tamaño de la colonia permitía realizar un repique a PDA.
[image:43.612.112.299.83.244.2]
(44)Figura 5.5. Cultivos monospóricos.
5 .5 . I DEN TI FI CACI ÓN TAXON ÓMI CA DE LOS
AI SLAMI EN TOS
La identificación taxonómica a nivel de género se llevó a cabo a
partir de los cultivos monospóricos, utilizando como base
metodologías y claves de identificación elaboradas por De Hoog y
colaboradores (2000), las cuales consideran la observación de
características microscópicas.
Las características morfológicas se determinaron por observaciones
macroscópicas de hongos filamentosos con textura algodonosa de
color blanco, crema, rosado, púrpura, salmón y morado con reverso
rosado, blanco, ámbar o morado; adicionalmente, mediante
microscopia directa con el objeto de determinar presencia de falsas
cabezas mucilaginosas, tipo de fiálides, macroconidios y presencia o
5 .6 . PRESERVACI ÓN DE LOS AI SLAMI EN TOS
5 .6 .1 .
Conservación de hongos en agua dest ilada est éril
Los aislamientos repicados en PDA de los cultivos monospóricos,
fueron cortados en discos de seis milímetros de diámetro, utilizando
la parte posterior de pipetas Pasteur, trasladados a frascos de vidrio
con 30 mL de agua destilada estéril con tres ciclos de autoclavado
(121:15:15) para asegurar la esterilidad, sellados y almacenados a
[image:44.612.115.297.325.464.2]temperatura ambiente (Bueno & Gallardo, 1998).
Figura 5.6. Discos de Agar-Micelio para conservación en agua destilada.
5 .6 .2 .
Conservación en aceit e m ineral est éril
El método utilizado fue el de capa de aceite mineral, que consistió
en inocular los hongos provenientes de los cultivos monospóricos ya
desarrollados en tubos que contienen agar PDA en pico de flauta,
que después de su desarrollo se cubrieron con una capa de aceite
mineral estéril (tres ciclos de autoclavado 121:15:15) y se
[image:45.612.113.223.84.244.2]
(46)Figura 5.7. Conservación en aceite mineral.
5 .6 .3 .
Conservación en papel filt ro est éril
Para realizar la metodología de conservación en papel, inicialmente
se cortaron cuadros de papel filtro de 1 x 1 cm que se llevaron a
esterilizar (tres ciclos de autoclavado 121:15:15). Paralelamente se
hicieron sobres en papel parafinado de 6 x 4 cm que se llevaron a
esterilizar (tres ciclos de autoclavado 121:15:15) junto con sobres
de papel bond de 8 x 5 cm.
Los cuadros de papel filtro estéril se trasladaron a medio PDA de tal
forma que el agar humedeciera el papel (21 cuadros por caja de
Petri); cada cuadro fue inoculado con el hongo a conservar
procedente del cultivo monospórico e incubado a temperatura
ambiente hasta obtener colonización del papel. Posteriormente
estos cuadros se trasladaron a cajas de Petri estériles y se secaron
a 26ºC por 15 días. Por último los cuadros de papel secos se
introdujeron en los sobres de papel parafinado estéril y estos a su
Para conservar los sobres se introdujeron en bolsas Ziploc (cada
cepa por separado) de tal forma que se permitiera la conservación
en la nevera sin afectar las propiedades físicas de los sobres de
papel por efecto de la humedad.
A.
B.
[image:46.612.116.524.194.480.2]C.
Figura 5.8. Metodología conservación en papel filtro. A. Aislamientos crecidos en papel
filtro por 15 días; B. Traspaso cuadro de papel filtro colonizados a sobres papel
parafinado; C. Conservación sobres papel parafinado, en sobre de papel bond.
