UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA
DIVISIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO
Maestría en Ciencias: Productos Naturales y Alimentos
“Productividad y actividad antioxidante de cepas silvestres,
reconstituidas e híbridas de
Pleurotus djamor”
Tesis para obtener el título de:
M. en C.: Productos Naturales y Alimentos
Presenta
I.A. Magdalena Paz Oropeza Guerrero
Directora
Dra. Paula Cecilia Guadarrama Mendoza
Co-Directora
Dra. Norma Francenia Santos Sánchez
ii
Este trabajó se realizó en las instalaciones de los Laboratorios de Productos Naturales y
Alimentos de la Universidad Tecnológica de la Mixteca, UTM, bajo la dirección de la Dra.
Paula Cecilia Guadarrama Mendoza y la co-dirección de la Dra. Norma Francenia Santos
Sánchez. Se contó con el apoyo de una beca de manutención, número 672314, otorgada
iii
Parte de los resultados de este trabajo se presentaron en la 12ª Reunión Internacional de
Investigación en Productos Naturales, en la modalidad de cartel, organizada por la
Asociación Mexicana de Investigación en Productos Naturales (Amipronat) el 18 de mayo
iv
Este trabajo lo dedico a mis queridos amores
que son parte de mi vida:
A Guino
A Nando
A Dany
v
Agradezco a Dios por colocar en mi camino a maravillosas personas…
Guino, Nando y Dany, son los hombres de mi vida que siempre me han dado su amor.
Fide, eres una mujer excepcional y estoy orgullosa de ser tu hija.
Abel, hay mucho de tu esencia en mi misma.
Nash y Ali, mis pequeños hermanos, los quiero mucho.
Dra. Paula Guadarrama, quien más que directora ha sido mi amiga.
Dra. Norma Francenia Santos Sánchez, quien me dio su tiempo y enseñanzas.
Dra. Mirna Patricia Santiago Gómez, Dr. Rogelio Valadez Blanco y Dra. Beatriz Hernández Carlos, quienes hicieron aportaciones valiosas a este trabajo.
Dr. Raúl Salas Coronado, quien me apoyó en esta investigación.
Dra. Edith González y M.C. Alma Salazar, me dieron su tiempo y su amistad.
A mi queridísima banda: Erickcín, Nancy, Karls, Fran Gómez y Tenoch. Por estar siempre conmigo.
A mis compañeros y amigos de los laboratorios: Dra. Clau, Uli, Tony, Lucecita, Héctor, Dra. May, Yessi, Irmis, Chío, Abi, Eu, Eli, Heri, Fran Santiago, Pablo, Greis, Mary, Dora,
Joseoziel y Quique, con quienes compartí momentos emotivos.
Moncha, Paty Guevara, Amparito, Doris, Perlita, Olga y Nubs, quienes me han dado lecciones de vida y amistad.
Sarita, Carmen y Celes, quienes agilizaron diversidad de trámites y lo hicieron más sencillo para mí.
A la Universidad Tecnológica de la Mixteca, por ser mi Alma Máter.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por la beca otorgada.
vi
RESUMEN
vii
CONTENIDO
Resumen
Página
vi
Lista de figuras x
Lista de tablas xi
Abreviaturas xii
1. Introducción 1
1.1 Hipótesis 3
1.2 Objetivos 4
1.2.1 Objetivo general 4
1.2.2 Objetivos específicos 4
1.3 Importancia y originalidad de este estudio 4
1.4 Delimitaciones del estudio 5
2. Marco teórico 7
2.1 Características generales de los hongos 7
2.2 El género Pleurotus 9
2.2.1 Morfología 9
2.2.2 Sustratos empleados en la producción de carpóforos de
Pleurotus spp.
10
2.2.3 Selección de genotipos 11
2.2.4 Producción de Pleurotus spp. 12
2.2.5 Productividad en el cultivo de los hongos 13
2.2.6 Importancia funcional de Pleurotus spp. 14
2.3 Actividad antioxidante (AA) 15
2.4 Métodos para determinar la actividad antioxidante (AA) 17
3. Estado del Arte 21
3.1 Rescate de germoplasma y obtención de nuevas cepas de Pleurotus
spp.
21
3.2 Productividad en el cultivo de Pleurotus djamor 23
3.3 Importancia del micelio 24
3.4 Actividad antioxidante (AA) en Pleurotus spp. 25
4. Metodología 28
4.1 Material biológico 30
4.2 Equipos y materiales 30
4.3 Reactivos, disolventes, medios de cultivo y sustrato 31
4.4 Preparación de medios de cultivo 32
4.4.1 Medio sólido en agar extracto de malta (AEM) para crecimiento micelial
32
4.4.2 Medio para producción de micelio en cultivo líquido 32
4.5 Caracterización de la morfología y el crecimiento micelial de cepas de
P. djamor en medio sólido AEM
viii
4.6 Productividad de las cepas de P. djamor 34
4.6.1 Producción del inóculo de grano de las cepas de P. djamor 34
4.6.2 Obtención de los carpóforos de las cepas de P. djamor 35
4.6.3 Determinación de humedad en carpóforos frescos y secos 36
4.7 Actividad antioxidante (AA) en P. djamor de carpóforos y micelio 37
4.7.1 Preparación de la muestra a patir de carpóforos 37
4.7.2 Preparación de la muestra micelial 37
4.7.3 Obtención del extracto metanólico desengrasado de
carpóforos
38
4.7.4 Obtención del extracto metanólico hidrolizado y
desengrasado de carpóforos
38
4.7.5 Obtención del extracto metanólico crudo de carpóforos y micelio
39
4.7.6 Obtención del extracto metanólico micelial y limpieza por extracción en fase sólida (EFS)
40
4.7.7 Cuantificación de fenoles totales (FT) 40
4.7.8 Cuantificación de flavonoides totales (FVT) 41
4.7.9 Cuantificación de la actividad antirradical por el método del DPPH•
42
4.7.10 Cuantificación del Poder Reductor (PR) 44
4.8 Análisis estadístico 46
5. Resultados y discusiones 47
5.1 Morfología micelial en medio sólido en agar extracto de malta (AEM) de cepas de P. djamor
47
5.2 Velocidad del crecimiento micelial (Vc) en medio sólido AEM de cepas de P. djamor
49
5.3 Productividad de las cepas silvestres, reconstituidas e híbridas 51
5.4 Determinación de humedad y rendimiento de extractos en carpóforos
y micelio de P. djamor
57
5.5 Cuantificación de fenoles totales (FT) 59
5.6 Cuantificación de flavonoides totales (FVT) 63
5.7 Evaluación de la actividad antioxidante (AA) 65
5.7.1 Actividad antioxidante mediante el radical DPPH• 65
5.7.2 Actividad antioxidante mediante el Poder Reductor (PR) 68
5.8 Correlación de los parámetros miceliales, productivos y de actividad
antioxidante (AA) 69
6 Conclusiones 72
7 Perspectivas 73
8 Referencias 74
9 Apéndice 80
Apéndice 1 Curva de calibración del ácido gálico para la cuantificación de fenoles totales (FT)
80
Apéndice 2 Curva de calibración de quercetina para la cuantificación de flavonoides totales (FVT)
81
Apéndice 3 Curva de muestras provenientes de extractos metanólicos
de carpóforos de las cepas de P. djamor para cuantificar la actividad antioxidante (AA) por el método del radical DPPH•
ix
Apéndice 4 Curva de muestras provenientes de extractos metanólicos
de micelio de las cepas de P. djamor para cuantificar la actividad antioxidante (AA) por el método del radical DPPH•
83
Apéndice 5 Curva de ácido gálico, BHT y rutina empleadas como control para cuantificar la actividad antioxidante (AA) por el radical DPPH•
84
Apéndice 6 Curva de muestras provenientes de extractos metanólicos
de carpóforos de las cepas de P. djamor para cuantificar la actividad antioxidante mediante el Poder Reductor (PR)
85
Apéndice 7 Curva de calibración de ácido gálico empleada como control para cuantificar la actividad antioxidante mediante el Poder Reductor (PR)
86
10 Anexo 87
x
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1 Carpóforo de basidiomiceto 8
Figura 2 Carpóforos de a) P. djamor; b) P. ostreatus; c) P. sajor-caju; d)
P. eryngii
9
Figura 3 Obtención de cepas reconstituidas e híbridas a partir de cepas silvestres
12
Figura 4 Compuestos fenólicos aislados en el género Pleurotus 16
Figura 5 Reacción de reducción de las sales de molibdato y tugstato por un compuesto fenólico
17
Figura 6 Estructura del complejo tricloruro de aluminio–flavonoide 18
Figura 7 Reacción de reducción de DPPH• por antioxidantes 19
Figura 8 Reacción de reducción de ferricianuro por antioxidantes 20
Figura 9 Carpóforos de a) P. djamor var. djamor (Rumph. Ex Fr.) Boedijn; b) P. djamor var. roseus Corner
22
Figura 10 Etapas del presente proyecto de investigación 28
Figura 11 Metodología general de la investigación 29
Figura 12 Cepas de Pleurotus utilizadas en esta investigación 30
Figura 13 Morfología micelial de cepas de Pleurotus spp. a) UTMB; b) 48
RP; c) H3; d) RRy e) H2
Figura 14 Carpóforos de Pleurotus:a) UTMR; b) BB; c) RR; d) H1; e) H2; f) H3; g) H4; h) RP; i) UAP9
xi
LISTA DE TABLAS
Página
Tabla 1 Propiedades funcionales en especies comestibles de Pleurotus 15
23
Tabla 2 Parámetros de productividad de cepas de P. djamor
Tabla 3 Fenoles totales (FT), flanovoides totales (FVT), IC50 y Poder
Reductor (PR) de extractos alcohólicos de carpóforos y micelio de cepas de Pleurotus spp.
