Antígenos del Líquido Seudocelómico de Ascaris suum detectados por Western Bot utilizando IgY producidos en Gallus gallus var Hisex Brown

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(1)DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE. AC IÓ. N. TRUJILLO. CO. Dra. Vilma Julia Méndez Gil. M UN. Rector de la Universidad Nacional de Trujillo. IC. Dr. Orlando Velásquez Benítez. RM ÁT. IC. A. Y. Vicerrectora Académica de la Universidad Nacional de Trujillo. Dr. Pedro Lavalle Ríos. IN FO. Secretario General de la Universidad Nacional de Trujillo. DE. Dr. Hermes Mario Escalante Añorga. Dr. Pedro Alvarado. SI. ST. EM. AS. Decano de la Facultad de Ciencias Biológicas. Dr. César Augusto Jara Campos Secretario General de la Facultad de Ciencias Biológicas. DI. RE CC IO. N. DE. Director de Escuela Académica Profesional de Microbiología y Parasitología. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEL ASESOR. El que suscribe, Profesor Principal del Departamento de Microbiología y. AC IÓ. N. Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo, asesor de la tesis titulada: Antígenos del Líquido Seudocelómico de Ascaris suum detectados por Western Blot. CO. M UN. IC. utilizando IgY producidos en Gallus gallus var. Hisex Brown. IC. A. Y. Certifica:. RM ÁT. Que la presente investigación fue desarrollada de conformidad con su. IN FO. correspondiente proyecto y teniendo en cuenta las orientaciones pertinentes. AS. DE. brindadas al tesista.. EM. Que el informe ha sido redactado bajo mi asesoramiento, acogiendo las. ST. observaciones y sugerencias alcanzadas. Por ello autorizo al Bachiller, continuar con. RE CC IO. N. DE. SI. los procedimientos correspondientes según sus fines.. DI. ________________________ Dr. César Augusto Jara Campos ASESOR. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. AC IÓ. N. Señores miembros del jurado examinador:. El presente informe de tesis ha sido elaborado cumpliendo con las. M UN. IC. disposiciones vigentes del Reglamento de Grados y Títulos de la Facultad de. Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo. Someto a vuestra. CO. consideración y elevado criterio el presente Informe de Tesis titulado: Antígenos del. IC. IN FO. RM ÁT. producidos en Gallus gallus var. Hisex Brown. A. Y. Líquido Seudocelómico de Ascaris suum detectados por Western Blot utilizando IgY. Esperando que el jurado se sirva a calificar este trabajo según su criterio. AS. DE. establecido.. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. Trujillo, 22 de julio del 2013.. DI. Br. Mario Daniel Arteaga García. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. M UN. IC. AC IÓ. N. MIEMBROS DEL JURADO. Dr. Juan Guevara González. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. Presidente. Secretario. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. Dr. César Augusto Jara Campos. Dra. Judith Roldan Rodríguez Vocal. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN Los profesores que suscriben, miembros del jurado examinador, declaran que la presente tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales, siendo por. Y. IC. AS. DE. IN FO. RM ÁT. Presidente. A. Dr. Juan Guevara González. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. unanimidad.. Secretario. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. Dr. César Augusto Jara Campos. Dra. Judith Roldán Rodríguez Vocal. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA. N. A mis queridos padres, Mario y María, por su amor,. AC IÓ. su paciencia, comprensión y apoyo; pero sobre todo. IC. por su gran esfuerzo en darme todo lo que eh. A. Y. CO. M UN. necesitado y mas de lo que eh merecido.. RM ÁT. IC. A mi hermana Carmen Elena, que con su ejemplo inspiro a no rendirme, seguir adelante. AS. DE. IN FO. y alcanzar mis metas.. ST. EM. A mis Tías, Emérita, Maruja y Minda,. SI. porque mas que mis tías son también mis. DI. RE CC IO. N. DE. madres. A Dios por permitir mi existencia y la culminación de mi carrera. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTO Al Dr. César Jara Campos por su generosidad. al brindarme la. oportunidad de recurrir a su capacidad y experiencia, así como su orientación y. AC IÓ. N. facilidades para la realización de este trabajo de tesis.. M UN. IC. Al M.Sc. Miguel Iglesias por su apoyo en la realización de la técnica. CO. de Electro-inmunotransferencia.. A. Y. A la Mblga. Marilia Gamarra Ruiz por su ayuda y consejos a lo largo. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. de todo este tiempo pero sobre todo por su gran amistad y aprecio.. