Efecto de tres mostos en la producción de etanol por Saccharomyces cerevisiae “killer” K+R+

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. EM. AS. DE. Efecto de tres mostos en la producción de etanol por Saccharomyces cerevisiae “killer” K+R+. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. TESIS Para obtener el Título Profesional de BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO. AUTORA: YAURI. ASESORA: TARAZONA. Br. CINTYA MILAGROS AGUILAR. Dra. EVA ELIZABETH VILLANUEVA. Trujillo – Perú 2014 i. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Y. Dra. Vilma Méndez Gil. CO. M UN. IC. RECTOR. AC IÓ. Dr. Orlando Velásquez Benites. N. DIRECTIVOS DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. RM ÁT. IC. A. VICERRECTORA ACADÉMICA. IN FO. Dr. José Mostacero León. Dr. William Zelada Estraver. SI. ST. EM. AS. DE. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. DI. RE CC IO. N. DE. PROFESOR SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. Dra. Bertha Soriano Bernilla DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR Los suscritos, miembros del Jurado, declaran que la presente tesis ha sido. CO. M UN. IC. AC IÓ. de Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.. N. ejecutada en concordancia con las normas de la Escuela Académico Profesional. A. Y. ____________________________. IC. Ms. C. Pedro Alvarado Salinas. DE. IN FO. RM ÁT. PRESIDENTE. ____________________________. SECRETARIA. ____________________________ Ms. C. Anibal Quintana Díaz VOCAL. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. Dra. Eva Villanueva Tarazona. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Dictaminador, declaran que la presente tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales, siendo. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. aprobada por UNANIMIDAD.. IC. A. ____________________________. RM ÁT. Ms. C. Pedro Alvarado Salinas. DE. IN FO. PRESIDENTE. ____________________________. SECRETARIA. ____________________________ Ms. C. Anibal Quintana Díaz VOCAL. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. Dra. Eva Villanueva Tarazona. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CERTIFICACIÓN DEL ASESOR La que suscribe, Dra. Eva Villanueva Tarazona, asesora de la tesis: Efecto de. N. tres mostos en la producción de etanol por Saccharomyces cerevisiae “killer”. AC IÓ. K+R+. M UN. IC. CERTIFICA:. CO. Que la presente investigación ha sido desarrollada de acuerdo al. Y. reglamento establecido por la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad. RM ÁT. IC. A. Nacional de Trujillo, estando en conformidad con su correspondiente proyecto y que el informe ha sido redactado acogiendo las observaciones y sugerencias. IN FO. alcanzadas.. DE. Por lo tanto, autorizo a la Br. CINTYA MILAGROS AGUILAR YAURI,. __________________________ Dra. Eva Villanueva Tarazona ASESORA. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. continuar con el trámite del reglamento correspondiente.. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA. IC. AC IÓ. N. A Dios, por guiar siempre mi camino. M UN. A mis padres, por su dedicación. CO. y todas sus enseñanzas.. Y. En especial a mi madre,. y por su apoyo incondicional. IN FO. RM ÁT. IC. A. por todo el amor que me brinda. DE. A mi esposo por su paciencia y tolerancia. AS. Por su comprensión y amor. A mis hermanas Chela y Tuty A Gabriel, Shihi y Cia, por su optimismo y alegría del día a día. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. Y por su apoyo en todo momento. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. .AGRADECIMIENTOS De manera muy especial a mi asesora, Dra. Eva Elizabeth Villanueva Tarazona, por su orientación, dedicación y apoyo brindado durante todo el. AC IÓ. N. desarrollo de la presente investigación.. M UN. IC. Infinitas gracias a mi madre por estar siempre dispuesta a apoyarme.. A mi esposo Jorgito porque en todo momento me apoyo e incentivó para. Y. CO. culminar este proyecto.. RM ÁT. IC. A. Al profesor Anibal Quintana Díaz por su orientación y gran apoyo. Al profesor Roger Rengifo Penadillos, por su apoyo preciso y por la. IN FO. orientación brindada.. AS. DE. Al profesor Lizardo Cruzado Razco por su tolerancia y apoyo.. EM. A mis hermanas y aquellos amigos que realizaron un aporte en la realización. DE. SI. ST. de la presente investigación.. DI. RE CC IO. N. A cada uno de Ustedes, MUCHAS GRACIAS!!!. . vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:. AC IÓ. N. En cumplimiento con las disposiciones vigentes establecidas en el Reglamento de Grados y Títulos de la Escuela Académico Profesional de. M UN. IC. Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la. CO. Universidad Nacional de Trujillo, someto a vuestra consideración y elevado. RM ÁT. IC. A. etanol por Saccharomyces cerevisiae “killer” K+R+. Y. criterio, el presente informe de Tesis: Efecto de tres mostos en la producción de. Esperando que los miembros del jurado se sirvan calificar este trabajo la presente sea merecedora de vuestra. IN FO. según el criterio establecido, y que. Trujillo, Abril del 2014. ______________________________ Br. Cintya Milagros Aguilar Yauri. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. aprobación.. . viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONTENIDO DIRECTIVOS DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ………...ii iii. AC IÓ. N. MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR. iv. IC. APROBACIÓN. M UN. CERTIFICACIÓN DEL ASESOR. Y. CO. DEDICATORIA. vi vii. RM ÁT. IC. A. AGRADECIMIENTOS. v. PRESENTACIÓN. IN FO. CONTENIDO. AS. DE. RESÚMEN. ix xi. ST. xii 01. MATERIAL Y MÉTODO. 09. DE. SI. INTRODUCCIÓN. EM. ABSTRACT. viii. DI. RE CC IO. N. 1. Material. 09. 1.1. Material de estudio. 09. 1.2. Medios de cultivo. 09. 2. Método. 09. 2.1. Reactivación de cultivos de Saccharomyces cerevisiae “killer” K+R+ aislados de Chicha de Jora, y verificación de pureza. 09. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.2. Selección del cultivo de S. cerevisiae mediante evaluación de la capacidad fermentativa. 10 10. 2.4. Propagación de biomasa. 10. AC IÓ. N. 2.3. Confirmación de la actividad “killer”. 2.5. Obtención de biomasa. 11. IC. 2.6. Esterilización y acondicionamiento de los sistemas de fermentación 11. M UN. 2.7. Obtención, preparación y tratamiento de los medios de fermentación 11. CO. 2.7.1. Mosto de frutos de Vitis vinifera ”uva”. 12. Y. 2.7.2. Mosto de Zea mays “maíz de jora”. 11. IC. A. 2.7.3. Mosto de melaza de Saccharum officinarum “caña de azúcar” 12. RM ÁT. 2.8. Fermentación. IN FO. 2.9. Monitoreo de los sistemas de fermentación. 12 13 13. 2.11. Evaluación de la producción de etanol. 13. DE. 2.10. Pasteurización de los medios de fermentación. 13. AS. 2.11.1. Destilación del mosto fermentado. EM. 2.11.2. Determinación de la producción de etanol en mosto. ST. fermentado (%v/v). DE. SI. 2.12. Análisis de los resultados. 