27
Tabla 4 Morfología micelial de las cepas de Pleurotus djamor en medio agar extracto de malta (AEM)
47
Tabla 5 Velocidad de crecimiento micelial de cepas de P. djamor 50
Tabla 6 Parámetros de productividad de las cepas de P. djamor 52
Tabla 7 Porcentaje de humedad y rendimiento de los extractos metanólicos de carpóforos y micelio de P. djamor
58
Tabla 8 Contenido de compuestos fenólicos y valores de IC50 de carpóforos y 61 micelio de P. djamor
Tabla 9 Coeficiente de correlación de Pearson lineal (r) entre crecimiento micelial, productividad y actividad antioxidante de cepas de P. djamor
xii
ABREVIATURAS
AA Actividad antioxidante
AEM Agar extracto de malta
Cma Crecimiento micelial acumulado
CR Capacidad reductora
DPPH• Radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo
EAG Equivalente de ácido gálico
EAT Equivalente de ácido tánico
EB Eficiencia biológica
EQ Equivalente de quercetina
EFS Extracción en fase sólida
FT Fenoles totales
FVT Flavonoides totales
IC50 Concentración de una muestra requerida para inhibir el 50% de la
concentración inicial de un reactivo
ICREAG Índice de capacidad reductora equivalente de ácido gálico
mf masa fresca
ms masa seca
Pm Peso fresco medio de las fructificaciones
PR Poder Reductor
Tct Tiempo de cosecha total
Tfp Tiempo de inicio para la formación de primordios
TP Tasa de productividad
1
1.
INTRODUCCIÓN
Los hongos del género Pleurotus tienen importancia comercial y ocupan el tercer lugar a
nivel mundial en la producción de hongos comestibles.1 Estos hongos poseen la ventaja de
ser cultivados en diferentes materiales lignocelulósicos para su crecimiento en condiciones
rurales e industriales y se adaptan a distintas condiciones de temperatura y humedad.2
Además se ha reportado que estos hongos tienen diferentes propiedades funcionales tales
como anticancerígenas, antivirales, antibióticas, antiinflamatorias y antioxidantes.3
Específicamente Pleurotus djamor es un hongo comestible que crece naturalmente sobre
troncos de árboles en descomposición. La especie silvestre tiene un cultivo comercial
incipiente en México, y crece en los estados de Chiapas, Tabasco, Quintana Roo y
Oaxaca.4 En trabajos previos a esta tesis, se aisló germoplasma a partir de cepas silvestres
provenientes de la región Mixteca oaxaqueña.5 También se realizaron modificaciones
genéticas a estas cepas mediante el método de desdicariotización química para la
obtención de cepas híbridas nuevas con propiedades productivas y morfológicas
potencialmente mejoradas.5
Por otra parte, la productividad es un término que se utiliza para determinar si la cepa tiene
factibilidad comercial. Los parámetros de importancia para evaluar la productividad de
hongos son la eficiencia biológica (EB) y la tasa de productividad (TP). Se ha reportado EB
en cepas de P. djamor en un intervalo de 20 a 147%,5,6 y de TP entre 0.30 a 2.80%.5,7
Además, entre las propiedades funcionales que exhiben los hongos del género Pleurotus
2
celular provocado por el estrés oxidativo, principalmente. Esta AA está asociada, en la
mayoría de los casos, a la presencia de compuestos fenólicos.8 El extracto metanólico de
carpóforos de cepas de P. djamor muestra valores de fenoles totales (FT) en un intervalo
de 2.25 ± 0.04 a 32.55 ± 0.21 mg equivalentes de ácido gálico/g de masa seca (mg EAG/g
ms).9,10. El contenido de flavonoides totales (FVT) para P. djamor, en extractos metanólico
y etanólico, se ha reportado de 0.0021 ± 0.0001 y 14.88 ± 2.13 mg equivalentes de
quercetina/g de extracto (mg EQ/g ext), respectivamente.11,12 Se reportó IC
50 entre 0.065 y
7.25 mg/mL, por el método de reducción del radical DPPH•10,12 y un IC
50 = 6.30 ± 0.50
mg/mL.11 mediante el método de Poder Reductor (PR),
Recientemente, las investigaciones científicas se han enfocado a la parte vegetativa de los
hongos (micelio). Esto se debe a que la producción de la biomasa micelar es rápida y ocupa
menos espacio que los carpóforos.13 Además, el micelio posee propiedades biológicas que
pueden compararse con las encontradas en los carpóforos.14 Las investigaciones en el
micelio se han realizado empleando extractos etanólicos. Liang y colaboradores15
reportaron en P. eryngii un contenido de FT de 12.65 ± 0.82 mg EAG/g ms. Vamanu16
reportó un contenido de FVT de 28.00 ± 5.70 mg EQ/g biomasa. Ćilerdžiċ y col.17 reportaron
un contenido de FVT de 4.42 ± 0.86 mg EQ/g ext s. Por su parte, Liang y col. en P. eryngii
reportó un IC50 = 2.47 mg/mL, Ćilerdžiċ y col. en P. ostreatus un IC50 = 13.94 mg/mL, ambos
por el método de DPPH•. Liang y col. reportaron un IC50 = 9.18 ± 0.03 mg/mL por el método
de PR. Los datos reportados en el micelio son cercanos a los descritos para los carpóforos
3
Por lo anterior, esta investigación tuvo como objetivo evaluar la productividad de los
carpóforos y cuantificar la AA de extractos metanólicos de micelios y carpóforos de cepas
silvestres, reconstituidas e híbridas. Se utilizaron dos cepas comerciales como control para
fines comparativos (una P. djamor y la otra Pleurotus spp.). Para lograr el objetivo anterior,
el proyecto se dividió en cuatro etapas: 1) Caracterización del micelio, evaluando la
morfología y velocidad de crecimiento de las cepas en medio sólido de agar extracto de
malta; 2) Productividad de las cepas, mediante EB y TP, para evaluar su potencial comercial
usando paja de trigo como sustrato; 3) Secado y preparación de la muestra para la
cuantificación de los compuestos antioxidantes; y 4) Cuantificación de compuestos
fenólicos y la AA por métodos espectroscópicos. En la cuantificación de FT se usó el
reactivo de Folin-Ciocalteu y para el contenido de FVT, el tricloruro de aluminio, AlCl3. Así
mismo, se determinó la actividad antirradical por el método de reducción del radical de
DPPH• y el PR empleando ferricianuro de potasio, K3Fe(CN)6. Estos parámetros permitieron
una evaluación y comparación de la productividad de los carpóforos, así como la AA entre
carpóforos y micelios de las cepas estudiadas.
