/ N o m b r e : Reyes Pérez María Eugenia M a t r í c u l a :
JL i c e n c i a t u r a :
88239901
Biología. Unidad Iztapalapa. División C.B.S.
/
T e l é f o n o : 4-28-69-45
T r i m e s t r e lectivo: 96- I Horas a la semana: 77 hrs
/Titulo del trabajo: "Evaluación de diferentes medios de cultivo en embriones inmaduros de trigo harinero
(Triticum aestivirrm
) Transformados por la Técnica de Bombardeo"Dra Sarah Ruth Fenell, Cientifico Asociado. Ingeniería Genética Aplicada. CIMMYT Biol. Salvador Gaona Ramírez, Profesor Titular "C" Tiempo Completo. Adscrito al Departamento de Biología, UAM-I (Vombre del asesor:
Lugar donde se realiza el servicio:
Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo, Int.
Fecha de inicio: 17 de abril de 1996 /Fe& a de term ¡nación : 17 de octubre de 1 9 9
C l a v e : B.O1 1.96
Nombre del proyecto: Técnica de Transformación Aplicada a Trigo harinero
(Trificim
aestivium
)\.
> - 1,c...
J /Fwma del asesor
Firma del alumno
,
Casa
abierta ai
liempo
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUDSERVICIO SOCIAL
A QUIEN CORRESPONDA:
Por medio de la presente se hace constar que el (la):
BIOL. SALVADOR GAONA RAM~RU del Departamento de: Biología
de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social:
TITULO: EVALUACIbN DE DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO EN EMBRIONES INMADUROS DE TRIGO HARINERO (Triticum aestivium) TRANSFORMADOS POR LA TECNICA DE BOMBARDEO
ALUMNO: REYES P É R U MAR¡A EUGENIA
LICENCIATURA: BIOLOGíA
PERIODO: 17 D E ABRIL DE 1996
-
30 DE OCTUBRE DE 1986Se extiende la presente para los tines que al interesado convengan, en la Ciudad de México, D.F. a los veintiocho días del mes de Noviembre de mil novecientos noventa y Seis.
Atentamente,
“Casa Abierta al Tiempo”
UNIDAD IAAPALAPA
CIMMYT,
Int.
Centro Iníemi\cinnnl de Mejoramiento de Maíz y Trigo
Intcriiationai Maiie and Whcat Improvcmcnt Ccnicr
Dr
.
Jose Luis Arredondo Figueroa Director de la División CBS.Presente.
Por medio de la presente, me permito informarle que la Srita. Maria Eugenia Reyes Pérez con matrícula 88239901 de la Lic. de Biología, Div. CBS UAM- Iztapalap. concluyó satisfactoriamente su Servicio Social en el Laboratorio de Genética Molecular, CIMMYT-Batán con el proyecto, Evaluación de diferentes medios de cultivo en embriones inmaduros de trigo harinero
( T r i t i c u m
aesrivium)
transformados por la técnica de bombardeo, bajo mi asesoria, dentro del proyecto Técnica de transformación aplicada a trigo harinero.Por
l o tanto manifiesto que estoy de acuerdo con el contenido del informe final.Agradesco la atención prestada a la presente.
A t e n t a m e n t e
./
Drü Sarah Ruth Fennell.
Cientifico Asociado, ingeniería Genética Aplicada
T&I: I7720U-CIMTME
Cihk CENCIMMYT
Far: (595) 41069
Tri- Y6iieo. D.F. (ws) 7% 90 91 Texmm (593 421 W4tO I I
Lisboa 27. C o l o i i Juinz
Apdo. Po1ul6641.06600 M4rho. D.F.. MÍiieo
(Mexim Cily office)
Casa abierta al tiempo
I
r-
I
I,
UNIVERSIDAD AUTONOMA
METROPOLITANA
DlViSlON OE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE U SALUD
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
1-
1-F
L
ii
i
17 octubre 1996
Dr.
José
Luis Arredondo Figueroa
Director de la División de Ciencias Biológicas
yde la Salud
Universidad Autónona Metropolitana lztapalapa
P R E S E N T E
Por medio de la presente hago constar que
la
alumna, Reyes Pérez María
Eugenia con Matricula 88239901 de la Licenciatura de Biologia. presentó
yconcluyo satisfactoriamente con su servicio social, que lleva por título:
"Evaluación de diferentes medios de cultivo en embriones inmaduros de trigo
harinero
(
Triticum
aestiviurn
)
transformados por la técnica de bombardeo".
