BlOLOGlA
EXPERIMENTAL
1
ESTUDIO
DE
LA
EXPRESION
DEL
GENE
DE
DA ENZIMA
1.2. MARCO HISTORIC0
...
3
1.3. La teoría hormonal de
la
diferenciación gonadal
...
5
1.4. La diferenciación sexual cromosómica
...
5
1.5. El cromosoma
sexual
Y
...
;
...
6
1.6. El cromosoma sexual X
...
8
1.7. La diferenciación gonadal del ratón
...
9
1.8. La diferenciación gonadal
y
la hormona inhibidora de
los
conductos Mullerianos
...
1 1
1.9. Las hormonas esteroides sexuales
y
la diferenciación sexual
gonadal
...
12
1
.I
O.
Las enzimas esteroidogénicas del
grupo P-450
...
16
I
.
11
.
La enzima
P-45OSCC
2.OBJETIVOS
...
18
2.1 Objetivo general
...
18
...
3.
HIPOTESIS DE TRABAJO
...
19
4
.
MATERIALES Y METODOS
...
2Q
4.1 Materiales
...
20
4.1
.
1. Medios de cultivo, soluciones
...
20
4.2. Métodos
...
26
4.2.1. Transformación de bacterias competentes
...
26
4.2.2. Amplificación del plásmido
...
26
4.2.3. Digestión enzimática
...
28
4.2.4. Purificación del DNA
...
29
4.2.5. Obtención de las sondas
...
30
4.2.6. Animales de experimentación
...
33
4.2.7. Extracción de RNA
total
...
33
4.2.8. Electroforesis del
RNA
...
34
4.2.9. Transferencia a filtros de nylon
...
37
. .
4.2.10. Hibridación por Northern blot
...
38
4.2.1 1
.
Análisis densitométrico
...
41
4.2.12. Análisis estadístico
...
41
5
.
Resultados
...
42
6
.
Discusión
...
46
7
.
Conclusiones
...
50
experimentalmente la proposición de De Bordeu, transplantando testículos a la cavidad abdominal de animales domésticos prepúberes castrados, demostrando que éstos se desarrollaban de manera normal. Sus hallazgos lo llevaron a apoyar la hipótesis de De Bordeu, así como a afirmar que sus resultados se debían a factores químicos y no a factores de tipo nervioso (48). Tuvieron que transcurrir más de setenta años para que se reiniciaran las investigaciones encaminadas a explicar la importancia de las gónadas para mantener la fisiología reproductiva.
En 1849 el médico Alemán Berthold retomó la línea experimental de Hunter, demostrando que en gallos castrados, se revertía la atrofia del canto al injertarles testículos en la cavidad abdominal. Este resultado le permitió concluir, que en efecto, una sustancia de naturaleza desconocida, producida por los testículos, era transportada por el torrente sanguíneo a todo el cuerpo, manteniendo la fisiología de
los
órganos sexuales accesorios y el comportamiento de cortejo de estas aves. A pesar de la descripci6n de este hecho, que dio lugar a lo que se conoce comoprincipio de la acción endócrina, este trabajo no tuvo repercusión en su tiempo
Aproximadamente 50 años después, Benoit confirmó la interpretación de
Berthold y dio evidencias experimentales en apoyo a la controvertida teoría intersticial (49). Esta teoría asumía la producción de una sustancia en las células intersticiales del testículo la cual podría ser responsable de la diferenciación sexual gonadal (49).
Después del trabajo de Benoit, surgió una de
las
teorías básicas de la diferenciación sexual. Bowin y Ancel en 1903 al estudiar las estructuras genitales de embriones de cerdo durante el periodo de la diferenciación sexual gonadal, propusieron que la diferenciación de las gónadas como de las estructuras genitales masculinas, eran causadas por una o varias sustancias producidas por las células células de Leydig (49).RESUMEN.
La diferenciación sexual es uno de
los
fenómenos biológicos mástrascendentales ya que se asegura la perpetuación de aquellas especies que se reproducen sexualmente. Los esteroides sexuales tienen un papel determinante en el desarrollo y diferenciación sexual en
los
mamíferos. En este trabajo se abordó a nivel de técnicas de biología molecular, el estudio de la expresión del gen de la enzima citocromo P-45OSCC durante etapas tempranas de la maduración gonadal del ratón. Esta enzima es clave en el paso limitante en la biosíntesis. de las hormonas esteroides sexuales (HES), el cual es el de biotransformar el colesterol en pregnenolona. Los resultados de este estudio demuestran, y por primera vez, que las gónadas femeninas y masculinas de ratones de 14 días postcoito se expresa el gen de la enzima P-45OSCC. Lo anterior da apoyo a los resultados previamente obtenidos en este proyecto de investigación. Además de dar paso a estudiar la expresión de otros genes implicados en la síntesis de las HES, así comoLa diferenciación gonadal, así como su maduración ontogenittica aún tienen varias incógnitas, por ejemplo, el de saber si hay biosíntesis de hormonas esteroides sexuales (HES) durante la expresión de genes gónada-determinantes como el Sty, así como el de saber si hay un patrón diferente en su biosíntesis entre las gónadas masculinas con respecto a las femeninas durante su etapa de maduración embrionaria. Po'r lo tanto, el estudiar la expresión del gen que regula ti
la enzima responsable del inicio de la biosíntesis de
las
HES, es importante para que posteriormente se estudie su regulación durante la diferenciación sexual gonadal.I
I. INTRODUCCI~N
1.1
ANTECEDENTES.
La diferenciación sexual es uno de los fenómenos biológicos más trascendentales ya que asegura la perpetuación de aquellas especies que se reproducen sexualmente. El dimorfismo sexual es el resultado de una secuencia de eventos que ocurren en las fases más tempranas de la vida y con un alto grado de precisión en sus mecanismos de regulación. Se considera que la diferenciación sexual completa se realiza en tres etapas (49). La primera etapa abarca la determinación del sexo genético o cromosómico después de la anfimixis. La segunda etapa es la de diferenciación gonadal, etapa en la cual el primordio gonadal indiferenciado se desarrolla para constituir un testículo o un ovario. En la tercera, y Última etapa, se lleva a cabo el establecimiento sexual del organismo o diferenciación sexual fenotípica. Por otro lado,
los
mecanismos implicados en losprocesos de la diferenciación. sexual no han sido aún del todo dilucidados, por Io que a partir de
los
hallazgos obtenidos se han propuesto diversas hipótesis yteorías para explicarlos (49). . I
1.2 MARCO HISTóRICO.
El hombre a través de su conocimiento empírico, sabía de las consecuencias
I .3 LA TEOR~A HORMONAL DE LA DIFERENCIACI~N GONADAL.
La era moderna de la investigación en la fisiología de la diferenciación sexual, se inicia con el estudio del free-martinismo en bovinos, a partir de
los
trabajos simultáneos pero independientes, de Lillie en 1916 y 1917 (25, 26), y de Keller y Tander en 1916 (22). El free-martinismo es el término que se usa para denotar gemelos de diferente sexo unidos por anastomósis vasculares coriónicas, en donde el gemelo femenino, presenta características sexuales masculinas. A partir de estos estudios, se consolidó el concepto funcional de la diferenciación sexual embrionaria a nivel hormonal, así como su comprobación experimental. Por lo que se considera a estos tres investigadores como
los
responsables de la Teoria Hormonal de la Diferenciación Sexual (49). Para explicar este proceso, los investigadores mencionados, propusieron que el desarrollo anormal del gemelo femenino era ocasionado en un estadio muy temprano del desarrollo embrionark por una sustancia secretada por las gónadas del gemelo masculino (49).. .
A partir de
la
teoría hormonal de la diferenciación sexual se fomentaron lasinvestigaciones de tipo experimental a partir de las cuales se constató que IC; esteroides sexuales intervienen en la diferenciación gónada (5). 'Sin embargo, ab? no se han esclarecido, por ejemplo, en que momento de la diferenciación gonadal se biosintetizan y actúan las hormonas esteroides sexuales (49).
