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SALVADOR GAONA RAM~RU del Departamento de: Biología de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social: TITULO: EVALUACIbN DE DIFERENTES MEDIOS

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(1)

/ N o m b r e : Reyes Pérez María Eugenia M a t r í c u l a :

JL i c e n c i a t u r a :

88239901

Biología. Unidad Iztapalapa. División C.B.S.

/

T e l é f o n o : 4-28-69-45

T r i m e s t r e lectivo: 96- I Horas a la semana: 77 hrs

/Titulo del trabajo: "Evaluación de diferentes medios de cultivo en embriones inmaduros de trigo harinero

(Triticum aestivirrm

) Transformados por la Técnica de Bombardeo"

Dra Sarah Ruth Fenell, Cientifico Asociado. Ingeniería Genética Aplicada. CIMMYT Biol. Salvador Gaona Ramírez, Profesor Titular "C" Tiempo Completo. Adscrito al Departamento de Biología, UAM-I (Vombre del asesor:

Lugar donde se realiza el servicio:

Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo, Int.

Fecha de inicio: 17 de abril de 1996 /Fe& a de term ¡nación : 17 de octubre de 1 9 9

C l a v e : B.O1 1.96

Nombre del proyecto: Técnica de Transformación Aplicada a Trigo harinero

(Trificim

aestivium

)

\.

> - 1,

c...

J /

Fwma del asesor

Firma del alumno

,

(2)

Casa

abierta ai

liempo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

SERVICIO SOCIAL

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio de la presente se hace constar que el (la):

BIOL. SALVADOR GAONA RAM~RU del Departamento de: Biología

de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social:

TITULO: EVALUACIbN DE DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO EN EMBRIONES INMADUROS DE TRIGO HARINERO (Triticum aestivium) TRANSFORMADOS POR LA TECNICA DE BOMBARDEO

ALUMNO: REYES P É R U MAR¡A EUGENIA

LICENCIATURA: BIOLOGíA

PERIODO: 17 D E ABRIL DE 1996

-

30 DE OCTUBRE DE 1986

Se extiende la presente para los tines que al interesado convengan, en la Ciudad de México, D.F. a los veintiocho días del mes de Noviembre de mil novecientos noventa y Seis.

Atentamente,

“Casa Abierta al Tiempo”

UNIDAD IAAPALAPA

(3)

CIMMYT,

Int.

Centro Iníemi\cinnnl de Mejoramiento de Maíz y Trigo

Intcriiationai Maiie and Whcat Improvcmcnt Ccnicr

Dr

.

Jose Luis Arredondo Figueroa Director de la División CBS.

Presente.

Por medio de la presente, me permito informarle que la Srita. Maria Eugenia Reyes Pérez con matrícula 88239901 de la Lic. de Biología, Div. CBS UAM- Iztapalap. concluyó satisfactoriamente su Servicio Social en el Laboratorio de Genética Molecular, CIMMYT-Batán con el proyecto, Evaluación de diferentes medios de cultivo en embriones inmaduros de trigo harinero

( T r i t i c u m

aesrivium)

transformados por la técnica de bombardeo, bajo mi asesoria, dentro del proyecto Técnica de transformación aplicada a trigo harinero.

Por

l o tanto manifiesto que estoy de acuerdo con el contenido del informe final.

Agradesco la atención prestada a la presente.

A t e n t a m e n t e

./

Drü Sarah Ruth Fennell.

Cientifico Asociado, ingeniería Genética Aplicada

T&I: I7720U-CIMTME

Cihk CENCIMMYT

Far: (595) 41069

Tri- Y6iieo. D.F. (ws) 7% 90 91 Texmm (593 421 W4tO I I

Lisboa 27. C o l o i i Juinz

Apdo. Po1ul6641.06600 M4rho. D.F.. MÍiieo

(Mexim Cily office)

(4)

Casa abierta al tiempo

I

r-

I

I,

UNIVERSIDAD AUTONOMA

METROPOLITANA

DlViSlON OE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE U SALUD

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

1-

1-

F

L

i

i

i

17 octubre 1996

Dr.