Despues de la revisión, expreso que estoy de acuerdo con el contenido del
informe final que presenta.
Agradesco la atención prestada a la presente aprovechando la ocasión para
enviarle
un
cordial saludo.
ATANTAMENTE
,-CASA ABIERTA
AL
TIEMPO
BIOL. SALVADOR
GAONA RAM~REZ
PROF
DEPTO. BIOLOGiA.
UNIDAD IZTAPALAPA
f
c
c
f
c
-
F L- F I p' L P i!-
I i-r
c
Ir
Lc
c
c
c
L:
INTRODUCCIONEn
el avance logrado por las ciencias biológicas en las Últimas decadas se handesarrollado técnicas que posibilitan el estudio de los organismos a nivel celular y molecular. La rama de la investigación que se ocupa de esto es la biotecnología, la cual es una herramienta poderosa para el mejoramiento de las plantas agrícolas y el consecuente beneficio para la humanidad.
Dentro de la biotecnología destaca el cultivo de tejidos ya que tiene una mayor aplicación práctica sobre todo en la agricultura, ya que constituye el puente entre la manipulación genética realizada en el laboratorio y su aplicación en los campos de cultivo ( Roca, 1991).
El cultivo de tejidos tambien es importante porque es básico para, la investigación sobre los procesos bioquímicos y morfalógicos de la diferenciación celular, para la aplicación y desarrollo de tecnologías; en la propagación clonár o como ya se mencionó anteriormente en el mejoramiento genético de las plantas a partir del cultivo de embriones.
El cultivo de embriones de las semillas consiste en el aislamiento y crecimiento in vitro, en condiciones estériles de un eñrbtión inmaduro pretendiendo obtener más de una planta viable.
En
base al estado de desarrollo de los embriones se pueden realizarprincipalmente dos formas de cultivos.
a) Cultivo de embriones inmaduros, los cuales se obtienen de semillas sin madurar completamente. Para el cultivo de este tipo de embriones se necesita un medio nutritivo complejo así como una muy cuidadosa disección.
b) Cultivo de embriones maduros, los cuales se obtienen a su vez en semillas maduras. Para este tipo de cultivo es suficiente un medio nutritivo simple con agar, azúcar y minerales. Se utiliza entre otras ventajas para garantizar 100% de germinación de las semillas.
Los enbriones inmaduros se desarrollan a expensas del endosperm0 y poseen una baja cantidad de sintesis celular, su desarrollo depende de ciertos nutrientes que en general son: macroelementos, microelementos, vitaminas y
hormonas que se encuentran en el saco embrionario. Una vez que se han formado los cotiledones, el embrión inmaduro pasa a ser autótrofo por l o tanto este se puede ya separar de los óvulos y cultivarse in vitro en un medio de
cultivo que contenga los nutrientes necesarios para la formación de callos
t:
P
F
L.
F-
I,
embriogénicos y posteriormente para su regeneración se pasan
a
un medio adecuado para obtención de plántulas.Son importantes para el exito de la formación de callos varios factores, por ejemplo el genotipo, la composición del medio nutritivo, así como factores físicos.
La ingeniería genética también conocida como tecnología del ADN recombinante, así como la biología molecular se están aplicando actualmente para intentar modificar caractere$ unigénicos como
la
resistencia de lasplantas a virus y, o insectos, también se está aplicando para el incremento de la calidad nutricional de las plantas mediante una proteína rica en aminoácidos esenciales y que es codificada por un solo gen.
Básicamente la manipulación genética es el método molecular de transmitir material genético, de un organismo a otro, sin intervención de la fase generativa (Roca, 1992).
En
general hay dos sistemas para introducir génes en el genoma de las plantas,la transferencia directa y la transferencia mediante bacterias del género A g r o b a c t e r i u m .
El
primero consiste en la introducción directa de genes empleando yasea la microinyección o el bombardeo de partículas de oro madiante un
acelerador de las mismas madiante el aparato llamado "Pistola de genes".
El segundo utiliza las propiedades biológicas de la bacteria del suelo A g r o b a c t e r i u m sp, para introducir el
A D N
foráneo. Esta bacteria causa laenfermedad llamada agalla de la corona infectando a la planta en el sitio de una herida. Las células de la agalla tienen dos características principales:
1) Producen sustancias denominadas opinas que no estan presentes en las células normales (Murai y Kemp, 1982). y 2) Tienen la capacidad de proliferar indefinidamente en un medio de cultivo sin necesidad de hormonas de crecimiento (White y Braun, 1942).
