Determinación de bacterias presentes en la rizósfera de Opuntia ficus indica var inermis en suelos áridos de Tumbes, Perú
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(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC. Dr. Orlando Gonzales Nieves. AS. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. BI O. LO G. RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. S. Dr. RÚBEN VERA VÉLIZ. DE. CI. EN. CI A. VICE RECTOR ACADÉMICO. Dr. WEYDER PORTOCARRERO CÁRDENAS. BI B. LI. OT E. CA. VICERRECTOR DE INVESTIGACIÓNICERRECTORA ACADÉMICO. SECRETARIO GENERAL DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Dr. Steban Ilich Zerpa. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC. AS. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS. LO G. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. CI A. S. BI O. Dr. Marco Leoncio Salazar Castillo. EN. SECRETARIO GENERAL DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. OT E. CA. DE. CI. Dr. Santos Enrique Padilla Sagastegui. Dr. Manuel Roberto Rodriguez Lacherre. BI B. LI. DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICOPROFESIONAL DE BIOLOGÍA. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA. AS. Con todo mi corazón y desde lo profundo de mi ser a Jehová Rey nuestro y Dios. IC. nuestro, por estar a mi lado siempre, guiándome, sosteniéndome, fortaleciéndome,. LO G. alimentando mi alma y brindándome su amor infinito, gracias a él por brindarme la profundidad de vivir, por contar con cada uno de mis seres queridos y lograr la. S. BI O. excelencia profesional, este trabajo es completamente suyo.. CI A. Con un inmenso amor y una eterna gratitud a mis padres Josefa y Mauro, por su amor, comprensión, paciencia, esfuerzo y fe en cada cosa que hago, con su ejemplo. BI B. LI. OT E. CA. DE. CI. EN. de vida pude seguir adelante. Este trabajo es suyo porque ustedes lo hicieron posible.. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTO. AS. A mi profesor Dr. Julio Chico Ruíz por haber brindado su amistad y orientación. IC. con mucho profesionalismo y paciencia, por compartir sus conocimientos, los. LO G. cuales hicieron realidad este trabajo.. BI O. Mi más sincero agradecimiento al Mc. Bernabé Luis Alaya por brindarme su apoyo incondicional en el presente informe de investigación, por la paciencia y. EN. CI A. S. el tiempo dedicado y por compartir sus conocimientos hacia mi persona.. A todo el equipo de la empresa INCA BIOTEC SAC que son mi segunda. CI. familia, en especial al equipo técnico y al grupo CACTUS, gracias por su. Gracias por todo y que Dios los bendiga siempre.. BI B. LI. OT E. CA. DE. amistad y el apoyo brindado para la realización de este proyecto.. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN En cumplimiento con las normas establecidas en el reglamento de grados y títulos que exige la Facultad de Ciencia Biológicas de la Universidad Nacional. AS. de Trujillo, se somete a vuestra consideración el siguiente proyecto de tesis. LO G. IC. titulado:. “Determinación de bacterias presentes en la rizósfera de Opuntia ficus-indica. Trujillo, Enero del 2016. Mendez Farroñan Sandra Johana. BI B. LI. OT E. CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI O. var. inermis en suelos áridos de Tumbes, Perú.”. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. LO G. IC. AS. MIEMBROS DEL JURADO. --------------------------------------------. CI A. S. PRESIDENTE. BI O. Dr. Eloy López Medina. --------------------------------------------. EN. Dr. Roger Veneros Terrones. BI B. LI. OT E. CA. DE. CI. SECRETARIO. -----------------------------------------------Dr. Julio Chico Ruiz. VOCAL. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN. Los profesores que suscriben, miembros del Jurado dictaminador, declaran que el presente. AS. Informe de Tesis titulado: ““Determinación de bacterias presentes en la rizósfera de. IC. Opuntia ficus-indica var. inermis en suelos áridos de Tumbes, Perú.”, ha. BI O. LO G. cumplido con los requisitos formales y fundamentales, siendo APROBADA por UNANIMIDAD.. S. --------------------------------------------. CI A. Dr. EloY López Medina. DE. CI. EN. PRESIDENTE. Dr. Roger Veneros Terrones. SECRETARIO. BI B. LI. OT E. CA. --------------------------------------------. -----------------------------------------------Dr. Julio Chico Ruiz VOCAL viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONTENIDO AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO…………… ii. AS. AUTORIDADES DE LA FACULDAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS……………..iii. IC. DEDICATORIA………………………………………………………………………...iv. LO G. AGRADECIMIENTO……………………………………………………………….….v. BI O. PRESENTACIÓN………………………………………………………………….… vi MIEMBROS DE JURADO………………………………………………………...…vii. CI A. S. APROBACION .………………………………………………………………………viii CONTENIDO…………………………………………………………………..………ix. EN. LISTA DE TABLAS …………………………………………………………..………xi. CI. LISTA DE FIGURAS……………………………………………………………...…xiii. DE. RESUMEN …………………………………………….………………………….....xvi. CA. ABSTRACT……………………………………………………………………..……xvii. OT E. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………...1. LI. MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………………12. BI B. RESULTADOS……………………………………………………………………….20 DISCUSIÓN…………………………………………………………………………..34 CONCLUSIÓN………………………………………………………………………..39 RECOMENDACIONES……………………………………………………………...40. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………………..41. BI B. LI. OT E. CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI O. LO G. IC. AS. ANEXOS………………………………………………………………………………54. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. LISTA DE TABLAS Tabla 1. Parámetros físico – químicos considerados en el análisis de las muestras de suelo de los diferentes puntos de muestreo………………………20. AS. Tabla 2. Bacterias cultivables presentes en la rizósfera de O. ficus-indica en el. IC. distrito de Corrales…………………………..………………………………………21. LO G. Tabla 3. Bacterias cultivables presentes en la rizósfera de O. ficus-indica en el. BI O. distrito de Cabuyal…………………………………………………………………...22 Tabla 4. Bacterias cultivables presentes en la rizósfera de O. ficus-indica en el. CI A. S. distrito de Casitas……………………………………………………………………23 Tabla 5. Bacterias cultivables presentes en la rizósfera de O. ficus-indica en el. EN. distrito de Uña de Gato……………………….