José

Luis Arredondo Figueroa

Director de la División de Ciencias Biológicas

y

de la Salud

Universidad Autónona Metropolitana lztapalapa

P R E S E N T E

Por medio de la presente hago constar que

la

alumna, Reyes Pérez María

Eugenia con Matricula 88239901 de la Licenciatura de Biologia. presentó

y

concluyo satisfactoriamente con su servicio social, que lleva por título:

"Evaluación de diferentes medios de cultivo en embriones inmaduros de trigo

harinero

(

Triticum

aestiviurn

)

transformados por la técnica de bombardeo".

Despues de la revisión, expreso que estoy de acuerdo con el contenido del

informe final que presenta.

Agradesco la atención prestada a la presente aprovechando la ocasión para

enviarle

un

cordial saludo.

ATANTAMENTE

,-CASA ABIERTA

AL

TIEMPO

BIOL. SALVADOR

GAONA RAM~REZ

PROF

DEPTO. BIOLOGiA.

UNIDAD IZTAPALAPA

(5)

f

c

c

f

(6)

c

-

F L- F I p' L P i

!-

I i

-r

c

Ir

L

c

c

c

c

L:

INTRODUCCION

En

el avance logrado por las ciencias biológicas en las Últimas decadas se han

desarrollado técnicas que posibilitan el estudio de los organismos a nivel celular y molecular. La rama de la investigación que se ocupa de esto es la biotecnología, la cual es una herramienta poderosa para el mejoramiento de las plantas agrícolas y el consecuente beneficio para la humanidad.

Dentro de la biotecnología destaca el cultivo de tejidos ya que tiene una mayor aplicación práctica sobre todo en la agricultura, ya que constituye el puente entre la manipulación genética realizada en el laboratorio y su aplicación en los campos de cultivo ( Roca, 1991).

El cultivo de tejidos tambien es importante porque es básico para, la investigación sobre los procesos bioquímicos y morfalógicos de la diferenciación celular, para la aplicación y desarrollo de tecnologías; en la propagación clonár o como ya se mencionó anteriormente en el mejoramiento genético de las plantas a partir del cultivo de embriones.

El cultivo de embriones de las semillas consiste en el aislamiento y crecimiento in vitro, en condiciones estériles de un eñrbtión inmaduro pretendiendo obtener más de una planta viable.

En

base al estado de desarrollo de los embriones se pueden realizar

principalmente dos formas de cultivos.

a) Cultivo de embriones inmaduros, los cuales se obtienen de semillas sin madurar completamente. Para el cultivo de este tipo de embriones se necesita un medio nutritivo complejo así como una muy cuidadosa disección.

b) Cultivo de embriones maduros, los cuales se obtienen a su vez en semillas maduras. Para este tipo de cultivo es suficiente un medio nutritivo simple con agar, azúcar y minerales. Se utiliza entre otras ventajas para garantizar 100% de germinación de las semillas.

Los enbriones inmaduros se desarrollan a expensas del endosperm0 y poseen una baja cantidad de sintesis celular, su desarrollo depende de ciertos nutrientes que en general son: macroelementos, microelementos, vitaminas y

hormonas que se encuentran en el saco embrionario. Una vez que se han formado los cotiledones, el embrión inmaduro pasa a ser autótrofo por l o tanto este se puede ya separar de los óvulos y cultivarse in vitro en un medio de

cultivo que contenga los nutrientes necesarios para la formación de callos

t:

(7)

P

F

L.

F-

I,

embriogénicos y posteriormente para su regeneración se pasan

a

un medio adecuado para obtención de plántulas.

Son importantes para el exito de la formación de callos varios factores, por ejemplo el genotipo, la composición del medio nutritivo, así como factores físicos.

La ingeniería genética también conocida como tecnología del ADN recombinante, así como la biología molecular se están aplicando actualmente para intentar modificar caractere$ unigénicos como

la

resistencia de las

plantas a virus y, o insectos, también se está aplicando para el incremento de la calidad nutricional de las plantas mediante una proteína rica en aminoácidos esenciales y que es codificada por un solo gen.