1.1 Hipótesis
La productividad de las cepas silvestres, reconstituidas e híbridas de Pleurotus djamor está
relacionada directamente con la velocidad de crecimiento micelial.
Los flavonoides presentes en los extractos metanólicos se relacionan directamente con la
4
1.2 Objetivos
1.2.1 Objetivo general
Evaluar la productividad de los carpóforos, así como la actividad antioxidante de carpóforos
y micelio de las cepas silvestres, reconstituidas e híbridas de Pleurotus djamor.
1.2.2 Objetivos específicos
Evaluar la velocidad de crecimiento micelial en medio sólido de las cepas silvestres,
reconstituidas e híbridas de P. djamor.
Evaluar la productividad de las diferentes cepas empleando los parámetros de
eficiencia biológica (EB) y tasa de productividad (TP), usando paja de trigo como
sustrato.
Cuantificar fenoles totales (FT) con el reactivo de Folin-Ciocalteu; flavonoides totales
(FVT) con tricloruro de aluminio; la actividad antirradicalar frente al radical DPPH• y
la actividad antioxidante (AA) en términos del PR, mediante la reducción de
ferricianuro en extractos metanólicos (carpóforos y micelio) de las cepas de P.
djamor.
Comparar y correlacionar las características miceliales, productivas y la AA de las
cepas estudiadas.
1.3 Importancia y originalidad de este estudio
Los hongos del género Pleurotus tienen la ventaja de ser cultivados en sustratos diversos
y se adaptan a diferentes condiciones de temperatura y humedad. Además, se han aislado
5
antioxidante.2,18 P. djamor es una fuente de agentes antibacterianos y antioxidantes que
pueden tener efectos potencialmente benéficos a la salud.12
Por otro lado, una de las ventajas de emplear hongos en lugar de plantas como fuente de
fitoquímicos es que debido a la facilidad para producir micelio tanto en cultivos líquidos
como sólidos, los carpóforos se producen en tiempos relativamente cortos, lo que a su vez
puede ayudar a optimizar la producción de productos bioactivos.19
Para promover el cultivo y consumo de cepas silvestres, reconsitutidas o híbridas de P.
djamor es importante caracterizar su potencial productivo y propiedades funcionales al ser
cultivadas en diferentes regiones. Por ello, en este trabajo se evaluó la productividad (EB y
TP) de los carpóforos, se cuantificaron los compuestos fenólicos y la AA de carpóforos y
micelios de cepas comestibles silvestres, reconstituidas e híbridas P. djamor. Se debe
mencionar que hasta el momento no se ha realizado un estudio que aborde a la
productividad y la cuantificación de compuestos fenólicos y AA de P. djamor. Así mismo, no
se tiene conocimiento de estudios acerca de AA para micelio y carpóforos de una misma
especie del género Pleurotus. Estos resultados permiten contribuir al conocimiento básico
de los hongos de P. djamor de la región Mixteca dando herramientas para su futura
investigación y posible aplicación tecnológica.
1.4 Delimitaciones del estudio
La investigación se delimitó a muestras de carpóforos de dos cepas silvestres endémicas
de la Mixteca Oaxaqueña (UTMB y UTMR), dos reconstituidas (BB y RR) y cuatro híbridas
6
(UAP9) y Pleurotus spp. (RP). Para el estudio de la AA del carpóforo se estudiaron las
cepas antes mencionadas, omitiendo a la cepa silvestre UTMB debido a su escasa
generación de biomasa. El inóculo de cada cepa se sembró en paja de trigo y se cosechó
en los laboratorios de Bioprocesos y Ciencia de los Alimentos de la Universidad Tecnológica
de la Mixteca entre los meses de junio de 2015 y febrero de 2016, a temperaturas entre 18
a 23 °C y una humedad relativa de 80 a 85%. Los extractos metanólicos de carpóforos y
micelio de dichas cepas se obtuvieron por extracción sólido-líquido asistida por ultrasonido
de la biomasa seca.
La cuantificación de los compuestos fenólicos y de la AA, se realizó por métodos
espectroscópicos. Para la cuantificación de FT se usó el reactivo de Folin-Ciocalteu, y para
el contenido de FVT se empleó el reactivo de tricloruro de aluminio. Así también, se
determinó la actividad antirradical al extracto metanólico por el método de DPPH• y el PR
7
2. MARCO TEÓRICO
Esta sección describe información general de los hongos y del género Pleurotus, su
producción, los sustratos más empleados y los métodos analíticos que se emplearon
durante esta investigación.
2.1 Características generales de los hongos
Los hongos son organismos eucarióticos, carentes de clorofila, unicelulares (levaduras) o
pluricelulares (filamentosos), su reproducción puede ser sexual o asexual. Se dividen en
cuatro filos: Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota. Dentro de los
basidiomicetos las especies que tienen mayor importancia económica pertenecen a los
géneros Agaricus (champiñón), Lentinula (shiitake) y Pleurotus (seta).
La mayoría de especies fúngicas están constituidas por filamentos largos y delgados
llamados hifas, los cuales están rodeadas por pared celular rígida compuesta de quitina
combinada con carbohidratos complejos, como celulosa. De la ramificación y
entrelazamiento de las hifas, se forma una estructura filamentosa denominada micelio. Si
el micelio tiene un solo núcleo se denomina monocariótico y si tiene dos núcleos se
denomina dicariótico.
En los basidiomicetos el esporóforo está formado por un pie o estípite, que sostiene al píleo
o sombrero, que en ocasiones emerge de una cazoleta basal (volva), Figura 1. El estípite y
el píleo están conformados por micelio ramificado. En la parte inferior del sombrero se
8
desde el margen hacia el estípite, cubiertas de basidios en ambas caras. En el himenio se
generan y liberan las esporas cuando el carpóforo ha madurado. Algunos basidiomicetos
poseen un anillo o velo alrededor del estípite por debajo del margen del píleo.20
.