1.4 LA DIFERENCIACIóN SEXUAL CROMOSÓMICA.
El proceso de la diferenciación sexual se inicia en el momento de ia
fertilización; cuando un espermatozoide que posee un cromosoma X o
cromosoma Y fertiliza el óvu10 que sólo aporta al cromosoma X. De esta manera se
establece el dimorfismo genético-sexual característico de los mamíferos; teniendo
la hembra un complemento cromosómico sexual XX (sexo homogamético) y ;I
macho XY (sexo heterogamético). El mecanismo subsecuente de la diferenciacicn
dependerá de la presencia de factores determinantes en la feminización o de la
masculinización localizados, tanto en los cromosomas sexuales como en los
autosomas (34, 37). La evolución ha influenciado el proceso de la diferenciación
cromosómica ya que originalmente ambos cromosomas sexuales eran homólogos.
El dimorfismo cromosómico se estableció a expensas de un
sólo
miembro del parque acumuló los factores necesarios para el desarrollo del sexo heterogamético
(cromosoma Y, en mamíferos). En cambio en el cromosoma X no se han
observado cambios filogenéticos importantes y se ha preservado en las diferentes
especies (43).
i
1.5 El CROMOSOMA SEXUAL Y.
En los mamíferos la presencia del cromosoma Y es necesaria para la
diferenciación testicular de la gónada primitiva independientemente del número de
cromosomas X presentes en el genoma de un individuo. Para tratar de localizar los
genes .testículo determinantes en el cromosoma 'Yl como. por ejemplo en los
humanos, se ha correlacionó el cariotipo y el fenotipo de pacientes con
aberraciones estructurales del Y (1g1 46, 51).
En los humanos, la presencia de isocromosomas para los brazos largos del
Y (3, 19) o la simple ausencia de los brazos cortos (46) condicionan fallas en la
organogénesis testicular,
lo
que permitió sugerir quelos
genes testículo-determinantes se encontraban localizados en los brazos cortos del cromosoma Y
(32). Pero en otros estudios se constató que algunos pacientes con isocromosoma
para los brazos cortos del cromosoma Y (51) no tenían desarrollo testicular, lo que
sugirió que ciertos factores requeridos en la maduración testicular estarían
dio pauta a que en el humano se identificara y se cracterizara en el cromosoma Y
el gen putativo determinante del testículo denominádandole SRY (sex determining
region Y) para el humano y Sly para el ratón y otras especies (14, 24, 52). Debido a
la alta homología de su secuencia de nucleótidos al de las proteínas no histónicas
de alta movilidad (HMG-1 y HMG-2) que sirven de enlace a secuencias de ADN, se
ha propuesto que es un factor de transcripción (52). Además se ha demostrado que
la proteína Sry tiene dominios de unión al ADN (52).
En el ratón el gen Sry se expresa a partir de los 10.5-1 1.5 dpc
proponiéndose que esta se da en las células que conformarán a la línea celular de
soporte: las células de Sertoli, que son las primeras en diferenciarse en el testículo
(47, 50). La proteína
Sry
desencadena la cascada de eventos que se llevan al caboen la diferenciación sexual gonadal. A partir de lo cual McCleavey et al. (30)
. .
propusieron su hipótesis de la regulación de la cascada para la diferenciación
sexual en los mamíferos. En esta hipótesis se propone la participación de dos
genes, el SRY y el "Z"', localizado en un cromosoma autosómico. A partir de la
regulación de ambos genes se lleva a cabo la diferenciación gonadal. De tal forma
que al transcribirse el gene SRY su proteína se uniría al gene "Z" reprimiendo su
transcripción; lo cual "encendería"
los
genes testículo determinantes. Por otro lado,en ausencia del SRY se expresa el gene
"2"
cuya proteína inhibe o "apaga" losgenes testículo determinantes, dando como resultado el desarrollo ovárico. Con
esta hipótesis de los dos genes -SRY y "2''- somático de la diferenciación gonadal,
estos autores apoyan la participación del SRY como el iniciador en la diferenciación
testicular, además de explicar satisfactoriamente patologías inherentes a la
diferenciación sexual gonadal (49).
1.6 EL CROMOSOMA SEXUAL X.
La participación del cromosoma X en la determinación gonadal y de las
gametas en ambos sexos es fundamental. Uno de los fenómenos más
sorprendentes en genética evolutiva es la inactivación de uno de
los
cromosomas Xen individuos femeninos homogaméticos, proceso que mantiene el equilibrio génico
en ambos sexos al igualar el contenido de ADN cromosómico activo (1
1 ,
28). Lainactivación del cromosoma X resulta en la formación de una partícula
heterocromática adyacente a la membrana nuclear conocida como cromatina X o
corpúsculo de Barr (1). La hipótesis de Lyon (27, 28) propone que durante el
desarrollo embrionario se lleva a cabo la inactivación de uno de los cromosomas X.
En la mujer ocurre al azar en el cromosoma X materno o paterno y una vez que
este se ha inactivado en una célula, el proceso se perpetúa en todas sus
descendientes. Sin embargo, la inactivación no ocurre a l azar cuando uno de
los
cromosomas X es anormal ya que en esta circunstancia se preserva el cromosoma
X normal (37). Por otra parte, la observación de la inactivación del cromosoma X en
el espermatocito primario ha sugerido que este proceso es necesario para la
espermatogénesis normal, ya que la presencia de un cromosoma X activo interfiere
con la meiosis (1 2). Estos datos sugieren que el cromosoma sexual X posee genes
reguladores de la diferenciación de las células germinales.
1.7 LA DIFERENCIACI~N GONADAL DEL RATÓN.
El sexo gonadal es el conjunto de procesos de diferenciación tanto
fisiológicos como morfológicos que llevan al cabo la gónada indiferenciada para
gónadas, existe una interaccibn entre dos líneas celulares que componen al
primordio gonadal: las células germinales primordiales (CGP) que son de origen
extragonadal y las células somáticas (6, 31). Durante
los
procesos de lamorfogénesis de las gónadas se observan tres etapas (32): 1) la colonización de
las células germinales primordiales hacia el primordio gonadal; 2) la organizaci6n
del primordio gonadal como gónada diferenciada y 3) la diferenciación de la gónada
en un testículo o en un ovario.
Las CGP derivan del ectoderm0 embrionario, detectándose en el pliegue
cefálico entre los 7.5 y 8 días postcoito (dpc). Migran del saco vitelino y el
mesoderm0 del alantoides, hacia la región de las crestas gonadales. A los 9.5 dpc
al formarse el intestino se lleva consigo a las CGP. A partir de la formación de la
cresta gonadal .a los 10 dpc las CGP salen del intestino y migran tanto por un
movimiento pasiva como activo a través del mesenterio dorsal hacia las crestas
genitales (31).
. .
. .
La diferenciación testicular (6, 32) se inicia cuando
los
cordones epitelialesque contienen a las células germinales (CG) se separan del epitelio celómico como
consecuencia de los arreglos producidos la invasión de mesenquima y vasos
sangíneos. Lo anterior provoca la compactación de
los
cordones testicularesquedano formados por las células del epitelio interno (células de Sertoli) y las CG;
la separación del epitelio superficial da lugar a la formación de la túnica albuginea
(31). Las células que rodean a
los
cordones testiculares al difrenciarse se lesdenomina células miodes, encargandose de la formación de las menbranas
basales. Las células de Sertoli se caracterizan por tener desarrollado notablemente
el retículo endoplásmico rugoso, que caracteriza a las células con capacidad para
secretar polipéptidos. Estas células tienen dos funciones: el empaquetamiento de
las CG y la síntesis de la hormona inhibidora de los conductos de Müller (HIM) (31).
La HIM es secretada por las células de Sertoli en los testículos fetales y adultos, así
como por las células de la granulosa en
los
ovarios postnatales (2). Por otro lado, laadquisición de la actividad endócrina de las células de Sertoli es independiente de
la organización de
los
testículos (31).Las células de Leydig se diferencian a partir del tejido intersticial y son las
encargadas de la síntesis de andrógenos
,(32).
