DE LA 1,5-BENZODIAZEPINA CLORADA SOBRE EL MUSCULO LISO INTESTINAL DE COBAYO

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Texto completo

(1)

U N I DAD: IZTAPALAPA

DIVISION: CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

CARRERA: BlOLOGlA EXPERIMENTAL

MATERIA: PROYECTO TERMINAL

TITULO:

ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LA 1,5-BENZODIAZEPINA CLORADA SOBRE EL MUSCULO LISO INTESTINAL DE COBAYO

MATRICULA: 88338396

ASESORES:

(2)

m

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LA

1,5=BENZODIAZEPINA CLORADA SOBRE

EL MúSCULO LISO INTESTINAL

(3)

INDICE

1.-

INTRODUCCION

...

1

11.-

OBJETIVO GENERAL

...

8

111.-

OBJETIVOS PARTICULARES

...

8

IV.- METODOLOGIA

...

9

V.- ACTIVIDADES REALIZADAS

...

22

VI.- OBJETIVOS

Y

METAS ALCANZADAS

...

22

VII.- RESULTADOS

...

23

VIII.- CONCLUSIONES

...

...,

...

26

IX.- RECOMENDACIONES

...

26

(4)

INTRODUCCION

Desde la antigüedad se ha recurrido al uso de productos naturales para modificar el pensamiento, los sentimientos, la conducta; asimismo para provocar un estado de sedación y promover el sueño (7).

Los primeros agentes introducidos específicamente como sedantes y después como hipnóticos fueron los bromuros (1853-1864). Ademis de estos, antes de 1900 se utilizaron otros sedantes-hipnóticos, como: el hidrato de cloral, el paraldehído, el uretano y el sutfonal. Sin embargo, los barbitúricos se han considerado como el prototipo de la clase, debido a su amplio uso desde su introducción. Los barbitúricos que se introdujeron con este propósito fueron el barbital en 1903 y en 1912 el fenobarbital. Las razones para desarrollar otros sedantes-hipnóticos, a pesar de los

disponibles, ha sido para evitar algunos de

los

efectos indeseables de

los

barbitúricos, incluyendo su potencial para causar adicción y dependencia fisica (7, 12).

Un avance significativo en el área de la neuropsicofarmacología fue el descubrimiento de los efectos ansiolíticos y tranquilizantes de las benzodiazepinas, una nueva clase de compuestos sintetizados a fines de la década de los ~ O ' S , cuyo prototipo el clordiazepóxido se sintetizo en 1957 por Sternbach, y se introdujo a la

práctica clínica en 1961. Se observó que este compuesto producía un efecto

tranquilizante en modelos experimentales animales. El seguimiento de esta

(5)

rapidez de sus efectos, a su eficacia y a su baja toxicidad (un margen de seguridad mayor que el de los barbitúricos, los agentes sedantes e hipnóticos desarrollados hasta ese momento) en los seres humanos (20).

El término benzodiazepina se refiere a la porción de la estructura compuesta por un anillo de benceno (A) fusionado a un anillo de diazepina de siete miembros (B) y un sustituyente 5 arilo (C), (Fig. 1). Se ha establecido que en el anillo A, la sustitución en la posición 7

sustitución

de grupos como CI, CF3 y NO2 aumenta la actividad; en el anillo B una grande en la posición 1 disminuye la actividad, la cual se incrementa por un grupo metilo; en el anillo C la actividad se incrementa por un halógeno en la posición 2' y disminuye por un sustituyente en la posición

4'.

Para que presenten un efecto

sedante-hipnótico, se requiere de un sustituyente en la posición 7 , ya sea un halógeno o un grupo nitro (7, 14, 17,

19).