Figura 1. Carpóforo de basidiomiceto
Los hongos se consideran quimioheterótrofos estrictos y requieren de sustratos
proveedores de energía para la biosíntesis. Debido a la pared rígida que tienen, los hongos
no pueden fagocitar moléculas más complejas; sin embargo, cuentan con enzimas
extracelulares complejas que les permite degradar sustratos diversos. La glucosa, maltosa,
sacarosa, quitina, lignina, hemicelulosa y celulosa constituyen la fuente de energía más
importante para la mayoría de los hongos lignocelulolíticos.2
Pileo o sombrero
Laminillas o himenio (contiene a las esporas)
Micelio
hifas vistas al microscopio Basidiosporas
Pie o estípite Basidio
9
2.2 El género Pleurotus
2.2.1 Morfología. El género Pleurotus pertenece al reino Fungi, phylum Basidiomycota,
clase Basidiomycetes, orden Agaricales y familia Pleurotacea. Las especies de Pleurotus
reciben nombres como: seta, hongo ostra, orejón, oreja (blanca, de palo, de patancán, de
cazahuate o de izote) o seta de chopo. Estas especies poseen cuerpos fructíferos
(carpóforos) con forma redondeada y abombada que se ensancha. El píleo es poco
convexo y se aplana hasta presentar forma de embudo, pétalo de flor o concha de ostra,
con textura lisa o escamosa hacia el centro. El color varía y puede ser blanco, gris, café o
rosa, Figura 2. El estípite de los carpóforos es lateral, corto y está recubierto de vellosidades
blancas. Las láminillas pueden estar o no unidas entre sí en su base. El tamaño depende
de la especie, edad y condiciones de cultivo, pueden medir desde 5 a 20 cm. Crecen
formando repisas o racimos naturales, poseen consistencia blanda y correosa con aroma y
sabor agradables.20
Figura 2. Carpóforos de a) P. djamor; b) P. ostreatus;21 c) P. sajor-caju;22d) P. eryngii23
Para dar impulso a la producción de hongos comestibles a nivel industrial se utilizan
diversas estrategias, entre las que destacan el desarrollo de formulaciones y tipos de
10
2.2.2 Sustratos empleados en la producción de carpóforos de Pleurotus spp. El carpóforo del género Pleurotus crece de forma natural sobre troncos caídos en
descomposición y de manera artificial, sobre residuos agroindustriales.2 Los nutrientes que
se requieren en un sustrato artificial son: celulosa, hemicelulosa y lignina quienes funcionan
como fuentes principales de carbono. Los sustratos artificiales pueden ser clasificados en
seis categorías.7
Pajas: Ajonjolí, arroz, cártamo, cebada, sorgo, trigo, avena, zacate
Rastrojos: Maíz, mijo, garbanzo, frijol
Pulpas: Café, cardamomo
Bagazos: Caña de azúcar, maguey tequilero, henequén, uva
Forestales: Aserrín, viruta, troncos, ramas
Otros: Papel, olote, hojas de piña, fibra de coco, lirio acuático, tallos de plátano,
desechos de la industria textil
Los sustratos deben tener una capacidad de retención de humedad entre el 70 y 80% para
un crecimiento óptimo de los hongos. El tamaño de partícula puede afectar el crecimiento
y fructificación.24 Ciertos estudios indican que la composición de nutrientes es un factor que
limita la colonización de las setas cultivadas y que distintas especies de un mismo género
pueden tener diferentes requerimientos de nutrientes. En este trabajo se utilizó paja de trigo
debido a que posee material lignocelulósico (aproximadamente 90%) que es degradado y
11
2.2.3 Selección de genotipos
Para realizar una selección adecuada de los genotipos, es necesario conocer los aspectos
biológicos de la especie a mejorar.5 En los hongos comestibles, la hibridación es un medio
por el cual algunas características genéticas deseadas y presentes en diferentes cepas,
pueden ser combinadas para obtener nuevas cepas y variedades que posiblemente
desarrollen características mejoradas. Para ello se requiere la disponibilidad de organismos
con diversidad genética.25
En especies de Pleurotus el mejoramiento genético se ha logrado empleando métodos de
hibridación, destacando los siguientes: apareamientos entre monospóricos provenientes de
la progenie meiótica recuperada de las esporas,7 apareamiento entre dicarión-monocarión
también llamado fenómeno Buller y apareamiento de neohaplontes compatibles utilizando
los métodos de desdicariotización.5
El método de apareamiento de neohaplontes, consiste en desdicariotizar (separar
artificialmente los componentes de un dicariote) a una cepa con características deseadas,
obteniéndose así sus componentes monocarióticos denominados neohaplontes. La
desdicariotización puede efectuarse por métodos mecánicos y químicos. Este método tiene
la ventaja de garantizar que la información genética de una cepa se encuentre intacta, y los
neohaplontes corresponden al micelio monocariótico que deriva de un dicarión sin la
intervención de la cariogamia o meiosis. Obtenidos los neohaplontes de cada cepa, pueden
volver a restituirse conformando a las cepas reconstituidas. Por otro lado, los distintos
neohaplontes de cada cepa dicariótica se cruzan entre sí para determinar los patrones de
12
Figura 3. Obtención de cepas reconstituidas e híbridas a partir de cepas silvestres
2.2.4 Producción de Pleurotus spp. Los hongos del género Pleurotus ocupan la tercera
posición en la producción de hongos comestibles después de las especies Agaricus
bisporus (champiñón) y Lentinula edodes (Shiitake).1 Las principales especies que se han
comercializado por sus características sensoriales y nutricionales son: P. eryngii, P.
ostreatus, P. pulmonarius y P. djamor. Según datos de la FAO,26 la producción mundial de
hongos comestibles en el 2009 alcanzó 6.4 millones de toneladas, de las cuales 20 mil ton
aproximadamente correspondieron a P. ostreatus. En México, en el 2010, se cultivaron
3,031 ton de Pleurotus spp. que representó cerca del 5% de la producción total de hongos
comestibles en el país. Lo anterior, tiene un impacto económico positivo, ya que el monto
anual de operaciones comerciales ha superado los 150 millones de dólares y los volúmenes
de exportación han aportado divisas al país por más de 4 millones de dólares anuales,
generando aproximadamente 20 mil empleos directos e indirectos.27
A
n1
n2
n1n1´ n1´
B
Cepas reconstituidas
A´ B´
n2´
n1n2´
n2n1´
n2n2´
Cepas híbridas
Cepa silvestre
13
El incremento en el cultivo de las especies de Pleurotus spp. en los últimos años radica en
que estos hongos tienen capacidad para utilizar como sustrato diversos materiales
enriquecidos en lignina y celulosa tales como rastrojo de maíz, paja de cereales, papel,
residuos vegetales y desechos ligninocelulósicos de la industria alimenticia1 así como a su
habilidad para crecer en un intervalo de temperaturas cercanas a la temperatura ambiente,
de 22 a 28 °C.
2.2.5 Productividad en el cultivo de los hongos. La productividad se considera una
característica importante en el cultivo de hongos y se utiliza para determinar si el cultivo de
la cepa es económicamente factible y también para determinar el sustrato más adecuado.
Los parámetros que se consideran en la productividad son: tiempo de incubación, aparición
de primordios, tiempo transcurrido en la obtención de las cosechas, eficiencia biológica (EB)
y tasa de productividad (TP). Para establecer si una producción puede ser rentable, los
parámetros EB y TP permiten caracterizar si una cepa puede ser productora de setas.28 La
producción de hongos se valora en kg por sustrato y se expresa en porcentaje, este
porcentaje es la EB. La calidad productiva de un sustrato con valor mayor al 50% se
considera aceptable y valores cercanos o mayores a 100 indican que el sustrato es idóneo
para el crecimiento de las cepas.29 TP es el porcentaje diario de producción, y se cuantifica
regularmente como un porcentaje. Estos parámetros presentan valores en un intervalo
amplio que puede deberse a las condiciones utilizadas durante su cultivo. Los factores que
influyen en la productividad de las setas son: 1) Sustrato. Es el material sobre el que los
hongos crecen y debe contener principalmente lignina, celulosa, hemicelulosa y proteína.
El sustrato es fuente de carbono y nitrógeno.28 Para aumentar la productividad a través de
14
(HR). Es necesario un balance entre la humedad ambiental y el contenido de la seta. Para
evitar la deshidratación del hongo, se requiere una HR entre el 80 - 90%. 3) Luz. Es un
factor modulador durante la agregación de hifas y la maduración de los carpóforos. También
evita la formación de nudos en las hifas. Dependiendo de la función requerida, se necesita
mayor o menor exposición de energía. 4) Temperatura. Hay una temperatura óptima para
cada etapa de crecimiento del hongo. La incubación del micelio se lleva a 25° C. La
fomación de primordios se lleva entre 15 a 25° C y la producción de carpóforos entre 20 a
30° C. 5) Aireación. Es necesario el oxígeno porque los basidiomicetos son organismos
aerobios. El CO2 estimula la colonización del micelio en el sustrato, pero no se requiere para
el desarrollo de carpóforos. Niveles altos de CO2 pueden producir hongos de baja calidad.