Estas células se diferencian pocodespués de los cordones testiculares; a los 14 dpc se hacen evidentes por
presentar gran cantidad de milocondrias de crestas tubulares, organelos
característicos de células esteroidogénicas, así como de un abundante retículo
endoplasmico liso, gotas de lípidos e inclusiones de glucógeno en el citoplasma
(27).
Durante la formación del ovario las CG quedan dentro de los cordones del
epitelio celómico, los cuales sufren a nivel central del blastema gonadal (médula)
un proceso morfogenético a partir del cual las CG se desplazan hacia su periferia e
inician su primera reducción meiotica. Los ovocitos quedan rodeadas por las
células intersticiales que provenientes de la disgregación de los cordones
medulares. Las células intersticiales tempranas, posteriormente se les denominan
células de
la
granulosa (12). Siendo hasta la pubertad que el ovario comienza a ser1.8 LA DIFERENCIACIóN GONADAL
Y
LA HORMONA INHIBIDORA DE LOSCONDUCTOS M~LLERIANOS.
Shen y colaboradores (50) proponen el mecanismo para tratar de describir la
ontogenia de los eventos involucrados en la diferenciación testicular. Una vez dada
la transcripción del SRY se inicia el primer evento morfológico de la diferenciación
testicular, el rearreglo de las células de Sertoli en la conformación de los cordones
medulares. Simultáneamente estas células inician la transcripción y secreción de la
hormona inhibidora de los conductos Müllerianos (HIM), que es un péptido
semejante al factor de crecimiento transformant?-p (54). Esta hormona es
la
causante de la muerte celular programada de los conductos de Müller. De tal
manera, .que en su ausencia, en las hembras se desarrollan los oviductos, úteros y
la parte superior de la vagina.
. .
De manera paralela a la expresión del HIM por el transcrito del SRY en las
células de Sertoli, este además regularía a nivel de'las células de Leydig algunas
enzimas involucradas en la producción de las HES. Estas serían los moduladores
en la morfogénesis gonadal (18, 50). Sin embargo, aún resta por determinar en que
línea(s) celular(es) de la gónada indiferenciada se expresa el SRY y como se
regula su expresión. Además de desconocerse los mecanismos a través de los
cuales su producto regula la transcripción de los genes involucrados en los
procesos que regulan la cascada de eventos de la diferenciación y morfogénesis
testicular (49). También se ha propuesto que la expresión de la HIM es el marcador
molecular primario en la diferenciación testicular y no la del SRY (49; 50).
’ 1.9 LAS HORMONAS ESTEROIDES SEXUALES Y LA DIFERENCIACI~N
SEXUAL GONADAL.
A partir de su actividad biológica las hormonas esteroides sexuales (HES) se
agrupan en dos grandes familias,
los
esteroides adrenales y los esteroidesgonadales. Los adrenocorticoides agrupan a los glucocorticoides y
los
mineralocorticoides; mientras que los esteroides gonadales abarcan a los
progestágenos, andrógenos y estrógenos (44). Las hormonas esteroides con
actividad progestacional, glucocorticoide y mineralocorticoide están constituidas por
un esqueleto de 21 átomos de carbono (C21) denominado pregnano. A su vez, las
hormonas con actividad andrógenica por el androstano (C19) y con actividad
estrogénica por el estrano (C18) (44).
La biosíntesis de los adrenocorticoides y los andrógenos siguen dos rutas metabólicas. La vía denominada de los A5 que involucra a los intermediarios con un grupo funcional 3 P-OH y que utiliza a la pregnenolona (C21) como precursor y la
, ,
vía
A 4
que utiliza a la misma pregnenolona como precursor, pero cuyosintermediarios poseen la estructura 4,3-ceto. Por su parte, la biosintesis de los
estrógenos puede provenir tanto de internediarios de la vía A 5 como la
V I A
A'
cti,
c=o I
V I A
A'
\I
3 O H OHLa síntesis de testosterona a partir del colesterol requie:e la presencia de 8
diferentes sistemas enzimáticos. Debe señalarse que cada uno de estos sistemas
enzimáticos tiene regulación génica autosómica diferente (44). Esta actividad
endócrina tan temprana de la célula de Leydig representa una excepción en la
economía fetal, ya que en general el feto tiene medidas de protección que no
permiten la síntesis de hormonas esteroides activas que podrían poner en peligro
su homeostasis (44). La testosterona de origen testicular ejerce su efecto enforma
local promoviendo la maduración de los túbulos espermatogénicos y es secretada a
la circulación fetal sistémica, lo que permite ejercer yn papel esencial en el
desarrollo del tracto genital masculino ( I O , 44).
La testosterona puede ser biotransformada a. su forma 5a-reducida,
formándose la tercera hormona fetal que participa en el desarrollo fenotípico de los
genitales externos de los machos, la Sa-dihidrotestosterona (DHT) (44, 55). Esta
conversión metabólica es mediada por la presencia de la 5a-reductasaI una enzima
de localización citoplasmática y nuclear dependiente de NADPH y con regulación
génetica autosómica. El mecanismo intimo de acción de T y DHT es esencialmente
similar al observado en la vida postnatal (55). El andrógeno T o DHT se une en el
citoplasma en forma no covalente y específica al receptor de andrógenos, una
macromolécula de naturaleza protéica con un coeficiente de sedimentación 8s
(unidad Sdverberg) en su forma no disociada y 4s en su forma disociada, presente
en los órganos andrógeno sensible o dependientes. Este receptor citoplasmático
para andrógenos está regulado por un gene localizado en el cromosoma X (34).
Posterior a la formación del complejo andrógeno-receptor éste es translocado al
interior del núcleo donde interacciona con la cromatina a través de receptores
incluye el incremento en la síntesis de ARN polimerasas ( I , II y Ill) y de ARN
mensajeros específicos que culmina con la 'síntesis ribosomal de proteínas,
expresando en esta forma su efecto androgénico. Mientras la testosterona induce
la virilización de los conductos Wolffianos, la DHT es la hormona fetal que induce la
virilización de los genitales externos durante la embriogénesis (55). Como resuttacfc
de la acción DHT los pliegues genitales se alargan y se fusionan para forma? e'
pene y la uretra masculina y como consecuencia de esta fusión los engrosamientzs
labios escrotales a cada lado del orificio uretra1 constituyen el escroto bilobula2s
que servirá como receptáculo a los testículos al momento de su descenso (44). La
DHT estimula el desarrollo prostático que es un órgano sexual accesorio que deriva
del seno urogenital.
La tendencia natural del embrión
en
términos de diferenciación sexuai S Shacia la feminización, mientras que el proceso de masculinización requiere de Y,;
sistema inductor complejo con múltiples mecanismos de regulación (23). E.
mecanismo de la diferenciación sexual ha sufrido cambios durante la evolución y. ' 2
situación en los mamíferos, debe ser analizada en el contexto de su partic+>'z-
forma de desarrollo. Es bien conocido el hecho de que usando hormonas
esteroides sexuales exógenas es posible "inducir" epigenéticamente una reversi&
sexual de la gónada en casi todos los vertebrados inferiores, así como en
iz
Smarsupiales (5, 49). Estas evidencias apoyan el concepto de que las hormom:;
esteroides desempeñan una función importante en la diferenciación sexual gonacai
en algunas especies.
Bogart (2) retomando la teoría hormonal y el papel de las hormoms
esteroides en la fisiología reproductiva, así como la regulación en la biosíntesis de
estrógenos, propone una hipótesis con la cual trata de explicar la diferenciaci8n
sexual gonadal (determinación sexual primaria) tanto en invertebrados
domo
envertebrados. El plantea que en todos los animales la diferenciación gonadal se
determina a partir de la relación local entre andrógenos y estrógenos, las cuales
regularán el inicio y el mantenimiento de la transcripción de los genes específicos,
como por ejemplo,
los
de las aromatasas. Si la relación de andrógenos es superiorque la de los estrógenos, se llevará a cabo la diferenciación testicular. Por el
contrario, si la concentración de los estrógenos es mayor que la de los andrógenos
se diferenciarán los ovarios. Lo anterior se debe a que los andrógenos regulan
negativamente y los estrógenos positivamente los genes de las aromatasas. El
control positivo se lleva a cabo a través de: a) la rápida transcripción de sus genes
y/o b) proteínas específicas que incrementan su actividad.