5 .7 . EN SAYOS DE PATOGEN I CI DAD CRUZADA
Para la realización de los ensayos de patogenicidad cruzada se hizo
un muestreo aleatorio sin reemplazo de tres aislamientos de cada
hospedero. El muestreo se realizó utilizando la tabla de números
aislamientos (tres de cada hospedero) en cada uno de los ensayos
de patogenicidad.
Los aislamientos de plantas utilizados en este ensayo cumplieron
previamente con los Postulados de Koch, que consisten en la
inoculación de plántulas de tomate con los mismos, para confirmar
su capacidad patogénica y un posterior re-aislamiento confirmando
[image:47.612.112.298.282.420.2]su presencia como agente causal de la enfermedad.
Figura 5.9. Cumplimiento de los postulados de Koch en plántulas de tomate y clavel.
5 .7 .1 .
Act ividad fit opat ógena
5 .7 .1 .1 . Preparación del inóculo
De cada cepa de
Fusarium
sp., originaria de cultivo monospórico, se
realizaron subcultivos en PDA que fueron incubados por siete días a
25 + 2ºC donde se observó una alta producción de conidios. La
colección de conidios se llevó a cabo por desprendimiento de la
colonia con perlas de vidrio estéril y 10 mL de solución salina
0.85% p/v más Tween 0.1% v/v, realizando movimientos
en 50 mL de solución salina estéril al 0.85% p/v pH 5.5 + 0.2 hasta
alcanzar una concentración celular de 10
6conidios/mL. El recuento
fue realizado en cámara de Neubauer (Marín, 2003).
5 .7 .2 .
I noculación de plánt ulas
La evaluación de actividad fitopatógena se realizó en plántulas de
tomate, variedad Chonto Santa Clara, susceptible a infección por
Fusarium
sp. Las plántulas de tomate con dos pares de hojas
verdaderas, de aproximadamente 30 días post-germinación, fueron
compradas en una empresa germinadora de semillas de tomate.
Para la inoculación de las plántulas de tomate, inicialmente se
realizó un lavado al sistema radicular con agua corriente para
eliminar los residuos de sustrato; se realizaron pequeños cortes a
los ápices de las raíces y se sumergieron en el inóculo durante 30
minutos. Este procedimiento se realizó en 10 plántulas por cada
cepa a evaluar. Se utilizaron como control negativo 10 plántulas
inoculadas con solución salina 0.85% p/v estéril, para un total de
100 plántulas (Rodríguez-Molina
et al.,
2003).
Las plantas se mantuvieron en sustrato (suelo - cascarilla de arroz,
relación 3:1, esterilizado con tres ciclos de autoclavado,
homogenizando entre ciclos para eliminar vapores tóxicos) bajo
condiciones de invernadero a temperatura aproximada de 22°C, en
macetas individuales para cada plántula. La distribución de las
plántulas en el invernadero se hizo de forma aleatoria y la
micro nutrientes (Nutriponic). La revisión de síntomas se realizó
semanalmente durante 51 días, al cabo de los cuales se realizó un
re-aislamiento de las cepas mediante la metodología de Jiménez
(2004) (Lara, 1999; Marín, 2003; Rodríguez-Molina
et al.,
2003).
A.
B.
5.10. Procedimiento inoculación de plántulas. A. Corte de los ápices de las raíces. B.
Plántula sumergida en inoculo.
La metodología de Jiménez (2004) es un método cuantitativo que
permite valorar la progresión de la enfermedad, en tallo y raíces.
La muestra a evaluar se tomó ubicando la corona y a partir de esta
se tomaron 5 cm del tallo y 5 cm de la raíz principal. Una vez
realizado el corte de tallo y raíz principal, se efectuó un lavado con
agua corriente para eliminar residuos del sustrato y posteriormente
una desinfección del material (inmersión y agitación por un minuto
en NaClO al 2.5% v/v y tres enjuagues por dos minutos en agua
destilada estéril). Luego de secado el material vegetal en papel
filtro, previamente esterilizado en luz UV por 24 horas, se procedió
secciones, en forma descendente en cajas de Petri con PDA
suplementado con cloranfenicol (50 ppm).