6) Plagas. Durante el cultivo de las setas, las principales plagas son: mosquitos, roedores,
algunas bacterias y hongos como Trychoderma, Penicilium y Arpergillus.7,28,31
2.2.6 Importancia funcional de Pleurotus spp. Estudios realizados con diferentes cepas
del género Pleurotus spp. muestran un valor promedio de 98% de digestibilidad proteica, y
se puede considerar que las proteínas de estos hongos (19 a 35% bs), son de alta calidad
por contener todos los aminoácidos esenciales.32 Los carpóforos contienen carbohidratos
que incluyen fibra dietética. Además se caracterizan por tener cantidades bajas de grasa (2
a 6% bs), que se concentra mayoritariamente en el estípite. Poseen un contenido de ácido
linoleico entre un 70 y 80% del total de los lípidos presentes.33
En los últimos años ha aumentado el interés por conocer las propiedades funcionales de
cepas de Pleurotus mediante la cuantificación y caracterización de compuestos bioactivos
15
tales como antiviral, antimutagénica, antiinflamatoria,3,10 hepatoprotectora, antitumoral,
antioxidante,34 entre otras. Tabla 1.
Tabla 1. Propiedades funcionales en especies comestibles de
Pleurotus34
Especie Actividad
P. eryngii Antiinflamatoria Hepatoprotector
P. ostreatus Antioxidante Antitumoral
Antiviral contra VIH
P. pulmonarius Antioxidante Antiviral contra VIH
P. sajor-caju Antibacterial Antitumoral
P. tuber-regium Antiviral contra herpes
P. djamor Antibacterial18 Anticancerígeno35 Antioxidante36 VIH: Virus de inmunodeficiencia humana.
2.3 Actividad antioxidante (AA)
El estrés oxidativo se define como un desequilibrio entre especies oxidantes y reductoras a
nivel celular en un organismo.37 Los organismos vivos poseen propiedades antioxidantes
que los protegen contra el daño oxidativo, pero hay casos donde las especies oxidativas
están en mayor proporción que las especies antioxidantes y pueden reaccionar con los
ácidos grasos poliinsaturados de las membranas celulares, u otras moléculas. Esto puede
promover la mutagénesis y carcinogénesis, arteriosclerosis, enfermedades inflamatorias,
16
En la actualidad, los hongos comestibles son reconocidos como un alimento funcional y
como fuente de componentes bioactivos. Presentan actividad protectora que ayuda al
organismo humano a reducir el estrés oxidativo. Se ha reportado que los compuestos
fenólicos de los hongos pueden ser antioxidantes o sinergistas.3 Se ha podido aislar e
identificar ácidos fenólicos, flavonoides y taninos en diez hongos silvestres comestibles
entre los que figuran Agaricus bisporus, Lentinula edodes, P. ostreatus y P. djamor.18
De los principales compuestos fenólicos encontrados en el género Pleurotus destacan los
derivados de ácido benzoico (ácido gálico y siríngico) y del ácido cinámico (ácido ferúlico y
cafeico), Figura 4.3,18
Ácido gálico Ácido siríngico Ácido ferúlico Ácido cafeico
H3C
H3C CH3
Figura 4. Compuestos fenólicos aislados en el género Pleurotus3,18
Por otra parte, algunos métodos espectroscópicos colorimétricos utilizados para evaluar la
AA incluyen la inhibición de la peroxidación del ácido linoléico, el secuestramiento de
radicales libres, la transferencia de electrones y la quelación metálica. Los métodos que se
mencionan a continuación se utilizaron en este trabajo para la evaluación antioxidante de
17
2.4 Métodos para determinar la actividad antioxidante(AA)
El método usado comúnmente para cuantificar fenoles totales (FT) en alimentos y extractos
vegetales se emplea el reactivo Folin-Ciocalteu. Este método, está basado en la capacidad
de los fenoles para reaccionar con agentes oxidantes de molibdato y tungstato sódico,
formando el complejo fosfomolíbdico-fosfotúngstico,39 Figura 5. La transferencia de
electrones a pH básico reduce los complejos fosfomolíbdico-fosfotúngstico en óxidos, que
son cromógenos de color azul intenso caracterizado con una banda de absorción de máx =
750 nm. Se conoce que la intensidad del color es proporcional al número de grupos hidroxilo
de la molécula.40
PhOH +
[MoO
3][H
3PO
4]
[H
3PW
12O
40]
PhO
.
+ (PMoW11O
40
)
4-Na
2CO
3Figura 5. Reacción de reducción de las sales de molibdato y tugstato por un compuesto
fenólico
Por otra parte, los flavonoides son un grupo de compuestos fenólicos que también pueden
ser cuantificados por métodos colorimétricos. Uno de los métodos para cuantificar
flavonoides totales (FVT) emplea tricloruro de aluminio. Este método se basa en la reacción
entre los iones aluminio y los flavonoides en medio alcalino y en presencia de nitrito de
sodio; formando un complejo de color rosa,41 caracterizado por una banda de absorción con
18
Figura 6. Estructura del complejo tricloruro de aluminio–flavonoide42
Además, los compuestos antioxidantes pueden desactivar radicales libres por dos
mecanismos principales. Uno de ellos implica la transferencia de átomos de hidrógeno
(HAT, por sus siglas en inglés), el otro se refiere a la transferencia de un solo electrón (SET,
por sus siglas en inglés). Además de eso, ambas transferencias pueden suceder al mismo
tiempo. En este caso, el mecanismo dominante estará determinado por la estructura
antioxidante, las propiedades de solubilidad del compuesto, el disolvente y el coeficiente de
reparto, principalmente.43
Así mismo, un método muy usado para determinar la HAT se basa en evaluar la capacidad
del analito para estabilizar al radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH•), Figura 7. La
estabilidad relativa de este radical se atribuye a la deslocalización del electrón
desapareado. Esta deslocalización produce una coloración violeta caracterizada por una
banda de absorción a un valor de máx = 520 nm en disolución etanólica. Cuando una
disolución de DPPH• está en contacto con una sustancia donadora de un átomo de
hidrógeno, o con otra especie radical (R•), se produce la forma reducida H o
DPPH-R, respectivamente con la consecuente pérdida del color original del radical. Para la
interpretación del método se emplea comúnmente el parámetro IC50, que indica la
B
6
A C
B 3´ 4´ 5´ 6´ 3 4 5 7
8 1 1´
2´
Catequina
19
concentración necesaria de la muestra evaluada para obtener un 50% de reducción del
radical DPPH•.
ArOH + pH 5 - 6.6
Figura 7. Reacción de reducción de DPPH• por antioxidantes
Para determinar la AA mediante un mecanismo de transferencia predominantemente de
electrones se emplea el método del Poder Reductor (PR) desarrollado por Oyaizu.44 En
esta técnica, la sustancia antioxidante (por ejemplo el ascorbato), reduce el anión
ferricianuro de potasio [Fe(CN)6]3-a ferrocianuro [Fe(CN)6]4-. El [Fe(CN)6]4- al combinarse
con el catión Fe+3 forma ferrocianuro férrico, denominado azul de Prusia, Figura 8. La
intensidad del color depende de la concentración de antioxidantes presentes en la muestra,
y tiene una banda de absorción a un valor de máx = 700 nm. El valor puede expresarse
como mg equivalentes de ácido gálico (EAG/g ms), IC50 (mg/mL), capacidad reductora CR
20
pH 6.6 buffer de fosfato 0.2M
[
]
2[Fe(CN)6]3- + C6H8O6- 2[Fe(CN)6]4- + C6H7O6 + H+
Ferricianuro Ascorbato Ferrocianuro Dehidroascorbato
Fe3+ + [Fe(CN) 6]
4- Fe
4[Fe(CN)6]3
Ión férrico Ferrocianuro Azul de Prusia
21
3. ESTADO DEL ARTE
En esta sección se da información sobre la obtención de las cepas objeto de estudio en
este trabajo y la importancia del micelio, así como los valores de fenoles y flavonoides
totales y la AA descritos en la literatura para el género Pleurotus.