Básicamente la manipulación genética es el método molecular de transmitir material genético, de un organismo a otro, sin intervención de la fase generativa (Roca, 1992).

En

general hay dos sistemas para introducir génes en el genoma de las plantas,

la transferencia directa y la transferencia mediante bacterias del género A g r o b a c t e r i u m .

El

primero consiste en la introducción directa de genes empleando ya

sea la microinyección o el bombardeo de partículas de oro madiante un

acelerador de las mismas madiante el aparato llamado "Pistola de genes".

El segundo utiliza las propiedades biológicas de la bacteria del suelo A g r o b a c t e r i u m sp, para introducir el

A D N

foráneo. Esta bacteria causa la

enfermedad llamada agalla de la corona infectando a la planta en el sitio de una herida. Las células de la agalla tienen dos características principales:

1) Producen sustancias denominadas opinas que no estan presentes en las células normales (Murai y Kemp, 1982). y 2) Tienen la capacidad de proliferar indefinidamente en un medio de cultivo sin necesidad de hormonas de crecimiento (White y Braun, 1942).

(8)

F

L OBJETIVOS

1. Conocer y saber aplicar la técnica de cultivo de tejidos a partir de embriónes inmaduros de trigo harinero del genotipo Bobwhite bombardeados con parttculas de oro para la probable obtención de plantas transgénicas.

2. Determinar y observar si hay cambios morfológicos de los callos obtenidos a partir de embriones bombardeados y no bombardeados.

3. Cuantificar la viabilidad y desarrollo de los embriones bombardeados y no bombardeados en cuanto a su capacidad de formación de callo y determinar la capacidad de regeneración de este último..

F

i

(9)

Se Ji\idiri en

dos apartados

la

inetodologia:

11)

inetodologia

en

campo

y

B)

inetodologia

cn

ihratorio.

r

I

L

F L.

!'

T

k

,!-

I L

.\)

\letodologia en campo

Sc

colectaron espigas de

trigo

harinero del

genotipo

Bobwhite

en

el invernadero

perteneciente al programa

de

trigo

que se

encuentra en

las

instalaciones del CiMMYT-

Batan,

Tescoco Ed. Mexico.

La

colecta consistió en

la

toma

de

una

seinilla

al

azar

de cada espiga, estas semillas se

cortaron para serciorarse que

los

embriones tengan

un tamaño de

0.5-2.0

m m

aproximadamente.

Una

vez seleccionadas

las

espigas

st: guardaron

en

una bolsa de papel

anotando genotipo

y

fecha de colecta.

B) Metodologia

de

Laboratorio

Postcrioriiisiite,

en

el laboratorio se Ilebó

a

cabo la

limpieza de

las

espigas consistiendo en

dcsprcnder

las

seinillas de cada espiga pa:a ser esterilizadas dentro de la c h a r a de

flujo

lain

inar.

Las

semillas se colocaron en solución de alcohol

al 70°ó

durante 20 seg. posteriormente se

sacaron

y se

pasaron

a

un

vaso

de precipitado previamente esterilizado con

una

barra

inagnitica,

a

una

solución

de

clorex

al

2090

de agua

drsionizada

y 5 gotas

de Tween-80/It

(detcrsente

no

ionico, usado

en la

preparación de esplante) durante

20-30

inin.

(10)

F t F L F Y-

i

L

r

I, F

I

i. F I i

F

L II

Transcurrido

este

lapso

de

tiempo, se realizaron tres lavados con agua desionizada cada

tino Jurmte

I O

imin

y

en

una caja de petri se colocaron las semillas para la estracción

iiiincdiata

di.

los

einbriones con

la

a y d a

de

un microscopio esteroseópico, pinzas

y

bisturí

se seinbraron de 40

a

50 embriones en cada caja petri conteniendo el medio de cu1tii.o

E3.

En una ciinara de

crecimiento (obscuridad total) a

27 "C

durante

7 dias se guardaron las

cajas de petri

que

contienen el cultivo de

los embriones, después de este lapso de tiempo,

se separaron solaiiiente los embriones

que

empezaron a formar callo, (se define como

un

tejido obtenido por medio del aislamiento de órganos o tejidos diferenciados) de

los

cuales

se apartaron

100

rinbriones

y los

deinis se colocaron en

el medio de pretratamiento

E3

sin

iiminoácidos

+

12% de

maltosa para transformación óüiirante

4

hrs.