14 15. RE CC IO. N. RESULTADOS. 14. 19. CONCLUSIONES. 26. DI. DISCUSIÓN. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 27. ANEXOS. 33. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESÚMEN En la presente investigación se evaluó el efecto de tres mostos (frutos de Vitis vinifera, Zea mays y melaza de Saccharum officinarum) sobre la producción de etanol por. AC IÓ. N. Saccharomyces cerevisiae “killer” K+R+, durante 96 horas de fermentación. Así mismo. IC. se empleó un control en Caldo Sabouraud sacarosado. Para tal fin, los mostos y el. M UN. control fueron higienizados con bisulfito de sodio y suplementados con azúcar refinada. CO. doméstica hasta 25ºBx. Cada sistema de fermentación fue inoculado con 2.25g de. Y. biomasa de S. cerevisiae “killer” K+R+. Durante la fermentación, cada 12 horas se. IC. A. realizó un monitoreo del contenido de sacarosa (°Bx) y del valor del pH, y después de. RM ÁT. las 96 horas de fermentación los mostos y control fueron pasteurizados y destilados para determinar el porcentaje de etanol producido. En base a los resultados obtenidos y al. IN FO. análisis correspondiente, se afirma que Saccharomyces cerevisiae “killer” K+R+. DE. produce 7.0% de etanol en mosto de Zea mays, 10.0% en melaza de Saccharum. AS. officinarum y 11.67% en mosto de frutos de Vitis vinifera, durante 96 horas de. EM. fermentación, siendo este último el que tiene un mayor efecto en la producción de. SI. ST. etanol.. DE. Palabras claves: Saccharomyces cerevisiae “killer”; etanol; mosto; Vitis vinifera; Zea mays y. DI. RE CC IO. N. Saccharum officinarum.. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT In the present investigation it was evaluated the effect of three musts (Vitis vinifera fruits, Zea mays and Saccharum officinarum molasses) on ethanol production by. AC IÓ. N. Saccharomyces cerevisiae "killer" K+R+ during 96 hours of fermentation. Additionally, a group control in sucrosed Sabouraud broth was used. Musts and control were sanitized. M UN. IC. with sodium bisulfite and supplemented with domestic refined sugar to 25 °Bx. Each fermentation system was inoculated with biomass 2.25g of S. cerevisiae "killer" K+R+.. CO. During fermentation, every 12 hours, sucrose content (°Bx) and the pH were monitored,. A. Y. and after 96 hours of fermentation musts and control were pasteurized and distilled to. RM ÁT. IC. determine the percentage of produced ethanol. Based on the outcomes and the corresponding analysis asserts that Saccharomyces cerevisiae "killer" K+R+ produces. IN FO. 7.0% ethanol in Zea mays, 10.0% in Saccharum officinarum molasses and 11.67% in. AS. effect on ethanol production.. DE. must fruits of Vitis vinifera for 96 hours of fermentation, the latter which has a greater. EM. Keywords: Saccharomyces cerevisiae “killer”; ethanol; must; Vitis vinifera; Zea mays and. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. Saccharum officinarum.. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCIÓN La fermentación implica el empleo de microorganismos para llevar a cabo. N. transformaciones de la materia orgánica catalizadas por enzimas. La fermentación ha. AC IÓ. sido realizada como un arte durante muchos siglos (Owen, 1991) y no es sólo un. IC. proceso que produce energía, sino un medio para obtener productos naturales que son. M UN. de utilidad para el consumo humano (Madigan y col., 2004). La fermentación es llevada. CO. a cabo por microorganismos, utilizándose diversas clases de bacterias y levaduras.. Y. El papel de las levaduras en la fermentación alcohólica no se puso en evidencia. IC. A. hasta los trabajos de Pasteur en 1866-1876 (Leveau y y Bouix, 2000), quien habiendo. RM ÁT. llevado a cabo investigaciones detalladas acerca de las fermentaciones de la cerveza y el. IN FO. vino, concluyó que las levaduras vivas fermentaban el azúcar en etanol y dióxido de carbono (Owen, 1991), en ausencia de oxígeno y tras una primera multiplicación en. AS. DE. aerobiosis (Bourgeois y Larpent, 1995).. EM. No obstante es necesario mencionar los aportes de Antonie van Leeuwenhoek,. ST. quién fue el primero en observar las levaduras al examinar gotas de cerveza fermentada. SI. con un microscopio primitivo en 1680. Posteriormente entre 1836 y 1837 Cagniard-. DE. Latour, Schwann y Kutzing manifestaron independientemente su opinión de que la. RE CC IO. N. levadura era una “cosa” viva. En 1847, Blondeau estudió las fermentaciones que implicaban a los ácidos láctico, butírico y acético; y parece que fue el primero en manifestar que las diferentes fermentaciones eran llevadas a cabos por distintos. DI. “hongos” (Owen, 1991). Es así que en 1897 Eduard Buchner prepara un extracto de levadura que realiza la fermentación. Su descubrimiento acerca de la fermentación libre de células, ha sido. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. celebrado como la resolución de una de las controversias científicas más famosas del Siglo XIX, la controversia entre Pasteur y Liebig sobre la naturaleza de la fermentación alcohólica. ¿Fue fermentación -como Pasteur sostenía- un acto vital fisiológico de la. AC IÓ. N. célula de levadura viva; o según Liebig, era por un agente puramente químico dentro de la célula de la levadura? ¿Podrían las levaduras intactas ser separadas de la. IC. fermentación?. Buchner demostró que en un sentido ambos tenían razón: la. M UN. fermentación se lleva a cabo por enzimas solubles en el jugo de levadura libre de células. CO. enteras, pero estas enzimas son sintetizadas por la célula de levadura viva (Prescott y. A. Y. col., 2004).. RM ÁT. IC. Las levaduras son los microorganismos más importantes y han sido utilizadas por el hombre desde hace milenios sin saberlo. La facilidad de cultivo y la inocuidad de un. IN FO. gran número de especies han hecho de ellas los microorganismos más ampliamente. DE. utilizados en la industria, para la producción de bebidas alcohólicas y de productos de. AS. panadería, pero también como fuente de proteínas y de vitaminas en la alimentación. EM. humana y animal, así como fuente de diversos factores de crecimiento (Leveau y Bouix,. SI. ST. 2000; Madigan y col., 2004).. DE. Pero si bien las levaduras son organismos interesantes, explotadas por sus. N. potencialidades propias o como soporte de nuevas propiedades, continúan siendo por. RE CC IO. otra parte agentes de alteración de productos alimentarios si no se controla su desarrollo. DI. (Leveau y Bouix, 2000). Las levaduras se cultivan por sus propias células, por sus componentes celulares y. por los productos finales que producen durante la fermentación alcohólica. La fermentación a gran escala que produce la levadura es la que hace posible la producción de alcohol para propósitos industriales, aunque se la conoce mejor por su papel en la 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. fabricación