…………………………………….24. CI. Tabla 6. Bacterias cultivables presentes en la rizósfera de O. ficus-indica en el. DE. distrito de Puerto Pizarro…………………………………………………………..24 Tabla 7. Porcentaje de abundancia de las bacterias presentes en la rizósfera O.. ficus-indica. CA. de. del. distrito. de. Corrales,. obtenido. mediante. OT E. metagenómica………………………………………………………………………..61 Tabla 8. Porcentaje de abundancia de las bacterias presentes en la rizósfera. BI B. LI. de O. ficus-indica del distrito de Cabuyal, obtenido mediante metagenómica y clasificado en familia, género y especie…………………………………………..67 Tabla 9. Porcentaje de abundancia de las bacterias presentes en la rizósfera de O. ficus-indica del distrito de Casitas, obtenido mediante metagenómica…68. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 10. Porcentaje de abundancia de las bacterias presentes en la rizósfera de O. ficus-indica del distrito de Uña de Gato, obtenido mediante metagenómica………………………………………………………………………..89. AS. Tabla 11. Porcentaje de abundancia de las bacterias presentes en la rizósfera. IC. de O. ficus-indica del distrito de Puerto Pizarro, obtenido mediante. BI B. LI. OT E. CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI O. LO G. metagenómica………………………………………………………………………98. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Localización de las áreas de muestreo……………………………..12. AS. Figura 2. Extracción del ADN de las muestras de suelo, empleando el Kit. IC. Power Soil…………………………………………………………………………….15. rizósfera. de. O.. ficus-. indica. obtenida. LO G. Figura 3. Porcentaje de diversidad bacteriana a nivel de género presente en la mediante. metagenómica,. BI O. correspondiente al Distrito de Cabuyal.……………………………………………25 Figura 4. Porcentaje de diversidad bacteriana a nivel de género presente en la O.. ficus-. indica. obtenida. S. de. mediante. metagenómica,. CI A. rizósfera. correspondiente al Distrito de Corrales.…………………………………………...26. EN. Figura 5. Porcentaje de diversidad bacteriana a nivel de género presente en la. CI. rizósfera de O. ficus- indica obtenida mediante metagenómica, correspondiente. DE. al Distrito de Casitas..........................................................................................27 Figura 6. Porcentaje de diversidad bacteriana a nivel de género presente en la de. O.. ficus-. CA. rizósfera. indica. obtenida. mediante. metagenómica,. OT E. correspondiente al Distrito de Uña de Gato…....…………………………………28 Figura 7. Porcentaje de diversidad bacteriana a nivel de género presente en la de. O.. ficus-. indica. obtenida. mediante. metagenómica,. BI B. LI. rizósfera. correspondiente al Distrito de Puerto Pizarro.…………………………….………29. Figura 8. Distribución de los dominios presentes en la rizósfera de Opuntia ficus – indica mediante metagenómica y analizados por MG-RAST……...……30. xiii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Figura 9. Distribución del Phylum bacteria presente en la rizósfera de Opuntia ficus – indica identificados por metagenómica empleando el programa MG – RAST…………………………………………………………………………..31. AS. Figura 10. Metagenoma de la rizósfera de Opuntia ficus – indica. Se clasificó y. IC. visualizó utilizando MG – RAST………………………………………………….32. LO G. Figura 11. . Curva de rarefacción y diversidad alfa de los cinco puntos de muestreo de la rizósfera de Opuntia ficus–indica. Se utilizó el programa MG –. BI O. RAST……….…………………………………………………………………………33. CI A. S. Figura 12. Preparación del material para la toma de muestra………………….53 Figura 13. Toma de muestra de la rizósfera de Opuntia ficus – indica en el. EN. distrito de Casitas…………………………………………………………..……..…53. CI. Figura 14. Siembra de bacterias…………………………………………….…….54. DE. Figura 15. Purificación de bacterias…………………………………………..…..54. CA. Figura 16. Bacterias purificadas sembradas en caldo nutritivo…………….....55. OT E. Figura 17. Vista al microscopio de las bacterias purificadas……………..…...55 Figura 18. Extracción de ADN de las bacterias presentes en la rizósfera.….56. BI B. LI. Figura 19. Termociclador con el programa 16S para bacterias……………….56 Figura 20. Depositando las muestras de ADN en gel de agarosa para el corrido electroforético………………………………………………………………….……57 Figura 21. Electroforesis en gel de agarosa al 1.5% (p/v) del ADN bacteriano de la rizósfera de las muestras de Casitas……………………………………….57. xiv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Figura. 22.. Muestras. de. amplicón. de. ADN. listos. para. enviar. a. secuenciar…………………………………………………………………………..58. AS. Figura 23. Kit Power Soil para la extracción de ADN por Metagenómica……58 Figura 24. Electroforesis en gel de agarosa al 1.5% (p/v) del ADN bacteriano. LO G. IC. obtenido por Metagenómica…………………………………………………….…59. BI B. LI. OT E. CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI O. Figura 25. Resultados de la secuenciación de las bacterias……………..…..60. xv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN Las investigaciones sobre la microbiota existe en la rizósfera de las plantas y sus propiedades benéficas en el desarrollo y promoción del crecimiento de las. AS. mismas, han sido actualmente temas preferidos por investigadores, por lo que. IC. el objetivo de la presente investigación se orienta a determinar las bacterias. LO G. presentes en la rizósfera de Opuntia ficus - indica en suelos áridos de Tumbes, Perú. El material biológico procedió de la rizósfera de Opuntia ficus - indica. El. BI O. cultivo de las cepas aisladas se procesó en Tripticase Soy Broth y Luria Bertani, a las cuales se le hizo extracción de ADN, luego se aplicó la técnica. CI A. S. de la PCR; con lo que se obtuvieron los amplicones de las muestras tratadas; por último se realizó la electroforesis y la respectiva secuenciación por el gen. EN. 16S ADNr, y por el método de metagenómica se identificó las bacterias. CI. cultivables y no cultivables presentes en la rizósfera; el análisis de los datos se. DE. hizo mediante el programa MG – RAST, se consultó con BLAST del NCBI para la identificación de la especie, se concluye