Los cultivos se incubaron a 22 + 2°C durante 6 días, en los cuales
se le hizo seguimiento diario para poder determinar la progresión
de la enfermedad.
A.
B.
[image:50.612.115.523.233.523.2]C.
Figura 5.11. Re-aislamiento de cepas, prueba fitopatógena. A. desinfección de plantas. B.
cortes de tallo, corona y raíz. C. Siembra de cortes en espiral.
5 .7 .3 .
Act ividad pat ógena sobre t ej ido anim al y hum ano.
Se desarrollaron dos modelos de infección
in vit ro,
asociados a la
degradación de queratina sobre cascos de vaca pulverizados y
5 .7 .3 .1 . Modelo
in vit r o
de pat ogenicidad anim al y hum ano
Para el análisis de la degradación de queratina, a partir de los
sustratos anteriormente mencionados, se utilizó el método de
pérdida de peso, utilizado por Singh (1999 y 2002).
Las nueve cepas se sembraron utilizando como inóculo un disco de
6 mm de diámetro en 25 mL de caldo glucosa gelatina (glucosa
10g/l, gelatina 10g/l, K2HPO4 1 g/l, MgSO4*7H2O 0.5 g/l, pH 7.0)
en erlenmeyer de 150 mL con agitación constante durante 21 días.
Estos cultivos fueron tomados como control positivo de crecimiento
y producción de biomasa de cada aislamiento.
Simultáneamente, las cepas fueron sembradas en caldo
glucosa-gelatina modificado, en el cual la glucosa-gelatina fue remplazada por 250
mg del sustrato (pelo ó casco) previamente esterilizado
(121:15:15). También se hizo una siembra con los sustratos en
ausencia de glucosa. La inoculación se realizó de la misma manera
que el control positivo de crecimiento y se mantuvo bajo las
mismas condiciones de incubación. Como control de peso de
queratina se realizó el montaje de erlenmeyers que contenían sales,
sustrato (pelo o casco) y sin inoculación.
Los cultivos fueron observados macroscópicamente a diario y
pasado el tiempo de incubación, se analizaron microscópicamente
Después del tiempo de incubación, los cultivos fueron filtrados y
secados en papel filtro estéril a 80ºC por 12 horas. Posteriormente
se pesaron para obtener un peso seco total (sustrato más micelio).
A.
B.
5.12. Método de peso seco. A. Filtración de incubado. B. secado a 80º C.
La degradación de queratina fue determinada mediante la
diferencia del peso seco total y la biomasa total, determinada en el
control positivo de crecimiento. Este resultado se le restó al peso
seco de la queratina no inoculada (Singh, 1999).
También se hicieron siembras en los mismos medios con adición de
agar-agar, para tener una apreciación cualitativa del crecimiento de
los aislamientos sobre el sustrato de queratina. La inoculación se
llevó a cabo de la misma manera que en los medios líquidos,
introduciendo un disco de 6 mm de diámetro en el centro de la caja
[image:53.612.116.304.86.228.2]
(54)Figura 5.13. Montaje de medios sólidos, prueba sobre tejido queratinizado.
5 .8 . AN ÁLI SI S ESTADÍ STI CO
Se realizó un análisis de varianza a los resultados, utilizando el
programa estadístico SAS, mediante la aplicación de la prueba de
rango múltiple de Duncan para obtener agrupaciones de las
variables analizadas.
Los resultados de la progresión de la enfermedad en plantas se
analizaron mediante la técnica de área bajo la curva y a partir de
estos resultados se realizaron los análisis anteriormente
mencionados.
A partir de los resultados de las pruebas de Duncan realizadas a los
6 . RESULTADOS Y DI SCUSI ÓN
6 .1 . ORI GEN DE AI SLAMI EN TOS
Los aislam ient os de hospedero hum ano se obtuvieron a partir de la
recuperación de conservaciones en agua de 12 cult ivos de hongos
que provenían de onicom icosis. Se obt uvo un buen desarrollo de
diez de est os y los dos rest ant es crecieron con flora acom pañante.