F
L OBJETIVOS
1. Conocer y saber aplicar la técnica de cultivo de tejidos a partir de embriónes inmaduros de trigo harinero del genotipo Bobwhite bombardeados con parttculas de oro para la probable obtención de plantas transgénicas.
2. Determinar y observar si hay cambios morfológicos de los callos obtenidos a partir de embriones bombardeados y no bombardeados.
3. Cuantificar la viabilidad y desarrollo de los embriones bombardeados y no bombardeados en cuanto a su capacidad de formación de callo y determinar la capacidad de regeneración de este último..
F
i
Se Ji\idiri en
dos apartados
la
inetodologia:
11)inetodologia
encampo
yB)
inetodologia
cn
ihratorio.
r
I
L
F L.
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I L.\)
\letodologia en campo
Sc
colectaron espigas de
trigo
harinero del
genotipoBobwhite
enel invernadero
perteneciente al programa
de
trigo
que seencuentra en
las
instalaciones del CiMMYT-
Batan,
Tescoco Ed. Mexico.
La
colecta consistió en
latoma
de
unaseinilla
al
azarde cada espiga, estas semillas se
cortaron para serciorarse que
losembriones tengan
un tamaño de
0.5-2.0
m m
aproximadamente.
Unavez seleccionadas
las
espigas
st: guardaronen
una bolsa de papelanotando genotipo
yfecha de colecta.
B) Metodologia
deLaboratorio
Postcrioriiisiite,
enel laboratorio se Ilebó
a
cabo la
limpieza de
lasespigas consistiendo en
dcsprcnder
las
seinillas de cada espiga pa:a ser esterilizadas dentro de la c h a r a de
flujolain
inar.
Las
semillas se colocaron en solución de alcohol
al 70°ódurante 20 seg. posteriormente se
sacaron
y sepasaron
a
unvaso
de precipitado previamente esterilizado con
unabarra
inagnitica,
a
una
solución
declorex
al
2090de agua
drsionizada
y 5 gotasde Tween-80/It
(detcrsente
noionico, usado
en lapreparación de esplante) durante
20-30inin.
F t F L F Y-
i
Lr
I, FI
i. F I iF
L IITranscurrido
estelapso
detiempo, se realizaron tres lavados con agua desionizada cada
tino Jurmte
I Oimin
yen
una caja de petri se colocaron las semillas para la estracción
iiiincdiata
di.
loseinbriones con
la
a y d ade
un microscopio esteroseópico, pinzas
ybisturí
se seinbraron de 40
a
50 embriones en cada caja petri conteniendo el medio de cu1tii.o
E3.
En una ciinara de
crecimiento (obscuridad total) a
27 "C
durante
7 dias se guardaron las
cajas de petri
quecontienen el cultivo de
los embriones, después de este lapso de tiempo,se separaron solaiiiente los embriones
queempezaron a formar callo, (se define como
un
tejido obtenido por medio del aislamiento de órganos o tejidos diferenciados) de
loscuales
se apartaron
100
rinbriones
y losdeinis se colocaron en
el medio de pretratamiento
E3
sin
iiminoácidos+
12% demaltosa para transformación óüiirante
4
hrs.
Despti2s
&Ipretratamiento
se
procedió
ala
aplicación de la técnica de bombardeo
biobalistico
altotal de embriones consistiendo en insertar
losgenes marcadores
yde
resistencia. Estos embriones se mantuvieron guardados durante las
24
hrs en la cámara de
crecimiento.
Pasado este
lapso de tiempo
se tomaron a1 azar tres embriones bombardeados
otransformados colocando
acada uno en
loscompartimientos de
una
placa de
inicrotitulación. añadiéndoles 400 de solución de s-gluc
(5-Bromo-4-Cloro-3-Indonyl-B-D-
Glucoronido), esta placa se
guardoen una incubadora
auna temperatura de
37
"C
durante
48 firs.
Posteriorinrnte
se
observó
si presentaron espresión transgénica mediante la
P L P
-
F Lr"
I
P ! LF
L 1 LF
1,e:
i
LiF
L
aparición de puntos azules en cada embrión
y
esto nos esta indicando
quese
insertaron
losgsnes en
losembriones de trigo.
Los cteinás callos se subcultiwron en partes
igualesen los medios de selección MSC+BilO
(10
mglrt
deBialaphos, herbicida)
yE3
sin aminoácidos
+
PPT5
(5
mg/ltde
Fosfinotricin, herbicida).
