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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

JDIV#IK)N DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD SECRETARIA ACADEMICA

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A Q U I E N CORRESPONDA:

J Pon.

medio

d e t a piluente 5e hace COn5XM que

el

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JORGE

SORIANO SANTOS. pa0,juoil d e l Uepailtamento de BiotecnoLogia a,5uoiló

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.siguiente S e ~ ~ v i c i o So&L:

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un concen.tilado p o t d n i c o d e l gilano d e m i l a n t o en c l o u o d e .)odio y 5 d 6 a t o

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b o d i o " .

/ A L U M N O ( S I : Ma. Gabhiela Madhigat Guenileilo, 86236539

Ae¿c¿a Ca.tilejón Ced¿eto, U 2 3 6 4 3 3

~ I C E N C I A T U R A : IngenLehía de Lo5 Aeimnt05

30 d e a W a l 30 de j u t i o d e 1992

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convengan.

UNIDAD mAPAUPA

Av. Mlchoacán y La Puríslma Iztapalapa 09340. MBxlc~ F. A.P. 55535 Fax: 1516868866 Telex: 1764296 UAMME Tel. 686.0322 ext. 302

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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

DEPTO. DE LOS ALIMENTOS (1992)

REPORTE FINAL

"SOLUBILIDAD DE LAS PROTEINAS SALINO-SOLUBLES DE UN

CONCENTRADO PROTEINICO DEL GRANO DE AMARANTO EN CLORURO DE SODIO Y SULFATO DE SODIO"

ALICIA CASTREJON CEDILLO

MA. GABRIELA MADRIGAL GUERRERO

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I N D I C E.

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1.INTRODUCCION

...

1

II.OBJETIVOS...

...

15

1II.MATERIALES Y METODOS

...

16

1V.RESULTADOS Y DISCUSION

...

23

V.CONCLUSION..

...

44

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1.INTRODUCCION.

Generalidades

Las especies de A. hypochondriacus

y

A. cruentus son

nativas de México y Guatemala, predominando en México la

variedad de A. cruentus, se les puede hallar también

en

Nepal, India y Estados Unidos, mientras que en Perú,

Argentina y Bolivia se localizan l a s especies de A.caudatus,

también conocida como A. edulis, siendo todas productoras de

semillas. Las hojas de algunos amarantáceas son comestibles y

su

valor nutritivo es similar a l a s especies productoras de

semillas, p. ej. A. hybridus que en México se conoce

popularmente como "quintonil" también conocida en Tailandia

como "phakhom", "bayam" en Malasia e Indonesia o "urai" en

Filipinas. Un ejemplo adicional e s el A. lividus que se

conoce en Grecia con el nombre de "vleeta".

En México actualmente el amaranto se cultiva en pequeña

escala.

Los

rendimientos del cultivo se determinan tanto por

factores genéticos como ambientales. Los agricultores

norteamericanos consideran como buenos rendimientos de 400 a

5 0 0 kg de semilla/ha (Martinez, 1985) pero en la literatura

se han registrado rendimientos de 1.1 tonlha (Rutle, 1 9 7 6 ) ,

en nuestro país se han encontrado rendimientos d e 100 a 2500

Kg/ha (Sánchez-Marroquín, 1 9 8 0 ) .

El uso de la semilla como alimento en México actualmente,

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semillas reventadas O tostadas mezcladas con miel o

piloncillo (Macazaga, 1985) Y que por coincidencia

gastronómica, algunos campesinos peruanos elaboran de manera

similar (sumar,1983). También en diversas regiones de nuestro

país la semilla se usa en la elaboración de alimentos típicos

como el pinole, tamales

y

atole (Sánchez-Marroquín, 1980).

Como verdura se conoce como t'huazontle't en México a l a

inflorecencia a manera de racimo que se prepara capeada

con

huevo y luego frito con queso en su interior, acompañada de

caldo de jitomate; pero antes de inflorecer y tierno se le

consume cocido en l a forma de "quintonil" (Macazaga, 1985).

Comwosición Ouímica

La composición química y el valor nutritivo de la semilla

de amaranto varía principalmente a causa de las prácticas

agronómicac. La mayoría de los investigadores (Becker y

co1.,1981; Sánchez-Marroquin, 1983; NRC,1984; Teutonic0 y

Knorr,1985) han observado la siguiente composición:

Proteína

Lípidoc

Almidón

Azúcares totales

Cenizas

Fibra

Vitaminas

12- 16 0

6- 7.5%

62- 69 %

2- 3

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3- 3.5%

4 - 7 . 2 %

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El almidón es el carbohidrato más abundante de la semilla

de amaranto y está constituido principalmente por

amilopectina, con sólo un 5 o 7 % de amilosa

Los ácidos grasos del amaranto están constituidos en un

7 6 % por los ácidos oleico (C18:1), linoléico (C18:2), y

palmltico (16:O); 20% de ac. esteárico (C18:O) con trazas de

linolénico (C18:3) y 4% de escualeno; contiene además

cantidades traza de esteroles y ésteres de estero1 (Becker y

col., 1981; Anónimo, 1983; Bressani, 1983; NRC, 1984). El

contenido mineral de las especies de amaranto generalmente es

más alto que el de los cereales de consumo tradicional, con

prevelecencia de fósforo, magnesio,potasio, calcio y hierro.

Estudios de molienda han demostrado que las cenizas estan

concentradas en un 66% en el revestimiento de la semilla y en

la fracción del germen. La semilla de amaranto es rica en

vitamina C, niacina y vitamina B1 y B2 además de B-caroteno.

(Teutonic0 y Knor, 1985).

Tiene factores antinutricionales, como inhibidores de

tripsina, polifenoles y saponinas, (actividad hemolftica que

aunque su concentración es relativamente baja, si no se

eliminan antes del consumo, el valor nutritivo disminuye

considerablemente. (Correa y Jokl, 1984; Calderón de la Barca

y col., 1985). El proceso de cocción es adecuado para su

eliminación (Becker y Saunders, 1 9 8 4 ; Bressani, 1983)

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Calidad Proteínica.