La selección de las nueve cepas a trabaj ar, se realizó teniendo en
cuent a el buen desarrollo de las colonias en PDA y se descartó el
aislam ient o que present ó m enor esporulación con respect o a los
ot ros. Para com plet ar los diez aislam ient os necesarios para el
desarrollo del proyect o, se obt uvo un aislam ient o provenient e de
querat it is que est aba siendo ut ilizado en el proyect o de
invest igación “ Est udio in vitro de germ inación de Fusarium
sp. en
los m at eriales de lent es de contact o blandos y eficacia de las
soluciones m ult ipropósit o cont ra este m icroorganism o” . Esta cepa
se encont raba en PDA con un buen desarrollo y alt a esporulación
( Tabla 6.1) .
Tabla 6.1. Aislam ientos de Fusarium sp. de origen hum ano
N úm ero
ident ificación Origen Lesión
N úm ero
ident ificación Origen Lesión
Organism o aislado 211 Clínico Onicom icosis Fusarium sp. 212 Clínico Onicom icosis Fusarium sp. 213 Clínico Onicom icosis Fusarium sp.
El porcent aj e de recuperación de los aislam ient os de hum anos
conservados en agua, t om ando las 12 m uest ras procesadas com o el
100% , corresponde al 83% . Est e porcent aj e no difiere en gran
m edida de los result ados obt enidos por Bueno y Gallardo ( 1998) y
por Panizo y colaboradores ( 2005) , en los est udios orient ados a
evaluar la viabilidad del m ét odo de conservación de cepas en agua
dest ilada, en los cuáles se obt uvo un porcent aj e de recuperación
del 100% , debido a que ninguno present ó cont am inación
bacteriana, por ácaros o por otros hongos. La razón por la cuál
durant e el desarrollo del present e t rabaj o se obt uvo el 83% de
recuperación, se at ribuye a la presencia de cont am inación en dos
de las m uest ras, la cual puede ser relacionada a errores
experim ent ales en el m om ent o de la conservación, com o lo
relacionaron Panizo y colaboradores en su est udio.
relacionadas con la caract eríst ica de ser hongos querat inolít icos, lo
que concuerda con lo report ado por Hennequin y colaboradores
( 1997) , Mayayo ( 1999) , Kunert ( 2000) , Garces y colaboradores
( 2001) .
[image:56.612.110.533.387.701.2]A part ir de lesiones provenient es de anim ales, se procesaron un
t ot al de 62 m uestras, de las cuales 24 result aron positivas para
hongos ( Tabla 6.2) , y en 10 de est as se aisló
Fusarium
sp. Las 38
m uestras restantes no se tuvieron en cuent a ya que present aban
cont am inación bact eriana o porque el cult ivo no present aba
crecim ient o del m ism o agent e aislado en t odos los punt os de
siem bra.
Tabla 6.2. Procesam iento de m uestras provenientes de lesiones de anim ales
N úm ero
ident ificación Origen Lesión
Organism o aislado 101 Canino Derm atitis generalizada en lom o Micelio estéril 108 Bovino Lagrim eo abundante e inflam ación del párpado Fusarium sp.
111 Canino Derm at it is generalizada, extrem idades anteriores Fusarium sp.
112 Canino Lesión costrosa interdigital Micelio estéril 116 Bovino Descam ación de piel en lom o Micelio estéril
119 Ave Descam ación en pata Derm atofito 120 Ave Descam ación en pata Aspergillus sp. 121 Canino Derm at it is generalizada, lom o zona anterior Fusarium sp.