El
subcultivo se realizó tres veces consecutims, cada uno durante
30dias con los mismos
medios antes mencionados
pero
reciin preparados.
De los
100 embriones no bombardeados que se separaron (controles), 50 se utilizaron para
el proceso de selección con
la utilización de
losmedios mencionados anteriormente
yen
cada selección se utilizó medios recién preparados,
los
otros
50 embriones no
bombardeados se subcultivaron en partes iguales en medio normal
(MSC
y
ES),
y
cada
30días se cambiaron en medios reciin preparados hasta el período de 90 días.
En
una cámara de crecimiento
seguardaron tanto
losembriones bombardeados
yno
bombardeados para
el desarrollo
ycrecimiento de callos.
Los
callos bombardeados
y nobombardeados
quesobrevivieron durante el proceso de
selección asi como
íoscallos
nobombardeados que sobrevivieron durante el
subcultivoen
medio normal se pasaron ai tncdio
\ISRpara regeneración
yobtención de plantas,
losb L F
u,
F
I iL
c:
F II,
[i
r
L
c
ACTIVIDADES REALIZADAS
Durante el tiempo que se llevo a cabo este trabajo se realizarón las siguientes etapas:
C o l e c t a .
Se cortar611 10 espígas de trigo harinero del genotipo Bobwhite para ser llevadas al laboratorio e iniciar la técnica de cultivo de tejidos.
Medios de cultivo.
Previamente se preparar611
los
siguientes medios a utilizar:E 3 (para formación de callos), E3 sin aminoácidos
+
12% de maltosa (para el pretratamiento del bombardeo de embriones), MSC+
BilO,
E S sin aminoácidos+
PPTS (para el proceso de selección en embriones bombardeados y no bombardeados), MSC, ES ( medio normal para el subcultivode embriones no bombardeados) y M S R (para la etapa de regeneración).
E s t e r i l i z a c i ó n
Dentro de la cámara de flujo laminar se llevó-a--cabo la esterilización de las semillas de trigo.
Extracción y siembra de embriones inmaduros
Se extrajerón 604 embriones y se cultivar& en el medio de cultivo E3, de tal forma que la posición del escutelo quedo hacia arriba y se mantuvierón en la cámara de crecimiento durante siete días.
B o m b a r d e o
Después de que se inició la formación de callos en el medio E3, se separarón 100 callos para ser utilizados en la siguiente etapa de cultivo de tejidos y los demás callos se pasarón inmediatamente al medio de pretratamiento E3 sin aminoácidos
+
12% de maltosa para llevarse acabo la aplicación de la técnica de bombardeo biobalístico consistiendo en insertar los genes G u s (E-
glucoronidasea) y Bar ( gen aislado de la bacteria Streptonyces hygroscopicus ) con el aparato denominado "Pistola de genes".
Estos embriones se guardarón durante 24 hrs en la camara de crecimiento para
s u recuperación. Transcurrido este lapso de tiempo al azar se tomarón 3
r i
r
L
F L.L
F
L
en una incubadora a 37°C durante 48 hrs para el conteo de puntos azules lo que nos índica que recibierón el inserto de los genes..
I n c u b a c i ó n
Un dfa después del bombardeo se inició el proceso de tres selecciones consecutivas cada
una
fue de 30 días, consistiendo en subcultivar los callos en partes iguales en los medios de selección MSC+
BilO y E5 sin aminoácidos+
PPTS unicamente los callos que se utilizarón fuerón los que sobrevivierón en cada período de selección con la utilización de los mismos medios pero recien preparados.Este proceso de selección se aplicó con 50 embriones
no
bombardeados(controles) se dividierón en partes iguales y en cada período de selección se subcultivarón los callos que sobrevivierón a medios recien preparados. E n medio normal (MSC Y E5) se subcultivarón en partes iguales 50 embriones no bombardeados durante el periodo de 90 días, durante este lapso de tiempo en cada 30 días se cambiarón los callos que se desarrollarón a medios recien preparados
Durante el período de selección los callos bombardeados y no bombardeados asf como los callos no bombardeados que estuvierón en medio normal se mantuvierón en la camara de crecimiento. Cada 15 días se midio y se cuantifico el desarrollo y formación de callos bombardeados y no bombardeados.