de bebidas alcohólicas, como son el vino, la cerveza y los licores (Madigan y col., 2004). La producción de células de levadura y la producción de alcohol mediante. AC IÓ. N. levadura son dos procesos que se diferencian desde el punto de vista industrial en el hecho de que el primero requiere la presencia de oxígeno para la producción máxima de. M UN. IC. material celular, mientras que la fermentación alcohólica es anaeróbica. Sin embargo, en. CO. casi todos los procesos industriales se utiliza una misma especie de levadura, o especies. Y. similares de la misma, a saber, Saccharomyces cerevisiae (Madigan y col., 2004).. IC. A. Las levaduras “killer” identificadas en 1963 por BEVAN y MAKOVER, segregan. RM ÁT. una toxina proteica que mata otras levaduras sensibles (Leveau y Bouix, 2000), las. IN FO. cuales pueden ser del mismo o de diferente género; existen además cepas neutras que no producen toxina ni son sensibles a ella. Es decir, existen tres fenotipos “killer”: “killer”. DE. K+R+, “sensible” K-R- y “neutro” K-R+ (Epifanio, 2005).. EM. AS. Una gran variedad de levaduras “killer” han sido observadas en varios géneros de. ST. levaduras (Marquina et al., 2001), tales como: Saccharomyces, Kluyveromyces,. SI. Debaryomyces, Pichia, Zygosaccharomyces, Hanseniaspora, Candida y Cryptococcus. DE. (Fleet, 1997). Pero es en las Saccharomyces donde el sistema “killer” ha sido mejor. RE CC IO. N. estudiado (Leveau y Bouix, 2000). En las especies del género Saccharomyces, este fenómeno está asociado a ARN de. DI. doble hebra encapsulado en el citoplasma (Leveau y Bouix, 2000). Cepas “killer” de. Saccharomyces cerevisiae llevan virus de ARN que dirigen la secreción de toxinas péptido letales para células libre de virus, sin embargo las mismas levaduras “killer” son inmunes a la toxina que ellas liberan. Esto favorece el dominio ambiental de células y es importante en la fermentación comercial y patogénesis microbiana (Sesti et al., 2001). 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Desde la perspectiva de la Microbiología Aplicada, la utilización de levaduras “killer” se ha postulado para el control de la contaminación de fermentaciones industriales o alimentos, llevados a cabo por levaduras (Palpacelli et al., 1991).. AC IÓ. N. Desde el punto de vista industrial, si una cepa “killer” posee características adecuadas para la fermentación, esta propiedad resulta favorable. Por el contrario, si una. M UN. IC. cepa “killer” posee propiedades no deseables puede originar dificultades en el proceso. CO. de fermentación, aún si éste ha sido inoculado con cepas seleccionadas (Castellanos y. Y. col., 2008).. IC. A. Independientemente del género al cual pertenezcan, las cepas salvajes de levadura. RM ÁT. “killer” pueden interferir en la fermentación y subsecuentemente en la calidad del. IN FO. producto. Su multiplicación y actividad pueden potencialmente retardar el inicio de una fermentación o dar un producto con niveles altos de acetaldehídos, ácido láctico, ácido. DE. acético u otras características sensoriales no deseadas (Bissón, 1999).. EM. AS. A partir del descubrimiento de las cepas “killer” de Saccharomyces cerevisiae en. ST. bodegas y viñedos europeos, se estimuló el interés en develar el significado y alcances. SI. de esta propiedad en la industria vitivinícola. Así, las levaduras “killer” con buenas. DE. características de fermentación han sido seleccionadas para la fermentación de la. RE CC IO. N. cerveza, vino o sake, y por lo tanto, pueden usarse como cultivos iniciadores en la industria del vino y prevenir el desarrollo de levaduras salvajes sensibles (Longo et al.,. DI. 1990; Van Vuuren and Jacobs, 1992). Una de las fermentaciones industriales más importantes y mejor conocidas es la. que da lugar al alcohol etílico, al actuar las levaduras sobre los azúcares. La buena marcha de las industrias de las bebidas y del vino dependen de la capacidad de las levaduras para producir alcohol (Salazar, 1996). 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La fermentación alcohólica es una reacción biológica que permite degradar azúcares y convertirlos en etanol y dióxido de carbono (Vásquez, 2007), utilizando diferentes materias primas dependiendo del país en donde se procese (Salazar, 1996) y. AC IÓ. N. pueden ser compuestos de almidón como maíz, papa, trigo o sorgo, compuestos azucarados como caña de azúcar o remolacha, compuestos celulósicos como madera. IC. (Ballenilla, 2007), además de frutos como la uva, los que contribuyen a la composición. M UN. química y calidad sensorial de la bebida alcohólica producida (Hernández, 2003).. CO. El mosto de Zea mays “maíz” -por la fermentación de su material azucarado- es. A. Y. empleado como materia prima para la elaboración artesanal de Chicha de Jora, la cual. RM ÁT. IC. es un producto oriundo del Perú con más de 3000 años de antigüedad y que además se. industrializable (De Florio, 2003).. IN FO. consume en otros países de América del Sur, constituyendo un producto potencialmente. DE. La principal variedad de maíz empleada en la preparación de chicha de jora es el. AS. maíz Alazán, el cual tiene distribución en los Departamentos de La Libertad,. ST. EM. Lambayeque y Piura (De Florio, 2003).. SI. El mosto de maíz contiene agua, un elevado porcentaje de carbohidratos (62%). DE. representados en su mayoría por almidón, así mismo contiene minerales como hierro,. RE CC IO. N. fósforo y calcio (Reyes y col., 2009). La melaza de caña o miel final, es un subproducto obtenido de la fabricación del. DI. azúcar crudo de caña o de su refinación; es un líquido oscuro altamente viscoso del que no puede cristalizarse más azúcar por los métodos físicos normales de fabricación (Icumsa, 2009; Fajardo y Sarmiento, 2007). Debido a que es un producto secundario y de bajo costo, tiene una gran aplicación industrial (Parazzi y Borges, 1992). En la mayoría de países latinoamericanos se utiliza como sustrato para la producción 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. industrial de etanol, y en el Perú es la principal materia prima empleada para tal fin (Gutierrez, 2007). La composición de la melaza varía considerablemente en función de la variedad. AC IÓ. N. de caña de azúcar, el suelo, el clima, el período de cultivo, la eficiencia de la operación de la fábrica, el sistema de ebullición del azúcar, el tipo y la capacidad de los. M UN. IC. evaporadores, entre otros. Es una mezcla compleja de sacarosa, azúcar invertido, sales y. CO. otros compuestos solubles en álcali que normalmente están presentes en el jugo de caña purificado, así como los formados durante el proceso de manufactura del azúcar. A. Y. (Fajardo y Sarmiento, 2007; Parazzi y Borges, 1992). Por otro lado, se caracteriza por. RM ÁT. IC. tener grados Brix (°Bx) o sólidos disueltos entre 68-75% y un pH de 5.0 a 6.1 (Castro,. IN