Despti2s

&I

pretratamiento

se

procedió

a

la

aplicación de la técnica de bombardeo

biobalistico

al

total de embriones consistiendo en insertar

los

genes marcadores

y

de

resistencia. Estos embriones se mantuvieron guardados durante las

24

hrs en la cámara de

crecimiento.

Pasado este

lapso de tiempo

se tomaron a1 azar tres embriones bombardeados

o

transformados colocando

a

cada uno en

los

compartimientos de

una

placa de

inicrotitulación. añadiéndoles 400 de solución de s-gluc

(5-Bromo-4-Cloro-3-Indonyl-B-D-

Glucoronido), esta placa se

guardo

en una incubadora

a

una temperatura de

37

"C

durante

48 firs.

Posteriorinrnte

se

observó

si presentaron espresión transgénica mediante la

(11)

P L P

-

F L

r"

I

P ! L

F

L 1 L

F

1,

e:

i

Li

F

L

aparición de puntos azules en cada embrión

y

esto nos esta indicando

que

se

insertaron

los

gsnes en

los

embriones de trigo.

Los cteinás callos se subcultiwron en partes

iguales

en los medios de selección MSC+BilO

(10

mglrt

de

Bialaphos, herbicida)

y

E3

sin aminoácidos

+

PPT5

(5

mg/lt

de

Fosfinotricin, herbicida).

El

subcultivo se realizó tres veces consecutims, cada uno durante

30

dias con los mismos

medios antes mencionados

pero

reciin preparados.

De los

100 embriones no bombardeados que se separaron (controles), 50 se utilizaron para

el proceso de selección con

la utilización de

los

medios mencionados anteriormente

y

en

cada selección se utilizó medios recién preparados,

los

otros

50 embriones no

bombardeados se subcultivaron en partes iguales en medio normal

(MSC

y

ES),

y

cada

30

días se cambiaron en medios reciin preparados hasta el período de 90 días.

En

una cámara de crecimiento

se

guardaron tanto

los

embriones bombardeados

y

no

bombardeados para

el desarrollo

y

crecimiento de callos.

Los

callos bombardeados

y no

bombardeados

que

sobrevivieron durante el proceso de

selección asi como

íos

callos

no

bombardeados que sobrevivieron durante el

subcultivo

en

medio normal se pasaron ai tncdio

\ISR

para regeneración

y

obtención de plantas,

los

(12)

b L F

u,

F

I i

L

c:

F I

I,

[i

r

L

c

ACTIVIDADES REALIZADAS

Durante el tiempo que se llevo a cabo este trabajo se realizarón las siguientes etapas:

C o l e c t a .

Se cortar611 10 espígas de trigo harinero del genotipo Bobwhite para ser llevadas al laboratorio e iniciar la técnica de cultivo de tejidos.

Medios de cultivo.

Previamente se preparar611

los

siguientes medios a utilizar:

E 3 (para formación de callos), E3 sin aminoácidos

+

12% de maltosa (para el pretratamiento del bombardeo de embriones), MSC

+

BilO

,

E S sin aminoácidos

+

PPTS (para el proceso de selección en embriones bombardeados y no bombardeados), MSC, ES ( medio normal para el subcultivo

de embriones no bombardeados) y M S R (para la etapa de regeneración).

E s t e r i l i z a c i ó n

Dentro de la cámara de flujo laminar se llevó-a--cabo la esterilización de las semillas de trigo.

Extracción y siembra de embriones inmaduros

Se extrajerón 604 embriones y se cultivar& en el medio de cultivo E3, de tal forma que la posición del escutelo quedo hacia arriba y se mantuvierón en la cámara de crecimiento durante siete días.