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2 \

(6)

En relación a las 1,4-benzodiazepinas (1,4-BDZ), la mayoría de ellas comparten el mismo perfil de actividad biológica, tanto a nivel de Sistema Nervioso Central (SNC) como a nivel periférico; sin embargo una característica que las hace diferentes son sus propiedades farmacocinéticas, así podemos identificar

a

las benzodiazepinas de vida media corta, intermedia o larga; lo que hace necesario considerar este aspecto en la elección para una situación específica (7)

Por otro lado el clobazam es la única l,5-benzodiazepina (1,5-BDZ) (Fig. 2), que difiere estructuralmente de todas las 1,4-BDZ utilizadas en el tratamiento de la ansiedad, y es el Único compuesto de estructura 1,5-benzodiazepínica en uso clínico. La molécula tiene un átomo de N en la posición 1 y 5 del anillo B, con una pérdida del grupo imino (C=N) en la posición 4 y 5. La saturación de este grupo imino en las 1,4-

BDZ muestra que está asociado con pérdida de la actividad biológica, sin embargo la actividad del clobazam no depende de esta característica estructural. Este compuesto ha sido estudiado ampliamente en diversos modelos experimentales como: ansiolítico, anticonvulsivante, en modelos de estudio electroencefalográficos y en estudios

psicométricos. Se ha demostrado que el clobazam presenta una actividad ansiolítica eficaz, sin interferir con la función psicomotora que normalmente se produce con la

(7)

c1

N -

1

B

5

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3

CH2

C

. /

Fig. 2

Estructura

del

Clobmam

El mecanismo de acción de las benzodiazepinas8 fue dilucidado en 1974 por

Haefely y Costa ( 9 ), quienes propusieron que este tipo de compuestos facilitan la acción de una molécula clave de la comunicación química del cerebro, el ácido gamma aminobutírico (GABA); Krnjevic y Schratz ( 3 ) demostraron en 1967 que el GABA es un neurotransmisor inhibitorio. AI igual que otros neurotransmisores, se sabe que éste actúa fijándose a receptores específicos de la membrana neuronal. Se han

(8)

fija al GABA, esta zona esta acoplada a un canal que atraviesa la membrana y que incrementa la conductancia al cloro (canal de cloro). En reposo, en ausencia de GABA, el canal está cerrado. Cuando el GABA se fija al receptor, el complejo cambia de conformación; el canal se abre y se incrementa la permeabilidad al cloro, quedando el estado eléctrico de la neurona modificado, se vuelve menos excitable y por

lo

tanto menos sensible a

los

estímulos de los demás neurotransmisores, es decir, se induce una hiperpolarización que da lugar a un potencial posináptico inhibitorio ( 15 ).

El complejo receptor al GABA, tiene además de la zona de reconocimiento, una proteína fijadora de benzodiazepinas y otro sitio de unión para barbitúricos. La fijación de las benzodiazepinas a este receptor "secundario" provoca un cambio de

conformación del complejo, que se vuelve más sensible al GABA, así las

benzodiazepinas facilitan la acción del GABA sobre

las

neuronas, induciendo una modulación alostérica. En este caso la modulación es positiva porque la acción es

facilitadora (3, 8).

Por otro lado y en relación a este tipo de compuestos, en el Instituto de Química de la UNAM, se han sintetizado una serie de moléculas de estructura 1,5-

benzodiazepínica (Fig. 3) ( 5 ) que requieren ser sometidas al estudio sistematizado de su actividad biológica para la caracterización de algún (os) efecto (S) que eventualmente pudiesen tener importancia terapéutica, dichos estudios comprenden

(9)

se administro agudamente en estas especies. Es importante señalar que este compuesto ha mostrado actividad anticonvulsivante en el modelo de convulsiones inducidas químicamente por el metrazol en el ratón. También se ha informado que este tipo de compuesto es capaz de facilitar el sueño de rnovimientos oculares rápidos

(MOR) en la ( 1,2,4).

2 2 2 4 8 1

Por lo anterior y continuando con el esl,udio de estas moléculas y

considerando que las 1,4-BDZ presentan además de la actividad biológica, a nivel de

SNC también a nivel periférico, se considero de interés estudiar si esta nueva molécula de estructura 1,5-benzodiazepina ejerce alguna actividad sobre el músculo liso intestinal de cobayo, con las características de la actividad descrita para las 1,4-BDZ clásicas ( 11 ).

(10)

SCH3

Cl

Fig.