La calidad proteínica del grano de amaranto; para el A.

caudatus el factor de conversión de nitrógeno a proteína es

5.85; en otras especies de amaranto los factores de

conversión a proteína varían entre 5.2 y 5.6 (Becker y

Saunders, 1984). La NRC considera adecuado para cualquier

especie de amaranto el factor 5.85.

La semilla de amaranto contiene un nivel promedio más alto

de proteína que la mayorla de los granos de uso convencional.

Su contenido de lisina, es casi tres veces mayor que el de

maíz y casi el doble del que contiene el trigo, de hecho el

contenido de este aminoácido en e l amaranto es similar al de

la leche (NRC, 1984). La proteína de amaranto es excepcional

porque su balance de aminoácidos es cercano al balance óptimo

requerido por el humano, por lo tanto, suplementa a los

cereales convencionales que son deficientes en lisina y

aunque la proteína de amaranto se ha encontrado limitante en

leucina, este aminoácido se encuentra en exceso en l o s demás

cereales (Becker y col., 1981; Bertschart y col., 1981;

Sánchez-Marroquln, 1983; NRC, 1984; Teutonic0 y Xnor, 1985).

Se ha propuesto que el triptofano pudiese ser el

aminoácido limitante (Martine de Lespinasse,l979), pero Tovar

y Carpenter (1982), Cánchez-Marroquin y col. (1985~) e

incluso observaron que el triptofano se encuentra en niveles

aún más elevados que en la leche, y con respecto a otros

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no se han encontrado deficiencias. La relación de eficiencia

proteínica (PER) para el grano cocido es similar al de la

caselna que es de 2.5 con una digestibilidad del 9 0 % y un

valor biológico (BV) de 75 que es cercano al balance ideal de

aminoácidos esenciales que teoricamente es de 1 0 0 . 0 0 (NRC,

1984).

Aislamiento Y fraccionamiento de txoteínas de fuentes

vecretales.

Tradicionalmente, las proteínas de granos y semillas se

han aislado mediante una extracción secuencia1 con solventes.

La extracción acuosa rinde una fracción definida como

albúminas; las soluciones salinas extraen globulinas; las

soluciones etanólicas las prolaminas y los ácidos

y

álcalis

las glutelinas (Osborne, 1924). Inicialmente Abdi y Sahib

(1976) encontraron una relación de globulina/albúmina (G/A)

de _0.3 y la albúmina como principal fracción proteínica de

reserva del grano de A. hypochondriacus, de acuerdo al método

de Mitchel (1948). Konishi

y

col. (1985) reportaron como

principal fracción proteínica de reserva a la globulina y la

relación G/A en este caso fue de 2 . 1 para A . hypochondriacus,

por el método de Landry y Moreaux (1975). Contrariamente,

Duarte y col. ( 1 9 8 ú ) aislaron l a s proteínas de la misma

especie de amaranto mediante el complejo método de

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.. . . .

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fraccionamiento de Padhye y Salunke ( 1 9 7 7 ) . La relación G / A

en este caso fue de 0.3 y la albúmina como la principal

fracción proteínica de reserva en el grano de amaranto.

Recientemente Bressani y Garca (1990) han reportado la

relación G / A de diferentes especies de amaranto: 0.89 para A.

caudatus, 0.94 para A. hypochondriacus y 0.95 para A.

cruentus. Estos resultados fueron obtenidos mediante el

uso

de una modificación al método de Landry y Moureaux (1970).

Finalmente, Soriano y col (1992) encontraron una relación G/A

de 0 . 5 y albúmina como principal proteína de reserva del

grano de A . cruentus, mediante el método de Padhye y Salunke

(1977).

Por otro lado, con respecto a las condiciones para lograr

una mejor extracción de proteínas para la obtención de

aislados proteínicos, se han realizado varios estudios con

algunos cereales como el maíz, cártamo y amaranto entre

otros.

Paredes-López y Ordorica (1986) encontraron que a partir

de un concentrado proteínico de cártamo obtenido en

laboratorio (SML) con un contenido proteínico del 46.8% y

otro concentrado proveniente de la industria aceitera (SMI)

con un contenido de proteina del 28.2%,se extrajeron con NaCl

0.8M, a pH 1.0 obteniendose una gran cantidad de proteína de

los mariales preferentemente para SML. La mayor recuperación

de proteína fué para el aislado obtenido por precipitación

isoeléctrica obteniéndose, para SHL y SMI valores de 78.8 y

46.9% respectivamente.

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Por su parte, Paredez

-

López, realizó estudios con harina

de A. hypochondriacus, utilizando dos muestras: harina entera

y harina desengrasada. El estudio se llevó a cabo, utilizando

varias concentraciones de NaC1, obteniendo una alta

recuperación de proteínas salino-solubles en un rango de

concentración de 0 . 8 a 1 . 0 M de NaCl de esta manera, la

extracción de proteínas (albúmina y globulina) se incrementó,

con

el aumento de la concentración de NaC1; además la

producción optima de proteína solubilizada fue a pH 11

y

precipitadas entre 4 . 5 y 5.5 para ambas harinas. Por otro

lado, determinaron que, las glutelinas constituyen la

principal proteína de reserva en el amaranto.

Contrariamente Konishi y col. (1991) reportaron que la

fuente principal de proteína en el grano de amaranto, eran

las fracciones de albúmina y globulina, para A.

hypochondriacus y A. cruentus (10.7g/lOOg y 9.975g/lOOg,

respectivamente). También se encontraron 2 fracciones de

albúmina, mediante la extracción secuencial. Alb-1 extraída

con NaCl al 0.5M y agua. Alb-2 se extrajo con agua después de

la extracción de las globulinas y la alb-1, utilizando una

modificación al método de Landry y Moureaux.