B o m b a r d e o

Después de que se inició la formación de callos en el medio E3, se separarón 100 callos para ser utilizados en la siguiente etapa de cultivo de tejidos y los demás callos se pasarón inmediatamente al medio de pretratamiento E3 sin aminoácidos

+

12% de maltosa para llevarse acabo la aplicación de la técnica de bombardeo biobalístico consistiendo en insertar los genes G u s (

E-

glucoronidasea) y Bar ( gen aislado de la bacteria Streptonyces hygroscopicus ) con el aparato denominado "Pistola de genes".

Estos embriones se guardarón durante 24 hrs en la camara de crecimiento para

s u recuperación. Transcurrido este lapso de tiempo al azar se tomarón 3

(13)

r i

r

L

F L.

L

F

L

en una incubadora a 37°C durante 48 hrs para el conteo de puntos azules lo que nos índica que recibierón el inserto de los genes..

I n c u b a c i ó n

Un dfa después del bombardeo se inició el proceso de tres selecciones consecutivas cada

una

fue de 30 días, consistiendo en subcultivar los callos en partes iguales en los medios de selección MSC

+

BilO y E5 sin aminoácidos

+

PPTS unicamente los callos que se utilizarón fuerón los que sobrevivierón en cada período de selección con la utilización de los mismos medios pero recien preparados.

Este proceso de selección se aplicó con 50 embriones

no

bombardeados

(controles) se dividierón en partes iguales y en cada período de selección se subcultivarón los callos que sobrevivierón a medios recien preparados. E n medio normal (MSC Y E5) se subcultivarón en partes iguales 50 embriones no bombardeados durante el periodo de 90 días, durante este lapso de tiempo en cada 30 días se cambiarón los callos que se desarrollarón a medios recien preparados

Durante el período de selección los callos bombardeados y no bombardeados asf como los callos no bombardeados que estuvierón en medio normal se mantuvierón en la camara de crecimiento. Cada 15 días se midio y se cuantifico el desarrollo y formación de callos bombardeados y no bombardeados.

R e g e n e r a c i ó n

Los callos bombardeados y no bombardeados que sobrevivierón en la selección así como los callos no bombardeados que estuvierón en medio normal se subcultivarón en el medio MSR para regeneración y fuerón colocados

en

una cámara de crecimiento a una temperatura de 27°C durante el fotoperíodo de

16

hora

LUZ:

8 horas OBS.

(14)

RESULT.-\DOS

Los

resultados obtenidos

a

partir del número de embriones extraídos hasta la obtención

ds

callos

en regeneración

fueron los

siguientes:

De

los 604

embriones que se rescataron

y

cultivaron

su

tamaño fue entre 0.5-1.5

min

siendo favorable el medio de cultivo

E3

para la obtención de callo (fig.

1).

Después de la aplicación de la técnica de bombardeo biobalístico con

el

aparato

denominado "Pistola de genes" al total de embriones (fig.

2),

los embriones bombardeados

que

se tomaron al azar después de aplicarles la solución x-gluc en

24

hrs manifestaron

expresión transginica, consistiendo en el teñimiento de puntos azules en la superfície de

cada embrión

(fig.

3).

Lo

cuál indica que la técnica de bombardeo fue aplicada

correctamente, por

lo

tanto

los

embriones recibieron el inserto de los genes.

-

~~

Se obseno que para

los

embriones bombardeados durante el

penodo

de selección,

los

medios utilizados resultaron ser óptimos para el desarrollo

y

crecimiento de

los

callos (fig.

4).

Respecto

a los

embriones no bombardeados que estu\ieron en e1 periodo de selección, los

medios utilizados

no

resultaron ser favorables para

el

desarrolio

y

crecimiento de

los

callos

y

en

un período de

60 días

se fueron muriendo

(fig. 5),

en comparación con

los

embriones

no

bombardeados que estuvieron cultivados en medio normal, estos medios resultaron

favorables durante el desarrollo

y

crecimiento de los callos

(fig. 6).

Dentro de las características más sobresalientes en el transcurso de

la formación de callo

tanto

de embriones bombardeados

y no

bombardeados fueron:

(15)

amarillo esto

indica

que su desarrollo

fue favorable

(fig.

4,

fig.