3

Estructura de la 1,5-Benzodiazepina clorada (2-Tiometil-7”[p-C1-

(11)

O B

JEnVO GENERAL

Estudiar en el modelo in vifro de íleon aislado de cobayo, el efecto de la 1,5-

benzodiazepina clorada (2-Tiometil-7-[p-CI-fenil-4,5-Berazo-3-~a-Z-n0nem)~ sobre la actividad espontánea y sobre las contracciones inducidas por la acetilcolina en esta preparación.

OBJETIVOS

PARTICULARES:

1) Probar la sensibilidad del músculo liso intestinal a la aoetilcolina y realizar curvas dosis respuesta a este neurotransmisor.

2) Estudiar la sensibilidad del músculo liso intestinal a la 1,5-BDZ y realizar curvas dosis respuesta a este compuesto.

(12)

METODOLOGIA:

Se emplearon segmentos de íleon, obtenidos de cobayos de la cepa Hartley, macho, adultos de 250-3009. Los animales fueron mantenidos a temperatura constante (22 f 2OC) en un cuarto con un ciclo luz-obscuridad (12 X 12 h), provistos con una dieta estandar y agua ad libifurn.

Los animales fueron sacrificados por dislocación cervical y el íleon fue removido

e inmediatamente colocado en cajas de Petri que contenían solución Krebs con la

X

8

no,

siguiente composición (mM): NaHC03 25, NaCl 118, KC1 4.7, NaH2P04 1.2, MgCh

5

2

1.2, CaCI2 2.5, Cloruro de colina 0.929 y Glucosa 11; el íleon fue separado de la grasa

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5

LAJ

5 8

6 5

y tejido conectivo circundante y se dividió transversalmente en segmentos de 1.5-2.0

E

FE!

1

-cm de longitud. Los segmentos de intestino fueron montados en una cámara para

2

3

niL!

q

órgano aislado de 30 ml que contenía solución nutriente de Krebs, burbujeada con una 7r SI,

(13)

en rangos (1 a 1.9, 2 a 2.9, 3 a 3.9 y 4 a 4.9

9).

De igual forma se procedió con la respuesta inducida con la acetilcolina y con el vehículo. Para cada condición

experimental se tomaron los mismos parámetros, después de un período de lavado de

(14)

TRANSDUCTOR

GRASS

7D

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Fig. 4 Montaje de la preparación de íleon aislado de cobayo macho, perfundido con

(15)

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(25)

ACTIVIDADES REALIZADAS

Como parte del desarrollo de este proyecto,se realizo la búsqueda, revisión, análisis y discusión de la información bibliográfica, en los seminarios internos del laboratorio.

También se llevo a cabo el adiestramiento técnico y metodológico a seguir. Se

desarrollo la fase experimental del proyecto, para posteriormente realizar las E...

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mediciones de los registros, la tabulación y el análisis estadístico de los resultados tat .

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obtenidos.

OBJETIVOS

Y

METAS

ALCANZADAS

En el presente trabajo se cumplieron los objetivos establecidos:

0 El manejo de órgano aislado

0 se probo el efecto de la acetilcolina y de la 1,5-BDZ-CI sobre el músculo liso

intestinal.

Se efectuaron curvas dosis respuesta a la acetilcolina en presencia de diferentes concentraciones de la 1,5-BDZ.

(26)

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

El efecto que produce la 1,5-benzodiazepina dorada sobre el músculo liso intestinal de cobayo, se muestra en la Fig. 5, aquí se muestran los trazos representativos de la actividad que induce este compuesto, en

la

parte superior se observan tres patrones de actividad de la 1,5-BDZ a la concentración de 3x1

O5

M. En la parte central se muestra también una curva dosis respuesta a la 1,5-BDZ a las dosis de 10,30,1 O0 y 300 x 1

O

M. En la parte inferior se incluye el comportamiento que

presento el músculo liso intestinal después de un período de lavado.

Estos registros muestran que durante la exposición a la 1,5-BDZ hay un aumento significativo en la actividad contráctil del íleon, respecto a la actividad basal. Después del lavado, esta actividad no solo persiste, sino clue se hace más intensa.