LAS ENZIMAS ESTEROIDOG~NICAS
DEL
GRUP.O P-450.
La biosíntesis de las hormonas esteroides sexuales requiere de l a acción
secuencia1 de un grupo de enzimas pertenecientes al grupo de las citocromo P-450
esteroides hidroxilasas que convierten el colesterol a varias clases de esteroides
(35).
Los andrógenos fetales son requeridos para la diferenciación sexual del
macho por lo que se ha sugerido que los ovarios fetales no son
esteroidogenicamente activos. Sin embargo, los detalles moleculares de como es
que las enzimas esteroidogénicas están presentes en los testiculos fetales y cuales
están presentes y/o ausentes en los ovarios fetales aún no ha sido del todo
establecido. La síntesis de andrógenos a partir del colesterol requiere de la acción
de cuatro enzimas (53): La enzima que rompe la cadena lateral del colesterol
(P45Oscc), 3p-hidroxiesteroide deshidrogenasa/A4 y A5-isomerasa (3pHSD), la
androstendiona y la testosterona pueden ser convertidas a estrógenos por la
enzima P450 aromatasa (P450arorn).
1.11
LA
ENZIMA
P-45OSCC.
La enzima P-45OSCC cataliza et primer paso en la biosíntesis de las hormonas esteroides sexuales, la conversión del colesterol a pregnenolona. La actividad de esta enzima es regulada por la hormona adrenocorticotrópica (ACTH), secretada por la glándula pituitaria, así corno por la concentración del AMPc en células de la corteza adrenal (38). A diferencia de las citocromo P-450 esta
hemoproteína no es sintetizada en los polisomas (39). Se sintetiza como un precursor largo (36) y es transportado hacia la mitocondria dónde es funcional. Se
ha propuesto la acción de un péptido señal a partir del cual la proteína precursora de la enzima se transporta hacia
el
interior de la mitocondria; y al ser removido se convierte en la forma “madura” (37). Las mitocondrias de la corteza adrenalcontienen otras formas de citocromos P-450, como la P-450 (1 I p-hidroxilasa), que es también sintetizada como un precursor largo en el citoplasma para ser importada hacia la mitocondria
2. OBJETIVOS.
2.1 OBJETIVO GENERAL:
Estudiar la expresión del gen de la enzima P-45OSCC en etapas tempranas de la maduración de los testículos y de los ovarios del ratón.
2.2 OBJETIVOS PARTICULARES:
1.- Obtención del ADNc de la enzima P-45OSCC por medio de
la
técnica de amplificación y transformación bacteriana.2.- Aislamiento de ARN total de testículos y ovarios de 14 días postcoito (dpc) para observar su integridad y concentración.
HIPóTESIS DE TRAB
Algunos autores han propuesto que no hay expresión del gen P-45OSCC en las gónadas de hembras en etapas tempranas de su diferenciación y que por lo tanto no hay biosíntesis de la pregnenolona. Contrario a lo anterior en estudios recientes hemos determinado la concentración por técnicas radioinmunoanalíticas (RIA), así como por la biotransformación de colesterol radiactivo in vitro de pregnenolona, y de otros esteroides sexuales, tanto en gónadas embrionarias como fetales de machos y hembras de ratón. Por lo que para complementar aún más los resultados anteriores, restaba estudiar la expresión de algunos genes implicados en la síntesis de enzimas esteroidogénicas. De tal manera que se estudió el gen de la enzima P-45OSCC cuyo producto es la enzima responsable de dar inicio a la síntesis de las HES: la biotransformación del colesterol en pregnenolona.
Por lo anteriormente expuesto se planteó la siguiente hipotesis de trabajo: Si la enzima P-45OSCC al ser. activa en los testiculos y ovarios de ratones en etapas tempranas de su desarrollo embrionario, el gen que la codifica debe expresarse antes y10 durante este período de la diferenciación sexual gonadal.
4.1. MATERIALES
4.1.1 Medios de cultivo, soluciones
.
1 .-Medio de cultivo líquido LB. 10 g NaCI.
5 g extracto de levadura.
10 g peptona.
Agua c.b.p. 1000 mi.
Se ajustó el pH a 7.5 y se esterilizó por autoclave. i
2.-Medio de cultivo en placa LB. 10 g NaCI.
5 g extracto de levadura.
10 g peptona.
5 g.agar.
Agua c. b.p. 1 O00 ml
Se ajustó el pH a 7.5 y se esterilizó por autoclave.
3.-Solución de ampicilina 12.5 mg/ml. 12.5 mg/ml ampicilina.
Amortiguador de fosfatos 0.6 M pH 6.4.
Se esterilizó por filtración en Millipore 0.45 mm. Se usó a una concentración de 35-50 mg/ml.
4.-Solución STE (pH 8). 0.1 M NaCI.
1 mM EDTA (pH = 8). Se esterilizó por autoclave.
5.-Solución I.
50 mM glucosa.
25 mM Tris-HCI (pH 8). 10 mM EDTA (pH 8)
Se esterilizó por autoclave y se guardó a 4°C.
6.-Solución de lisozima. 10 mg/ml lisozima.
I O mM Tris-HCI (pH
=
8).Se preparó justo antes de usarse.
7.-Solución II.
0.2 N NaOH (recién diluido de una solución 10 N de NaOH). 1% SDS.
8.-Solución I l l .
60 m1 acetato de potasio 5 M. 11.5 m1 ácido acético glacial. 28.5 mi agua.
La solución resultante es 3 M con respecto al potasio y 5 M con respecto al acetato
9.-Solución TE (pH 8.0). 10 mM Tris-HCI (pH 8).
1 mM EDTA (pH 8).
1 O.-RNAsa pancreática.
10 mg/ml RNAsa pancreática libre de DNAsa.
10 mM Tris-HCI (pH = 7.5). 15 mM NaCI.
La solución se calentó 15 minutos a 1000 C. Se permitió que se enfriara A
temperatura ambiente y se guardó en alícuotas a -20" C.
11 .-Fen01 saturado pH > 7.8
Se licuó el fenol a 68" C y se adicionó 8-hidroxiquinoleina a una COtXXntraci¿Jr I
final de 0.1%. Se adicionó un volumen igual de Tris-HCI 0.5 M (pH 8) y se agill'l durante 10 minutos, después de los cuales se descartó la fase acuosa (superior). ZJn
repitió la operación dos veces más y se adicionó un volumen igual de Tris-HCI 0.1
M
(pH 8). Se agitó durante 15 minutos y se descartó la fase acuosa. Se repitió la misnm operación hasta que el pH del fenol fue superior a 7.8. El fenol se ak"Em?nÓ con 0 Ivolúmenes de Tris-HCI 0.1 M (pH 8) conteniendo 0.2% de (I-merCaptOetanol.:~c; almacenó en un frasco obscuro a 4" C.
12.-Solución fenol-cloroformo.
1 volumen de fenol saturado pH > 7.8.
1 volumen de cloroformo.
Se preparó justo antes de usarse.
13.-Acetato de sodio 3 M (pH 5.2). 3 M acetato de sodio.
Se ajustó el pH con ácido acético glacial y se esterilizó por autoclave.
14.-TBE 10 X (25 mM). 54 g Trizma base. 27.5 g ácido bórico. 20 m1 EDTA 0.5 M (pH 8).
Agua cbp 500 ml.
15.-Gel de agarosa 1% en TBE. 1.2 g agarosa:
120 ml TBE 0.5X.
0.5 pg/ml bromuro de etidio.