Soriano y col (1992) encontraron que para A.cruentuc, la

albúmina fue la mayor fracción de proteínas de la semilla de

amaranto, seguida de la globulina, prolamina y glutelinas.

Utilizando una sal divalente, la mayor extracción se obtuvo a

una concentración d e 0 . 0 4 M de N a 2 S 0 4 ; pero con una sal

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el nitrógeno soluble se incrementó de manera considerable

( 5 3 % ) , esto si se lleva a cabo a un pH entre 2-5, pero a p~ 6

se observó un decremento del 50% de nitrógeno soluble. En

general la extracción de nitrógeno soluble de albúmina y

globulina de A. cruentuc pueden darse a pH alcalino,

como

en

otros aislados proteínicos.

Métodos de Cuantificación de Nitróseno Proteínico Y No

Protefnico.

a)Determinación de Nitrogen0 Total.

El método de Kjeldahl (Jacobs,1965) se basa en la

digestión de la muestra

en

presencia de ácido sulfúrico y

un

catalizador. Posteriormente se logra la separación del amonio

con exceso de NaOH, e l cual se destila y es recogido en ácido

bórico con un indicador, finalmente se valora con HC1 y se

cuantifica la cantidad de nitrogen0 total presente

en la

muestra, el cual pudo formar parte de:proteínas, ácidos

nucleicos, carbohidratos nitrogenados, alcaloidec, llpidos

nitrogenados, porfirinas, pigmentos nitrogenados y algunas

vitaminas como niacina, riboflavina, piridoxina, ácido

fólico, boitina, colina y cianocobalamina

b)Determinación de Nitrógeno Proteínico.

Para la cuantificación de nitrógeno proteínico se puede

utilizar el método de proteína ligada al colorante, que se

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Coomassie G - 2 5 0 (figura 1 y 2). Donde la forma roja es

convertida a a z u l , cuando el colorante se liga a la proteína.

Existe una reproducibilidad del 1.2% De acuerdo a lo

reportado por Bradford (1976) los agentes alcalinos no

afectan la densidad Óptica a 595nm. Pero se producen algunos

efectos menores debidos a sustancias como: Tris,

ac.

acético,

2-mercaptoetanol, sacarosa, glicerol, EDTA, trazas de

detergentes, etc.

Compton y Jones (1985) estudiaron los mecanismos de

respuesta del colorante y su interferencia en el ensayo de

proteínas de Bradford. Se encontró que el colorante Azul

Brillante de Coomasie G-250 ligado a la proteína, existe en

tres formas: catiónica, neutra y aniónica. La forma aniónica

no se encuentra en forma libre, ya que forma el complejo con

la proteína, dando el color azul.

Fig. 1.1.Estructura del colorante A z u l Brillante de Coomacsie

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-OH -OH

Anion

>

-

Neutral

>

-

Cation

H + €I+

595nm 650nm 470nm

(azul) (verde) (rojo)

Fig. 1.2.Especies de absorción del Azul Brillante de

Coomassie G-250.

A 650

y

470 nm

y

con un decremento del pH, las especies se

identifican como una simple y una doble protonación, con una

forma neutral y un cambio positivo, respectivamente.

Para que el colorante adquiera la característica de

ligante, debe presentar la forma macromolecular con ciertos

grupos reactivos funcionantes. Las interacciones con arginina

primariamente con grupos amino, otras bases (histidina,

lisina) y residuos aromáticos (tirosina,tripsina y

fenilalanina) dan altas respuestas; estas respuestas son

provocadas por las fuerzas de Van der Waals

y

a las

interacciones hidrofóbicas. Por lo que las interferencias con

las bases, detergentes y otros conpuestos, se explican de

acuerdo a los equilibrios entre las tres formas que presenta

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b.1) Método Turbidimétrico.

Vera ( 1 9 8 8 ) realizó estudios modificando el método

turbidimétrico para la determinación de protelnas, utilizando

ácido tricloroacético como un agente precipitante, también

utilizó dodecil sulfato de sodio para evitar la interferencia

por grupos aniónicos y catiónicos de detergentes lípidos;

utilizando albúmina como estándar encontró una relación

lineal entre la turbidez a 340 nm y la concentración de

proteína si es observada entre 2 y 4 0 pg de proteína. Se

encontró que este método es insensible a compuestos de bajo

peso molecular tales como aminoácidos, glucosa (0.1M) y

hexosaminas(0.lM). Mediante esta modificación se pueden

detectar hasta menos de 2 l.(g de proteína en un volumen de 0.3

ml (6.7 p g de proteína/ml). Este método es una alternativa

común a otros métodos para la cuantificación de proteína,

posee una elevada selectividad y sensibilidad

y

muestra una

gran tolerancia a reactivos que se utilizan en la

purificación y la caracterización de las proteínas.

b.2) Método de Biuret.

La reacción de Biuret (Scopes, 1982) involucra un fuerte

reactivo cúprico alcalino el cual produce una coloración

púrpura con la proteína. El reactivo cúprico reacciona con la

cadena de peptidoc melor que con otros grupos. Existe

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también fracciones de sulfato de aaonio dando resultados poco

exactos. La gran sensibilidad de l a reacción de Biuret es

llevada a cabo por observación del complejo proteína-cobre a

310 nm.

b . 3 ) Método de Lowry.

Una combinación de la reacción cúprica usada en el método

de Biuret y la reacción de los reactivos de Folin-Ciocalteau

con fenoles tal como la tirosina en la proteína fue hecha

dando un fuerte color azul obscuro con proteinas

(Scopes,1982). La sensibilidad del método da un buen color

con O.lmg/ml de proteína o menos. Para manbtener el sistema

donde la reacción se controle y se desarrolle un color rápido

se debe tener un pH de 11.0, esto se logra mediante la

adición de una solución concentrada de NaOH.

píétodos de extracción de vroteínac

Los métodos de extracción se basan en la diferencia de

solubilidad de las proteínas en solución, la cual depende de

la interacción electrostática, por lo que el ajuste del medio

iónico y del pH se realiza para obtener la mínima interacción

electrostática. Para un p~ con carga neta igual a cero, la

solubilidad de l a proteína es mínima y sólo la albúmina es

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mantener a la proteina en su forma nativa. Además la

solubilidad de las proteínas es dependiente de la

concentración y de la cinética de la disolución, por lo que

un incremento en el mezclado puede desnaturalizar a las

proteinas.