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN El presente trabajo estuvo orientado a identificar los antígenos en Líquido Seudocelómico de Ascaris suum, mediante la técnica de Electro-inmunotransferencia. AC IÓ. N. “Western Blot” utilizando IgY producidos en Gallus gallus. El Líquido Seudocelómico se obtuvo de ejemplares hembras que fueron extraídas directamente. M UN. IC. del intestino de cerdos naturalmente infectados y sacrificados en el Camal Municipal de El Porvenir; el cual se utilizó para inmunizar, junto con el adyuvante completo e. CO. incompleto de Freud, a un ejemplar de G. gallus; a fin de obtener IgY contenida en. A. Y. la yema de huevo. La IgY se usó en la Electro-inmunotransferencia para la. RM ÁT. IC. determinación de los antígenos, de los cuales una parte fue tratada con Dithiothreitol (DTT) y la otra parte no fue tratada. En los antígenos tratados con DTT se encontró. IN FO. 12 bandas antigénicas, cuyos pesos moleculares fueron: 101.0, 94.9, 65.0, 61.1, 50.6,. DE. 45.0, 41.5, 34.6, 22.4, 16.3, 14.4 y 12.7-10.5 KDa; mientras que en los antígenos que no se trataron con DTT, se encontraron 15 bandas antigénicas cuyos pesos. EM. AS. moleculares fueron: 101.0, 94.9, 65.0, 61.1, 50.6, 45.0, 41.9, 34.6, 27.0, 25.4, 21.5,. ST. 18.5, 16.3, 14.4 y 11.2 KDa. Estos resultados permiten concluir que el Líquido. SI. Seudocelómico de Ascaris suum es una buena fuente de proteínas antigénicas que. DE. podrían utilizarse en el diagnostico de Ascariasis.. DI. RE CC IO. N. Palabras claves: Ascaris suum; Líquido seudocelómico; Electro-inmunotransferencia,. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT The present study was aimed to identify antigens at seudocelómic fluid (SF) of ascaris suum, by means of technique of electro-inmunoblotting "Western Blot". The SF was. AC IÓ. N. obtained from female specimens that were extracted directly from intestine of naturally infected pigs and sacrificed in the municipal slaughterhouse of El Porvenir, SF was used. M UN. IC. to immunize along with complete and incomplete Freud's adyuvant, to a specimen of G. gallus, to obtain the IgY contained in the egg yolk. The IgY was used in the electro-. CO. inmunoblotting for determining to antigens, of which a portion was treated with. A. Y. dithiothreitol (DTT) and the other portion wasn’t treated. In the DTT-treated antigens. RM ÁT. IC. was found 12 antigenic bands, whose molecular weights were: 101.0, 94.9, 65.0, 61.1, 50.6, 45.0, 41.5, 34.6, 22.4, 16.3, 14.4, 12.7-10.5 KDa, while in the antigens that weren't. IN FO. treated with DTT, were found 15 antigenic bands whose molecular weights were 101.0, 94.9, 65.0, 61.1, 50.6, 45.0, 41.9, 34.6, 27.0, 25.4, 21.5, 18.5, 16.3, 14.4, 11.2 KDa.. DE. These results suggest that the SF of Ascaris suum is a good source of protein antigens. AS. that could be used in the diagnosis of Ascariasis.. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. Keys words: Ascaris suum; Seudocelomic Fluid; Electro-inmunoblotting. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. i. Del Asesor. ii. Presentación. iii. AC IÓ. Autoridades de la Universidad Nacional de Trujilo. N. ÍNDICE. Miembros del Jurado. iv. M UN. IC. Aprobación Dedicatoria. CO. Agradecimiento. A. Y. Resumen. RM ÁT. IC. Abstract Índice. IN FO. I. Introducción II. Material y Métodos. DE. 1. Material Biológico. vi vii viii ix x 1 7 7 7. AS. 2. Procedimiento. v. ST. EM. 2.1 Obtención de formas adultas de A. suum. 7. SI. 2.2 Obtención del líquido seudocelómico de A. suum. 7. DE. 2.3 Determinación de la concentración de proteínas de Líquido 8. RE CC IO. N. Seudocelómico 2.4 Inmunización de G. gallus y Obtención de Anticuerpos IgY. 8. DI. 2.5 Determinación de los pesos moleculares de los antígenos de Líquido Seudocelómico por la Técnica de Western Blot. 9. 2.5.1 Preparación de Proteínas de Líquido Seudocelómico. 9. 2.5.2 Electroforesis en gel de poliacrilamida. 9. 2.5.3 Transferencia de proteínas. 10. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.5.4 Revelado enzimático de los antígenos de A. suum. 10. 2.5.5 Determinación de pesos moleculares 11 12. IV. Discusión. N. III. Resultados. AC IÓ. de cada una de las bandas antigénicas. 14 18. IC. V. Conclusión. M UN. VI. Referencias Bibliográficas. 25. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. Anexos. 19. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. I.. INTRODUCCIÓN. La ascariasis, enfermedad causada por los nematodos Ascaris lumbricoides y A. suum, constituye una infección frecuente en humanos a nivel mundial, en. de aproximadamente 1,4 billones1. - 5. AC IÓ. N. particular en zonas tropicales y templadas, con una frecuencia de infección global . Estos nematodos están principalmente. M UN. IC. presentes en comunidades donde la pobreza prevalece, las implementaciones de salubridad son deficientes y la educación adecuada sanitaria no ocupa un lugar. Y. CO. preferente en el desempeño diario 1.. IC. A. Esta parasitosis puede ser de dos tipos: la intestinal, que es producida por las traumáticas y. RM ÁT. formas adultas del nematodo, los cuales producen lesiones. reacciones toxicas; y la forma pulmonar, causada particularmente en las primeras. IN FO. fases de la infección, por las larvas de tercer y cuarto estado del parasito;. DE. produciendo manifestaciones respiratorias como neumonitis, síndrome de Loeffler. AS. y otros cambios en la función respiratoria; y en algunos casos también. EM. encefalopatías6 – 9.. ST. El ciclo evolutivo es directo; las hembras depositan aproximadamente 200,000. DE. SI. huevos en el intestino delgado del huésped, que en el momento de la postura no. N. están segmentados; en este estado salen con las deposiciones al medio externo, y en. RE CC IO. condiciones ambientales favorables y con un tiempo entre 2 a 3 semanas los huevos evolucionan a larvas de primer estado (L1), que luego mudan a larva de segundo. DI. estado (L2)10 – 13. Al ser ingerido los huevos con las