FO. 1993).. El mosto de frutos de Vitis vinifera “uva” contiene agua, un elevado porcentaje de. DE. azúcares (mayormente fructosa y glucosa) y sacarosa en menor cantidad; minerales. AS. como magnesio, calcio, sodio, fierro, etc. Sin embargo, su composición porcentual. EM. difiere con la variedad de uva, las condiciones climáticas, el estado de sanidad y grado. SI. ST. de madurez de sus bayas, por lo que es recomendado para la producción de vino. DE. emplear frutos maduros y de esta forma garantizar la adecuada producción de etanol. N. (Lee, 2000). También influye si los racimos han sido despalillados o no, si se ha. RE CC IO. producido ruptura de pepas, y de las condiciones y tiempo de estrujado (Hidalgo, 2003). A partir de los mostos mencionados, donde el principal sustrato son los azúcares. DI. que contienen, Saccharomyces cerevisiae en condiciones anaeróbicas es capaz de. transformar los azúcares fermentables, principalmente en alcohol etílico y anhídrido carbónico, además de otros compuestos como son: alcoholes superiores, ésteres y aldehídos (Valencia, 2010). 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Durante el proceso de fermentación alcohólica, parte de los nutrientes del mosto son convertidos en biomasa, sin embargo el mayor porcentaje es transformado a etanol. La velocidad de la reacción metabólica y por lo tanto de la fermentación alcohólica. AC IÓ. N. depende de factores físicos, químicos y biológicos (Johnson, 2009). Entre los factores fisicoquímicos se puede mencionar a la temperatura, pH, concentración de sustrato,. IC. nitrógeno, vitaminas, etc. (Torija et al., 2003). Entre los factores biológicos se. M UN. consideran el tipo de levadura, su estado fisiológico y la concentración celular (Prescott. CO. y col., 2004). Todos estos factores interactúan e influyen durante el proceso de. A. Y. fermentación (Pedro, 2012).. RM ÁT. IC. Actualmente el Perú cuenta con bioindustrias fermentativas tales como: Industrias vinícolas, cervecerías y destilerías de alcohol; todas estas industrias requieren. IN FO. permanentemente el empleo de levaduras debidamente seleccionadas y caracterizadas,. DE. las cuales en algunas ocasiones son importadas periódicamente; aunque resulta más. AS. efectivo el uso de cultivos puros de levaduras que procedan de la zona donde se van a. EM. utilizar, lo que se conoce como levaduras locales seleccionadas (Mas y col., 2002).. ST. Aunque existe más de un tipo de variable que afecta la expresión de los fenotipos. DE. SI. “killer” y “sensible”, abunda evidencia que este tipo de interacciones pueden determinar. N. la evolución de las distintas poblaciones de levaduras durante la fermentación. En. RE CC IO. algunas ocasiones una cepa “killer” de S. cerevisiae predomina al final del proceso fermentativo, sugiriendo que la expresión de la toxina le permitió conducir parte del. DI. proceso fermentativo (Fleet, 2003). El fenotipo “killer” K+R+ de una levadura es importante porque determina la evolución de las distintas poblaciones de levaduras durante el proceso de fermentación alcohólica, controlando contaminaciones por cepas salvajes sensibles, llegando a 7. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. predominar y conducir el proceso. Estas levaduras se encuentran presentes en la naturaleza y existe una gran variabilidad de los tipos microbianos encontrados en la flora natural de los frutos procedentes de una región a otra.. AC IÓ. N. En la Libertad, Salinas (2009) observó ausencia del fenotipo “killer” en levaduras productoras de etanol aisladas a partir de Vitis vinifera cultivadas en Cascas; mientras. M UN. IC. que Polo (2010), encontró que un 32% -aproximado- de levaduras aisladas de Chicha de Jora del distrito de Moche, presentaron fenotipo “killer” K+R+; sin embargo, hay que. CO. tener en cuenta que las levaduras “killer” son mayoritarias en gran parte de viñedos,. A. Y. bodegas, chicheros y plantas de destilación y no existen investigaciones publicadas en. RM ÁT. IC. Perú sobre su aplicación, siendo importante su uso en la producción de etanol a partir de. IN FO. mostos elaborados en base a materias primas disponibles en la región La Libertad. Teniendo en cuenta lo antes mencionado, en esta investigación se determina el. DE. efecto de los mostos de frutos de Vitis vinifera “uva”, de Zea mays “maíz de jora” y de. AS. melaza de Saccharum officinarum “caña de azúcar” en la producción de etanol por. ST. EM. Saccharomyces cerevisiae “killer” K+R+.. Cuantificar el etanol producido por Saccharomyces cerevisiae “killer” K+R+ en. N. 1.. DE. SI. Se consideraron los siguientes objetivos:. RE CC IO. mostos de frutos de Vitis vinifera, Zea mays y melaza de Saccharum officinarum,. después de 96 horas de fermentación;. DI. 2.. Identificar cuál de los tres mostos evaluados (frutos de Vitis vinifera, Zea mays, y melaza de Saccharum officinarum) tiene un mayor efecto en la producción de etanol por Saccharomyces cerevisiae “killer” K+R+ durante 96 horas de fermentación.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y MÉTODO 1.. Material 1.1. Material de estudio. AC IÓ. N. Cultivos de Saccharomyces cerevisiae “killer” K+R+ aislados de Chicha de Jora producida en forma artesanal, procedentes del Pueblo y la. M UN. IC. Campiña de Moche, Trujillo-Perú.. Cultivo referente de Saccharomyces cerevisiae CECT 1387 (Colección. CO. Española de Cultivos Tipo) con fenotipo “killer” K+R+.. A. Y. Cultivo referente de Saccharomyces cerevisiae CECT 1443 (Colección. RM ÁT. IC. Española de Cultivos Tipo) con fenotipo “sensible”K-R-. Frutos de Vitis vinifera “uva” (Anexo 01). IN FO. Mosto de Zea mays “maíz de jora”. (Anexo 02). DE. Melaza de Saccharum officinarum “caña de azúcar” (Anexo 03). AS. 1.2. Medios de cultivo (Anexo 04). ST. EM. Agar Sabouraud sacarosado enriquecido (ASSE). SI. Agar Yeast Peptone Dextrose (YPD), tamponado a pH 5.6. DE. Caldo Sabouraud sacarosado.. N. Método. RE CC IO. 2.. DI. 2.1. Reactivación de cultivos de Saccharomyces cerevisiae “killer” K+R+ aislados de chicha de jora, y verificación de pureza (Anexo 05) Se reactivaron 50 cultivos de S. cerevisiae “killer” K+R+ aislados de Chicha de Jora, mediante siembra por estrías en dos placas conteniendo Agar Sabouraud sacarosado enriquecido (ASSE); luego se incubaron a 30°C durante 24-48 horas. 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En cada cultivo, se observó uniformidad de las colonias desarrolladas y a partir de una de ellas se realizó coloraciones de Gram para determinar su pureza; después el cultivo puro se sembró en ASSE y se incubó a 30°C. AC IÓ. N. durante 24 horas para posteriormente evaluar su capacidad fermentativa. 