Para la solubilización de las globulinas, se requieren

concentrados de ácidos o bases, provocandose daños por

desnaturalización local debido a pHs extremos. En el caso de

proteínas de grupos sulfidrilos lábiles, la presencia de

agentes reductores como el 2-mercaptoetanol actua protegido a

bajos pH's.

Se puden obtener concentrados enriquecidos de fracciones

de proteína por varios métodos. Uno de ellos es l a

clasificación por aire, si se requiere un alto valor

nutricional, se utiliza una combinación de procesos de

clasificación por aire y de secado-tostado. Existe uno que

involucra la acción de un solvente para lograr la separación,

el ciclon líquido, donde la diferencia de sedimentación de

los cuerpos de proteína se recuperan en hexano, en este caso

el objetivo es la detoxificación de la semilla, se obtiene

una elevada recuperación de proteína cerca del 6 6 % , este

proceso tiene la ventaja de no alterar la estructura de la

proteína, pero una remoción siguiente con solventes, un

secado y esterilización pueden causar daño.

Durante l o s pasos intermedios que se llevan a cabo en l a

extracción de proteínas, como son la ultrafiltración, el pH

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de electroviscocidad. Durante la coagulación por calor ocurre

una desnaturalización y e s limitante.

En la precipitación isoeléctrica que comunmente se

utiliza, se lleva a cabo una concentración por centrifugación

que provoca una extensa agregación y modificación d e la

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1I.OBJETIVOS.

.l) Determinar las mejores condiciones de extracción de las

proteínas salino-solubles en Cloruro de sodio y Sulfato

de sodio.

2) Adecuar el método de Landry y Moureaux tanto en concen-

tración, tipo de sal empleada y a s € como tiempos de ex-

tracción de las proteínas salino-solubles.

3 ) Proponer una metodología para l a obtención de un aislado proteínico del grano de amaranto a partir de un concen-

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111. MATERIALES Y METODOS

Se utilizó para todas las pruebas un concentrado

proteínico de amaranto (CPA)

,

proporcionado por la industria

San Miguel de Proyectos Agropecuarios, el cual fue obtenido

mediante un método de clasificación por aire.

semilla cruda

tostada o

- - -

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Limpieza---+ Molienda

reventada I

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Harina

Clasificación

e---

integral

neumática

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(Concentrado amiláceo) (Concentrado proteínico)

10-15% Prot. 35-40% Prot.

La muestra fué hornogenizada y desengrasada, se almacenó en

bolsas dobles de plástico perfectamente cerradas para que la

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Desensrasado del CPA con acetona

El CPA fué desengrasado con acetona en una proporción de

1: 10 (harina/acetona) con agitación mecánica durante 36

horas a -20 C después se realizaron dos cambios de solvente

(1250 ml) cada 24 horas, se filtró

y

se sometió

a

secado al

aire

en

la campana de extracción,

se

almacenó en bolsas

dobles de plástico cerradas y en refrigeración.

i

METODOS OUIMICOS

Análisis Ouímico Proximal

El análisis químico - t n para e CPA y CPA

desengrasado se efectuó siguiendo los métodos oficiales del

AOAC ( 1 9 8 0 ) que incluyeron:

Determinación de humedad por el método de la estufa

(método No. 14004); determinación de cenizas por incineración

(método No. 14006); determinación de proteína cruda

por

Microkjeldahl (método No.2.049); determinación de fibra cruda

por hidrólisis ácida y alcalina (método No.7.054);

determinación de carbohidratos (por diferencia).

Determinación de Nitróqeno Proteínico

1. Preparación del reactivo Colorante para Proteína.

1 8

250 obtenido de Sigma, 50 ml etanol a l 9 5 % , 100 ml de ácido

fosfórico al 85% ( w / v ) y se afOrÓ a un litro con aqua

destilada.

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2. Preparación de Buffer pH 7.0.

Se mezclaron 29.54 ml de NaOH 0.2M con 5 0 m l de KH2P04

' 0.2M

y

se aforaron a 200ml con agua destilada.

3. Curva Patrón de Proteína.

3.1. Se realizó empleando albúmina sérica bovina(Sigma),

con

la cual se prepararon soluciones que contenían de 1 0 a

1 0 0 pg de albúmina en un volumen de 0.1 ml

3.2. Se le adicionaron 5 ml de reactivo de colorante.

Se preparó un blanco tomando 0 . 1 ml de buffer y 5 m l de

reactivo de colorante.

3.3. Se leyó la absorbancia de cada una de la5 muestras a

5 9 5

nm,

después de 2 minutos y antes de 1 hora de haberse

adicionado el reactivo de Proteína.

3.4. Se contruyó una curva de Absorbancia vs

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19

Prueba de Solubilidad del CPA Desengrasado

Para efectos de esta determinación se prepararon las

siguientes series de soluciones:

SOLUCION

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A-2

A-3

A-4

A-

A- 6

A-7

A-8

A-9

A-10

Todas

NaCl (M)

0 . 0 5

0 . 1 0

0 . 1 5

0 . 2 0

0.25

0 . 3 0

0 . 4 0

0.60

0 . 8 0

1 . 0 0

las soluciones SOLUCION 1A-1 1A-2 1A-3 1A-4 1A-5 1A-6 1A-7 1A-8 1A-9 1A-10

se ajustaron a pH 7. O

Procedimiento

1 . Se pesaron 0.2g de CPA desengrasada

precipitados de 50 ml

Na2S04 (M)

0 . 0 5

0 . 1 0

O . 1 5

0.20

0 . 2 5

0 . 3 0

0 . 4 0

0.60

0 . 8 0

1 . 0 0

en un vaso de

2. Se le adicionaron 5 ml de solución (de la serie A O

1A) y se ajustó el pH a 7.0

3 . Se sometió a agitación magnética durante 60 minutos a

4 o c

4 . Se centrifugó durante 10 minutos a 42000g

~

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1

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20

por el método del Colorante ligado a la Proteína a 595 nm, el

resto del sobrenadante se almacenó.