que se logró identificar 46 especies. CA. de bacterias cultivables presentes en la rizósfera de Opuntia ficus – indica,. OT E. mediante metagenómica se logró la identificación de las bacterias nativas cultivables y no cultivables presentes en la rizósfera, encontrándose cerca de. LI. 600 géneros por punto de muestreo.. BI B. Palabras clave: rizósfera, Opuntia ficus - indica, metagenómica.. xvi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT Research on the microbiota exists in the rhizosphere of plants and their beneficial effects on the development and promotion of growth thereof, have. AS. now been favorite subjects for researchers, so that the objective of this research. IC. is aimed at determining bacteria present in the rhizosphere of Opuntia ficus-. LO G. indica in arid soils of Tumbes, Peru. The biological material came from the rhizosphere of Opuntia ficus - indica. The cultivation of isolates processed in. BI O. Trypticase Soy Broth and Luria Bertani, to which was made DNA extraction, then the PCR technique was applied; whereby the amplicons of the treated. CI A. S. samples were obtained; Finally respective electrophoresis and sequencing the 16S rDNA was performed, and the method of metagenomics cultivable and. EN. non-cultivable bacteria was identified in the rhizosphere; The data analysis was. CI. done using the program MG- RAST were consulted BLAST of NCBI to identify. DE. the species, it is concluded that was possible to identify 46 species of cultivable bacteria in the rhizosphere of Opuntia ficus - indica, using metagenomics. about. 600. genera. per. sampling. point. was. achieved.. OT E. being. CA. identification of arable and non-arable these native bacteria in the rhizosphere,. BI B. LI. Keywords: rhizosphere, Opuntia ficus-indica, metagenomics.. xvii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCIÓN La desertificación es un problema ambiental que afecta de manera significativa a la población en el mundo y en particular a los. AS. pobres que ocupan parte importante de las zonas áridas. En el Perú, se. IC. tiene 40% de la superficie del país desertificada (MINAM, 2011) y el. LO G. 24% se encuentra en proceso de desertificación (INRENA, 2006). Sin embargo, el conocimiento sobre el tema y su incorporación en las. BI O. políticas públicas es limitado (Gómez, 2008).. S. La desertificación en el Perú, es un problema crítico y creciente,. CI A. debido a la pérdida de la capacidad productiva del suelo en zonas de producción agrícola. El Perú tiene 3,862,786 hectáreas desertificadas, a. EN. lo cual se suma 30,522,010 hectáreas en proceso de desertificación. CI. (INRENA, 2006). Una parte importante de la desertificación se encuentra. DE. en la costa norte, la cual es un área importante de producción agrícola para agroexportación.. Las zonas áridas, sub áridas y áridas sub. CA. húmedas reciben apenas el 2% de la precipitación pluvial que cae en el. OT E. país (Gómez, 2008).. LI. El análisis de la desertificación cobra importancia por las. BI B. consecuencias económicas y sociales que genera sobre todo en el sector agrícola, el cual es un sector intensivo en mano de obra y donde la población de bajos ingresos es la más vulnerable a este problema ambiental (Gómez, 2008).. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La agricultura es el sector económico en el que la escasez de agua tiene más relevancia. En la actualidad, la agricultura es responsable del 70% de las extracciones de agua dulce y más del 90%. AS. de su uso consuntivo. Bajo la presión conjunta del crecimiento de la. IC. población y de los cambios en la dieta, el consumo de alimentos está. LO G. aumentando en casi todas las regiones del mundo. Convirtiéndose en no sólo una causa, sino también una víctima de la escasez de agua. BI O. (MINAM, 2011).. El desarrollo de la agricultura de desierto, es decir el uso de. CI A. S. plantas que tengan elevada capacidad de uso eficiente de agua (EUA) las cuales puedan adaptarse a los suelos áridos y semiáridos, es poco. EN. conocida (Alary y col., 2007), además la investigación sobre el uso de. CI. microorganismos benéficos asociados a la rizósfera de las plantas ha. DE. sido pobremente desarrollada en nuestro país (Marasco y col., 2012,. CA. Schmidt y col., 2014).. De lo expuesto, es necesario destacar la relación que existe entre. OT E. agricultura desertificación y pobreza. Diversos estudios señalan que más que identificar si los pobres causan desertificación o si la. LI. desertificación incrementa la pobreza, es un hecho que los pobres son. BI B. los más afectados por la desertificación debido a que ellos son altamente dependiente de la agricultura y por ende de la productividad de la tierra para su sostenimiento (Hazell y col., 2002, tomado de Winslow, 2004).. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Uno de los principales cultivos en las zonas áridas y semiáridas que se ha venido implementando en muchos países es el cultivo de cactáceas, en años recientes, se han intensificado las plantaciones para. AS. fruta o producción de forraje, así como para vegetales o nopalitos y. IC. cochinilla, en muchos países de África, América, Asia y Europa. Hay un. LO G. creciente interés por Opuntia, con énfasis en O. ficus-indica, y en el importante papel que desempeñan y seguramente seguirán proponiendo. BI O. para el éxito de sistemas agrícolas sustentables en zonas áridas y semiáridas, donde agricultores y ganaderos deben concentrarse en. S. aquellas especies que pueden no solo sobrevivir sino producir. CI A. económicamente. Así, O. ficus-indica, se ha convertido en un recurso de. EN. productos y usos, inicialmente como planta silvestre, y después, como cultivo de subsistencia y comercial; contribuyendo a la seguridad. CI. alimenticia de poblaciones en áreas agrícolas marginadas (Nobel, 2002;. DE. Reynolds, 2003; Alary y col., 2007).. CA. Los cactus son plantas suculentas en gran mayoría espinosas. OT E. miembros de la familia Cactaceae, única representante del orden Cactales, incluye 130 géneros y 2000 especies (Shedbalkar, 2010); se. LI. divide en cuatro subfamilias: Pereskioideae (monogenérica; especies. BI B. provistas de hojas bien formadas), Opuntioideae (a la que pertenece Opuntia), Maihuenioideae (monogenérica; especies restringidas a. Argentina y Chile) y Cactoideae (la de mayor número de especies) (Anderson, 2001; Wallace, 1995; Wallace y col., 2002; Nobel, 2002). En el Perú se han registrado 40 géneros, de los cuales 11 son endémicos,. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 262 especies de las cuales 81% son endémicos, es decir sólo se encuentran en nuestro país, formando parte de nuestra rica flora. AS. silvestre (Ostolaza, 2014). Actualmente Opuntia es cultivado para producción de fruta en. IC. Perú, Chile, Italia, México, EUA y existe interés por cultivarlo en muchos. LO G. otros países. Su principal ventaja fisiológica es la alta eficiencia de uso del agua (Saenz, 2000). La experiencia de Brasil ha demostrado que la. BI O. utilización de Opuntia como forraje es más sencilla de integrar en los sistemas agrícolas de las regiones semiáridas, donde su cultivo para. CI A. S. forraje data de principios del siglo XX y en la actualidad existen más de 300 000 Ha plantadas (Russell, 1990). Opuntia se adapta a una gran. EN. variedad de condiciones de cultivo, pero la productividad en su hábitat. CI. natural es limitada por la sequía y la mala calidad de los suelos, por ello. DE. se realizan esfuerzos para la mejora del cultivo usando prácticas agrícolas eficiente como la utilización microorganismos promotores del. CA. crecimiento (Gómez, 2008).. OT E. Los Cactus, y específicamente Opuntia ficus-indica var. inermis.. han sido extremadamente útiles como forraje para el ganado en épocas. LI. de sequía, principalmente por el suministro de energía digestible, agua y. BI B. vitaminas, las cuales han mostrado impactos positivos en la producción. de leche, ganancia de peso y crecimiento del ganado alimentado con este recurso. Aunque se utiliza principalmente para el ganado, Opuntia. también se ha utilizado como forraje para cerdos. (Cordeiro y Gonzaga, 2003). 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Para. conseguir convertir los suelos áridos en tierras arables,. requerimos de una visión global de todo el ecosistema e interacción planta-microorganismos, así la agricultura de desierto se ha convertido. AS. en una fuerte área de crecimiento de agricultura en todo el mundo, sin. IC. embargo la diversidad microbiana del suelo, las cuales son responsables. LO G. de los microecositemas y sanidad vegetal, aun es poco conocida. Basados sobre adaptaciones genéticas, fenotipicas y fisiológicas de las. BI O. plantas y su adaptación en suelos áridos los cactus se presentan como una alterativa para iniciar la agricultura de desierto (Nobel, 2002; Kobert. CI A. S. y col., 2011, Marasco y col., 2012,). La rizósfera es el ambiente que está bajo la influencia de las. EN. raíces de las plantas, donde existe un flujo de compuestos orgánicos. CI. producto de la fotosíntesis que son exudados por la raíz (Loredo y col.,. DE. 2004; Gómez y col, 2012). Desde que Hiltner la definió en 1904, se han realizado grandes avances en la investigación, que reconocen el papel. CA. que tienen los microorganismos rizosféricos en el crecimiento de las. OT E. plantas. La rizósfera es el hábitat ecológico en el cual los microorganismos están en contacto directo con la raíz de las plantas y. LI. es el sitio donde se dan diversas interacciones, como: competencia,. BI B. mutualismo, comensalismo, amensalismo, predación y parasitismo. Dependiendo del tipo de relación con la planta, los microorganismos pueden ser benéficos o nocivos. Muchos aspectos importantes de las interacciones suelo-planta son mediados por los procesos de la rizósfera, incluyendo la adquisición de nutrimentos por la planta, la. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. colonización de las raíces por los microorganismos y la descomposición de la materia orgánica (Gómez y col., 2012).. AS. Durante la mayor parte de la historia de la vida, los microorganismos eran los únicos habitantes en la tierra, y siguen. IC. dominando el planeta en muchos aspectos. La vida microbiana era. LO G. esencial para la evolución de la vida y tiene un papel importante en humanos, la salud, la agricultura, el funcionamiento de los ecosistemas y. BI O. los ciclos geoquímicos globales (Whitman, 1998); dentro de estos microorganismos se encuentran las bacterias, en especial las llamadas. CI A. S. bacterias promotoras de crecimiento vegetal (BPCV).. EN. Los mecanismos de las (BPCV) para promover el crecimiento de las plantas son diversos. Los que se mencionan con más frecuencia en. CI. la literatura son: fijación de nitrógeno, producción de sustancias. DE. reguladoras del crecimiento, incremento en el desarrollo de la raíz,. CA. producción de compuestos sideróforos que incrementan la disponibilidad del Fe en la rizósfera, alteraciones en el potencial de la membrana de la. OT E. raíz, inducción de resistencia sistémica a patógenos, inhibición del crecimiento de organismos antagónicos e interacción sinérgica con otros. BI B. LI. microorganismos del suelo (Loredo y col., 2004). Dentro de los microorganismos del suelo que son beneficiosos. para las plantas se destacan las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal. Se las conoce como Rizobacterias Promotoras del Crecimiento en Plantas. Entre ellas, muchos tipos se encuentran asociados a la familia Enterobacteriaceae, mientras que otros están 6. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. relacionados con los géneros Azospirillum, Azotobacter y Pseudomonas (Schoebitz, 2006). pueden ejercer un efecto benéfico. AS. Las Pseudomonas spp.. directo, a través de la síntesis de fitohormonas y de vitaminas,. IC. estimulación de la germinación de semillas y emergencia de plántulas,. LO G. inhibición de la síntesis de etileno, solubilización de fósforo (P) inorgánico. De manera indirecta, por medio de síntesis de antibióticos y. BI O. fungicidas, competencia por nutrientes, producción de sideróforos o por la inducción de la resistencia sistémica a patógenos. Pueden también. CI A. S. actuar como Agentes de Control Biológico (BCA), capaces de proteger a las plantas de la infección, causadas por agentes fitopatógenos (Siddiqui. EN. y Shaukat, 2003 en Cano, 2011).. CI. En virtud de su capacidad de adaptación fisiológica y versatilidad. DE. metabólica, las bacterias en las zonas de raíces de las plantas son un. CA. agente clave del cambio del suelo en los agroecosistemas, con efectos positivos, en cuanto a tolerancia de altos contenidos de sales, aumento. OT E. en los rendimientos de los cultivos y mejoras en la calidad del suelo, respecto a la disponibilidad de nutrientes; sin embargo, esta regulación. LI. está mediada por el quórum sensing de las bacterias, las cuales, se. BI B. deben adaptar para alcanzar una alta proliferación y, de esta manera, se estimulan, se activan y se mantienen en la zona radicular, por medio de la liberación selectiva de los exudados y lixiviados, por parte de las planta y otros microorganismos (Cano, 2011).A su vez, las bacterias de la rizósfera son capaces de generar una amplia variedad de metabolitos 7. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. secundarios, que pueden tener una influencia positiva, sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas, mejoran la disponibilidad de. AS. minerales y nutrientes en el suelo, etc. (de-Bashan y col., 2007). En el año 1997 se comunicó la presencia de Azospirillum sp en. IC. los géneros Cenchrus, Atriplex, Opuntia, Simmondsia, Gossypium y. BI O. et al, 1997 en Pernasetti y Di Barbaro, 2012).. LO G. Salvia chia, plantas cultivadas en zonas áridas y semiáridas (Stegmayer. Pernasetti y Di Barbaro (2012) ensayaron inoculando Azospirillum. S. brasilensis en Opuntia (tuna) resultando en un aumento significativo de. CI A. las raíces, característica de gran importancia para esta planta que se. EN. desarrolla en zonas de aridez, ya que amplía la posibilidad de toma de agua y nutrientes sin olvidar también la importancia que tiene el mayor. DE. CI. desarrollo radical en el anclaje de la planta en zonas ventosas. Por lo tanto, la secuenciación del ADN de estos organismos tiene. CA. una gran importancia, proporcionando una mejor comprensión de mundo. y. mejorar. las. estrategias. para. mejorarlo.. OT E. nuestro. Desafortunadamente, sólo una pequeña parte de los microorganismos. LI. puede ser cultivable, lo que significa que nuestra comprensión del. BI B. mundo microbiano es altamente sesgada y no representa la realidad en la naturaleza (Amann y col., 1995; Pace, 1997; Neelakanta y Sultana, 2013; Handelsman, 2004). Además, casi todos los microorganismos viven en comunidades de especies múltiples donde interactúan y se benefician de la cooperación microbiana. Un cultivo clonal carece en la representación verdadera de estos estados, lo que hace importante 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. obtener información genética directamente de sus hábitats naturales. Los primeros estudios en este mundo desconocido se centraron en el gen 16S ribosomal RNA (rRNA) (Stein y col., 1996; Hugenholtz y col.,. AS. 1998) (que a menudo se conserva dentro de una especie y. LO G. campo para caracterizar procariotas no cultivadas.. IC. generalmente es diferente entre las especies), y mostró el potencial del. Con la aparición de las tecnologías NGS, se llevaron a cabo. BI O. proyectos de escopeta (WGS) secuenciación de las comunidades bacterianas (Venter y col., 2004; Tringe y col., 2005). Esta tecnología,. CI A. S. denominada metagenómica, permite la secuenciación de toda la comunidad representada en la producción de grandes volúmenes de. EN. datos, en magnitudes que pueden alcanzar terabytes (TB) de. CI. información de una muestra de suelo (Gans, 2005). Por lo tanto, los. DE. nuevos retos computacionales han surgido y los nuevos métodos serán necesarios para analizar estas enormes cantidades de datos con el. CA. objetivo final de responder a dos preguntas fundamentales: "¿Quién está. OT E. ahí?" y "¿Qué están haciendo?". Un gran número de herramientas fueron puestas en libertad para los estudios de metagenómica desde. BI B. LI. entonces, ya sea en el nivel taxonómico o funcional. La metagenómica o estudio genómico de microorganismos hace. referencia a este no cultivo basada en el enfoque del estudio colectivo del genoma de una población mixta de microorganismos (Neelakanta y Sultana, 2013; Handelsman, 2004).. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Desde la realización de que la diversidad microbiana es mucho mayor que lo previamente observado, la caracterización taxonómica de las comunidades microbianas ha estado bajo la atención de la. AS. comunidad científica. Los estudios de metagenómica primero se. IC. centraron en el gen 16S rRNA para el análisis de la diversidad genética. LO G. (Muyser y col., 1993) pero la aplicación de este gen ha sido impulsado por los avances en la secuenciación del ADN y pirosecuenciación con. BI O. código de barras (Hamady y col., 2008). Tecnologías como la NGS (Next Generation Sequency) pueden utilizar cebadores de amplificación del. S. gen 16S rRNA para la orientación de regiones hipervariables (hay 9 para. CI A. este gen: V1-V9) que permite la discriminación de la diversidad. categorías. principales. han. sido. utilizadas. para. la. CI. Tres. EN. bacteriana en muestras del medio ambiente (Shah y col., 2011).. DE. identificación de la secuencia de clasificación basada en el aprendizaje supervisado: secuencia de búsqueda de similitudes, composición de la. CA. secuencia y métodos filogenéticos (Bazinet y Cummings, 2012). Un gran. OT E. número de aplicaciones de software han sido lanzados (Gerlach y Stoye, 2011; Schreiber y col., 2010) y la mayoría de ellos utilizan sólo uno de. LI. los enfoques, a pesar de algunas excepciones en las que se utilizan dos. BI B. métodos simultáneamente. Este enfoque se basa en la información obtenida por homología. en búsquedas de bases de datos. La selección del taxón es una estrategia relativa más básica para buscar el mejor éxito en la base de datos, pero este tipo de clasificación ha de interpretarse con cuidado, ya 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. que la distancia evolutiva entre el Fragmento de ADN y el éxito es desconocido (Gerlach y Stoye, 2011). Sin embargo, esta clasificación es fiable sobre los niveles taxonómicos superiores (por ejemplo súper reino. AS. o filo). CARMA (Gerlach y Stoye, 2011), MARTA (Horton y col., 2010),. IC. MetaPhyler (Liu y col., 2011), MetaPhlAn (Segata y col., 2012) o MG-. LO G. RAST (Glass y col., 2010) son algunas herramientas basados en búsquedas de similitud y cada uno de ellos tiene características. BI O. complementarias para mejorar la clasificación.. El objetivo de este trabajo de investigación fue determinar las. CI A. S. bacterias presentes en la rizósfera de Opuntia ficus-indica var. Inermis en suelos áridos de Tumbes, Perú., y los objetivos específicos fueron. EN. aislar e identificar las bacterias cultivables presentes en la rizósfera. CI. mediante el gen 16S rRNA; e identificar las bacterias cultivables y no. BI B. LI. OT E. CA. DE. cultivables presentes en la rizósfera mediante metagenómica.. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y METODOS 2.1.1 Localización del área de estudio:. AS. Tumbes es un departamento del Perú situado en el extremo noroeste del. IC. país. Esta circunscripción está limitada al oeste y norte con el océano. LO G. Pacífico (Golfo de Guayaquil), al sur con el departamento de Piura y con territorio ecuatoriano por el este y suroeste. La región comprende la. BI O. estrecha planicie costera en el oeste y los Cerros de Amotape en el norte, dominados por el bosque seco ecuatorial, y los manglares y. S. bosques tropicales del norte. La temperatura promedio de esta zona es. CI A. de unos 26 a 27 °C, con una altitud de 6 msnm. El promedio de la. EN. precipitación anual es de 182.5 mm (SENAMHI).. CI. Los puntos de muestreo fueron Corrales, Cabuyal, Casitas, Uña de gato y Puerto Pizarro, de los cuales se recolectaron las muestras de rizósfera. BI B. LI. OT E. CA. DE. de Opuntia ficus-indica.. Figura 1. Localización de las áreas de muestreo.. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.1.2 Lugar de ejecución: La presente investigación se realizó en el departamento de Tumbes, en los laboratorios de la empresa de Biotecnología Molecular INCA. AS. BIOTEC SAC. en las áreas de Microbiología, Extracción de ADN, PCR y. LO G. IC. Electroforesis.. 2.1.3 Material Biológico:. BI O. El material biológico empleado fueron muestras de la rizósfera de Opuntia ficus–indica de diferentes lugares de Tumbes, como son:. S. Corrales, Cabuyal, Casitas, Uña de Gato y Puerto Pizarro. Con ayuda de. CI A. pequeñas palas se tomó aproximadamente 2 kg de muestra de rizósfera. EN. de seis plantas seleccionadas por juicio no probabilístico o de conveniencia debido a que las plantas se encontraban en pequeñas. CI. cantidades y en estado silvestre, se consideró como juicio crítico la. DE. vigorosidad de la planta y el tamaño; se desinfectó con alcohol todo el. CA. instrumental empleado cada vez que se cambió de planta, las muestras fueron colectadas por separado en bolsas ziploc, siendo trasladadas de. OT E. inmediato al laboratorio.. BI B. LI. 2.1.4 Análisis Físico – Químico del suelo: Luego de la recolección de las muestras se pesó 1 kg de suelo para el análisis físico químico, el mismo que fue realizado por el Laboratorio de Agua, Suelo, Medio Ambiente y Fertirriego de la Facultad de Ingeniería. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Agrícola de la Universidad Nacional Agraria La Molina, quienes enviaron los resultados para el análisis correspondiente.w 2.1.5 Aislamiento de Bacterias Cultivables:. AS. Para el aislamiento de bacterias presentes en la rizósfera, se procedió a. IC. utilizar la técnica de diluciones, la cual consistió en adicionar 2 g de. LO G. muestra en 18 ml de caldo de cultivo Trypticase Soy Broth (TSB) y Luria Bertani (LB) respectivamente, se colocó en shaker orbital por toda la. BI O. noche para luego tomar 10 µl de cada solución y ser sembrada por aspersión en diferentes placas Petri conteniendo, por separado, medio. CI A. S. de cultivo Trypticase Soy Agar (TSA) y Cetrimide, donde el primero es un medio de cultivo general y el segundo es un medio específico para. CI. EN. Pseudomonas.. y. Comprobación. de. Cepas. Bacterianas. DE. 2.1.6 Purificación Cultivables:. CA. Posteriormente se purificaron las bacterias haciendo repliques hasta. OT E. obtener cepas putativas; estas placas fueron usadas para seleccionar las colonias bacterianas basadas en su diferencia morfológica. Las. LI. colonias seleccionadas fueron mantenidas en el mismo medio de. BI B. crecimiento de donde fueron obtenidas, para luego mediante la técnica de tinción diferencial (Tinción Gram) ser observadas al microscopio.. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.1.7 Identificación de bacterias cultivables y no cultivables mediante la técnica de Metagenómica: La caracterización molecular de los microorganismos presentes en el. AS. suelo, se realizó mediante estudio metagenómico, para lo cual se. IC. procedió a la extracción de ADN de bacterias presentes en el suelo. LO G. empleando el Kit Power® Soil DNA Isolation y se procedió según el protocolo del laboratorio MO BIO. La muestra fue añadida a un tubo y se. BI O. centrifugó para la homogenización rápida y completa. La lisis celular se produjo por métodos mecánicos y químicos. El ADN genómico total se. CI A. S. capturó en una membrana de sílice en un formato de columna de centrifugación, se lavó con el reactivo C5 del kit, se diluyó con el reactivo. EN. C6 y entonces quedó listo para el análisis de PCR y otras aplicaciones. CI. posteriores. Estos procedimientos se pueden ver a mayor detalle en la. BI B. LI. OT E. CA. DE. Figura 2.. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(33) CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI O. LO G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Power Soil.. LI. OT E. Figura 2. Extracción de ADN de las muestras de suelo, empleando el Kit. BI B. 2.1.8 Extracción de ADN de Bacterias Aisladas:. Para la extracción de ADN, se utilizó el método de extracción rápida de ebullición por Buffer Fosfato Alcalino (PBS).. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Las unidades formadoras de colonia (UFC) “puras” que estaban en microtubos fueron microcentrifugadas a 10 000 rpm por 2 minutos, se eliminó el sobrenadante y se conservó solo el pellet.. AS. Para la lisis celular se agregó Tris HCl - Edta (1x) y se colocaron los. IC. tubos a ebullición por 10 minutos, seguido a esto se procedió a incubar. LO G. los tubos en hielo por 5 minutos. Este shock de temperatura junto con los reactivos antes mencionados ayudó a la rotura de las membranas. BI O. celulares de las bacterias.. S. Las muestras fueron centrifugadas a 10 000 rpm por 2 minutos y se. CI A. retiró todo el sobrenadante posible, sin tocar el pellet; este fue resuspendido en agua ultrapura y se adicionó ARNasa para luego ser. CI. EN. puesto en incubadora a 37°C por una hora.. DE. 2.1.9 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Es una técnica de biología molecular que consiste en la amplificación de. CA. una determinada cadena de ADN o ADNc y producir muchas copias,. OT E. para diferentes fines, como visualización en gel, cuantificación, secuenciación, etc.. LI. Para realizar la PCR, se preparó un buffer mix, el cual contenía Buffer. BI B. 10x,, Agua Ultra Pura (AUP), dNTPs, Taq Polimerasa recombinante y Primers 16S: Forward y Reverse. Se adicionó 23 µl del mix en microtubos junto con 2 µl del ADN obtenido por extracción y fueron colocados en el termociclador con el programa establecido para los genes 16S: 94°C por 5 minutos, 94°C por 30 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. segundos, 58°C por 45 segundos, 72°C por 1 minuto y 72°C por 4 minutos.. AS. 2.1.10 Electroforesis:. IC. Se preparó gel de agarosa al 1.5%, para ello se pesó 0.9 g de Agar Agar. LO G. y se resuspendió en 60 ml de Tris Ac. Acético EDTA, se adicionó 3 µl de bromuro de etidio y se vertió sobre una cubeta de 20 pocillos, en cada. BI O. pocillo se colocó la mezcla de azul de bromofenol con los amplicones obtenido por PCR, cada uno por separado. Posteriormente fue colocada. S. en una cámara de electroforesis conectada a un polo positivo (+) y otro. CI A. negativo (-); se dejó migrar las muestras por 30 minutos a 90 voltios, después de ello el gel fue puesto en una cámara UV donde se. CI. EN. observaron bandas fluorescentes hacia el polo positivo. 2.1.11 Secuenciación:. DE. Es una técnica de bilogía molecular, por la cual, se obtiene la secuencia. CA. de nucleótidos de un segmento de ADN o ARN, en este caso por medio de la PCR se amplificó un segmento del ADN de las cepas bacterianas. OT E. aisladas, permitiendo así su identificación. Las muestras fueron enviadas a la compañía biotecnológica. Macrogen, quienes enviaron los. BI B. LI. resultados para el alineamiento correspondiente.. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.1.12 Análisis de Datos: Los resultados de las secuencias de nucleótidos del gen 16S rRNA se alinearon empleando el programa Mega 6 y se analizaron utilizando el. AS. BLAST de NCBI y los OTU (Operational Taxonomic Unit) obtenidos por. IC. metagenómica fueron analizados mediante el programa bioinformático. BI B. LI. OT E. CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI O. LO G. MG – RAST.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS Los resultados obtenidos del análisis físico – químico del suelo de cada punto. AS. de muestreo se presentan en la Tabla 1.. pH Lugar de. N. (%). (%). relación. muestreo 1:1 Arena franca. 8.18. 1.79. Cabuyal. Arena franca. 8.37. 1.30. Casitas. Franco Limoso. 6.73. Uña de Gato. Franco Arenoso. 8.13. Puerto Pizarro. Franco Arenoso. 7.74. K. ppm. ppm. %. 0.08. 44.36. 268.00. 3.84. 0.06. 39.95. 190.80. 0.28. 1.61. 0.08. 46.53. 1,628.00. 0.12. 0.71. 0.04. 32.05. 137.60. 0.18. 3.82. 0.16. 25.38. 228.00. 0.42. CI. EN. CI A. S. Corrales. CaCO3. P. BI O. Textura. M.O.. LO G. muestras de suelo de los diferentes puntos de muestreo.. IC. Tabla 1. Parámetros físico – químicos considerados en el análisis de las. DE. El resultado por Blast (Altschul y col., 1997) frente a los datos del NCBI. CA. recogiendo la extensión del segmento solapado, el porcentaje de semejanza y el nombre del microorganismo con un mayor grado de identidad de secuencia. OT E. de las bacterias nativas cultivables presentes en la rizósfera de Opuntia ficus-. BI B. LI. indica en los diferentes puntos de muestreo (Tabla 2 – 6) corresponden a:. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 1 2 3 4 5 6 7. Acinetobacter baumannii Acinetobacter junii Acinetobacter lwoffii Bacillus cereus Bacillus megaterium Enterobacter asburiae Enterobacter cancerogenus. 8 9. Enterobacter xiangfangensis Escherichia hermannii. 10. Leclercia adecarboxylata. 11 12 13 14 15 16. Lysinibacillus fusiformis Pseudomona putida Pseudomonas mosselii Salmonella enterica Serratia marcescens WW4 Staphylococcus saprophyticus. IC. BACTERIAS. BI B. LI. OT E. CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI O. LO G. N°. AS. Tabla 2. Bacterias cultivables presentes en la rizósfera de O. ficus-indica en el distrito de Corrales.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC. EN. CI A. S. BI O. LO G. BACTERIAS Aeromonas punctata Bacillus sp. Citrobacter freundii Citrobacter murliniae Endophytic bacterium Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae Enterobacter ludwigii Enterobacter sp. Klebsiella pneumoniae Klebsiella sp. Klebsiella variicola Pantoea agglomerans Pantoea sp Pseudomonas mendocina Pseudomonas plecoglossicida Pseudomonas putida Pseudomonas sp. Staphylococcus sciuri. BI B. LI. OT E. CA. DE. CI. N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19. AS. Tabla 3. Bacterias cultivables presentes en la rizósfera de O. ficus-indica en el distrito de Cabuyal.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC. CI. EN. CI A. S. BI O. LO G. BACTERIA Acinetobacter baumannii Acinetobacter pittii Acinetobacter sp. Bacterium str. Enterobacter aerogenes Enterobacter hormaechei Enterobacter sp. Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas guariconensis Pseudomonas monteilii Pseudomonas plecoglossicida Pseudomonas putida Pseudomonas sp. Uncultured bacterium Uncultured proteobacterium Uncultured Pseudomonas sp. Uncultured soil bacterium. BI B. LI. OT E. CA. DE. N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19. AS. Tabla 4. Bacterias cultivables presentes en la rizósfera de O. ficus-indica en el distrito de Casitas.