6),

en

comparación

con

los

callos

no

bombardeados

que

estuvieron en

selección

los

cuales manifestaron

una

coloración

neguzca

por l o tanto

nos indica

que

no

tuvieron

una eficiente

resistencia

(fig. 5).

Tamaño: El tamaño de crecimiento de los callos no bombardeados durante el

período de selección así como los callos no bombardeados que estuvierón en medio normal fue aumentando gradualmente, en comparación con los callos no

bombardeados que estuvierón en selección, en los cuales después de 45 días no se presento aumento de su tamaño de crecimiento (tabla I ) y (Fig 7).

L o s callos bombardeados que lograrón crecer y desarrollarse durante el pertodo de selección, al exponerse en la camara de luz se observó que en el transcurso de

40

dias solamente en los callos que aparecierón brotes regenerativos fuerón los que estuvierón en el medio de selección

E5

sin aminoácidos

+

PP5 (Fig

8)

y el resto de los callos murieron (Fig 9).

Con respecto a los callos no bombardeados que lograrón desarrollarse y crecer en el medio normal y al pasar al proceso de regeneración, se observó una favorable aparición de brotes regenerativos (Fig 10).

Por último además de los objetivos del proyecto del Servicio Social y de los resultados esperados referente n la obtención de los primeros brotes

(16)

F

i

T

L

F CONCLUSIONES

L. *- i ii F L

r

i L

r

L

c

c

r"

L

F

L

i

i

c

r

L

r

L.

Para obtener mejores resultados en la aplicación de la Técnica de Cultivo de Tejidos se deben de tomar en cuenta dos puntos importantes: el genotipo y los

medios de cultivo que se van a utilizar.

Siendo ambos factores los que nos permiten conocer los requerimientos nutricionales esenciales de los embriones inmaduros y como consecuencia la

obtención de plantas con genotipos modificados.

De

tal manera que se tiene que hacer una selección de los genotipos y medios de cultivo durante varios experimentos y

los

que resulten

ser

favorables se utilizarán continuamente.

Referente a la evaluación de los medios de cultivo para la selección de

los

embriones transformados, los cuales resultarón ser optimos durante e l

crecimiento y desarrollo para formación de

+allo,

esto probablemente nos

indica que los embriones que se bombardearon puedan tener o no insertado el gen de resistencia.

Para entender está situación se deven de tomar en cuenta los siguientes factores:

a)

En

cuanto a los embriones transformados, no se sabe que embriones

recibierón el bombardeo biobalístico, aun con la prueba de la solución x-gluc realizada en elgunos de ellos y si estos manifiestarón expresión transgénica, esto indica que recibierón el bombardeo biobalístico. Está prueba no se puede aplicar en todos los embriones que se transformarón debido a que causa efecto inhibitorio en su crecimiento y por lo tanto no se sabe si tienen insertado los genes.

(17)

F

I

F-

L

i

1-

p"

ir-

r"

i,

cj

En cuanto

a e1

número de selecciones utilizadas

y

las concentraciones de

los

agentes

selecti\,os

Bi

y

PPT

(

herbicidas) se debe de considerar que hay m i a s opciones para la

obtención de callos resistentes con

la

probabilidad de estar transformados.

-

Por una parte cuando

se

lleva

a

cabo tres selecciones consecuti\as

y

en cada selección se

baya

auinentando las concentraciones

de los

herbicidas

o

13

utilización de

una

sola

concentración.

se

obtendria en un tiempo prolongado callos resistentes

-

Otra opción cuando se utiliza una selección aunado con una concentración alta de

herbicidas se obtendria en menor tiempo callos resistentes.

d )

La

obtención de callos en regeneración, de ibwal manera las cantidades de callos que

regeneraron no nos esta indicando que las plantas que se vayan a obtener tengan la

probabilidad de que sean transginicas.

De

igual manera

estos

factores se deben de aplicar en

los

controles debido

a

que estos nos

J a n

inforinación en cada una de las etapas de nuestro experimento y de

está

manera saber

las

modificaciones que

se

puedan hacer en experimentos posteriores.