6. Al residuo se le adicionaron 5 ml más de solución

(serie A o 1A).

7 . Se sometió a agitación magnética por 30 minutos a 4 0 C

8 . Se repitió la secuencia a partir del paso 4 hasta que

la lectura del método colorimétrico dió el

cero

de la curva

estandar.

La metodología se aplicó a cada una de las soluciones de

la serie A y l A , con el fin de encontrar las condiciones más

favorables para una mayor extracción de proteínas salino-

solubles.

Caracterización de las mroteínas salino-solubles

Preparación del aislado proteínico a partir de CPA

desengrasado.

1. El Nitrógeno soluble se extrajo con Na2S04 0.25M hasta

la cuarta extracción a partir de 4 g de CPA desengrasado

2 . Se obtuvieron 4 0 0 ml de sobrenadante, de los cuales se

tomó una muestra para determinar proteína ligada al colorante

y otra para determinar Kjeldahl

3. Al residuo también

se

le determinó Kjeldahl y se

almacenó en cuarto frío y con azida de sodio al 0.02%

~

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1

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B

^.

L L

ultrafiltración a 4 O C y se dializó durante 2 4 horas con agua

destilada con cuatro cambios de la misma

5. Se concentró nuevamente por ultrafiltración hasta 50

ml

.

*

Preparación de la columna de tamizado molecular

1.Se preparó un buffer de Eosfatos con la siguiente

composición: 32.5mM K2HP04

-

2.6mM KH2P04

-

0.4M NaCl

-

2OmM

2-Mercaptoetanol y 0.02g de azida de sodio por cada litro de

solución, la cual fue ajustada a pH 7.5.

2.E1 gel que se utilizó fue Sephacril 5-200 de Sigma,

mismo que se lavó con el buffer de fosfatos en un matraz con

trampa de vacío para eliminar el aire y en un baño de agua a

4OoC.

3.üna vez que se verificó que la columna no tuviera fugas,

se adicionó el gel en suspención, permitiendo que se fuera

acentando, hasta que llegó a la marca establecida, entonces

se adicionó

un

poco de buffer y se colocaron l o s aditamentos de la columna.

4.Se estableció un flujo de 6 ml/h

5.La columna se calibró aplicando 0.3 ml de una solución

de colorantes que contenían 0.1% de Azul de dextran0 y 0.05%

de rojo de fenol.

6. Una vez determinado el volumen muerto, se procedió a

aplicar 2 m l de muestra previamente preparada con un poco de

22

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1

1

7. Se dejó correr l a muestra por 24 horas y se colectaron

fracciones de 3 m l

a.

Cada una de l a s fracciones s e leyeron en el

espectrofotómetro a 230nm y 280nm.

9. Se identificaron las fracciones que contensan proteína

por el método d e Colorante ligado a la Proteína.

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1

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23

1V.RESULTADOS Y DISCU'jm.

La semilla de amaranto tuvo un contenido de proteína de

10.8% (tabla IV.l), el concentrado proteínico de la misma

(CPA)

tiene

24.31% de proteína y éste

una

vez desengrasado

(CPAD) contiene 26.25% de proteína en base seca. La protefna

del CPAD fué solubilizada en soluciones salinas de NaCl y

Na2S04 a diversas concentraciones.

La solubilidad de las proteínas salino-solubles es

variable y esta influenciada por el pH y concentración de la

solución (fuerza iónica), entre otras cosas (Myers,1988). Los

valores de pH entre 3 y 8 . 5 pueden no ser perjudiciales

directamente para las proteínas. Pero en el caso de las

globulinas este parámetro es una variable en el control de la

solubilidad

,

por lo que durante los ensayos realizados se

mantuvo

un control estricto del pH, se ajustaron las

soluciones a pH de 7.0+0.2. Este parámetro también fué

controlado en las determinaciones de nitrógeno proteínico,

mediante el método del Colorante ligado a la Proteína el

cual presenta desviaciones causadas por iones en solución,

buffer alcalinos, detergentes, etc. (Read y Northcote, 1981).

Las proteínas almacenadas en semillas y legumbres son

generalmente extraibles en medio acuoso, pero se encontró que

la extracción de proteína con soluciones salinas se

solubilizan más a baja fuerza iónica de sales neutras y sales

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2 4

(Soriano y col., 1 9 9 2 ) . Este comportamiento se presentó en

l o s ensayos realizados.

Al aislar una proteína no debe sufrir desnaturalización,

causada por agentes como el calor, la fuerza iónica o el pH,

se tiene as1 una mejor solubilidad de la proteha, de aqul la

importancia de controlar los parámetros antes mencionados.

Pero en algunos casos se ha observado que una

desnaturalización alcalina durante el aislamiento ayuda

posteriormente a la dispersión del aislado, aumentando las

propiedades de emulsificación de la proteína, así como las de

gelificación de baja fuerza iónica (Myers, 1 9 8 8 ) .

Cuando una proteína se aisla de una fuente protelnica y

concentrada como parte de un proceso, la solubilidad llega a

ser uno de los atributos más importantes y como las protelnas

son

polielectrolíticas, el comportamiento de su solubilidad

es gobernado principalmente por interacciones elactrostáticas

(iónicas).