122 Bovino Lagrim eo abundante y tum or en oj o Micelio est éril 127 Bovino Descam ación en pata Derm atofito 131 Canino Derm at it is en lom o, zona
N úm ero
ident ificación Origen Lesión
Organism o aislado 156 Canino Derm atitis lom o zona posterior Fusarium sp. 157 Canino Lagrim eo abundante e inflam ación párpado Aspergillus sp.
159 Canino Derm atit is generalizada zona abdom inal Fusarium sp. 160 Bovino Derm atitis en lom o, zona m edia Fusarium sp. 161 Canino Derm atitis zona m edia del lom o Fusarium sp. 162 Canino Derm atitis lom o zona posterior Fusarium sp.
preparado fue PDA sin suplem ent os. Los result ados obt enidos
fueron un punt o de corrección durant e el desarrollo del t rabaj o ya
que, para realizar los repiques y purificación de los aislam ient os, se
t uvo en cuent a la im port ancia de suplem ent ar PDA con
cloranfenicol.
Frecuencia aislam ient o
20,8
41,7 16,7
12,5 8,3
Micelio estéril Fusarium sp. Aspergillus sp.
Dermat ófit os Scopularipsis sp.
Figura 6.1. Porcentaj e de frecuencia de aislam iento de hongos en m uestras anim ales
Algunos de los pat rones que se pueden est ablecer a part ir de los
result ados obt enidos en est e proyect o, perm it en est ablecer a
Fusarium
sp., com o agent e causal no solo de querat om icosis sino
t am bién com o pat ógeno frecuent e que causa lesiones superficiales
en la derm is de una gran variedad de especies anim ales.
I gualm ent e perm it e est ablecer que causa infecciones con m ayor
frecuencia en caninos y bovinos com o lo indica la Tabla 6.2.
Adicionalm ent e, se com probó lo reportado por Ort oneda ( 2003) y
Godoy y colaboradores ( 2004) , quienes afirm an que las pat ologías
causadas por Fusarium
sp. son m ayores en áreas tropicales y
subt ropicales ( clim a cálido y húm edo) aum ent ando su incidencia en
t em poradas de lluvia por las variaciones de tem peratura y
hum edad, condiciones que se relacionan direct am ent e con la
capacidad de germ inación de las esporas del m icroorganism o y de
est a form a causar pat ologías.
[image:60.612.109.531.162.707.2]
(61)solanáceas, una cucurbit ácea y seis claveles) siendo positivas 16
para Fusarium
sp, com o se m uestra en la Tabla 6.3.
Tabla 6.3. Aislam ientos a partir de m aterial vegetal
N úm ero
ident ificación Origen Sint om at ología H ongo aislado
301 Tom ate
Marchit am ient o generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
302 Clavel
Marchit am ient o unilat eral de la planta y pudrición de haces
vasculares
Fusarium sp.
303 Tom ate
Marchit am ient o generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
304 Tom ate de árbol
Marchit am ient o generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
305 Tom ate de árbol
Marchit am ient o generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
306 Tom ate
Marchit am ient o generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
307 Calabacín Marchitam iento Fusarium sp.
308 Tom ate
Marchit am ient o generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
309 Tom ate
Marchit am ient o generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp
310 Tom ate
Marchit am ient o generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp
311 Tom ate
Marchit am ient o generalizado y pudrición de haces vasculares
N úm ero
ident ificación Origen Sint om at ología H ongo aislado
312 Tom ate
Marchit am ient o generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp
313 Clavel
Marchit am ient o unilat eral de la plant a, pudrición de haces
vasculares
Fusarium sp.
314 Clavel
Marchit am ient o unilat eral de la planta y pudrición de haces
vasculares
Fusarium sp.
315 Clavel
Marchit am ient o unilat eral de la planta y pudrición de haces
vasculares
Fusarium sp.
316 Lulo
Marchit am ient o unilat eral de la planta y pudrición de haces
vasculares
No ident ificado
317 Clavel
Marchit am ient o unilat eral de la planta y pudrición de haces
vasculares
Fusarium sp.