R e g e n e r a c i ó n
Los callos bombardeados y no bombardeados que sobrevivierón en la selección así como los callos no bombardeados que estuvierón en medio normal se subcultivarón en el medio MSR para regeneración y fuerón colocados
en
una cámara de crecimiento a una temperatura de 27°C durante el fotoperíodo de16
hora
LUZ:
8 horas OBS.RESULT.-\DOS
Los
resultados obtenidos
a
partir del número de embriones extraídos hasta la obtención
ds
callos
en regeneración
fueron lossiguientes:
De
los 604embriones que se rescataron
y
cultivaron
sutamaño fue entre 0.5-1.5
min
siendo favorable el medio de cultivo
E3
para la obtención de callo (fig.
1).Después de la aplicación de la técnica de bombardeo biobalístico con
el
aparato
denominado "Pistola de genes" al total de embriones (fig.
2),los embriones bombardeados
quese tomaron al azar después de aplicarles la solución x-gluc en
24
hrs manifestaron
expresión transginica, consistiendo en el teñimiento de puntos azules en la superfície de
cada embrión
(fig.
3).
Locuál indica que la técnica de bombardeo fue aplicada
correctamente, por
lo
tanto
losembriones recibieron el inserto de los genes.
-
~~
Se obseno que para
losembriones bombardeados durante el
penodode selección,
los
medios utilizados resultaron ser óptimos para el desarrollo
ycrecimiento de
loscallos (fig.
4).Respecto
a losembriones no bombardeados que estu\ieron en e1 periodo de selección, los
medios utilizados
no
resultaron ser favorables para
el
desarrolio
ycrecimiento de
loscallos
yen
un período de
60 díasse fueron muriendo
(fig. 5),en comparación con
losembriones
no
bombardeados que estuvieron cultivados en medio normal, estos medios resultaron
favorables durante el desarrollo
ycrecimiento de los callos
(fig. 6).Dentro de las características más sobresalientes en el transcurso de
la formación de callo
tanto
de embriones bombardeados
y nobombardeados fueron:
amarillo esto
indica
que su desarrollofue favorable
(fig.4,
fig.6),
en
comparacióncon
los
callos
no
bombardeados
queestuvieron en
selección
los
cuales manifestaron
unacoloración
neguzca
por l o tantonos indica
queno
tuvieron
una eficienteresistencia
(fig. 5).Tamaño: El tamaño de crecimiento de los callos no bombardeados durante el
período de selección así como los callos no bombardeados que estuvierón en medio normal fue aumentando gradualmente, en comparación con los callos no
bombardeados que estuvierón en selección, en los cuales después de 45 días no se presento aumento de su tamaño de crecimiento (tabla I ) y (Fig 7).
L o s callos bombardeados que lograrón crecer y desarrollarse durante el pertodo de selección, al exponerse en la camara de luz se observó que en el transcurso de
40
dias solamente en los callos que aparecierón brotes regenerativos fuerón los que estuvierón en el medio de selecciónE5
sin aminoácidos+
PP5 (Fig8)
y el resto de los callos murieron (Fig 9).Con respecto a los callos no bombardeados que lograrón desarrollarse y crecer en el medio normal y al pasar al proceso de regeneración, se observó una favorable aparición de brotes regenerativos (Fig 10).
Por último además de los objetivos del proyecto del Servicio Social y de los resultados esperados referente n la obtención de los primeros brotes
F
i
T
L
F CONCLUSIONES
L. *- i ii F L
r
i Lr
L
c
c
r"
LF
L
i
ic
r
Lr
L.Para obtener mejores resultados en la aplicación de la Técnica de Cultivo de Tejidos se deben de tomar en cuenta dos puntos importantes: el genotipo y los
medios de cultivo que se van a utilizar.
Siendo ambos factores los que nos permiten conocer los requerimientos nutricionales esenciales de los embriones inmaduros y como consecuencia la
obtención de plantas con genotipos modificados.
De
tal manera que se tiene que hacer una selección de los genotipos y medios de cultivo durante varios experimentos ylos
que resultenser
favorables se utilizarán continuamente.Referente a la evaluación de los medios de cultivo para la selección de
los
embriones transformados, los cuales resultarón ser optimos durante e lcrecimiento y desarrollo para formación de
+allo,
esto probablemente nosindica que los embriones que se bombardearon puedan tener o no insertado el gen de resistencia.
Para entender está situación se deven de tomar en cuenta los siguientes factores:
a)
En
cuanto a los embriones transformados, no se sabe que embrionesrecibierón el bombardeo biobalístico, aun con la prueba de la solución x-gluc realizada en elgunos de ellos y si estos manifiestarón expresión transgénica, esto indica que recibierón el bombardeo biobalístico. Está prueba no se puede aplicar en todos los embriones que se transformarón debido a que causa efecto inhibitorio en su crecimiento y por lo tanto no se sabe si tienen insertado los genes.