larvas infectivas, estos llegan al duodeno, donde son atacados por los jugos digestivos y liberan las larvas; al no. tener las mecanismos necesarios para soportar las condiciones del medio que les rodea, estas larvas penetran la mucosa intestinal alcanzando la circulación porta y llegando al hígado, de donde pasa a la vía sanguínea del corazón para ser impulsada 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. hacia los pulmones; ahí se convierten en larvas de tercer estado (L3) y cinco días después vuelven a mudar para convertirse en larvas de cuarto estado (L4), ascendiendo por los alveolos, bronquios, tráquea y faringe, para luego ser. N. deglutidas hacia el tubo digestivo; la mayoría de larvas son eliminadas en las heces. AC IÓ. y el resto se desarrollan hasta la fase adulta4, 10, 13.. M UN. IC. A. suum es una especie estrechamente relacionada con A. lumbricoides y sólo presentan pequeñas diferencias, como por ejemplo; en el extremo cefálico presenta. CO. tres labios con finos dentículos en el margen anterior, y se diferencian también por 15, 16. . Además se ha. A. Y. la secuencia de seis nucleótidos de su ADN ribosomal14,. RM ÁT. IC. encontrado similitud entre bandas patrones de las proteínas extraídas de la pared del cuerpo y los órganos reproductivos, lo que refleja su estrecha relación genética y la. IN FO. alta probabilidad de infección cruzada entre el ser humano y el cerdo; considerando entonces que ambas especies son variaciones fisiológicas de una forma primitiva. AS. DE. que fue original a uno u otro huésped12, 17.. EM. Se ha establecido que la Ascariasis constituye uno de los fenómenos más. ST. frecuentes en diversas poblaciones con efectos negativos para ellas, tales como:. SI. deficiencias en la alimentación, desnutrición, falta de crecimiento pondoestatural,. DE. deficiencias en la aprehensión con consecuencias negativas en la formación escolar,. RE CC IO. N. deficiencias inmunológicas, asma y susceptibilidad a otras infecciones frecuentes, como. aquellas. producidas. por. Plasmodium. falciparum,. Mycobacterium. DI. tuberculosis y el virus de la inmunodeficiencias adquirida11. En el Perú, a través de estudios coproparasitoscópicos, se ha establecido que en la infección por A. lumbricoides se ha presentado con prevalencias que variaron entre el 06 y 98%, con mayores porcentajes en poblaciones infantiles de la selva y ceja de selva 18.. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. A. suum, es uno de los parásitos más prevalentes en cerdos domésticos, y es el único helminto frecuente en sistemas de producción masiva4, 19. Las infecciones son más frecuentemente diagnosticadas por la presencia de las formas adultas en el. N. intestino delgado en mataderos o por el hallazgo de los típicos huevos en muestras. AC IÓ. de materia fecal2, 3, 20. Ambos métodos han sido ampliamente usados en estudios de. IC. prevalencia y han proveído información directa e indirecta, respectivamente, de la. M UN. presencia de las formas adultas en el intestino delgado; sin embargo, estas técnicas. CO. no proveen información respecto del porcentaje de individuos que han. Y. experimentado infecciones pasadas o de los que tienen las larvas en fase migratoria;. IC. A. es más, el recuento de huevos en heces puede dar resultados falso-negativos debido. RM ÁT. a que las formas adultas están aun sexualmente inmaduras o el parasitismo ha. IN FO. ocurrido por solo uno de los sexos, o por el contrario falso-positivo debido a la ingestión de huevos por la coprofagia del huésped20.. DE. Con frecuencia, la máximas prevalencias de 20 a 50% son obtenidas en el. EM. AS. campo de las investigaciones usando uno de dichos métodos; sin embargo, tales. ST. prevalencias pueden constituir una seria subestimación de cerdos que hayan. SI. experimentado migración y los cuales quizá estén expuestos constantemente a la. DE. infección de huevos4, 19. Anteriormente han usado un antígeno ascaris-especifico y. RE CC IO. N. la técnica de ELISA; y se determinó una elevada especificidad y sensibilidad de esta prueba, cuando se la compara con puntos en el hígado de cerdos de engorde; sin embargo, no se encontró relación entre tal prueba y el número de formas adultas. DI. de ascaris en el intestino20.. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La ascariasis pulmonar tanto en el humano como en el cerdo está relacionada con la ruptura de los capilares y de las paredes de los tabiques alveolares por las larvas de tercer y cuarto estado de A. lumbricoides y A. suum, habiéndose. N. demostrado infección cruzada, aunque las larvas de origen porcino no llegan al. AC IÓ. estado adulto en el humano 5, 12, 21. Esta fase migratoria conduce a que el huésped. IC. forme anticuerpos anti-ascaris aspecto que favorece el uso de técnicas serológicas. M UN. en el diagnostico21.. CO. Tanto las ascariasis humana como la porcina se diagnostican principalmente. A. Y. por el hallazgo de huevos típicos en las heces, sin embargo, esta técnica no. RM ÁT. IC. demuestra la fase migratoria de las larvas ni las continuas exposiciones a huevos de ascaris20, 21. Entonces, las técnicas de detección de anticuerpos o antígenos toma. IN FO. importancia porque permiten detectar una real parasitación; para ello se han