3.1. Rescate de germoplasma y obtención de nuevas cepas de Pleurotus spp.
El cultivo de las especies de Pleurotus ha sido una de las alternativas que pretende ayudar
a contrarrestar la carencia de alimento de calidad sobre todo en el sector rural de México.
También como alternativa de alimentos para personas que consumen poca proteína de
carne. Por tal motivo, en los últimos años han surgido grupos productores en las distintas
regiones del país. Sin embargo, para extender el cultivo de Pleurotus hacia otras regiones
es necesaria la producción de cepas capaces de crecer y fructificar bajo condiciones
climáticas distintas a las de su hábitat natural, así como de nuevas cepas con características
mejoradas. Una de las alternativas para obtener nuevas cepas, consiste en el rescate de
germoplasma nativo mediante el mejoramiento genético utilizando sistemas de hibridación,
como es el método del acoplamiento de neohaplontes compatibles.
En trabajos previos, en el grupo de investigación del Laboratorio de Bioprocesos,5 se
recuperó el germoplasma de cepas silvestres de Pleurotus spp. (denominadas UTMB y
UTMR) de Huajuapan de León, Oaxaca, México (altitud 1785 m, latitud norte 17°49’40’’ y
longitud oeste 97°48’23’’). Después de desdicariotizar las cepas y recuperar sus respectivos
neohaplontes, se obtuvieron nuevas cepas reconstituidas e híbridas, para evaluar su
22
en el presente trabajo fueron diez: dos cepas silvestres (UTMB y UTMR), dos reconstituidas
(BB y RR), cuatro híbridas (H1-4), y dos cepas usadas como control (RP, Pleurotus djamor;
y UAP, Pleurotus spp.).
Con base en la morfología de las cepas silvestres en el trabajo previo, se realizó la
identificación taxonómica en la Colección de Macromicetos del Herbario de la Facultad de
Ciencias (FCME) de la UNAM, la cepa UTMB de color blanco se identificó como Pleurotus
djamor var. djamor (Rumph. Ex Fr.) Boedijn (número de registro 26234), y la cepa UTMR
de color rosa, como Pleurotus djamor var. roseus Corner (número de registro 26233).5 Los
carpóforos de estas cepas tienen forma de pétalo de flor, píleo liso, asi como consistencia
firme y correosa, Figura 9. El diámetro en el sombrero oscila de 3 a 5 cm y el estípite es
menor a 1 cm.
Figura 9. Carpóforos de a) P. djamor var. djamor (Rumph. Ex Fr.) Boedijn; b) P. djamor
23
3.2 Productividad en el cultivo de Pleurotus djamor
La productividad de diferentes cepas silvestres, reconstituidas e híbridas de Pleurutos
djamor se han estudiado en nuestro país, así como en otros países. Los sustratos
empleados en su cultivo son pajas de cebada, sorgo y trigo,6,46 El tiempo de inicio para la
formación de primordios (Tfp) está en el intervalo de 10 a 37 días y un tiempo de cosecha
total (Tct) entre 29 a 108 días. El peso medio (Pm) oscila entre 0.50 a 8.80 g, la eficiencia
biológica (EB), de 12 a 147% y la tasa de productividad (TP), entre 0.20 a 2.85%, Tabla 2.
Tabla 2. Parámetros de productividad de cepas de P. djamor
Cepa Sustrato Tfp
(d)
Tct (d)
Peso medio
(g)
Eficiencia biológica
(%)
Tasa de
productividad
(%)
País
Nativa6 Pa -- -- -- 20 - 56 0.36 - 1.00 Panamá
Nativa6 Maíz -- -- -- 23 - 53 0.40 - 1.00 Panamá
Parental7 Pc -- -- -- 53 - 86 0.90 - 1.40 México
Parental31 Pc 10 - 13 35 - 108 -- 55 - 73 1-10 -1.70 México
Parental38 Pt 18 33 5.11 58 1.76 México
Parental47 Pts 13 -- 2.17 -- -- India
Silvestre UTMB5 Pt 31 58 0.50 12 0.2 México
Silvestre UTMR5 Pt 16 48 2.60 147 2.80 México
Silvestre var djamor48 Pt 27 - 37 -- -- 62 - 112 -- Argentina
Silvestre var roseus48 Pt 27 - 31 -- -- 89 - 107 -- Argentina
Híbrida7 Pc -- -- -- 74 - 115 1.20 - 1.90 México
Híbrida31 Pc -- -- -- 19 - 85 0.35 - 1.50 México
Híbrida38 Pt 16 29 8.80 81 2.85 México
Tfp: tiempo de formación de primordios. Tct: tiempo de cosecha total. Pa: paja de arroz. Pc: paja de cebada. Pts: paja de trigo suplementado. Pt: paja de trigo.
Como se aprecia en la Tabla 2, las investigaciones enfocadas a la productividad de P.
djamor son países del contienente americano, principalmente México. Todas las cepas sin
importar su procedencia, muestran un amplio intervalo para EB y TP. Esto puede deberse
24
no necesariamente se ven reflejados en TP, ya que este último parámetro involucra la
variación del tiempo del ciclo productivo. El Pm es otro parámetro que muestra un amplio
intervalo de valores tanto en cepas silvestres como las híbridas. Una razón problable sean
los sustratos utilizados, ya que contienen diferente composición y biodisponibilidad. Otro
aspecto que puede influir en la productividad es el factor genético.Hasta el momento, se
tiene escasa información de la productividad de cepas híbridas y reconstituidas. Los pocos
datos con los que se cuenta, muestran que no todas las cepas híbridas logran mejorar sus
características. Así también, no hay una tendencia clara que muestre que las cepas híbridas
mejoran sus características con respecto a las silvestres.
3.3 Importancia del micelio
Investigaciones recientes cuantifican la AA en extractos orgánicos de micelio. Esto se debe
a que, al igual que los carpóforos, es fuente de proteínas, vitaminas, minerales y presenta
diversos compuestos bioactivos tales como polisacáridos, complejos péptido-polisacáridos,
lectinas, triterpenos, fenoles, flavonoides.La producción de la biomasa micelar es continua,
rápida y ocupa menos espacio que el carpóforo.13 Por otra parte, el crecimiento del
carpóforo es un proceso complejo que implica el uso de compostas sólidas, períodos de
cultivo largos y un control estricto en las condiciones de cultivo si se compara con la
obtención de micelios. Los micelios se producen principalmente en cultivos sumergidos con
nutrientes definidos con lo cual se puede producir biomasa de forma rápida.49 Durante la
obtención de micelio se controlan parámetros como temperatura, luz, humedad y pH.Las
investigaciones más recientes se han enfocado a optimizar el proceso de obtención del
micelio porque la cantidad y características fisicoquímicas de los metabolitos secundarios
25
posee propiedades biológicas comparables a las encontradas en los carpóforos de los