16.-Amortiguador de carga para DNA 6X (Loading Buffer). 0.25 % azul de bromofenol.
0.25 % xilencianol. 30.0 Ohglicerol.
Se preparó en condiciones estériles y se guardó a 4" C.
17.-Amortiguador de carga para RNA 6X (Loading Buffer). 50 Ohglicerol.
1 mM EDTA (pH 8.0). 0.25 Ohazul de bromofenol. 0.25 % xilencianol.
18.-TRlzol Reactivo para la extracción
d e
RNA (Gibco BRL). Tiocianato de guanidinaFenol
p-mercaptoetanol
Se mezcló 1 ml de dietilpirocarbonato (DEPC) con 9 ml de alcohol etílico absoluto y se aforó a 1000 ml con H20 destilada. Se colocó en baño de temperatura
a 37" C por dos horas y se esterilizó por autoclave. 20.-MOPS 12X.
O. 1 M MOPS (acido 3-[N-morfolino] propanesulfónico). 40 mM acetato de sodio.
5 mM EDTA
Se preparó con Hz0 + DEPC y se esterilizó por filtración.
21.-NaOH 0.5 N + NaCl 1.5 M. 20 g NaOH.
87.66 g NaCI.
Agua cbp 1000 ml. Se esterilizó por autoclave.
22.-Tris-HCI 1 M (pH 7.4) + NaCl 1.5 M. 157.64 g Tris-HCI.
87.66 g NaCI. Agua 800 ml.
,Se ajustó el pH a 7.4, se aforó a 1000 ml y se esterilizó por autoclave.
23.-ssc 20x
175.3 g NaCI.
88.2 g citrato de sodio. 800 ml agua.
. .
Se ajustó el pH a 7.0, se aforó a 1000 ml y se esterilizó por autoclave.
24.-SDS (Dodecil sulfato de sodio) 10 %. 10 g SDS.
90 ml agua.
Se calentó a 68" C hasta que se disolvió completamente. Se ajustó el pH a 7.0, se aforó a 100 ml y se esterilizó por autoclave.
25.-EDTA 0.5 M (pH 8)
186.1 g de Na2EDTA
*
2 Hz0 (Etilendiaminotetraacetato de sodio). 800 ml de H20.10 g Ficoll tipo 400. 1 O g polivinilpirrolidina.
10 g Albúmina sérica bovina (ASB). Agua cbp 500 ml.
Se esterilizó por filtración y se guardó a
-
20" C.27.-PB 0.6 M pH 6.5 (Amortiguador de fosfatos)
Se disolvieron 21.3 g de Na2HP04 en 250 mt de agua. En otros 250 ml de agua se disolvieron 20.7 g de NaH2P04. A la solución de fosfato dibásico se adicionó poco a poco la solución de fosfato monobásico hasta que se alcanzó el pH deseado.
28.-Sephadex G-50. 1
10 g de sephadex G-50 se lavaron varias veces con 360
ml
de agua desionizada para eliminar el dextran soluble. Se equilibró la resina con TE (pH 8) y se esterilizó por autoclave.25
4.2.
MÉTODOS.
4. 2.1. Transformación de bacterias competentes.
1. Se utilizaron bacterias E. coli DH5a competentes (Gibco BRL). Se descongeló un
tubo con las bacterias competentes en la palma de la mano, después de lo cual se colocaron en un baño de hielo por 10 minutos.
2. Se tomaron 150 pI de bacterias y se colocaron en un tubo eppendorf estéril frio. Se le agregaron 10 ng del plásmido con el cual se transformaron y se dejó en el hielo por 30 minutos. El plásmido que fue introducido es el: pUC18 el cual tenía integrado el
cDNA de P-45OSCC de Bovino. 1
3. Se colocó el tubo en un baño de agua a 42" C por 90 segundos y después se
transfirió a un baño de hielo por 2 minutos. Se agregó 800 pI de medio de cultivo LB
al tubo y se colocó en un horno a 37" C por 45 minutos.
4. Se tomaron 100 pi y se colocaron en cajas petri que contenian medio de cultivo LB
sólido
+
20 pg/ml de ampicilina. Las bacterias se extendieron en la placa con un rodillo de vidrio y se dejaron incubando a 37" C por 12-16 horas.4.2.2. Amplificación del plásmido.
1. Se tomó una coJonia de la placa y se sembró en 500 ml de medio líquido LB que
contiene de 35 a 50 pg/ml de ampicilina. Se incubó
a
37"C
con agitación por 12-16horas.
2. Se transfirió la solución a dos tubos Beckman de 400 ml y se colocó en hielo 10
Se decantó el sobrenadante, se resuspendió la pastilla en 100 ml de solución STE fria y se volvió a'centrifugar en las mismas condiciones.
3. Se decantó el sobrenadante, se resuspendió la pastilla en 18 ml de Solución I y se incubó 10 minutos a temperatura ambiente. Se adicionó 2 ml de lisozima (IO mg/ml) recién preparada y 40 ml de Solución II recién preparada. Se mezcló invirtiendo suavemente los tubos y se incubó a temperatura ambiente por 5-10 minutos. Se agregó 20 ml de Solución Ill fría, se mezcló y se colocó en hielo por 10 minutos.
4. Se centrifugó el lisado bacteriano a 4,000 rpm por 15 minutos a 4"
C.
Se filtró el sobrenadante por 4 capas de gasa estéril y se colocó en un tubo de centrífuga. Se le adicionó 0.6 volúmenes de isopropanol, se mezcló bien y se incubó a temperatura ambiente por 10 minutos.5. Se centrifugó a 5,000 rpm por 15 minutos a temperatura ambiente. Se decantó el
sobrenadante y la pastilla se lavó con etanol al 70% a temperatura ambiente. Se decantó el etanol y se disolvió la pastilla en 3 ml de TE (pH 8).
6. Se adicionó RNAsa pancreática libre de DNAsa a una concentración final de 10
pg/ml y se incubó la mezcla por 1 hora a temperatura ambiente.
7 . Se extrajo el DNA con un volumen igual de fenol-cloroformo y se centrifuge a 12,000 rpm por 10 minutos. Se tomó la fase acuosa y se precipitó con 2.5 volúmenes
de etanol absoluto frío por 12 horas a -20" C.
8. Se centrifugó a 14, O00 rpm por 20 minutos a 4"
C
y se desechó el sobrenadante.La pastilla se disolvió en TE (pH 8). Se hicieron diluciones 1 :IO0 y se leyó la absorbancia de estas muestras a las siguientes longitudes de onda: 260, 280 y 310
nm. Se determinó la concentración de DNA mediante la siguiente fórmula: 1 unidad de Absorbancia a 260 nm
=
50 pg de DNA /ml. También se determinó la pureza delDNA por medio de la relación de absorbancias obtenida a 260 y 280 nm (260/280 nm).
9. Para determinar la integridad de
los
plásmidos obtenidos estos se observaron en un gel de agarosa al I % , el cual se corrió en TBE 0.5X a 80 V por una hora.4.2.3.
Digestión enzimática de los plásmidos.
Plásmido con P-45OSCC inteqrado.
El cDNA de P-45OSCC de bovino estaba inserto en el plásmido Pucl8 (Fig.2) 1. Se colocó en un tubo eppendorf:
10 pg de plásmido purificado Pucl8 con P-450 SCC integrado.
5 pl de amortiguador 1OX para EcoRI.
1.5 pl de EcoRl (30 unidades),
Agua estéril cbp 50 pJ.
2. Se mezcló perfectamente bien y se incubó a 37" C durante 1 hora.
3. El plásmido digerido con Eco RI fue cortado nuevamente con la enzima Sal I
5 pl de Sal -I (30 unidades ).
4. Se mezcló perfectamente y se incubó a 37°C Durante toda la noche.
5. Se extrajo la muestra con un volumen igual de fenol-cloroformo y se centrifugó a
12,000 rpm por 10 minutos a 4" C. Se tomó la fase acuosa y se precipitó con 2.5
volúmenes de etanol absoluto + O. 1 volúmenes de acetato de
sodio
3 M a -20" C por 12 horas.6. Se centrifugó la muestra a 12,000 rpm por 20 minutos. Se desechó el
4.2.4. Purificación del
DNAc.