En la fig. 6, en el rango de 1 a 1.9 g, se observa que cuando se incubo el músculo liso intestinal en presencia de la 1,5-BDZ-CI, hay un aumento significativo en el número de contracciones, fenómeno que es dependiente de la concentración de la

1,5-BDZ; por otro lado se aprecia que, después del lavado aumentan en frecuencia e

intensidad las contracciones musculares.

(27)

fenómeno que se manifiesta como un desplazamiento hacia la izquierda de la curva dosis respuesta.

Analizando el rango de 3 a 3.9 g, se observo que el número de contracciones en presencia de la BDZ es menor en comparación con el rango anterior. Pero, por otro lado se observa que siguen persistiendo aún más las contracciones después del lavado y que es más evidente el desplazamiento de la curva dosis respuesta hacia la izquierda

(Fig. 8).

La Fig. 9 muestra el número de contracciones en presencia de la BDZ en el rango de 4 a 4.9 g, es muy notorio como estas contracciones aumentan después del lavado y como la CDR esta desplazada hacia la izquierda.

En la Fig. 10 se aprecian las curvas dosis respuesta en conjunto de todos

los

rangos de tensión (1 a 4.9 g) durante la incubación del músculo liso intestinal en

presencia de la 1,5-BDZ. Se observa que en el primer lrango de tensión (1 a 1.9 g) el número de contracciones es mayor en comparación con los otros rangos de tensión.

Después de la incubación con la 1,5-BDZ se procedió a lavar el tejido y se observo (Fig. 11) que el número de contracciones es significativamente mayor en todos

los

rangos. Se aprecia que el primer rango (1 a 1.9 g) priedomina sobre los otros rangos

(28)

mantienen, son más frecuentes y de mayor intensidad. Cabe destacar que estos

hallazgos son particularmente importantes, ya que se sabe que las benzodiazepinas clásicas (1,4-BDZ) tienen un efecto inhibitorio sobre las contracciones espontáneas y

las evocadas eléctrica y farmacológicamente sobre el músculo liso intestinal, aspecto que se confirmo en una serie de experimentos realizados con la 1,4-benzodiazepina prototipo, el diazepam (Fig 14).

Por otro lado también se observo el efecto de la 1,5-BDZ en el número total de contracciones en el rango de I a 4.5 g , se muestra ( Fi!g 12) que en presencia de la BDZ hay un aumento en el número de contracciones; em contraste con el vehículo , donde se observa un efecto menor

Cuando se realizo la curva dosis respuesta a la acetilcolina, se observo un

aumento en el número de contracciones del músculo liso; (en cambio en presencia de la acetilcolina más la 1,5-BDZ aumentan significativamente

has

contracciones

Cuando se realizó la incubación de la preparación en presencia de la 1,5-BDZ o

de la 1,4-BDZ (Diazepam), se encontró que aún a tiempos muy prolongados de

incubación (135 min), la 1,5-BDZ es capaz de aumentar el número de contracciones y

en contraste

la

incubación con la 1,4-BDZ (Diazepam) por el mismo período de tiempo, no solo no incrementa las contracciones espontáneas, sino que incluso la abate totalmente , aspecto que como ya sabemos está relacionado con la capacidad de las 1,4-BDZ como el diazepam para inhibir las contracciones inducidas eléctrica o

(29)

Por lo anterior podemos concluir que la 1,5-BDZ aumenta de manera

dependiente de la concentración, la intensidad y la frecuencia de las contracciones del músculo liso intestinal. Este incremento persiste incluso después de un período de

lavado del tejido. Por el contrario, la incubación del músculo liso intestinal de cobayo en presencia de la 1,5-BDZ bloquea la actividad contráctil espontánea en este tejido. Asimismo la 1,5-BDZ sinergiza las contracciones que

son

inducidas por la acetilcolina.

Estos resultados permiten inferir que la actividad biológica de la 1,5-BDZ es de tipo colinérgico muscarínico en el músculo liso intestinal in

vih.

Son necesarios estudios adicionales para la caracterización de la actividad biológica de esta molécula.

RECOMENDACIONES

Con el propósito de tener más información sobre

110s

efectos farmacológicos de la 1,5-BDZ, se sugiere la realización de estudios adicionales para la caracterización de la actividad biológica de está molécula.

(30)

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5-

18.

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