2.2. Selección del cultivo de S. cerevisiae mediante evaluación de la. M UN. IC. capacidad fermentativa. CO. De los 50 cultivos de S. cerevisiae “killer” K+R+ se reactivaron 20, a los. Y. cuales se les evaluó su capacidad fermentativa mediante el Método de. IC. A. Davies-Griffith modificado (Anexo 06). Se seleccionó el cultivo que. IN FO. confirmó su actividad “killer”.. RM ÁT. presentó la mayor productividad de etanol (Anexo 07); posteriormente, se. 2.3. Confirmación de la actividad “killer” K+R+. DE. El cultivo de S. cerevisiae “killer” K+R+ seleccionado se sembró por estría. AS. en dos placas conteniendo Agar YPD tamponado con buffer acetato a pH. EM. 5.6 y se incubó por 10 días a 22°C. Luego, en forma perpendicular a las. SI. ST. estrías anteriores se sembraron los cultivo de S. cerevisiae CECT 1387 con. DE. fenotipo “killer” K+R+ y CECT 1443 con fenotipo “sensible” K-R-, y se. DI. RE CC IO. N. incubaron a 22°C durante 48 horas. Después de la incubación se observó crecimiento del cultivo CECT 1387 y la inhibición del crecimiento del cultivo CECT 1443, confirmándose el fenotipo “killer” K+R+ del cultivo seleccionado (Anexo 08).. 2.4. Propagación de biomasa El cultivo de S. cerevisiae “killer” K+R+ seleccionado se propagó en ocho frascos conteniendo ASSE y se incubó a 30° durante 24 horas. Después del 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. tiempo de incubación establecido, se procedió a “cosechar” el cultivo con ADE y en condiciones asépticas (Anexo 09 - A).. N. 2.5. Obtención de biomasa. AC IÓ. De la suspensión obtenida en el paso anterior, se distribuyó 1.8 mL en cada. IC. uno de 24 microviales estériles y previamente pesados; luego se. M UN. centrifugaron a 3500 rpm durante 10 minutos. Posteriormente se eliminó el. CO. sobrenadante y cada microvial se pesó nuevamente para por diferencia de. Y. pesos determinar el peso de la biomasa húmeda obtenida (Anexo 09 - B).. RM ÁT. IC. A. 2.6. Esterilización y acondicionamiento de los sistemas de fermentación Los materiales empleados para la construcción de los sistemas de. IN FO. fermentación se lavaron con detergente y se enjuagaron con abundante agua. DE. potable.. AS. Las partes plásticas fueron esterilizadas con hipoclorito de sodio al 1%, por. EM. inmersión durante 30 minutos. Luego se enjuagaron con abundante agua. ST. potable estéril (APE) hasta la eliminación del olor característico del. SI. hipoclorito, el último enjuague se realizó con ADE. Las partes de vidrio se. DI. RE CC IO. N. DE. esterilizaron en horno, a 180°C durante 2 horas. Cada sistema de fermentación se ensambló conforme Anexo 10 y el volumen de trabajo fue de 450 mL.. 2.7. Obtención, preparación y tratamiento de los medios de fermentación 2.7.1. Mosto de frutos de Vitis vinifera “uva” Se pesó 2.0 Kg de uva y se lavó con agua de caño, posteriormente los frutos se desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio 11. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. al 0.5% durante 15 minutos; y se enjuagaron con abundante APE hasta la eliminación del olor característico del hipoclorito, los dos últimos enjuagues se realizaron con ADE. Luego de despalillar, los. AC IÓ. N. granos fueron estrujados y machacados manualmente de forma aséptica; esta operación se realizó hasta que toda la pulpa fue. IC. disgregada. Posteriormente se filtró para separar las pepas y hollejos. M UN. del mosto (Anexo 11).. CO. 2.7.2. Mosto de Zea mays “maíz de jora”. IC. A. Y. El mosto se obtuvo en el distrito de Moche, y fue transportado en. RM ÁT. condiciones asépticas al Laboratorio de Microbiología Industrial.. IN FO. 2.7.3. Mosto de Melaza de Saccharum officinarum “caña de azúcar” La Melaza fresca se obtuvo de la Empresa Agroindustrial Laredo y. DE. fue transportada en condiciones asépticas al Laboratorio de. EM. AS. Microbiología Industrial.. ST. Los tres mostos fueron higienizados con bisulfito de sodio (100 mg/L); así. SI. mismo, sus densidades fueron corregidas hasta obtener 25°Bx; en el caso de. DE. los mostos de maíz de jora y de uva se adicionó azúcar refinada doméstica,. RE CC IO. N. y el mosto de melaza fue diluido con ADE.. DI. 2.8. Fermentación (Anexo 12) Se transfirió 2.25g de biomasa húmeda de la levadura a cada sistema de fermentación que fue acondicionada con 450 mL del mosto (maíz de jora, melaza y uva).. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Los sistemas se cerraron dejando una salida para la liberación de CO 2 y fueron incubados en anaerobiosis durante 96 horas a temperatura ambiental (20.6 ± 0.3°C).. AC IÓ. N. Además se usó como control un sistema con Caldo Sabouraud sacarosado a. IC. 25°Brix.. CO. 2.9. Monitoreo de los sistemas de fermentación. M UN. Se realizaron tres repeticiones del experimento.. A. Y. Durante el proceso de fermentación, cada 12 horas se midió los °Bx y los. RM ÁT. IC. valores de pH; para lo cual se extrajo 2 mL del medio en forma aséptica. Las determinaciones se realizaron haciendo uso de un refractómetro y. IN FO. pHmetro respectivamente (Anexo 13).. DE. 2.10. Pasteurización de los medios de fermentación. AS. Después de transcurridas las 96 horas de fermentación, los mostos fueron. EM. trasferidos a botellas y pasteurizados a 65°C por 30 minutos. Transcurridos. ST. este tiempo se sumergió en agua helada por un lapso de 30 segundos. Se. DE. SI. dejó decantar para luego transvasar a botellas limpias y secas para su. RE CC IO. N. conservación hasta el momento de la destilación.. DI. 2.11. Evaluación de la producción de etanol 2.11.1. Destilación del mosto fermentado En un balón de destilación se colocaron 50 mL del mosto y 100 mL de agua destilada (AD), se sometió a un proceso de destilación simple hasta obtener un destilado con volumen de 100mL (Anexo. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 14). En los casos que se obtuvo menos de 100mL, se aforó con AD hasta llegar a los 100mL.. N. Esto se realizó para cada sistema de fermentación.. AC IÓ. 2.11.2. Determinación de la producción de etanol en mosto fermentado. IC. (%v/v). M UN. El destilado obtenido en el paso anterior se empleó para determinar. CO. el grado alcohólico, se medió el porcentaje de etanol en volumen. Y. directamente utilizando un alcoholímetro (Anexo 15). Los resultados. IC. A. obtenidos del contenido de etanol de cada mosto se expresan como. RM ÁT. % v/v.. IN FO. 2.12. Análisis de resultados. DE. Los datos de porcentaje de etanol, los °Bx y valores de pH obtenidos en cada mosto evaluado se organizaron en tablas y figuras; además, fueron. EM. AS. sometidos a un análisis de la varianza (ANOVA) de un factor.. ST. Adicionalmente los datos de porcentaje de etanol fueron sometidos a una. DI. RE CC IO. N. DE. SI. prueba de comparaciones múltiples, Prueba Post-Hoc de Bonferroni.. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS Al evaluar el efecto de tres mostos sobre la producción de etanol por. N. Saccharomyces cerevisiae “killer” K+R+, se observa en la Fig. 01 que en el mosto de. AC IÓ. frutos de Vitis vinifera se produce el mayor porcentaje de etanol, en el mosto de Zea. IC. mays se produce el menor porcentaje de etanol, inclusive menor al control compuesto. M UN. por Caldo Sabouraud sacarosado.. CO. La Fig. 02 muestra la variación del contenido de sacarosa (°Bx) de los tres mostos. Y. y el control (Caldo Sabouraud sacarosado), teniendo en cuenta que la concentración. IC. A. inicial en todos es de 25°Bx, siendo el mosto de frutos de Vitis vinifera el que presenta. RM ÁT. el menor contenido de sacarosa, tras 96 horas de fermentación; y el mosto de Zea mays. IN FO. presenta el mayor contenido de sacarosa, después del mismo periodo de fermentación.. DE. La Fig. 03 representa la variación de los valores de pH en los mostos evaluados y. AS. el control, durante la producción de etanol, tras 96 horas de fermentación; se observa en. EM. los mostos de fruto de Vitis vinifera y de Zea mays, que el valor del pH fluctúa entre 3 a. ST. 4 a partir de las 12 horas de fermentación; en tanto, en los mostos de melaza de. SI. Saccharum officinarum y Caldo Sabouraud sacarosado, el valor del pH fluctúa entre. DI. RE CC IO. N. DE. 4.3 a 5.3, también a partir de las 12 horas de fermentación.. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. *: Caldo Sabouraud sacarosado a 25°Bx. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. *: Caldo Sabouraud sacarosado a 25°Bx. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. *: Caldo Sabouraud sacarosado a 25°Bx. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DISCUSIÓN La producción de etanol no sólo está condicionada por el sustrato empleado y por. AC IÓ. concentración de nutrientes inherente al medio de fermentación (mosto).. N. los microorganismos encargados de la fermentación, también influye la diferente. M UN. IC. En la presente investigación se emplearon mostos de frutos de Vitis vinifera, Zea mays y melaza de Saccharum officinarum, los cuales contienen en forma natural. CO. cantidades variables de azúcares fermentables, fuentes de nitrógeno, vitaminas,. Y. fosfolípidos, esteroles, ácidos grasos insaturados, minerales, etc., que permiten la. IC. A. producción de etanol (Ribéreau-Gayon et al., 2006). Siendo importante identificar el. IN FO. “killer” K+R+ aislada de Chicha de Jora.. RM ÁT. mosto que permita la mayor producción de etanol empleando Saccharomyces cerevisiae. Teniendo en cuenta el hecho que las levaduras indígenas, portadoras del factor. DE. “killer”, son mayoritarias en la mayor parte de viñedos, bodegas, chicheros y plantas de. EM. AS. destilación, es deseable elegir cepas seleccionadas que sean por sí misma “killer” o que. ST. sean neutras, es decir que no sean eliminadas (por este mecanismo) por la flora. SI. indígena. Por lo anteriormente expuesto, es que se eligió a S. cerevisiae “killer” como el. N. DE. microorganismo fermentador.. RE CC IO. Las levaduras “killer” se emplean como cultivos iniciadores y además determinan. la evolución de las distintas poblaciones de levaduras durante el proceso de. DI. fermentación, controlando contaminaciones por levaduras salvajes sensibles; es decir favorecen el dominio ambiental de células, llegando a predominar y conducir el proceso de fermentación (Sesti et al., 2001; Fleet, 2003).. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. El cultivo de S. cerevisiae “killer” utilizada en la presente investigación fue aislado de Chicha de Jora elaborada en forma artesanal en la Campiña de Moche (Polo, 2010), y tras su evaluación con el Método de Davies-Griffith modificado en Caldo. AC IÓ. N. Sabouraud sacarosado presenta una productividad de 0.1232 g etanol/g levadura/h (Anexo 07); y se ha demostrado que ésta levadura produce etanol a partir de diferentes. M UN. IC. mostos (frutos de Vitis vinifera, Zea mays y melaza de Saccharum officinarum).. CO. En un proceso de fermentación un buen arranque se caracteriza por la rápida puesta en marcha de las actividades de la levadura. Esto implica dos exigencias: por una. A. Y. parte, es necesario una determinada población inicial de levaduras viables, bien. RM ÁT. IC. adaptadas a las características de los mostos y a las condiciones de fermentación; por otra parte, se requiere una concentración suficiente de nutrientes en el mosto, necesarios. IN FO. para el metabolismo de las levaduras.. DE. Según Leveau y Bouix (2010), la adición de levaduras es una práctica usual hoy. AS. en día, ofrece ventajas como población viable elevada desde el comienzo de la. EM. fermentación, sin embargo está condicionada por una buena implantación de la cepa. SI. ST. seleccionada, en relación con un aporte en cantidad suficiente, así como la eliminación. DE. máxima de las levaduras indígenas susceptibles de entrar en competición con la cepa. N. seleccionada. En la presente investigación los sistemas de fermentación fueron. RE CC IO. inoculados con 0.5% de la levadura seleccionada. Hidalgo (2003) señala que el estudio de los requerimientos nutricionales en las. DI. levaduras tienen una influencia directa sobre su crecimiento, esto en proporción a los nutrientes presentes en los mostos que van a condicionar e influir en el proceso de la fermentación alcohólica.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Ribéreau-Gayon et al. (2006) mencionan que la cinética de la fermentación se ve afectada por el contenido de azúcares del mosto, afirmando que elevadas cantidades de sustrato, es decir superior a 200g/L, interrumpe la fermentación; ya que una tasa de. AC IÓ. N. azúcar elevada afectaría la población de levaduras, reduciendo la fermentación inclusive antes de la aparición de una cantidad significativa de etanol que agrega un efecto. M UN. CO. suplementados con azúcar refinada doméstica hasta los 25°Bx.. IC. antiséptico. A pesar de ello, en la presente investigación, los mostos fueron. La Fig. 01 muestra el efecto que tiene la concentración de nutrientes de cada. A. Y. mosto, sobre la producción de etanol (%v/v) por S. cerevisiae “killer” K+R+;. RM ÁT. IC. obteniéndose en el mosto de frutos de Vitis vinifera el mayor porcentaje de etanol (11.67 %v/v), en el mosto de Zea mays se obtuvo el menor porcentaje de etanol (7.00. IN FO. %v/v), inclusive menor al del Control Caldo Sabouraud sacarosado (9.00 %v/v), en. DE. tanto en el mosto de melaza de Saccharum officinarum se obtuvo 10.00 %v/v de etanol.. AS. Al analizar estadísticamente los porcentajes de etanol obtenidos mediante. EM. ANOVA de un factor (Anexo 16), se demuestra que los valores obtenidos en los tres. SI. ST. mostos ensayados son diferentes entre sí. Adicionalmente, la prueba Post-Hoc. DE. Bonferroni, permitió comparar los porcentajes de etanol de cada mosto ensayado,. N. indicando que en todas las comparaciones realizadas existe un nivel de significancia. RE CC IO. estadísticamente relevante, por lo tanto, se puede concluir que el mayor porcentaje de etanol (11.67 %v/v) se obtuvo a partir del mosto de frutos de Vitis vinifera y el menor a. DI. partir