Según Franks (1988), existen dos principios importantes:

primero, la solubilidad experimenta un mínimo alrededor del

pH isoeléctrico y segundo, los efectos de las sales en la

solubilidad tienen un comportamiento cualitativamente

similar, siendo producido por todas las sales, a bajas

concentraciones de sal los efectos de la fuerza ibnica

predominan y todas las sales aumentan la solubilidad.

En el presente trabajo experimental se ajustó el pH a

7.0f0.2 en la respectiva solución salina y la solubilidad se

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1

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1

1

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1

1

25

microkjeldahl (1965) y como nitrógeno salino-soluble

(Bradford, 19 ) . El valor máximo de nitrógeno soluble, como

se aprecia en la Tabla IV.2 fué de 16.Eg/lOOg en 1.0 M de

NaC1. El mínimo de extracción se obtuvo en NaCl 0.05 M con

valores de 7.5g/lOOg de CPAD obteniendose una diferencia de

55%.

Para la sal divalente Na2S04 el máximo de extracción

presente fué a 0.3 M con un valor de 19.5g/lOOg de CPAD y el

valor mínimo se obtuvo en Na2S04 1.OM con l2.OOg/lOOg de

CPAD,

con

una diferencia de 38.5%, (Tabla IV.3).

En cuanto a la eficiencia de extracción de nitrógeno

proteínico para la solución de NaC1, la máxima extracción se

obtuvo a una concentración de 0.25M, con un valor de

8 . 5 g / i O O g del CPAD, el mínimo se presentó en NaCl 0.8 M con

4.4g/lOOg de CPAD. La diferencia entre estos valores es de

48.3%.

Con la sal divalente, el máximo de nitrógeno proteinico

extraído se presentó en Na2S04 1 . 0 M con un valor de

7.3g/lOOg; el mínimo fué en Na2S04 0.25M con 5.7g/lOOg.

Resultando una diferencia del 21.9%. Con sales divalentes se

aprecia un efecto constante en todo el rango de la fuerza

iónica probadas, lo que indica que el Na2S04 puede

considerarse la solución más adecuada para la extracción de

proteínas salino-solubles del CPAD. El efecto de la sal

monovalente NaC1, en la solubilidad del nitrógeno proteínico

es inverso a l incremento en la fuerza iónica (concentración).

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1

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26

eficiencia de extracción de nitrógeno salino-soluble por el

uso de NaCl 1.0 M f u e cerca del 6 4 % del total del nitrógeno

contenido en el CPAD. Con Na2S04 (Fig.IV.2) la eficiencia de

nitrógeno soluble fué de 74.28% con respecto al total de

nitrógeno contenido en CPAD (26.25g/lOOg).

La

relación entre nitrógeno proteínico

y

nitrógeno

soluble.

por

lo

tanto

es mayor en 0.25 M de NaC1,

sin

embargo

la relación de nitrógeno proteínico y nitrógeno soluble es

mayor

a 0 . 1 5 M de NaC1, que es de 84.7%; esto es porque

a

esta fuerza iónica, se extrae menor cantidad de nitrógeno

soluble medido por microkjeldahl, comparado con la solución

de 0.25 M donde hay mayor extracción de nitrógeno proteinico.

Un efecto similar se observa con la sal divalente, donde la

relación de nitrógeno proteínico y nitrógeno soluble es mayor

en 0.05 M (44.9%), aunque esta concentración no sea la máxima

para la extracción de nitrógeno proteínico.

.

r ,

El contenido de nitrógeno soluble total de una proteína

esta marcadamente influenciado por varios factores

relacionados con las condiciones de proceso como el

aislamiento, la precipitación, la concentración, extracción y

otras.

Todo método de extracción, tanto para proteína total como

para fracciones selectivas, depende de la solubilidad

diferencial d e las proteínas en solución acuosa. En general,

se obtienen mínimas interacciones electrostáticas ajustando

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1

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27

nitrógeno proteínico y no proteínico del CPAD a diferentes

concentraciones de NaCl y Na2S04 se observan gráficamente en

las figuras.IV.1 y IV.2 respectivamente; la comparación de la

eficiencia de extracción entre las dos sales se encuentra

en

la figura IV.3.

Una vez que la proteína fui5 extraída, se 'empleó una

columna de tamizado molecular para identificarla, dicha

columna primero se calibró con una mezcla de colorantes de

elevado peso molecular, para estimar el volumen de elucidn

inicial y final; el volumen muerto indicó las fracciones de

mayor peso molecular que no fueron retenidas por la columna

utilizada y el volumen total determinó las fracciones

colectadas de más bajo peso molecular que pueden obtenerse en

dicha columna, esta determinación se puede apreciar en la

figura IV.4, en la cual se identifica el volumen muerto (Vo)

a los 1 0 ml y el volumen total (Vt) a los 3 9 ml.

La cromatografía en columna es una técnica inicial

recomendada para examinar un aislado y compararlo con la

fuente material. La forma particular de examinar por

cromatografía puede ser particularmente determinado por la

cantidad de proteína. Mediante el método de filtración en gel

se puede estimar el peso molecular de proteínas y separar

especies individuales por espectro y otros análisis (Myers,

1 9 8 8 ) .

Entre las proteínas, la mayoría de las mediciones de

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1

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2 8

residuos de aminoácidos aromáticos como fenilalanina,

triptofano y tirosina, en el üV más lejano otros grupos son

absorbidos, así a menos de 230 nm otros aminoácidos con carga

secundaria absorben, pero también l o s electrones desplazan al

peptido principal produciendo espectro de absorción (Franks,

1 9 8 8 ) . En la figura IV.5 se observa el perfil de elución de

la albúmina obtenida del CPAD a 230, 260 y 280

nm,

en

donde

se

tiene

que los valores mayores de absorbancia son a 260nm y

el menor espectro fué a 230 nm. Cuando una proteína pura es

caracterizada por W , es de utilidad calcular la proporción

del máximo, al rededor de 280 nm, sobre el mínimo a 260

nm,

para la mayoría de las proteínas se encuentra un valor mayor

a 2, estos valores son utilizados en un último examen de

aislados, para evaluar la posible contaminación.