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BACTERIA. 1. Lysinibacillus macroides. 2. Lysinabacillus sp.. IC. N°. AS. Tabla 5. Bacterias cultivables presentes en la rizósfera de O. ficus-indica en el distrito de Uña de Gato.. BACTERIA. 1. Vibrio sp.. CI A. S. BI O. N°. LO G. Tabla 6. Bacterias cultivables presentes en la rizósfera de O. ficus-indica en el distrito de Puerto Pizarro.. EN. Mediante metagenómica dirigida al gen 16S rRNA se ha podido identificar las bacterias nativas presentes en la rizósfera de O. ficus-indica en suelos áridos. CI. de Tumbes, Perú, tal así que se han logrado identificar un total de 59 familias. DE. que incluye 90 géneros y 176 especies para Corrales; 89 familias con 161 géneros y 303 especies para Cabuyal; 127 familias que incluye 276 géneros y. CA. 683 especies para el distrito de Casitas; 104 familias con 191 géneros y 429. OT E. especies para Uña de Gato; 99 familias con 193 géneros y 452 especies para. LI. el distrito de Puerto Pizarro. (Tabla 7 a 11). BI B. Así podemos observar que en las muestras procedentes de Cabuyal los principales géneros en cuanto a su porcentaje de abundancia. son:. Pseudomonas (10%), Acidobacterium (6%), Pelobacter (4%), Gemmatimonas (3%), Sphingomonas (3%), Rhodopseudomonas (2%), Holophaga (2%), Bacillus (2%), Flavobacterium (2%), Pirellula. (2%) y Steroidobacter (2%). (Figura 3). 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(42) EN. CI A. S. BI O. LO G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CI. Figura 3. Porcentaje de diversidad bacteriana a nivel de género presente en la. DE. rizósfera de O. ficus- indica obtenida mediante metagenómica,. OT E. CA. correspondiente al Distrito de Cabuyal.. De forma similar se puede observar que para las muestras procedentes de. LI. Corrales los principales géneros bacterianos en cuanto a su porcentaje de. BI B. abundancia incluyen: Bacillus (6%), Pelobacter. (6%), Conexibacter (6%),. Nocardioides (4%), Solirubrobacter (4%), Sphingomonas (3%), Rhodoplanes (3%), Acidobacterium (3%), Gemmatimonas (3%) y Pirellula (2%) (Figura 4).. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(43) EN. CI A. S. BI O. LO G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CI. Figura 4. Porcentaje de diversidad bacteriana a nivel de género presente en la. DE. rizósfera de O. ficus- indica obtenida mediante metagenómica,. OT E. CA. correspondiente al Distrito de Corrales.. En las muestras procedentes de Casitas, los principales géneros en cuanto a son: Bacillus (6%), Pelobacter (4%), Dongia. LI. su porcentaje de abundancia. BI B. (4%), Gemmatimonas (4%), Sphingomonas spp. (3%), Acidobacterium (3%), Conexibacter. (2%),. Anaeromyxobacter. (2%),. Streptomyces. (2%). y. Nocardioides (2%) (Figura 5).. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(44) CI. EN. CI A. S. BI O. LO G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DE. Figura 5. Porcentaje de diversidad bacteriana a nivel de género presente en la rizósfera de O. ficus- indica obtenida mediante metagenómica,. OT E. CA. correspondiente al Distrito de Casitas.. LI. De igual forma en las muestras procedentes de Uña de Gato (Figura 6) se. BI B. puede observar que los principales géneros bacterianos en cuanto a su porcentaje de abundancia incluyen: Gemmatimonas (5%), Bacillus (5%),. Pelobacter (5%), Sphingomonas (4%) Acidobacterium (3%), Pseudomonas (3%), Dongia (2%), Perlucidibata (2%), Anaeromyxobacter (2%), Holophaga (2%) y Conexibacter (2%).. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(45) EN. CI A. S. BI O. LO G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CI. Figura 6. Porcentaje de diversidad bacteriana a nivel de género presente en la. DE. rizósfera de O. ficus- indica obtenida mediante metagenómica,. CA. correspondiente al Distrito de Uña de Gato.. OT E. En las muestras procedentes de. Puerto Pizarro (Figura 7), los principales. LI. géneros en cuanto a su porcentaje de abundancia son: Acidobacterium (6%),. BI B. Pelobacter. (6%),. Rhodopseudomonas. Dongia (3%),. (6%),. Bacillus. Holophaga. (4%),. (3%),. Steroidobacter. Conexibacter. (4%),. (2%). y. Sphingomonas (2%).. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(46) DE. CI. EN. CI A. S. BI O. LO G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Figura 7. Porcentaje de diversidad bacteriana a nivel de género presente en la. correspondiente al Distrito Puerto Pizarro.. LI. OT E. CA. rizósfera de O. ficus- indica obtenida mediante metagenómica,. BI B. A través de los resultados analizados por el programa MG - RAST se logró identificar los dominios: bacteria, arquea, eucariota, así como también dominios no asignados y secuencias no clasificadas (Figura 8). En el distrito de Casitas se obtuvo 86.63% del dominio bacteria, en Puerto Pizarro un 87.03%, en Uña de Gato 84.72%, en Cabuyal 80.44% y en Corrales 82.06%.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
(47) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Así mismo se identificó que dentro de la distribución del dominio bacteria se encuentran. los. phylum. Proteobacteria,. Actinobacteria,. Firmicutes,. AS. Verrucomicrobia, Bacteroidetes, Acidobacteria, Nitrospirae y Cyanobacteria, y. IC. en un menor porcentaje a los phylum Planctomycetes, Chlamydiae, Aquificae,. LO G. Deinococcus – Thermus, Fusobacteria y Spirochaetes (Figura 9). Dentro de las muestras procedentes de Cabuyal se identificó un mayor porcentaje de 28.97%. BI O. de Proteobacterias, y un menor porcentaje de 14.77% en las muestras provenientes de Corrales; así mismo se identificó 29.65% de Actinobacterias. en las muestras de. CI A. S. en las muestras de Corrales y un menor porcentaje en las muestras de 6.31% Cabuyal, el phylum Firmicutes estuvo presente en un. BI B. LI. OT E. CA. DE. CI. muestras de Cabuyal.. EN. 12.90% en las muestras de Casitas y un menor porcentaje de 2.15% en las. Figura 8. Distribución de los dominios presentes en la rizósfera de Opuntia ficus-indica mediante metagenómica y analizados por MG-RAST.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..
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