del mosto de Zea mays (7.00 % v/v).. La producción de etanol por fermentación es influenciada por la presencia de iones metálicos como el zinc y el hierro dado que son cofactores de la enzima alcohol 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. deshidrogenasa (Peña y col., 2010); al analizar los componentes de cada materia prima empleada para la obtención de los mostos ensayados, se tiene según la tabla peruana de composición de alimentos del Ministerio de Salud (Anexo 25) que el fruto de Vitis. AC IÓ. N. vinifera presenta zinc, compuesto mineral no reportado en el maíz alazán (maíz de jora) ni melaza.. M UN. IC. El zinc es un oligoelemento que es particularmente importante en la fermentación. CO. con respecto a su papel como activador de la Zn-metaloenzima alcohologenica terminal, etanol deshidrogenasa. Medios deficientes en zinc pueden conducir a fermentaciones. A. Y. lentas o incompletas, y esto ha sido reconocido como un problema ocasional en la. RM ÁT. IC. industria de la elaboración de la cerveza (Densky et al., 1966); así mismo, De Nicola y Walker (2011) afirman que el zinc tiene un impacto en el rendimiento de la. IN FO. fermentación y la calidad del producto obtenido.. DE. Como cofactores en la reacción para producción de etanol es posible la utilización. AS. de zinc o hierro dependiendo del tipo de enzima alcohol deshidrogenasa. En cuanto al. EM. hierro, en el Anexo xx se observa que está presente en el fruto de Vitis vinifera en. SI. ST. mayor cantidad que en la melaza y no esta reportada su presencia en el maíz alazán. Por. DE. todo lo anteriormente expuesto, en cuanto al zinc y hierro, es que estos cofactores. N. influyen para que a partir del mosto de Vitis vinifera se obtuviera la mayor producción. RE CC IO. de etanol (11.67 %v/v), una menor producción se obtuvo en el mosto de melaza (10.00. DI. %v/v) y aún menor en el mosto de Zea mays (7.00 %v/v). En relación a otros minerales presentes en los mostos evaluados, se puede señalar. que el potasio es indispensable para el crecimiento de las levaduras, incluso pequeñas cantidades son suficientes; si se encuentran en cantidades mayores, pueden ejercer una acción desfavorable sobre el crecimiento y la fermentación. Así mismo, el calcio no es 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. necesario para el crecimiento de las levaduras, pero parece ejercer una acción favorable sobre la fermentación; conforme el Anexo 25, tanto el maíz alazán, frutos de Vitis vinifera y melaza contienen calcio.. AC IÓ. N. En cuanto al magnesio, éste es imprescindible para el desarrollo de las levaduras y también necesario para la fermentación, pues este elemento es uno de los activadores. M UN. IC. del proceso fermentativo alcohólico (Adrián, 1999). En relación a los frutos de Vitis. CO. vinifera, estos contienen un elevado porcentaje de azúcares fermentables, además calcio, magnesio, fosforo, sodio, zinc, hierro, compuestos nitrogenados, taninos y. A. Y. vitaminas A, B1 y C, por lo que a partir del mosto de estos frutos es que se obtuvo la. RM ÁT. IC. mayor producción de etanol (11.67 % v/v). IN FO. Si bien el maíz es un alimento muy rico en nutrientes, su composición química se ve afectada por el genotipo, medioambiente y condiciones de siembra. En promedio, el. DE. contenido de proteína es de 10 % y más de 60 % son prolaminas conocidas como. AS. zeínas; las cuales presentan muy bajo contenido de aminoácidos esenciales como lisina,. EM. triptófano e isoleucina, lo que provoca que el valor biológico de la proteína sea bajo (De. SI. ST. Florio, 2003). La pobre calidad nutricional del maíz sumado a que no se le reporta. DE. presencia de zinc y hierro (Reyes y col., 2009), influyen en la baja producción de etanol. N. en el mosto de Zea mays, a partir del cual se obtuvo el menor porcentaje de etanol (7.00. RE CC IO. %v/v) y es consecuente con lo reportado por De Florio (1986) quien en su estudio de la fermentación del maíz alazán empleando S. cerevisiae, obtuvo 7.00 % v/v de alcohol en. DI. la bebida final. Adicionalmente se llevó a cabo un ANOVA de un factor a los datos obtenidos en cada uno de los mostos, tanto para el contenido de sacarosa (°Bx) como para los valores. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. del pH (Anexos del 17 al 24). Dicho análisis logró determinar que existe diferencia significativa en cada uno de estos mostos evaluados. En la Fig. 02 se puede observar que las concentraciones de todos los mostos. AC IÓ. N. inician con 25° Brix y disminuyen a través del tiempo; sin embargo en el mosto de uva la disminución es mayor y en el maíz de jora es menor, aún por debajo del control. Esta. M UN. IC. disminución del contenido de sacarosa está relacionada con la producción de etanol;. CO. pues conforme la levadura va degradando los azúcares presentes en el mosto, los niveles. Y. de etanol se van incrementando.. IC. A. En la Fig. 03 se grafica la variación de los valores del pH en los tres mostos. RM ÁT. evaluados y el control, se observó en los mostos de V. vinifera y melaza de S.. IN FO. officinarum que los valores de pH se mantienen casi constantes a lo largo de todo el proceso fermentativo, en valores del pH alrededor de 3.1 y 5.0 respectivamente; en. DE. tanto, en el mosto de Zea mays se evidencia un valor inicial de pH 5.51, el cual decrece. AS. conforme transcurre la fermentación y después de 48 horas se establece en un valor del. EM. pH 3.5. De Florio (1986) afirma que un valor del pH de 5.0 es el óptimo para el inicio. SI. ST. de la fermentación del mosto de “maíz de jora”, quién también reporta que la variación. DE. del valor del pH no afecta la producción de etanol.. RE CC IO. N. En la presente evaluación se higienizaron los mostos con bisulfito de sodio en una concentración de 100 mg/L, con la finalidad de eliminar la flora nativa de las materias primas evaluadas. En un estudio realizado por Perez et al. (2001) se demuestra que la. DI. actividad “killer” de S. cerevisiae solo es posible cuando esta se encuentran en una. mayor proporción que las cepas “killer sensibles” y que la capacidad de las cepas “killer” para eliminar las cepas sensibles depende de su proporción inicial, la susceptibilidad de las cepas sensibles y el tratamiento del mosto. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Es preciso señalar que, para determinar el efecto de los tres mostos sobre la producción de etanol por S. cerevisiae “killer”, la investigación se realizó bajo las mismas condiciones físicas; es decir en anaerobiosis, a una temperatura de 20.6 ± 0.3°C. N. y en valores de pH inherentes al medio de fermentación, condiciones que son propicias. AC IÓ. para el desarrollo de las levaduras “killer” tal como lo indican Heart y Fleet (1987);. IC. cabe señalar que la concentración de sustrato y la biomasa utilizada fueron debidamente. M UN. controladas a fin de garantizar que los porcentajes de etanol obtenidos fueron producto. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. del efecto de cada mosto evaluado.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONCLUSIONES 1.. Saccharomyces cerevisiae “killer” K+R+ aislada de Chicha de Jora, produce 7.0. N. % de etanol (v/v) en mosto de Zea mays, 10.0% en melaza de Saccharum. AC IÓ. officinarum y 11.67 % en mosto de frutos de Vitis vinifera, durante 96 horas de. 2.. M UN. IC. fermentación.. El mosto de frutos de Vitis vinifera tiene un mayor efecto en la producción de. CO. etanol, durante 96 horas de fermentación, por Saccharomyces cerevisiae “killer”. Y. K+R+ en comparación a los mostos de Zea mays y melaza de Saccharum. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. officinarum.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Adrián R. (1999). Capacidad fermentativa y tolerancia al etanol de levaduras. N. alcoholeras aisladas a partir de diferentes fuentes naturales. Tesis para obtener. AC IÓ. el título de Biólogo-Microbiólogo. Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo,. M UN. IC. Perú.. Ballenilla, M. (2007). Biocombustibles: Mito o realidad. Tesis Pregrado Ciencias. CO. Ambientales. Universidad Miguel Hernández de Elche. España.. IC. A. Y. Bissón, L. (1999). Stuck and sluggish fermentations. American Journal of Enology and. RM ÁT. Viticulture. 50: 107-119. IN FO. Bourgeois, C.; Larpent, J. (1995). Microbiología Alimentaria. Vol. II Fermentaciones Alimentarias. Zaragosa, España: Acribia S.A.. DE. Castellanos, L.; Toro, M.; Vásquez, F. (2008). Actualidad microbiológica en vinos.. EM. AS. Argentina.. ST. Castro, M. (1993). Estudio de la melaza de caña como sustrato de la fermentación. DE. SI. Acetobutílica. Tesis Pregrado Ingeniería Química, Universidad Nacional de. RE CC IO. N. Colombia. Bogotá, Colombia. De Florio, E. (1986). “Estudio de la fermentación de Chicha de Jora”. Tesis Pregrado. DI. Industrias alimentarias. Universidad Nacional Agraria La Molina. Lima, Perú. De Florio, E. (2003). Elaboración tradicional de chicha de jora. Recuperado el 14 de marzo. de. 2013,. del. sitio. Web. RevistaCiencias.com:. http://www.revistaciencias.com/publicaciones/EpyuVFuuylqspZyKno.php. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. De Nicola, R.; Walker, G. (2011). Zinc Interactions with Brewing Yeast: Impact on Fermentation Performance. J. Am. Soc. Brew. Chem. 69(4):214-219. Densky, H., Gray, P.J. and Buday, A. (1966). Further studies on the determination of. AC IÓ. N. zinc and its effects on various yeasts, Proceedings of the American Society of. IC. Brewing Chemists, 93-94.. M UN. Epifanio, S. (2005). Influencia de la tecnología de vinificación en la microbiología y el. CO. desarrollo de la fermentación alcohólica. Tesis Doctoral. Universidad de la. A. Y. Rioja, España.. RM ÁT. IC. Fajardo, E.; Sarmiento, S. (2007). Evaluación de la melaza de caña como sustrato para la producción de Saccharomyces cerevisiae. Tesis Grado Microbiología. IN FO. Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá, Colombia.. DE. Fleet, GH. (1997). Wine. En Doyle, M.; Beuchat, L.; Montville, T. (Eds), Food. AS. Microbiology Fundamentals and Frontiers (pp. 671-694). Washington, DC:. ST. EM. ASM Press.. SI. Fleet, GH. (2003). Yeast interactions and wine flavour. Int. Journal Food Microbiology.. DE. 86: 11-22.. RE CC IO. N. Gutierrez C. (2007). Estudio comparativo de los sistemas de cultivo tipo “Batch” y Fed“Batch”, con Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT-L51 en la. DI. producción y rendimiento alcohólico a partir de melaza de caña (Saccharum officinarum). Tesis Pregrado Ingeniería Industrial. Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo, Perú.. Hernández, A. (2003). Microbiología Industrial. San José, Costa Rica: Euned.. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Hidalgo, J. (2003). Tratado de Enología. Tomo 1. Madrid, España: Mundi-Prensa. ICUMSA. Libro de Métodos. (2009). Método GS4/3-3 2007: Determinación de azúcares reductores en melaza de caña y en algunos jarabes refinados por. AC IÓ. N. medio del procedimiento Lane & Eynon a volumen constante – Oficial.. IC. Alemania: Bartens. M UN. Johnson, H. (2009). El Vino. Nuevo atlas mundial. Barcelona, España: Blume.. CO. Lee, B. (2000). Fundamentos de Biotecnología de los Alimentos. Zaragosa, España:. IC. A. Y. Acribia S.A.. RM ÁT. Leveau, J.; Bouix, M. (2000). Microbiología Industrial. Los microorganismos de interés. IN FO. industrial. Zaragoza, España: Acribia, S.A.. Longo, E.; Velázquez, J.; Cansado, J.; Calo, P.; Villa, T. (1990). Role of killer effect in. DE. fermentations conducted by mixed cultures of Saccharomyces cerevisiae.. EM. AS. FEMS Microbiology. 71: 331-336.. ST. Madigan, M.; Martinko, J.; Parker J. (2004). Brocks. Biología de los Microorganismos.. DE. SI. (10a ed). Madrid, España: Pearson Prentice Hall.. N. Marquina, D.; Barroso, J.; Santos, A.; Peinado, M. (2001). Production and. RE CC IO. characteristics of Debaryomyces hansenii killer toxin. Microbiological. DI. Research 156 (4), 387-391.. Mas, A.; Torija, M.; Beltrán, G.; Novo, M.; Hierro, N.; Poblet, N. Rozés, N.; Guillamón, J. (2002). Fermentos Selección de levaduras. Tecnología del vino. 39-44.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Owen, W. (1991). Biotecnología de la fermentación. Principios, procesos y productos. Zaragosa, España: Acribia, S.A. Palpacelli, V.; Ciani, M.; Rosini, G. (1991): Activity of a different “killer” yeasts on. AC IÓ. N. strains of yeast species undesirable in the food industry. FEMS Microbiology. IC. 84, 75-78.. M UN. Parazzi, C.; Borges, M. (1992). Claraficacão do Melaço e a Fermentação Alcoólica.. CO. Álcool & Açucar. 64, 16-27.. A. Y. Pedro, D. (2012). Productividad de etanol de Saccharomyces cerevisiae en mostos de. RM ÁT. IC. Passiflora edulis, Aranas comosus y Vitis vinifera. Tesis Pregrado Microbiología y Parasitología. Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo, Perú.. IN FO. Peña, C.; Arango, R.; Restrepo, L. (2010). Efecto de adición de iones hierro y zinc. DE. sobre la producción de etanol de dos cepas recombinantes de Saccharomyces. jun.. 2010.. ISSN. 1909-8758.. Disponible. en:. EM. 168,. AS. cerevisiae. Revista Colombiana de Biotegnología. [S.l.], v. 12, n. 1, p. 158-. ST. <http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/15581/3. DE. SI. 8077>. Fecha de acceso: 20 abr. 2014. RE CC IO. N. Polo, C. (2010). Fenotipo “killer” en levaduras productoras de etanol aisladas de chicha de jora del distrito de Moche, región La Libertad, Perú. Tesis Pregrado. DI. Microbiología y Parasitología. Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo, Perú.. Prescott, L.; Harley, J.; Klein, D. (2004). Microbiología. (5a ed.). Madrid, España: McGraw-Hill-Interamericana.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..