La medición de la absorbancia ultravioleta puede ser

utilizada directamente en soluciones aisladas, con alguna

purificación cromatográfica. La relación A280/A260 puede ser

usada para monitorear empiricamente impurezas que absorben a

2 6 0 nm. Si la fuente material del aislado contenía ácidos

nucleicos, entonces estos serán los principales posibles

contribuyentes a la absorbancia a 260 nm. Para los aislados

preparados de semillas de plantas como fuente, sin embargo,

los carbohidratos, ácido fítico y otros materiales son los

contaminantes más probables, éstos también proporcionan una

mayor contribución a 2 ú 0 nm que a 280 nm, aunque no hay

cromóferos a 260 nm (Myers, 1988).

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fl

3

29

el volumen muerto y en el pico I medida por el método del

colorante ligado a la proteína a 595 nm, pero en el pico 11

no se presentó una absorción significativa a la misma

longitud de onda que indicase la presencia de protelna

en

cantidades considerables, sin embargo, se observó que a 260

nm se presentó la máxima absorción en dicho pico lo que

indicaba la presencia de una gran cantidad de impurezas que

absorben a esta longitud de onda.

En el perfil de elución de l a globulina (Fig. IV.6) se

observó una absorción elevada a 595 nm en seguida del volumen

muerto, lo cual significaba que estas fracciones protelnicas

eran de elevado peso molecular, ya que a medida que se

acercaran al volumen muerto (Vo), aumentaba el peso

molecular,sin embargo a 280 nm se observó no sólo éste

sino

otro pico más que indicaba un alto contenido de contaminantes

en las fracciones y sabiendo que la globulina tiene un alto

contenido de aminoácidos aromáticos, dicha absorción puede

deberse a éstos. Por otra parte, al compararse los perfiles

de elución de la albúmina (Fig. IV.5) y la globulina

(Fig.IV.6) a 2 8 0 nm se observó que el de la globulina

presentó una mayor concentración de impurezas dadas las

absorbancias de los picos que presentaron.

Finalmente, se debe tener presente, al seleccionar la

longitud d e onda a la cual se van a efectuar las lecturas, el

solvente (agua, buffer o algún otro), ya que el espectro de

absorbancia es dependiente del solvente que se emplee,

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3 0

1v.7, IV.8, IV.9 y IV.10. Utilizando el agua como solvente el

máximo de absorbancia se obtuvo a los 230 nm aproximadamente,

tanto para albúmina sérica bovina ( F i g . IV.7), como para el

extracto cruda de albúmina extraído del CPAD (Fig. IV.8). Por

otro lado, empleando buffer como medio solvente, la máxima

absorbancia se obtuvo en el rango de longitud de onda entre

260-280 nm, tanto para albúmina sérica bovina (Fig. IV.9) como para el extracto crudo de albúmina extraído del CPAD

(Fig.IV.10). Por esta razón el espectro de absorción a 230 nm

en las figuras IV.5 y IV.6 es tan pequeño ya que se trabajó

con buffer como medio solvente y en cambio los espectros a

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SEMILLA DE AMARANTO CRUDA

gll0Og

31

CPA CPAO

9 / 1009 gl100g

T A B L A I V . l . Analisis qsiaico proxiaal de l a semilla be anaranto cruda y del

CPA' y CPAD'

10.80?0.03

14. 1 8 1 0 . 0 0 15.90 6.77?0. 22 7 . 6 0

2.86f0.00 5.00 4.4Sf0.00 3.21 60.93 68.29

COYPONENIE

9.1820. o2

24.31t0.66 26.77 9.U1'0.03 10.80

7.5@f0.00 8.26 4.8810.02 5.29 44.48 4 8 . 8 8 ~

HUMEOAO

PROTEINA

EXTRACTO EIEREO

CENIZAS

FI3RA CRUDA

CARBOHIORATOS

'

Concentrado P I

8.2OfO.06

26.2510.39 28.59

O. 79f0.06 O. 86

1

8.2410.00 8.97 5.27f0.00 5.74

5 5 . 8 2

I

1 51.24

t e i T d e anaranto.

1

Concentrado proteinico de anarano desengrasado. A Base huneda.

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1

32

l a b l a I V . 2 . Solnbilidad del nitrbgeno sal ¡ir-soluble y nitrbgeno proteinico del CPi'

en diferentes concenti8cioner de WaCl a p H 7.0

Y g ~ a I o = gY1OOg

x

v

g110og X X I 0 . 0 5 1.520.1 7.520.,03 28.6t1.7 1.22B.O 6.520.0 24.2tO.O 70.721.6 0.15 2.020.2 10.3fl.YD 39.2i4.0 1.4tB.3 7.520.2 27.720.6 84.726.0

0 . 2 5 2.420.2 t2.0f0.9 45.823.5 1.620.2 8 . 5 2 0 . 1 31.520.4 68.'720.8

0.30 3.-020.'0 14.4t0.9 57.5tO.O 1 . M - I 4.7tO.O 18.120.2 31.120.3 0.40 3.020.0 13.9t0.9 51.120.0 1.020.0 4.820.0 18.220.1 31.8t0.2

0.60 3 . 1 2 0 . 0 14.321.3 58.1t0.9 1.010.0 4.720.2 18.121.0 30.621.6

0 . 8 0 2.920.0 14.321.3 58.324.7 0.9fB.4 4.420.2 17.020.8 30.721.4 1.00 3.42Ó.O 16.8!1.3 58.824.7 1.0t0.6 4.920.3 18.021.2 28.7$1.8 1.50 3.0iO.O 14.7rO.O 57.120.0 1.2tB.2 6 . O t O . l 23.220.3 40.620.6 2.00 3.4tO.O 16.7i0.3 63.a20.9 1.320.1 6 . 5 2 0 . 0 2 4 . 9 2 0 . 1 38.4t0.2

'

Concentrado de proteinas de amaranto :\ -

*

Nitrbgeno soiubilizadolen . L l a respectiva solución salina (sétodo de Kjeldahl).