Una vez que se cortaron los plásmidos con las enzimas de restricción se purificaron los DNAc por medio de electroelución.
1. Los plásmidos digeridos se corrieron en un gel de agarosa al 1 Ohen TBE 0.5X a 80 V por 2 horas.
2. Con un bisturí se corto el segmento del gel que contenía el DNAc, se colocó dentro
de una bolsa de diálisis y se le agregó 300 pl de TE (pH 8). Se colocó la bolsa de
diálisis dentro de una
0.5X por 1 hora. Se
segundos.
1
cámara de electroforesis y se migró la banda a 80 V en TBE
invirtió el sentido de la corriente y se migró a 80 V por 45
3. Se tomó la solución de TE que se encontraba dentro de la bolsa de diálisis y se colocó dentro de un tubo eppendorf. La bolsa de diálisis se enjuagó con 100 pl de TE y estos se colocaron en el tubo'eppendorf.
4. Se extrajo el DNAc con un volumen de fenol-cloroformo, se centrifugó a 12,000 rpm por 10 minutos y se tomo la fase acuosa. Se precipitó el DNAc con 2.5
volúmenes de etanol + 0.1 volúmenes de acetato de sodio 3 M a -20" C por 12 horas.
5. Se centrifugó a 12,000 rpm a 4" C por 30 minutos, se desechó el sobrenadante y
se lavó la pastilla con etanol al 80 %. Se centrifugó a 12,000 rpm a 4" C por 10 minutos y se desechó el sobrenadante.
6. Se redisolvió la pastilla en 30 pI de TE.
4.2.5. Obtención de las
sondas.
Se llevaron a cabo los métodos descritos anteriormente con el objetivo de obtener los fragmentos del gen de la P45OSCC el cual se usó como sonda en las hibridaciones Northern blot. Se llevó a cabo la transformación de bacterias
competentes E. coli DH 5a con los plásmidos que contenían el DNA complementario (DNAc) de P45OSCC. El DNAc de P45OSCC de bovino estaba inserto en el plásmido PUC18 (37) (Fig. 2). Posteriormente se llevó a cabo la amplificación, digestión enzimática y purificación de
los
DNAc.La Figura 3. Muestra el fragmento de P45OSCC que se usó como sonda antes y después de purificarlo. El carril (1 y 2 corresponde al DNA del plásmido digerido con EcoRI. En el carril 3 se observa el DNA del plásmido, sin digerir, de
. pUCI18 el cual tiene inserto el DNAc de P45OSCC. Los carriles 4 5 6 y 7
corresponden al fragmento de P45OSCC digerido con Eco RI +Sal I. El fragmento
es de 1.75 kb. . .
En la Figura 4. se muestra el muestra el fragmento de P45OSCC usado
como sonda. El DNA del fago h digerido con Hind I l l se usó como marcador de peso molecular (carril I). En el carril 2 se observa el DNAc de el pUC18 / P45OSCC que se purificó por electroelución y
el
tamat70 del fragmento es de 1.750
P
m
o2
6.
O 3 I
O n
-
X
Figura cortes
3. Electroforesis en gel de agarosa al 1% en la cual se muestran
los
del plásmido con las dos enzimas de restricción EcoRllSall para la
obtención del fragmento de P45OSCC de 1.75 kb.
4.2.6. Animales de experimentación.
En este estudio se utilizaron ratones adultos de la cepa CD-1 de 100-80 g, que fueron mantenidas en un ciclo 1uz:oscuridad 14.10, con agua y comida ad libifurn, y
embriones de 14 dpc
Para el experimento de expresión se extrajeron ovarios y testículos de ratones adultos sacrificando al animal por dislocación cervical en el caso de
los
adultos,y el mismo tejido de fetos de 14 días. Para los embriones las gónadas se obtuvieron por microcirugía. Se hicieron grupos de 10 testículos y ovarios en adultos y de 40 gónadas en fetos. Se procesó inmediatamente para extraerel
RNA total.4.2.7. Extracción
del
RNA total.
El RNA total se extrajo de grupos de 1 O testículos y 10 ovarios de los ratones adultos y ,de grupos de 40 ovarios y 40 testículos de los ratones de 14 dpc. Para lo
cual se siguió el siguiente procedimiento:
1. En tubos nuevos y estériles se homogenizaron con un politrón, 100 mg de tejido
con 1 ml de TRlzol a 4" C.
2. Se transfirieron las muestras homogenadas a tubos eppendorf de 1.5 ml y se
agregaron 200 VI de cloroformo por 1 ml de homogenado. Se taparon los tubos y se agitaron con vortex por 30 seg.
3. Los tubos se mantuvieron en hielo por 5 minutos y se centrifugaron a 12,000 rpm a
4" C por 15 minutos. AI final se obtuvieron dos fases: la inferior de color rojo
compuesta por feno1:cloroformo y la porción superior acuosa incolora.
El
RNA quedó en esta última fase, mientras que el DNA y las proteínas se mantienen en la interfase y en la fase orgánica.4. Se transfirió la fase acuosa a otro tubo eppendorf y se agregó un volumen igual de
isopropanol. La muestra se mantuvo a 4" C durante toda la noche.
5. Se centrifugaron las muestras por 15 minutos a 12,000 rpm a 4" C. El RNA se precipitó formando una pastilla blanca amarillenta.
6. Se removió el sobrenadante y se lavó la pastilla con etanol al 80%. Se centrifugó a 7,500 rpm durante 8 minutos a 4" C.
7. Se removió el sobrenadante y se colocaron los tubos en sentido inverso sobre una
gasa estéril y se secó la pastilla en un horno con vacío a temperatura ambiente sin que se secara por completo la pastilla para evitar la insolubilidad de la misma.
8. Se disolvió la pastilla de RNA en 30 pl de H20-DEPC. Se hicieron diluciones 1 :250 y se leyó la absorbancia de estas muestras a las siguientes longitudes de onda : 260, 280 y 310 nm. Se determinó la concentración de RNA mediante la siguiente fórmula: 1 unidad de Absorbancia a 260 nm = 40 pg de RNA /ml. Tambjén se determinó la pureza del RNA por medio de la relación de absorbancias obtenida a 260 y 280 nm (260/280 nm).
4.2.8.
Electroforesis del RNA.
1. Se preparó un gel desnaturalizante de agarosa al 1 % de la siguiente manera:
1 % 6 % 1 x
""_
Concentración final Cantidad necesaria para
preparar 120 ml de gel
Agarosa 1.2 g
Formaldehído 37% 19 ml
MOPS 12X 10 ml
La agarosa se disolvió en el agua tratada con DEPC. Posteriormente se agregaron el formaldehído y el MOPS, se mezcló la solución y se virtió en el molde de la cámara de electroforésis.
2. Para el corrimiento electroforético se prepararon las muestras de la siguiente manera:
Concentración final.
RNA 3 I-19
Formamida 50 %
Formaldehído 6.5 %
MOPS 1 x
Amortiguador Loading para RNA 1 x I
Bromuro de Etidio 2.5 P9
El RNA se mezcló con la formamida, el formaldehído y el MOPS y se calentó a
75" C por 5 minutos, se colocó inmediatamente en hielo por 5 minutos. Se le agregó . .
el amortiguador Loading y el bromuro de etidio.
3. Se cargaron las muestras en el gel y se corrieron a 90 volts por 120 minutos. Se observaron las muestras en un transiluminador de luz ultravioleta.
En la Figura 5 se observa la integridad del RNA y se aprecia que no hay degradación del mismo.
28s
3 8s
5s
Figura 5. Electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa en el cual se
4.2.9. Transferencia a filtros de nylon.
1. Se enjuagó el gel con agua estéril varias veces. Se cortó un pedazo de membrana de Nylon (Gene Screen) y dos de papel Whatman 3 MM del mismo tamaño que el gel. Se colocaron 1 minuto en agua estéril y I O minutos en SSC 1 O X.