hongos. Actualmente dicha biomasa se ha empleado como saborizante, como alimento
funcional y como parte de formulaciones nutracéuticas.8
3.4 Actividad antioxidante (AA) en Pleurotus spp.
Existen algunos reportes del contenido de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
(AA) para la especie P. djamor. La mayor parte de ellos provienen de países asiáticos,
donde también es común su consumo, Tabla 3. Los extractos provenientes de carpóforos
más empleados para la cuantificación de estos metabolitos y su AA, son los extractos
etanólicos, metanólicos y acuosos debido a que los compuestos antioxidantes de interés
son polares. Se puede observar que el contenido de fenoles totales (FT) se encuentra en
un intervalo de 2.25 ± 0.04 a 32.55 ± 0.21 mg equivalentes de ácido gálico por gramo de
masa seca (mg EAG/g ms),9.10 y 27.00 ± 4.89 mg equivalentes de ácido gálico/g de extracto
seco (mg EAG/g ext s).El contenido de flavonoides totales (FVT) de 0.002± 0.0001 a 14.88
± 2.13 mg equivalentes de quercetina por gramo de extracto seco (mg EQ/g ext s) en
extractos metanólico y etanólico, respectivamente de esta especie.11,12 En relación a la
actividad antioxidante determinada por el método de reducción del radical DPPH• se han
reportado IC50 entre 0.065 y 7.25 mg/mL 10,12 y determinada mediante Poder Reductor (PR),
un IC50 = 6.30 ± 0.50 mg/mL.11 El Poder Reductor (PR) también se ha expresado como mg
equivalentes de ácido gálico por gramo de masa seca (mg EAG/g ms), capacidad reductora
(CR) expresado como porcentaje, e índice de capacidad reductora equivalente de
26
Las investigaciones realizadas para cuantificar compuestos fenólicos y AA en extractos de
micelio de P. djamor hasta el momento son nulas. Liang y colaboradores15 reportaron en P.
eryngii un contenido de FT de 12.65 ± 0.82 mg EAG/g ms, un IC50 = 2.47 mg/mL por el
método del radical de DPPH• y un IC
50 = 9.18 ± 0.03 mg/mL con el método de PR. Vamanu16
en P. ostreatus reportó 35.40 ± 6.75 mg/g biomasa y un contenido de FVT de 28.00 ± 5.70
mg EQ/g biomasa. Mientras que para P. ostreatus Ćilerdžiċ y col.17 reportaron un contenido
de FT de 14.41 ± 1.68 mg EAG/g ext s, FVT de 4.42 ± 0.86 mg EQ/g ext s, y AA con el
radical de DPPH• un IC50 de 13.94 mg/mL.
La AA de los carpóforos por el método radical DPPH• y expresada como IC50 = 1.46 mg/mL
es aproximadamente diez veces menor al obtenido a partir de micelio, IC50 = 13.94 mg/mL.
El primer valor de IC50 corresponde a P. djamor y el segundo a P. ostreatus. Esto podría
sugerir que la AA es mejor en los extractos provenientes de los carpóforos. Sin embargo,
la escasa información y la comparacion de valores en especies diferentes no valida esta
suposición y se requiere más investigaciones.
Por otro parte, no hay mención respecto al origen de las cepas a las cuales se evaluó la
AA, si proceden de cepas silvestres o híbridas. Los valores de FT, FVT y PR se han
reportado en diferentes unidades. Así también, las cepas empleadas para la obtención de
los extractos miceliales no pertenecen a P. djamor. Estas diferencias influyen en la variación
27
Tabla 3. Fenoles totales (FT), flavonoides totales (FVT), IC50 y Poder Reductor (PR) de extractos alcohólicos de carpóforos y micelio del género Pleurotus spp.
Especie Extracto
FT (mg EAG/g ms)
FVT (mg EQ/g ext s)
IC50 (mg/mL)
PR
IC50 País
(DPPH•) (mg EAG/g ms) (mg/mL) ICREQ
Carpóforos
P. djamor3 Metanólico 3.6 ND 1.90 ± 0.31 1.9 ± 0.20 ND ND India
P. djamor9 Metanólico
remanente 2.25 ± 0.04 ND 2.87 ± 0.29 ND ND ND India
P. djamor 10 Metanólico 32.55 ± 0.21 1.53 ± 0.11 0.065 ND ND ND India
P. djamor11 Metanólico 27.00 ± 4.89a 2.1E-3 ± 0.10 1.46 ± 0.04 ND 6.3 ± 0.50 ND India
P. djamor var
djamor12 Etanólico 51.94 ± 0.67b 14.88 ± 2.13 7.25 ND ND 0.771 Malasia
P. djamor var
roseus12 Etanólico 43.89 ± 0.99b 5.66 ± 1.92 6.50 ND ND 0.874 Malasia
P. djamor50 Etanólico ND ND 0.12 ND ND ND Colombia
Micelio
P. eryngii15 Etanólico 12.65 ± 0.82 ND 2.47 ± 0.03 ND 9.18 ± 0.03 ND China
P. ostreatus16 Etanólico 35.40 ± 6.75c 28.00 ± 5.70c ND ND ND ND Rumania
P. ostreatus17 Etanólico 14.41 ± 1.68a 4.42 ± 0.86 13.94 ND ND ND Serbia EAG: Equivalentes de ácido gálico. ms: masa seca. EQ: Equivalente de quercetina. aext s. bmg equivalentes de ácido tánico (EAT)/g ext. cmg EQ/g biomasa. ICREQ: Índice de capacidad
28
Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3 Etapa 4
4
. METODOLOGÍA
La metodología que se realizó en esta tesis se dividió en cuatro etapas: 1) Caracterización
del micelio, 2) Productividad de las cepas de Pleurotus, 3) Secado y preparación de la
muestra y 4) Cuantificación de compuestos fenólicos y la AA, Figura 10.
Figura 10. Etapas del presente proyecto de investigación
La metodología general que se empleó en este trabajo se muestra en la Figura 11. Esta
incluye la obtención de micelio y carpóforos, obtención de los extractos metanólicos de las
diez cepas de Pleurotus, y la cuantificación espectroscópica de FT, FVT y AA.
Caracterización del micelio
•Morfología •Velocidad de
crecimiento (Vc)
Productividad de las cepas •Eficiencia biológica (EB) •Tasa de productividad (TP) •Producción de
micelio en medio líquido
Secado y preparación de la
muestra •Secado de carpóforos y micelio •Extracciones metanólicas sólido-líquido Cuantificación de compuestos fenólicos y actividad
29
Figura 11. Metodología general de la investigación
Cuantificación actividad antioxidante, AA
(DPPH•y Poder Reductor, PR)
Secado y molienda Extracción sól-líq MeOH Caracterización del micelio Semilla de Pleurotus Activación de micelio en agar extracto de malta
(AEM) Inoculación en
paja de trigo
Producción de micelio en medio
líquido Incubación y cultivo
del hongo
Micelio
Evaluación
de productividad
Carpóforo
Tasa de productividad (TP) Eficiencia biológica (EB) Extracción asistida por ultrasonido
Morfología Velocidad de
crecimiento (Vc) Limpieza extracción en fase sólida (EFS) Cuantificación fenoles totales (FT) Cuantificación actividad antioxidante, AA
(DPPH•) Extracción sól-líq hexano Extracción sól-líq MeOH Cuantificación fenoles totales (FT) Extracción sól-líq MeOH Hidrólisis
30
4.1 Material biológico
Se usaron cepas del género P. djamor provenientes del cepario de la UTM, las cuales,
fueron aisladas, identificadas y caracterizadas previamente por el grupo de investigación
del Laboratorio de Bioprocesos.5 Las cepas son las siguientes: cepas silvestres (UTMB y
UTMR), cepas reconstituidas (BB y RR), cepas híbridas (H1, H2, H3 y H4) y cepas control
que fueron donadas por el Laboratorio de Cultivos Celulares de la Unidad Profesional
Interdisciplinaria de Biotecnología (UPIBI), (RP, Pleurotus djamor y UAP9, Pleurotus spp.),
Figura 12.