'

X de nitrbgeno salino-soluble de harina desengrasada

,

0 p.4 ,,

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Witrbgeno soluble/Witrogeno total ' , 2 ~ ~ j ~ , ~ l ; ~ ? ? * ~ ) d>!;'O..-,

,:a.

5.i c

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N i t r b g e n o proteinico extraido por l a solncibn salina (método de Bradford)

*

X de nitrógeno proteinico salino-soluble de la harina desengrasada

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1

1

Tabla I V . 3 . Solubilidad del nitrógeno salino-soluble y nitrógeno proteinico del CPA' en diferentes concentraciones de N a d o . a pH~7.0

Y gx102 g/1oog

x

gx102 gl100g.

x

x

0 . 0 5 2 . 8 2 0 . 1 14.020.5 5 3 . 3 t 4 . 8 1 . 3 t e . i 6 . 3 t 0 . 4 2 3 . 9 t 3 . 3 44-;9+2;8

0.10 3 . 3 t 0 . 5 1 6 . 5 t 2 . 5 6 1 . 8 2 9 . 5 1 . 2 2 0 . 6 5 . 8 2 0 . 3 2 4 . 5 t 4 . 1 39.026.5

6 . 0 i 0 . 1 2 4 . 6 t 2 . 7 3 7 gi'0.3

0 . 2 0 3 . 3 t 0 . 2 1 6 . 5 t 1 . 0 6 3 . 3 t 5 . 0 1 . 2 t 0 . 6 6 . 0 t 0 . 3 2 4 . 8 f 3 . 4 3 :5?1.4 0 . 2 5 3 . 8 t 0 . 5 1 9 . O t 2 . 5 7 1 . 7 ? 8 . 1 1 . 2 t B . 7 5 . 7 t 0 . 4 2 3 . 9 i 1 . 4 3 0 . 2 t d O 0 . 3 0 3 . 9 t o . 6 i g . s t 3 . 0 7 3 . 6 2 1 2 . 1 1 . 3 t e . g 6 . 2 2 0 . 5 2 3 . 6 t 1 . 3 31/Út1.7 0 . 4 0 3 . 2 2 0 . 4 1 6 . 0 ? 2 . C 6 0 . 3 t 7 . 9 1 . 4 t 0 . 3 7 . O t O . 1 25.3t2.8

:

4 1 . 5 t 4 . 6 0 . 5 0 3 . 1 t O . O 1 5 . 5 t 9 . C 5 9 . 0 t O . O 1 . 4 r 2 . 3 i . l t 1 . 2 2 5 . 2 2 4 . 5 4 1 . 1 i 5 . 4

0.60 3 . 6 t 0 . 8 1 8 . O ? C . O 5 8 . 6 2 1 5 . 1 1 . 2 t 2 . 2

0 . 5 0 3 . 0 t O . O 1 5 . O t O . O 5 1 . 1 t 2 5 . 5 1 . 3 t 2 . 3 6.7t1.1 2 5 . 6 2 3 . 1 4 4 . 8 t 5 . 4

1 . 0 0 2 . 4 t 0 . 6 12.020.0 4 6 . 3 2 0 . 0 1 . 5 i 0 . 8 7 . 3 t 0 . 4 2 5 . 9 t 3 . 8 44. p t 4 . 8

1

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0 . 1 5 3 . 2 t o . 3 i 6 . o t i . 5 6 2 . s ? 5 . 0 t . 2 t e . t

/

6 . 1 2 1 . 1 2 4 . 0 t 2 . 9 4 4 . 6 t 4 . 3

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.

~~

'

Concentrado de proteinas del aaaranto

Nitrógeno solubilizado en la respectiva solucion salina (método de Kjeldahl).

X de nitrogeno salino-soluble de harina desengrasada

Nitrógeno solublelnitrógena total.

Nitrógeno proteinico exlraido por l a solucion salina (netodo de Bradford).

x

de nitrogeno pioteinico sal ¡no-soluble de harina desengrasada.

Nitrógeno proteinicolnitr6geno total

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I

I

1

I

I

I

I

I

1

I

I

I

I

I

I

I

I

I

d O (B

cu

ai 2 c O o xi 3 O ra

z

*

O ai

z

c Q Q 3 O ra

z

-

-

-

n

-

n

t

_-

37

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

1

I

1

Fig.IV.4 Determinación del volumen muerto (Vol y el volumen total ( V t ) d e la columna d e tamizado molecular con una mez- cla de a z u l de d e x t r a n 0 2000 0.1% y rojo d e fenol al

0.06%

en buffer de fosfatos

pH

7.6.

vo

t

A

I I 1 I I

O

10

20

30

40

50

60

70

ml

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

1

I

I

I

1

1

Fig.iV.5 Perfil de eiución de la albúmina obtenida d e l CPA desengrasado a diferentes longitudes d e onda

en Sephacrii 5-200.

1

II

A

b

r

b

a

n

C

i

35

t

1

0,4

O

L

O

5

10

15

20

25

30

35

40

45 50 55

Fracción

(mi)

Abs.

230nm

+Y Abs.

280nm

A 4- Abs.

260nm

Fig.IV.6 Perfil de elución de la globulina obtenida del CPA desengrasado a diferentes longitudes d e onda en

Sephacril 5-200

295

2

A

b

S

1,5

r

b

a

n

i

a

O

1

C

095

O

-

I

3 9

I

I

I

I

I

I

I

I

I

1

I

I

I

I

1

I

1

1

Vt

t

O

10

20

30

40

50

Fracción

(mi)

280nm

-C-

595nm

I

I

40

I

I

I

w h)

" "

O

" 0 -

O

P

O

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

1

I

I

w

u

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O

" O

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

1

I

1

I

I

1

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O

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O

1.

E,

a 0

O

3

a

w

P

O