empleado diversas técnicas, siendo ELISA la más frecuentemente utilizada. DE. tradicionalmente, aunque, debido a su poca especificidad se están tratando de. EM. AS. implementar técnicas más sensibles como la técnica de Western Blot 17. En efecto,. ST. con la idea de utilizar esta última técnica para el diagnóstico, en otros estudios se. SI. han determinado a los antígenos de excreción-secreción de las formas adultas22; y. DE. de las formas larvarias pulmonares utilizando anticuerpos producidos en conejo,. RE CC IO. N. Oryctolagus cuniculus21. Sin embargo, considerando que la obtención de los antígenos de excreción-secreción requiere del uso de medios especiales, estufa y un. DI. tiempo no menor de 24 horas, se ha optado por el uso del líquido seudocelómico 23. Las inmunoglobulinas presentes en la yema de huevo de gallina han sido. ampliamente utilizadas en inmunología, bioquímica, biotecnología y salud humana y animal; aunque presentan una serie de ventajas frente a las IgG de mamíferos, su aislamiento requiere por una parte la eliminación de los lípidos presentes de la 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. yema sin alterar su funcionalidad, y por otra la utilización de metodologías de purificación que permitan una recuperación tal que haga factible su empleo como herramientas de detección y purificación a escala significativa 24, 25. A diferencia de. AC IÓ. N. las IgG de mamíferos; funcionalmente no interactúan con factores reumatoideos, de tal manera que la probabilidad de dar falsos-positivos en ensayos inmunoquímicos. IC. disminuye; las IgY no se unen a la proteína A estafilocócica ni a la proteína G ni al. M UN. sistema de complemento humano 24 – 27.. CO. Se ha demostrado por Western Blot que las IgY reconocen predominantemente. A. Y. bandas protéicas de bajo peso molecular de reactividad cruzada (10-20 y 20-. RM ÁT. IC. 29KDa), en cambio las IgG reconocen de preferencia proteínas de alto peso molecular (entre 46 y 77KDa); lo que evidencia la ventaja de utilizar gallinas, las. 27. IN FO. cuales proveen un repertorio nuevo de anticuerpos útiles, abundantes y baratos25, 26, , así mismo, la IgY de gallina presenta afinidad y sensibilidad similares a las de la. DE. IgG mamífera; y de hecho, puede ser usada en la mayoría de las pruebas de. EM. AS. aglutinación28. Además, debido a la distancia filogenética que separa a los. o. péptidos. que. serían. indetectables. utilizando. conejos. SI. conservadas,. ST. mamíferos de las aves, las IgY pueden reconocer proteínas mamíferas altamente. DE. hiperinmunizados27, 28.. RE CC IO. N. Teniendo en cuenta que la ascariasis es una parasitosis frecuente en el Perú y que no existen técnicas indirectas útiles para detectar la presencia de tanto formas. DI. juveniles como adultas de Ascaris, se planteó el presente trabajo que estuvo. orientado a determinar los antígenos del Líquido Seudocelómico de A. suum detectados por Western Blot utilizando IgY producidos en G. gallus var. Hisex Brown, de tal manera que sirva de base y sustento para el desarrollo de técnicas de diagnóstico para la ascariasis pulmonar en humanos. 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Objetivos específicos: 1. Determinar las proteínas antigénicas de Líquido Seudocelómico al ser tratado con DTT previamente a realizar el Western Blot.. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. tratado con DTT previamente a realizar el Western Blot.. AC IÓ. N. 2. Determinar las proteínas antigénicas de Líquido Seudocelómico sin ser. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. II.. MATERIAL Y MÉTODOS. 1. MATERIAL BIOLÓGICO. N. Se utilizaron 15 ejemplares hembra de A. suum para la obtención de líquido. AC IÓ. seudocelómico; y un ejemplar de G. gallus var Hysex Brown de las granjas de El. IC. milagro, para la obtención de la IgY en la yema de huevo.. M UN. 2. PROCEDIMIENTO. CO. 2.1 Obtención de formas adultas de A. suum. A. Y. Ejemplares de A. suum fueron extraídos directamente del intestino de cerdos. RM ÁT. IC. naturalmente infectados y sacrificados en el Camal Municipal de El Porvenir (Trujillo-Perú) e inmediatamente colocados en un frasco con solución salina. IN FO. fisiológica (SSF) tibia, previo lavado para eliminar la materia orgánica, y trasladadas al laboratorio de Helmintología Parasitaria de la Universidad Nacional. DE. de Trujillo. Se diferenciaron las hembras de los machos por su tamaño y forma. EM. AS. terminal de la cola (Anexo 1, 2, 3, 4, 5).. ST. 2.2 Obtención del Líquido Seudocelómico de A. suum. DE. SI. Los 15 ejemplares hembras de A. suum fueron lavadas cuatro veces con SSF. N. estéril y una con SSF más antibióticos (Gentamicina 0.5 ml/ 100 mL y Penicilina. RE CC IO. G sódica 0.5 mL/ 100 mL de 1,000,000 UI); luego en condiciones de esterilidad y con la ayuda de una tijera estéril se procedió a realizar un corte en la parte final de. DI. la cola del parásito y de esta manera se recolectó el Líquido Seudocelómico en un. frasco estéril; el cual fue conservado en refrigeración a -20ºC hasta ser utilizado 23 (Anexo 6, 7).. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.3 Determinación de la concentración de proteínas del Líquido Seudocelómico El Líquido Seudocelómico fue centrifugado a 10,000 rpm por 10 minutos, luego. IC. 2.4 Inmunización de G. gallus y Obtención de Anticuerpos IgY. AC IÓ. concentración de proteínas por el método colorimétrico de Bradford29.. N. se eliminó el sedimento y se utilizó el sobrenadante para determinar la. M UN. Para la obtención de anticuerpos, los antígenos de Líquido Seudocelómico fueron. CO. inoculados en cuatro ocasiones, cada siete días, a un ejemplar de G. gallus var.. Y. Hisex Brown, hembra, por vía subcutánea; la primera inoculación se realizó. IC. A. mezclando 1 mL de adyuvante completo de Freund (que favorece el deposito del. RM ÁT. antígeno en el sitio de inoculación y potencia la inmunogenicidad) con 1 mL de antígeno a una concentración de 250 µg/mL (dilucion de 0.09 mL del antígeno de. IN FO. Líquido Seudocelómico con 3.91 mL de SSF), esta concentración fue obtenida. DE. teniendo en cuenta el resultado de la medición de proteínas por el método de. AS. Bradford; los componentes fueron depositados en un frasco de penicilina estéril. EM. colocado sobre un deposito con hielo y la emulsión fue obtenida de la agitación de. ST. ambos (Anexo 8), a la mezcla se le consideró óptima cuando el agua ya no la. DE. SI. dispersaba; ya obtenida la emulsión se procedió a la inmunización (Anexo 9), para la segunda, tercera y cuarta inoculación también se obtuvo una emulsión,. RE CC IO. N. pero con 1 mL de adyuvante incompleto de Freund y de 1 mL antígeno30. En efecto, se utilizaron los huevos obtenidos del ejemplar cuatro días previos a la. DI. primera inoculación (para usarlos como controles negativos) y los recolectados post cuarta inoculación hasta el noveno día (30 días posteriores a la primera inoculación), esto debido a que los anticuerpos aparecen a partir de la segunda o tercera semana después de iniciada la inmunización y se mantienen constantes y elevados hasta la doceava semana27. Para ello, primero, se liberó a la yema de la 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ovoalbúmina y de la membrana que la recubría, manualmente; luego se les peso por separado y se les agrego el doble de volumen de PBS estéril a 1 x 0.01M, pH 7.2 y homogenizó cuidadosamente; e inmediatamente, 5 mL del homogeneizado. AC IÓ. N. se colocó en tubos de ensayo y se agregó 5 mL de cloroformo en constante agitación, luego se dejó en reposo durante una hora para, finalmente, centrifugar a. IC. 4500 rpm, por 15 minutos, obteniendo una solución con tres fases de las que se. M UN. separó el sobrenadante, y en donde se hallaron los anticuerpos requeridos; este. CO. sobrenadante fue conservado a -20°C hasta su uso30, 31.. RM ÁT. IC. Seudocelómico por la Técnica de Western Blot. de Líquido. A. Y. 2.5 Determinación de los pesos moleculares de los antígenos. La ejecución de la técnica de Western Blot y la preparación de los reactivos se. IN FO. efectuó siguiendo las indicaciones sugeridas por Escalante y col32.. DE. 2.5.1 Preparación de Proteínas de Líquido Seudocelómico. AS. El Líquido Seudocelómico fue preparado a las concentraciones de 0.025. EM. µg/uL y 0.05 µg/µL, una parte de estas concentraciones de Líquido. SI. ST. Seudocelómico fueron tratadas con Dithiothritol (DTT), 0.1% de duodecil. DE. sulfato de sodio (SDS), 6% de glicerol y 0.025% de azul de bromofenol y. N. las partes restantes se prepararon sin DTT; luego, se calentó a 65ºC por 20. RE CC IO. minutos, dejándose enfriar a temperatura de laboratorio (22 ± 1ºC) antes de su uso.. DI. 2.5.2 Electroforesis en gel de poliacrilamida Se realizó los corridos en minigeles de 8 x 7 x 0.05 cm a la concentración del 15% de acrilamida del gel separador y al 3% del gel concentrador. Colocando 15 µL de antígeno en cada uno de los pocillos del gel 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. concentrador. La electroforesis se llevó a cabo a 60V en el gel concentrador por 10 minutos y a 200V en el gel separador por 50 minutos, hasta que el colorante trazador, azul de bromofenol, alcanzo el extremo inferior del gel.. AC IÓ. N. 2.5.3 Transferencia de proteínas. Los componentes proteicos separados en el gel de poliacrilamida fueron. M UN. IC. transferidos al papel de nitrocelulosa en una cámara de electroforesis. CO. horizontal (TRan- Blot Cell, Bio Rad) a 100V por espacio de dos horas y a 4ºC, utilizando un buffer de transferencia constituido por 0.2 mL Tris/HCL. A. Y. pH 8; 20% de metanol y agua destilada. Para ello el gel se unió con el papel. RM ÁT. IC. de nitrocelulosa, y se cubrió con papeles de filtro y esponjas que fueron colocadas con un casquete especial, el cual fue depositado en la cámara de. IN FO. transferencia.. DE. 2.5.4 Revelado enzimático de los antígenos de A. suum. AS. Las tiras de nitrocelulosa fueron incubadas con las muestras de IgY, de. EM. huevos recolectados antes de la primera inmunización y de huevos post. SI. ST. cuarta inmunización, las cuales fueron diluidas 1/50 en PBS/Tween-20 y. DE. leche descremada a la dilución de 5%. El volumen de la muestra por canal. N. de placa de incubación fue de 0.5mL. Las tiras se incubaron en agitación. RE CC IO. constante a temperatura ambiente por una hora, luego se lavaron tres veces con PBS/Tween-20, a temperatura ambiente por 5 minutos en agitación. DI. constante. Posteriormente, se adiciono 0.5ml de conjugado enzimático (Anti chicken IgY conjugated-Sigma) por tira a la dilución de 1/1000 en PBS/Tween-20 al 0.3%, los cuales se mantuvieron en agitación constante por una hora y luego se realizaron tres nuevos lavados con PBS/Tween-20 pH 7.2 y dos lavados con PBS, por 5 minutos cada lavado a temperatura de 10. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. laboratorio (22 ± 1ºC) en agitación constante. Para revelar las bandas antigénicas se adiciono 500 µL de la solución de sustrato (H202 al 0.01% y diaminobenzidina a la concentración de 0.5 mg/mL y 10 mL de PBS) y se. AC IÓ. N. incubó por 10 minutos, la reacción fue detenida adicionando agua destilada. 2.5.5 Determinación de pesos moleculares de cada una de las bandas. M UN. IC. antigénicas. CO. La determinación de los pesos moleculares de cada una de las bandas antigénicas de las proteínas de Líquido Seudocelómico, se realizó por. A. Y. comparación con las bandas de las proteínas del marcador de bajo peso. RM ÁT. IC. molecular (Low Range, Ewigh Standard; Bio Rad), el cual incluye las siguientes proteínas: Fosforilasa b (97.4 KDa), albúmina sérica (66.2 KDa),. IN FO. ovo albúmina (45.0 KDa), anhidrasa carbónica (31.0 KDa), inhibidor de la. DE. tripsina (21.5 KDa) y lisozima (14.4 KDa); de esta manera se determinó el. AS. peso molecular relativo de los antígenos, para lo cual se encontró la. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. movilidad relativa (Rf) del marcador y de los antígenos en estudio.. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. III.. RESULTADOS. Del Liquido seudocelómico de 15 ejemplares hembras que fue centrifugado a. AC IÓ. N. 10,000 rpm por 10 minutos, se obtuvo 7.5 mL de sobrenadante, el cual tuvo una concentración de proteínas de 10,700 µg/mL.. M UN. IC. Los pesos moleculares de las proteínas de A. suum obtenidas a las concentraciones de 0.05 µg/uL y 0.025 µg/µL y tratadas con DTT fueron: 101.0, 94.9, 65.0, 61.1, 50.6,. CO. 45.0, 41.5, 34.6, 22.4, 16.3, 14.4, 12.7-10.5 KDa; mientras que, los pesos moleculares. A. Y. de los proteínas a las concentraciones de 0.05 µg/µL y 0.025 µg/µL que no se trataron. RM ÁT. IC. con DTT fueron: 101.0, 94.9, 65.0, 61.1, 50.6, 45.0, 41.9, 34.6, 27.0, 25.4, 21.0, 18.5,. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. 16.3, 14.4, 11.2 KDa.. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. C 0.025µg/mL 0.05µg/mL. 101 94.9 65. 41.5 34.6. 41.5 34.6. 61.1 50.6 45. 31 27. CO. Y. 22.4. 21.5. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. 16.3 14.4 12.7 10.5. 14.4. 25.4 21.5 18.5 16.3 14.4 11.2. AC IÓ. 45. 101 94.9 65 61.1 50.6 45. IC. 97.4 66.2. D. N. B 0.025µg/mL 0.05µg/mL. M UN. A. DE. SI. Fig 1. Pesos moleculares de bandas antigénicas del Líquido Seudocelómico de. N. ejemplares hembras de Ascaris suum detectadas por IgY producidas en Gallus Gallus. RE CC IO. mediante la técnica de Western Blot. FF A: PM (KDa). DI. B: Antígenos del Líquido Seudocelómico con Dithiothreitol (DTT) C: Antígenos del Líquido Seudocelómico sin Dithiothreitol (DTT) D: Control pre-inmune. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IV.. DISCUSIÓN. La utilización de G. gallus como modelo experimental para la producción de anticuerpos anti-antígenos de Líquido Seudocelómico de ejemplares hembras de A.. AC IÓ. N. suum representa una alternativa interesante para la obtención de anticuerpos a partir de la yema de huevo; debido a que la ventaja de este método es que una vez inmunizada la. M UN. IC. gallina se cuenta con una fuente consistente de anticuerpos frescos durante todo el ciclo de postura del animal; esto debido a que el comportamiento inmunológico de las aves es. CO. más uniforme que el de los mamíferos (conejos, cobayos, etc); porque siempre muestran. A. Y. niveles relativamente elevados de anticuerpos para el caso de inmunógenos peptídicos,. RM ÁT. IC. lo cual ha sido comprobado por otros autores, por lo tanto esto representa una manera práctica y económica para la obtención de anticuerpos33.. IN FO. El volumen de antígenos depende del tamaño y cantidad del parasito, cuando se utilizan como fuente larvas para obtener productos de excreción-secreción se requiere. DE. miles de larvas, mientras que al usar las formas adultas se requiere de menor cantidad;. AS. sin embargo, la cantidad producida es escasa; frente a esto el uso de líquido. EM. seudocelómico resulta ventajoso, porque, se necesitan pocos ejemplares adultos y se. SI. ST. obtiene una mayor cantidad de volumen34. Otro aspecto a mencionar, es que los. DE. productos de excreción-secreción necesitan de un medio mínimo esencial, una. RE CC IO. N. incubadora, la cantidad de tiempo en el que se dispone y por último la sonisacion con un sonicador para la obtención de los antígenos totales; por el contrario el líquido seudocelómico se obtiene como tal y solo se requiere centrifugar23, 34.. DI. La inmunización se realizó por medio de la vía subcutánea teniendo en cuenta. estudios anteriores donde se compararon la producción de anticuerpos al realizar inmunizaciones tanto en vía subcutánea como por vía intramuscular, en donde demostraron que no existen diferencias entre estas vías de inmunización27.. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Se utilizó el adyuvante completo de Freund en la primera inmunización, y el adyuvante incompleto de Freund en las tres restantes para potenciar la inmunogenicidad de la gallina durante la inmunización experimental21, 35. De esta manera se hace más. N. efectiva la respuesta inmune, asegurando un mayor nivel de producción de anticuerpos. AC IÓ. específicos para obtener buenas lecturas en el resultado 35.. IC. La IgY es una inmunoglobulina presente en cantidades significativas en la yema de. M UN. huevo; estas proteínas son transportadas desde el suero durante la maduración de la. CO. yema en el oviducto por un mecanismo similar a la transferencia placentaria que ocurre. Y. en los mamíferos; esto resulta en mayores concentraciones de IgY en la yema que en el. IC. A. suero de la gallina24. Las ventajas del uso de la IgY frente a la IgG, es que no producen. RM ÁT. daño en el animal para su formación y es de fácil extracción debido a que se encuentran. IN FO. en mayor cantidad que otras proteínas en la yema, entonces no es necesario el uso de sulfato de amonio para precipitar las proteínas36. El método de deslipidacion empleado. DE. es eficiente debido a que no produce daño alguno sobre las proteínas, tampoco requiere. AS. ambientes exigentes porque el volumen empleado de cloroformo es bajo 30.. EM. La técnica de Western Blot tiene elevada sensibilidad (93%), porque detecta los. SI. ST. complejos antígenos-anticuerpos mediante la técnica de Elisa; y también presenta. DE. elevada especificidad (100%) debido a que fracciona los componentes proteínicos del. N. antígeno37, 38. Debido a estas razones, esta técnica ha sido utilizada para determinar los. RE CC IO. antígenos producidos de varios helmintos como por ejemplo: Taenia solium32, Toxocara. canis34, Cysticercus tenuicollis36, Hymenolepis nana37 y Fasciola hepatica39.. DI. Se utiliza SDS (duodecil sulfato) que es una sal sódica que se une a las proteínas y. les confiere carga negativa, betamercaptoetanol que reduce cualquier puente disulfuro, glicerol que aumenta la densidad y ayuda a mantener estable la muestra, y azul de bromofenol que es el marcador y tiene movilidad superior a las proteínas de la muestra,. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. se utiliza como marcador del frente de la electroforesis, que en principio garantiza que por detrás se encuentren las proteínas e indica cuando se debe de interrumpir la electroforesis38, 40, 41.. AC IÓ. N. El líquido seudocelómico fue sometido a un tratamiento con un agente reductor, Dithiothreitol (DTT), de puentes disulfuro; esto con la finalidad de desnaturalizar las. M UN. IC. proteínas y transformar las estructuras complejas en estructuras simples. Sin embargo al procesar las proteínas del Líquido seudocelómico sin DTT se obtuvo bandas mejor. CO. definidas que las bandas del líquido seudocelómico con DTT; esto significa que los. A. Y. antígenos del Líquido seudocelómico del parásito son mayormente proteínas simples23.. RM ÁT. IC. La evidencia ausencia de algunas de las bandas antigénicas al utilizar las mismas concentraciones puede deberse a la acción desnaturalizante del DTT, ya que afecta a las. IN FO. proteínas, exponiendo sus epitopes, para facilitar su interacción con los anticuerpos, teniendo como consecuencia la aparición de nuevas bandas, o simplemente pueden. DE. alterar los epitopes de las proteínas y por ende desaparecer la banda antigénica al ser. EM. AS. revelada34.. ST. De las bandas determinadas, algunas de ellas han sido detectadas o están. SI. estrechamente relacionadas con otras investigaciones. El antígeno de peso molecular. DE. 14.4 KDa es una proteína compartida con A. lumbricoides ya sea utilizando la forma. RE CC IO. N. adulta o el extracto de sus órganos reproductores como fuente de antígenos17, o bien estrechamente relacionada con el antígeno 14.9 KDa presente en las larvas. DI. pulmonares21. Sin embargo no es una proteína especifica de A. suum porque se le ha detectado también en investigaciones realizadas con Toxocara canis (14.1 KDa). 34. . La. banda de 16.3 KDa es similar a la de 16KDa presente en el estadio larvario tres, para la cual se ha creado un recombinante AS16 reportándose como protector contra la migración de larva tres21,. 34. . Las proteínas de 21.5, 50.6 KDa coinciden con otra 16. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. investigación donde se ha trabajado con extractos de órganos reproductores y cutícula de A. suum17, y las bandas de 18.5, 25.4 KDa coinciden con los antígenos de excreciónsecreción determinados por Ramirez L22. La banda cuyo peso es de 34.6 KDa ha sido. N. detectada como antígeno de excreción-secreción de larvas de estado tres y también en. AC IÓ. antígenos somáticos21. Los antígenos de peso de 41.9 y 45 KDa están dentro del rango. IC. de los antígenos cuticulares de A. suum los cuales están comprendidos entre 36 a 47. M UN. KDa42. Sin embargo, los antígenos de peso de 22 y 27KDa son proteínas que no son. CO. especificas de A. suum, porque otros autores las han determinado en infecciones. Y. producidas por Anisakis simplex; por lo tanto su detección tiene muy poco valor en el. IC. A. diagnostico porque podría dar lugar a reacciones cruzadas43, 44. Igualmente las proteínas. RM ÁT. de 61.1 y 65.0 KDa son responsables de reacción