2. Se colocó un pedazo de papel Whatman 3 MM sobre un soporte más ancho y largo que el gel, se colocó dentro de un recipiente y se llenó este último con SSC 10 X. Cuando el papel Whatman que se encontraba sobre el soporte se mojó completamente, se eliminaron las burbujas de aire con una varilla de vidrio.
3.Se colocó el gel sobre el soporte en posición invertida y se eliminaron las burbujas entre el gel y el papel Whatman con una varilla de vidrio. Se cortó la esquina superior izquierda del gel para señalar el primer carril.
4 Se colocó la membrana de Nylon sobre el gel y se le cortó la misma esquina que al gel. Se eliminaron las burbujas de aire entre la membrana y el-gel y se colocaron, sobre la membrana, dos pedazos de papel Whatman y se eliminó el aire con una varilla de vidrio.
5. Se cortaron toallas de papel del mismo tamaño que el gel y se colocaron encima
del papel Whatman hasta alcanza'r una altura de 8 a 10 centímetros. Se colocó un soporte de vidrio encima de las toallas de papel y encima del vidrio una pesa de 500
g.
6. Se transfirieron por capilaridad los productos de Northern blot durante 18 horas. AI
pasar este tiempo se quitaron las toallas y el papel Whatman. Se marcaron
los
pozos del gel en la membrana con un lápiz .7. La membrana se retiró del gel y se eliminó el exceso de sales sumergiéndola en SSC 6 X a temperatura ambiente durante unos segundos. Se colocó la membrana
sobre papel Whatman y se dejó secar a temperatura ambiente durante 30
.
minutos.
8. Se colocó la membrana entre dos pedazos de papel Whatman y se calentó durante 2 horas a 80" C en un horno con vacio para fijar los productos de Northern blot a la membrana.
4.2.10. Hibridación por Northern blot.
1. Se preparó la solución de prehibridación el mismo día que se llevó a cabo la prehibridación. Esta solución está constituida por:
Concentración final
1
Formamida 40%
SDS 0.2%
EDTA (pH 8) 10 mM Reactivo Denhardt 4 x PB (pH 6.5) 120 mM DNA esperma de salmón 100 pg/ml
ssc
2 xSe prepararon 0.2 mi por cada cm2 de membrana que se hibridó.
El DNA de esperma de salmón se disolvió e n - I ml de agua estéril tratada con DEPC
y se calentó a 100" C por 5 minutos. En seguida se colocó en hielo por 5 minutos y posteriormente se le agregó a la mezcla.
2. Se colocó la membrana de nylon dentro de una bolsa de hibridación. Se añadió la
solución de prehibridación dentro de la bolsa y se eliminó todo el aire. Se selló la
3. Se marcó el DNAc de P45OSCC con [a-32P] dCTP por medio del método de
“Iniciadores Aleatorios” (Sambrook
et
al., 1989). Para ello se preparó la siguiente mezcla:DNAc
Buffer de iniciadores aleatorios dATP
dGTP dTTP
[a- 32P] dCTP
Fragmento Klenow de la DNA polimerasa
H20
4. Se mezcló el DNAc con el agua y se desnaturalizó a 100” C por 5 minutos. Se
sacó e inmediatamente se colocó en hielo otros 5 minutos. Se le agregó el buffer de iniciadores aleatorios, el dATP, dGTP y el dTTP.
5. En la campana y detrás de una pantalla de acrílico se le agreg6 el [a- 32P ] dCTP y se mezcló con ¡a punta de la pipeta. Se agregó el fragmento ,Klenow de la DNA polimerasa y se mezcló con la punta de la pipeta. Se dejó incubar la mezcla 2 horas a temperatura ambiente dentro de un blindaje de plomo en la campana detrás de la pantalla de acrílico.
6. Media hora antes de que terminara la incubación se prepararon unas columnas de
Sephadex G-50 para separar el [a- 32P] dCTP no incorporado. Para esto se colocó
en el fondo de una jeringa de insulina un poco de fibra de vidrio estéril y después se llenó la jeringa con el Sephadex usando una pipeta Pasteur estéril. Se centrifugaron
las columnas a 1,500 rpm por 3 minutos a 4” C.
7. Dentro de un tubo de centrífuga se colocó un tubo eppendorf sin tapa y rotulado. Dentro de este mismo tubo se colocó la columna de Sephadex.
8. Transcurridas 2 horas, se agregaron a la mezcla, en la campana y detrás de la pantalla de acrílico, 5 1.11 de amortiguador de inactivación del fragmento Klenow
(Na2EDTA 0.2 M pH 7.5) y 100 pl de TE (pH 8) y se mezcló.
9. Se colocaron los 155 pl de mezcla dentro de la columna de Sephadex y se centrifugaron a 1,500 rpm por 3 minutos a
4"
C. Se comprobó con el contador Geiger, detrás de la pantalla de acrilico, la cantidad de radioactividad que se quedó en la columna y la que se incorporó a las sondas. El porcentaje de incorporación en todoslos casos fui: por lo menos del 50%.
I
O.Con unas pinzas se sacó el tubo eppendorf del tubo de centrífuga y se tapó. Se hirvió la sonda por 5 minutos, después de los cuales se enfrió en hielo 5 minutos.
11. Se sacó la membrana de nylon del baño de agua y se le hizo un peque.ñ0 corte a la bolsa por el cual se sacó la mitad del amortiguador de hibridación. Se sacó el aire que se pudo haber formado dentro de la bolsa.
12:Csn una pipeta Gilson se metió dentro de la bolsa la sonda marcada. Se selló la bolsa y se colocó dentro de una caja de acrílico con tapa. Se metió la caja de acrílico
en un bat70 de agua y se dejó hibridando a 40" C por 24 horas.
13. Transcurrido
el
tiempo, la hibridación se sacó del baño de agua. En la campana y detrás de la pantalla de acrílico se abrió la bolsa por una esquina. Se vació el amortiguador de prehibridación con la sonda dentro de un tubo Falcon. El tubo se colocó en un blindaje de plomo y se guardó en el congelador ya que puede ser reutilizada en otra hibridación.temperatura ambiente. Se cambió la solución por un? nueva de SSC 2X y se dejó agitando 30 minutos como en el paso anterior.
15. Se cambió la solución por otra de SSC 0.1X
+
SDS 0.1%. Se colocó el recipiente en un baño de agua a 50" C y se lavó por media hora. Se sacó la membrana y se verificó con el contador Geiger la radiactividad.16. Se colocó la membrana dentro de una bolsa de plástico y se selló la bolsa. Se expusieron las membranas a una película X-OMAT (Kodak) por diferentes tiempos y
se revelaron. Fig.6A
4.2.1 l.
Análisis densitométrico,
Las autoradiografías que se obtuvieron se cuantificaron por densitometría en un.espectrofotómetro DU 600 de Beckman; se usaron las autoradiografías que tenían
el menor tiempo de exposición. Las autoradiografias se colocaron en el adaptador para geles y películas y este se colocó dentro del espectrofotómetro. Se calibró a cero con una parte de la misma placa que no estaba expuesta a radiación. Las muestras se leyeron a 420 nm y se obtuvieron las lecturas de absorbencia de cada muestra
4.2.12.
Análisis estadístico.
Todos los experimentos se realizaron por dupli cad o y los datos fueron analizados mediante un análisis de varianza de una sola vía (ANOVA) seguida por la prueba T de Student de diferencias individuales entre medias. El programa estadístico SIGMA-PLOT fue usado para calcular los valores de probabilidad.
5.
RESULTADOS.
Se obtuvo el fragmento de de 1750 pb, que posteriormente por Northern blot.(Fig. 4).