F
I
F-
L
i
1-
p"
ir-
r"
i,
cj
En cuanto
a e1número de selecciones utilizadas
y
las concentraciones de
losagentes
selecti\,os
Bi
yPPT
(herbicidas) se debe de considerar que hay m i a s opciones para la
obtención de callos resistentes con
laprobabilidad de estar transformados.
-
Por una parte cuando
se
lleva
a
cabo tres selecciones consecuti\as
yen cada selección se
baya
auinentando las concentraciones
de losherbicidas
o
13utilización de
una
sola
concentración.
seobtendria en un tiempo prolongado callos resistentes
-
Otra opción cuando se utiliza una selección aunado con una concentración alta de
herbicidas se obtendria en menor tiempo callos resistentes.
d )
Laobtención de callos en regeneración, de ibwal manera las cantidades de callos que
regeneraron no nos esta indicando que las plantas que se vayan a obtener tengan la
probabilidad de que sean transginicas.
De
igual manera
estos
factores se deben de aplicar en
loscontroles debido
aque estos nos
J a n
inforinación en cada una de las etapas de nuestro experimento y de
está
manera saber
las
modificaciones que
se
puedan hacer en experimentos posteriores.
Es importante mencionar que la Técnica de
Culti\.o
de Tejidos son relevantes en el
contexto general de la agricultura moderna.
Por loque
lospaises en vías de desarrollo
deben de tomar parte activa en
el
desarrollo de la biotecnología agrícola ya que es una
dternati\.a en
lospróximos
años
para producir n u e m variedades de plantas que
se
Y
Y
Y
!
a,
I
b4
Fig 2. "Pistola de genes", aparato utilizado para l a aplicación de la
t k n i c a de homhardeo hiohalístico en trigo y maíz.
k
h
1F i g 3. E x p r e s i ó n t r a n s g é n i c a (puntos azules) m a n i f e s t a d a e n
embriones de trigo harinero después del bombardeo biobalístico
F i g 5. C a l l o s no bombardeados que n o t u v i e r ó n suficiente
resistencia durante la etapa de selección a ) MSC
+
BilO. b) E5 s i nFig h. Comparación en el desarrollo y crecimiento de callos no
Tabla
1.
Crecimiento d e callos transformados
o
bombardeados
del Genotipo Bo'bwhite durante el proceso d e selección.
Los
datos del tamaño d e los callos es
unpromedio d e las
medidas de cada período d e selección
Callos Transform
Tiempo de MSC+BiIO E5+f
Crecimiento (días)
5.0 75 6.2
90 1.5
c;
u
3
o
I
*
5
3
c
E
Tamaño
de callos
(mm)
- I
I
in
O
Fig 8. Callos bombardeados que estuvierón en el medio de selección E5 s i n arniinolícidos
+
P P T j y al pasar a la etapa de regeneración seF i g y. c u l l o s bombardeados q u e estuvierón e n el m e d i o de selección
\Isc
+ Bil0 y al pasar a la etapa de regeneración durante 40 días noF i g 10. O b t e n c i ó n d e b r o t e s r e g e n e r a t i v o s d e c a l l o s n o
F i g 11. P r i m e r a s e t a p a s d e creciniiento y d e s a r r o l l o d e plantas de t r i g o h a r i n e r o o b t e n i d a s a p a r t i r d e e m b r i ó n i n m a d u r o
RECOMENDACIONES
En
los Laboratorios donde se trabaje con la técnica de cultivo de tejidos, se debede tomar diversas precausiones, una de la más recomendables es en tener
cuidado sobre la esterilización tanto del material vivo como del material no
vivo para poder evitar problemas de contaminación.
Otra observación con respecto a la técnica de transformación en trigo harinero, es que después de colectarse el material en el invernadero este deve de utilizarse inmediatamente, ya que no es recomendable guardarlo en refrigeración durante varios días, este es un factor que inhibe el crecimiento
y desarrollo de los embriones.
Referente ai los diferetes medio!j de cultivo que se bayan a utilizar es
recomendable que sean medios que fuerón preparados unos 15 días antes y no que tengan un tiempo de 6 a 7 meses, ya que estos medios de varios meses repercuten de alguna manera en el desarrollo y crecimiento desde el cultivo de embriones inmaduros hasta la obtención de plantas.
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