cruzada con Toxocara cannis;. trabajo de. IN FO. porque se encuentran dentro del rango 55-66 KDa, el cual ha sido determinado por el Nunes y col45; otros autores también han mencionado que estos dos. DE. helmintos tienen varias bandas antigénicas comunes como Espinoza y col46.. EM. AS. La no presencia de bandas antigénicas al hacer la evaluación pre-inmune se debe a. ST. que los anticuerpos anti-antígenos no están presentes en ese fluido y por lo tanto cuando. SI. se enfrentan a los antígenos de líquido seudocelómico no se produce reacción antígeno-. DE. anticuerpo47. Las bandas encontradas que solo aparecen en otros trabajos es debido a. RE CC IO. N. que los sueros con los que trabajan solo contienen algunas fracciones de antígenos de parasito y cada individuo tiene una respuesta inmune diferente, las condiciones del. DI. trabajo, al marcador de peso y a otros factores inherentes36.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. V.. CONCLUSION. De acuerdo a los resultados obtenidos se concluye que:. AC IÓ. N. El Líquido Seudocelómico de A. suum contiene proteínas antigénicas capaces de inducir la producción de anticuerpos, IgY; que al ser tratados con DTT. M UN. IC. previamente a realizar la técnica de Western Blot, permite la visualización de 12 bandas antigénicas, cuyos pesos moleculares fueron: 101.0, 94.9, 65.0,. CO. 61.1, 50.6, 45.0, 41.5, 34.6, 22.4, 16.3, 14.4, 12.7-10.5 KDa; y en caso de no. A. Y. ser tratados con DTT evidencian la aparición de 15 bandas antigénicas con. RM ÁT. IC. pesos moleculares de: 101.0, 94.9, 65.0, 61.1, 50.6, 45.0, 41.9, 34.6, 27.0,. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. 25.4, 21.0, 18.5, 16.3, 14.4 y 11.2 KDa. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 9. Inatomi Y, Murakami T, Tokunaga M, Ishiwata K, Nawa Y, Uchino M. Encephalopathy caused by visceral larva migrans due to Ascaris suum. J Neurol Sci. 1999; 164(2): 195-199.. AC IÓ. N. 10. Diez C. Sensibilización frente a antígenos de Parásitos responsables de. M UN. Santiago de Compostela. Facultad de Veterinaria de Lugo; 2011.. IC. Helmintozoonosis y Artritis Reumatoide [Tesis Doctoral]. Lugo. Universidad de. CO. 11. Scott ME. Ascaris lumbricoides: Una revisión de su epidemiologia y su relación. Y. con otras infecciones. Ann Nestle [Esp]. 2008; 66: 7-22.. IC. A. 12. Delgado V, Liñán RM. Alteraciones clínicas y Tisulares producidas por larvas. RM ÁT. de Ascaris suum en Mus musculus var. Albinus infectados experimentalmente.. IN FO. Cienc Desarro. 2004; 8: 36-39.. 13. Sinniah B. Daily egg production of Ascaris lumbricoides: the distribution of. DE. eggs in the feces and the variability of egg counts. Parasitology. 1982; 84(1):. AS. 167-75.. EM. 14. Leles D, Gardner SL, Reinhard K, Iñiguez A, Araujo A. Are Ascaris. SI. ST. lumbricoides and Ascaris suum a single species?. Parasit Vectors. 2012; 5: 42.. DE. 15. Sánchez J. Etiología y epidemiologia de la ascariosis porcina. Mundo ganadero.. RE CC IO. N. 2002; (145): 42-48. 16. Zhu X, Chilton NB, Jacobs DE, Boes J y Gasser RB. Characterisation of. DI. Ascaris from human and pig hosts by nuclear ribosomal DNA sequences. Int J Parasitol. 1999; 29(3): 469-478.. 17. Alba JE, Comia MN, Oyong G, Claveria F. Ascasis lumbricoides and Ascaris suum: A comparison of electrophoretic banding patterns of protein extracts form the reproductive organs and body wall. Vet Arhiv. 2009; 79(3): 281-291. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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(37) RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. ANEXOS. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. Anexo 1: Ejemplares Machos y Hembra de A. suum. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) CO. M UN. IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IN FO. Macho. DE. SI. ST. EM. AS. DE. Parte terminal de la cola. RM ÁT. IC. A. Y. Hembra. Macho de A. suum. DI. RE CC IO. N. Anexo 2: Comparación del tamaño y forma terminal de la cola entre Hembra y. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Anexo 3: Parte Anterior - Labios de A. suum. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. DE. IN FO. RM ÁT. Anexo 4: Extremo Posterior de la Hembra de A. suum. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. e. DI. Anexo 5: Extremo Posterior del Macho de A. suum enroscado ventralmente, y con presencia de espícula (e).. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DI. RE CC IO. N. DE. Anexo 6: Lavado de los Ejemplares Hembras de A. suum en SSF. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DI. RE CC IO. N. DE. Anexo 7: Recolección de Líquido Seudocelómico. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 1 mL de Antigeno a 250 µg/mL. Agitación de ambos componentes. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. 1 mL de Adyuvante de Freund. de Freund, para la inmunización.. DI. RE CC IO. N. Anexo 8: Preparación de la Emulsión, de Líquido seudocelómico con el adyuvante. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(45) EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. Anexo 9: Inmunización del ejemplar G. gallus por vía sub cutánea.. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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