Figura 12. Cepas de Pleurotus utilizadas en esta investigación
4.2 Equipos y materiales
En la parte experimental relativo a la productividad, se empleó lo siguiente: Campana de
flujo laminar Labconco Clean Bench 36125-00, incubadora Riossa, incubadora de agitación
orbital VWR®, microscopio Iroscope MG-11P1, centrífuga Eppendorf 5810 R, refrigerador
General Electric Smart RG19X1MA, congelador Torrey CVPS21, autoclave Presto,
(Pleurotus djamor var. djamor) (Pleurotus djamor var. roseus) Silvestres
(parentales)
UTMB UTMR
Reconstituidas
BB RR
H1 H2 H3 H4 Híbridas
RP UAP Controles
(comerciales)
31
licuadora Osterizer dos velocidades, mechero Fisher, balanza granataria OHAUS Triple
Beam TJ2611, vernier MetroMex Scala, termohigrómetro TFA Dostmann Wertheim,
cronómetro Cole-Parmer®, cajas Petri.
En la parte experimental que involucró a la AA: Molino ciclónico FossTM Cyclotec 1093,
ultrasonicador-degasificador cleaner SB-3200 DTN, rotavapor Heildoph Laborota 4000,
campana de extracción Manufacturera metálica Argos, efficient, bomba de vacío
Vacuubrand MZ2C, lector de microplacas Synergy HTX BioTek®, balanza analítica Ohaus
Pioneer PA214, termobalanza SartoriusTM MA45, C18 de Burdick & Jakson, vórtex
Barnstead International type 16700 Mixer e IKA®, placas de 96 pozos Costar de media área
de fondo plano de poliestireno, micropipetas de volumen ajustable, micropipeta multicanal
Accumax. El secado de las muestras se realizó en un deshidratador de charolas giratorias,
construido en el Instituto de Agroindustrias de la UTM.51 En toda la parte experimental se
empleó: material de vidrio, parrillas de calentamiento Barnstead Thermolyne CIMAREC®,
micropipetas de volumen ajustable,
4.3 Reactivos, disolventes, medios de cultivo y sustrato
Ácido gálico monohidratado 98%, 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH•), KH2PO4 (fosfato de
potasio monobásico) 99%, MgSO4•7H2O (sulfato de magnesio heptahidratado) 98%, (±)
ácido-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico (trolox) 97%, K3Fe(CN)6
(hexacianoferrato (III) de potasio) 98.5-102.0%, y quercetina ≥95%,
2,6-di-tert-butil-4-metilfenol (BHT), rutina ≥94%, fueron adquiridos de Sigma-Aldrich®. AlCl3 (cloruro de
aluminio) en cristales 97.8%, fue comprado en J.T. Baker®. FeCl3 (cloruro férrico) en trozos
32
trihidratado) 99.7%, CCl3COOH (ácido tricloroacético) 99%, fueron de Reactivos Química
Meyer; reactivo Folin-Ciocalteu 2 M fue de la marca Fluka; Na2CO3 (carbonato de sodio)
anhidro en polvo 99%, NaNO2 (nitrito de sodio) granular 97% y C6H12O6 (glucosa) anhidra
fueron de la marca Productos Químicos Monterrey; NaOH (hidróxido de sodio), K2HPO4
(fosfato dibásico de sodio) anhidro fue obtenido de Wako Pure Chemical Industries;MeOH
(metanol) 99.8%, EtOH (etanol) 99.9% y cloruro de benzalconio 50% fueron comprados de
Reasol. Agar extracto de malta (AEM) fue de la marca Dibico; agar bacteriológico, extracto
de levadura y peptona fueron de la marca Bioxon. Hipoclorito de sodio comercial de la
marca Cloralex. Grano y paja de trigo. Los disolventes, incluido el agua, se destilaron y
degasificaron antes de ser usados.
4.4 Preparación de medios de cultivo
4.4.1 Medio sólido en agar extracto de malta (AEM) para crecimiento micelial. Se
disolvieron 20.0 g de agar bacteriológico y 15.0 g de AEM en 1 L de agua pasada por
ósmosis inversa. La disolución se esterilizó en autoclave a 121 °C, 15.65 psi por 20 min.
Esterilizada la disolución, se colocó 10 mL de medio AEM en cajas Petri e incubaron a 28
°C por 24 h para comprobar su esterilidad. Las cajas con agar, libres de contaminación, se
almacenaron en la incubadora hasta su empleo posterior.
4.4.2 Medio para producción de micelio en cultivo líquido.52 Se disolvieron 20 g de
glucosa, 1 g de extracto de levadura, 1 g de peptona, 0.6 g de K2HPO4,1 g de KH2PO4 y
0.5 g MgSO4•7H2O en 1 L de agua destilada. En matraces Erlenmeyer de 500 mL se
33
a 121 °C, 15.65 psi por 20 min. Una vez estériles, se dejaron en reposo a temperatura
ambiente por 24 h para asegurar su esterilidad.
4.5 Caracterización de la morfología y el crecimiento micelial de cepas de P. djamor
en medio sólido AEM53
Se utilizó AEM como medio de cultivo sólido para realizar el crecimiento micelial de las
cepas.El micelio de las cepas se mantuvo activo realizando resiembras en AEM cada 21
días y se incubó en la oscuridad a 28 ± 2 °C. Para confirmar que los micelios resembrados
pertenecían a las cepas de interés se hicieron observaciones en el microscopio de las
fíbulas (estructuras formadas durante la etapa de crecimiento celular en células dicarióticas)
presentes en las hifas septadas. Una vez que el micelio invadió por completo el medio sólido
de AEM contenido en la caja Petri se hizo la caracterización visual de la morfología micelial.
Las características que se evaluaron fueron textura (algodonosa o floculosa), densidad
(alta, regular o baja), color (transparente, blanco o rosa pálido) y forma de crecimiento
(escaso, regular o abundante).
Para la caracterización del crecimiento micelial de las cepas en medio AEM, se determinó
la velocidad de crecimiento micelial (Vc). Para ello se transfirieron fragmentos de 8 mm de
diámetro de micelio de cada cepa a cajas Petri (90 x 15 mm) con 10 mL de AEM y se
incubaron en oscuridad a 28 °C. El crecimiento micelial acumulado (Cma) fue determinado
midiendo diariamente con un calibrador vernier el diámetro de la colonia hasta completar la
invasión de la caja.31 Se evaluó el crecimiento micelial en medio sólido desde el inicio de la
inoculación hasta la invasión total de la caja (10 días aproximadamente). De este
34
el tiempo (d), y se obtuvo un ajuste lineal correspondiente a la ecuación (ejemplo: y =
0.8877x - 0.6933 con R2 =0.981). Por lo tanto, la velocidad de crecimiento se estimó
calculando la pendiente (m) de la ecuación de la curva:
y1 = mx1 + b
Donde y1 es el diámetro de Cma expresado en cm, x1 es el tiempo expresado en días (d) y
m es la velocidad promedio de crecimiento micelial (Vc) expresado en cm/d.5 Las
velocidades de crecimiento micelial promedio se obtuvieron a partir del promedio de cinco
repeticiones por cada cepa ± desviación estándar.
4.6 Productividad de las cepas de P. djamor
4.6.1 Producción del inóculo de grano de las cepas de P. djamor. La preparación de la
semilla (grano de trigo) se realizó de la manera siguiente: se limpió el trigo eliminando
impurezas y se remojó en agua por 24 h a temperatura ambiente. El trigo se lavó varias
veces para eliminar azúcares fermentados, se pesaron 150 g del grano hidratado y se
colocaron en bolsas de polipapel (20 x 30 cm). Se esterilizaron a 121 °C, 15.65 psi durante
40 min. El grano de trigo contenido en las bolsas fue inoculado en condiciones estériles y
combinado con el contenido de la mitad de una caja invadida con micelio a temperatura
ambiente. Se eliminó todo el aire posible y la bolsa se amoldó para formar un cilindro de 3
cm de diámetro x 10 cm de altura aproximadamente. Las bolsas inoculadas fueron selladas,
etiquetadas e incubadas en la oscuridad a 28 ± 2 °C y posteriormente se esperó hasta que
el micelio invadiera al grano en su totalidad. Para cada cepa se realizaron ocho réplicas ±