DNAc específico para P-45OSCC cuyo tamaño es fue utilizado como sonda para las hibridaciones
Los testículos y ovarios de los ratones de 14 dpc fueron disectados por microcirugía, así como
los
de ratones adultos, matados por dislocación cervical. Los tejidos fueron procesados por medio de la técnica del isotiocianato deguanidinal fenol/ cloroformo (TRlzol) para obtener el RNA total.
La concentrlación y la pureza de
los
RNAs de los tejidos analizados al ser obtenidos por medio de la lectura de la absorbencia a 260 y 280 nm se encontróque estos fueron. puros; ya que la relación 260/280 nm fue mayor de I .8. La Figura 5 muestra la electroforesis de los RNAs obtenidos de gónadas de 14 dpc de machos y de hembras, as¡ como de los tejidos.de los ratones adultos. Se observan los RNAs ribosomales 28S, 18s y 5s
los
cuales están aproximadamente en lamisma proporción. Además de no hacerse evidente material degradado,
lo
cual nos indica quelos
RNAs obtenidos eran íntegros (Fig.5).Las membranas se prehibridaron y posteriormente se hibridaron, las cuales se habían marcado con 32P por el método de "iniciadores aleatorios". Los resultados de las hibridaciones se obtuvieron por medio de autoradiografías (Fig. 6A) y se cuantificaron por medio de densitometría. La expresión relativa se obtuvo al dividir la expresión del gen estudiado con la expresión del gen de GDAPH que es usado como un gen de expresión constitutiva (Fig 6B).
O T
P45OSCC
ZKb
G W H
r 1
I
I
1 4 p C
O T
*
Figura 6B. En la gráfica se presenta la expresión del gen estudiado corregida con el valor promedio de GADPH. Se observa,
al
igual que en la gráfica 6B, que la expresión del gen de la P45OSCC es menor en los ovarios, fetales conrespecto a los testículos fetales. La' expresión relativa se obtuvo al corregir la expresión de los genes estudiados con la de GADPH , el cual es usado como un
gen de expresión constitutiva. Los valores representan la media ~f: D.E.
*
P< 0.01.El DNAc para la P-45OSCC fué donado por Moroahashi et al. (35) a partir de la corteza adrenal de bovino utilizando oligonucleótidos sintéticos. Posteriormente el mismo grupo clonó cuatro formas diferentes de la misma enzima en humanos. El análisis de la secuencia reveló la presencia de nueve exones separados, que codifican para una estructura primaria consistente de 521 aminoácidos, y que presenta una identidad del 72% con
la
P-45OSCC de bovino. Posteriormente Noga et al. (42) utilizando la sonda de humano de la P-45OSCC, donaron el DNAc de células de la granulosa en la rata; utilizándola para hacer estudios por Northern blot. Su análisis reveló que el transcrito de la P-45OSCC en ratas, es de 2 Kb. A paqir de nuestros reultados obtenidos en este trabajo, se demuestra que el transcrito de la P-45OSCC en el ratón es muy similar al reportado por Noga et al.(42).
A partir de que las secuencias de aminoácidos para las enzimas esteroidogénicas están altamente conservadas evolutivamente en las diferentes
especies
con
un alto grado de homología, utilizamosel
DNAc de Moroahashi et al: , .(35} para este estudio.
El
fragmento de DNAc inserto en el plásmidp PUC 18A y a partir del mapa de restricción proporcionado por K. Moroahashi (comunicación personal con el Dr. Marco A. Cerbón) (Fig. Z), se hizo la digestión con EcoRI/Sail (Fig. 3). AI comparar el tamaño del fragmento obtenido, que fue de 1750 pb (Fig 4), coincidió con el del Dr. K. Moroahashi.Los RNAs obtenidos de cada una de las muestras procesadas fueron puros y con una alta integridad (Fig. 5).
los
RNAs; la cual fue la misma para cada uno delos
ensayos. Lo anterior se corrobora a partir de la expresión del gen constitutivo GADPH, haciendo notar que la concentración de RNAs fue la misma que para el gen P-45OSCC (Fig.6A).A partir de técnicas de biología molecular, como
el
Northern blot, utilizada en este estudio se demostró por primera vez que el gen de la enzima P-45OSCC se expresa en los ovarios y los testículos de ratones durante su período de maduración gonadal temprana. Siendo la expresión significativamente menor en losovarios con respecto a la de
los
testículos. Lo anterior concuerda conlos
resultados de biotransformación obtenidos (Salame-Méndez, comunicación personal). De. tal manera que el haber demostrado la expresión del gen de la enzima responsable en el inicio de la biosíntesis de HES, permite saber un poco q á s sobre la síntesis y posterior regulación delos
esteroides sexuales durante y después de la diferenciación sexual gonadal en el ratón.Estudios realizados por lkeda et al. (18) a partir de la técnica de hibridación . .
in situ demuestran que en tejidos gonadales la expresión de la P-45OSCC, en
los
testículos se ‘expresa a partir de los 12.5 dpc; mientras que en los. ovarios no es detectada de
los
13.5-16.5 dpc. Por su parte Tamara y Payne (53) por RT-PCR estudiaron la expresión de diferentes genes de enzimas esteroidogénicas en gónadas de fetos de ratón. Encontrando que la síntesis delos
transcritos de la P-45OSCC ocurre en
los
testículos y no en los ovarios de ratones de 13 dpc. A partirde los cual, sugirieron que la ausencia de los transcritos de la enzima P-45OSCC es
debida a la ”quiescencia” esteroidogénica de las gónadas de las hembras. A partir de los resultados obtenidos por Salame-Méndez y colaboradores y los obtenidos en este trabajo,
los
ovarios no son “quiescentes” en su capacidad esteroidogénica. Ya que se ha demostrado que enlos
primordios gonadales de embriones femeninos de ratón de 10.5 dpc, y de las gónadas de hembras de 11.5-19.5 dpc hay y se biosintetiza la pregnenolona y la progesterona. Así como de expresarse en los ovarios de 14 dpc el gen de la enzima P-45OSCC (Fig. 6A).47
La posible diferencia con los resultados de lkeda et. al. (I 8) se puede deber . a nivel de la técnica utilizada. La hibridación in situ es menos sensible que la
técnica de Northern blot. Por tal razón, al estar en una baja concentración los
transcritos para la enzima, posiblemente no sean detectados por la técnica utilizada, lo cual no indica que los transcritos no existan.
Por otra parte, la incongruencia de los datos de Tamara y Payne (53) con los del presente estudio puedieran deberse a lo siguiente. Estas investigadoras sólo utilizan un PCR semicuantitativo y no utilizan técnicas de Hibridación para detectar los transcritos de la enzima. En el caso de la aromatasa de
los
testículos y ovarios fetales al no ser detectada su expresión por PCR, hicieron una hibridización del producto del PCR con la sonda de aromatasa demostrando así la presencia de la enzima. El procedimiento anterior no lo realizaron con las otras enzimas esteroidogénicas, por lo que técnicamente no pudieron detectar la P-45OSCC en los ovarios fetales.A partir de las evidencias obtenidas por Salame-Méndez y colaboradores
postulan que el control de la esteroidogénesis en el ratón por
el
gen Sry puede ser directa o indirecta. Para el control directo existen al menos tres posibilidades: 1) ElSry al expresarse en las células precursoras de las células de Sertoli en este tiempo también sean esteroidogénicas. 2) Las células precursoras de las células de Sertoli a partir de un factor parácrino regulen la esteroidogénesis en las células precursoras de las células de Leydig y 3) El Sry se exprese en las células precursoras de Leydig. Indirectamente
la
proteína Sry acelerara la capacidad esteroidogénica de las gónadas masculinas e incrementando la velocidad de su crecimiento.se expresaba en los tejidos gonadales durante su período de establecimiento. La
importancia de los resultados obtenidos en mi proyecto de.Servicio Social es que al demostrar la expresión del gen de la enzima P-45OSCC apoya aún más los resultados anteriormente obtenidos por uno de mis asesores. Además de que formarán parte del trabajo que será sometido en breve para su revisión (Salame- Méndez et al., en preparación).