Es importante mencionar que la Técnica de

Culti\.o

de Tejidos son relevantes en el

contexto general de la agricultura moderna.

Por lo

que

los

paises en vías de desarrollo

deben de tomar parte activa en

el

desarrollo de la biotecnología agrícola ya que es una

dternati\.a en

los

próximos

años

para producir n u e m variedades de plantas que

se

(18)
(19)

Y

Y

Y

!

a,

I

b4

Fig 2. "Pistola de genes", aparato utilizado para l a aplicación de la

t k n i c a de homhardeo hiohalístico en trigo y maíz.

(20)

k

h

1

F i g 3. E x p r e s i ó n t r a n s g é n i c a (puntos azules) m a n i f e s t a d a e n

embriones de trigo harinero después del bombardeo biobalístico

(21)
(22)

F i g 5. C a l l o s no bombardeados que n o t u v i e r ó n suficiente

resistencia durante la etapa de selección a ) MSC

+

BilO. b) E5 s i n

(23)

Fig h. Comparación en el desarrollo y crecimiento de callos no

(24)

Tabla

1.

Crecimiento d e callos transformados

o

bombardeados

del Genotipo Bo'bwhite durante el proceso d e selección.

Los

datos del tamaño d e los callos es

un

promedio d e las

medidas de cada período d e selección

Callos Transform

Tiempo de MSC+BiIO E5+f

Crecimiento (días)

5.0 75 6.2

90 1.5

(25)

c;

u

3

o

I

*

5

3

c

E

Tamaño

de callos

(mm)

- I

I

in

O

(26)

Fig 8. Callos bombardeados que estuvierón en el medio de selección E5 s i n arniinolícidos

+

P P T j y al pasar a la etapa de regeneración se

(27)

F i g y. c u l l o s bombardeados q u e estuvierón e n el m e d i o de selección

\Isc

+ Bil0 y al pasar a la etapa de regeneración durante 40 días no

(28)

F i g 10. O b t e n c i ó n d e b r o t e s r e g e n e r a t i v o s d e c a l l o s n o

(29)

F i g 11. P r i m e r a s e t a p a s d e creciniiento y d e s a r r o l l o d e plantas de t r i g o h a r i n e r o o b t e n i d a s a p a r t i r d e e m b r i ó n i n m a d u r o

(30)

RECOMENDACIONES

En

los Laboratorios donde se trabaje con la técnica de cultivo de tejidos, se debe

de tomar diversas precausiones, una de la más recomendables es en tener

cuidado sobre la esterilización tanto del material vivo como del material no

vivo para poder evitar problemas de contaminación.

Otra observación con respecto a la técnica de transformación en trigo harinero, es que después de colectarse el material en el invernadero este deve de utilizarse inmediatamente, ya que no es recomendable guardarlo en refrigeración durante varios días, este es un factor que inhibe el crecimiento

y desarrollo de los embriones.

Referente ai los diferetes medio!j de cultivo que se bayan a utilizar es

recomendable que sean medios que fuerón preparados unos 15 días antes y no que tengan un tiempo de 6 a 7 meses, ya que estos medios de varios meses repercuten de alguna manera en el desarrollo y crecimiento desde el cultivo de embriones inmaduros hasta la obtención de plantas.

(31)

BIBLIOGRAFIA

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6 . - Roca, M.W. y L.A., Mroginsk.. (1991). Cultivo de Tejidos en la Agri'cultura. Centro Internacional de Agricultura Tropical.

Figure

Fig  1.  Cultivo  de  embriones  inmaduros  de  trigo  con  un  tamaño  entre  0.5-1.5  m m
Fig  2.  "Pistola  de  genes",  aparato  utilizado  para  l a   aplicación  de  la  t k n i c a   de  homhardeo  hiohalístico  en  trigo  y  maíz
Fig  h.  Comparación  en  el  desarrollo  y  crecimiento  de  callos  no  bombardeados  que  estuvierón  en  medio  normal
Tabla  1.  Crecimiento  d e   callos  transformados  o  bombardeados  del  Genotipo  Bo'bwhite durante  el  proceso  d e   selección
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Referencias

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