Así mismo, hacemos de su conocimiento que el retraso en la entrega del reporte hal

. .

- '

/Nombre : RnIDo SANCHEZ MONICA ALEJANDRA Matrinili : 93329665

JLicencLtun: INGENfERlA DE LOS _ALIMENTOS

UNIDAD IZTAPALAPA

/DIVISION CIENCIAS BIOuxilCAS Y DE LA SALUD.

Fecha i n i i .

,/Fecha de brainieióa :

Claw :

Nombre h y e c t o :

6.73.32.52 97-0

20 Horas

.

2 DE OCTUBREDE 1997. 2 DE ABFULDE 1998

1

IA056.97

INTRODUCCION; ADAFl'AClON Y DESARROLLO DE LA "ECNOLWIA DEL CULTIVO DE LA

TA DE AGUA DULCE (Cherm quadncMn0fusl

Firma aiumno:- Pulid

i

cUib*<pdmpO

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

DiviSdN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Y

DE

LA

SALUD Departamento de Biotecnología

Area de Microbiologia

3 de Noviembre da 1998.

DR. JOSE

LUIS

ARREDONDO FIGUEROA

DIRECTOR, DIVISION CIENCIAS BIOLOGICAS

Y

DE

LA

SALUD

P R E S E N T E

Por

medio de la presente, le comunicamos que la alumna Mónicn Alejandra Pulido Sánehez,

matricula 93329665 de la carrera de Jngeniena de los Alimentos, desarrollo y concluyó satisfactoriamente el proyecto y reporte find del trabajo titulado: “CARACXERIZACION DE PEPTIDOS OBTENIDOS A PARTIR DE LA RECUPERACION DE PROTEMA DE SUBPRODUfXOS DE U INDUSTRU PESQUERA, MEDIANTE LA HIDRÓLISIS ENZIMATICA CON ALCALASA”. Dicho proyecto se realizó

en la planta piloto 4 del departamento de Biotecnología, bajo nuestra dirección y supervisión.

Así mismo, hacemos de su conocimiento que el retraso en la entrega del reporte h a l se debió a la necesidad de la repetición de ensayos durante el desarrollo del proyecto.

Sin otro particular, aprovechamos la ocasión para reiterar a usted nuestra más atenta consideración.

~

A T E N T A M E N T E ‘Tasa abierta al tiempo”

Dra. Li

Y

ia Arely Prado Barragán

Profesor Titular Profesor Titular

UN I DAD IZTAPALAPA

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD SERVICIO SOCIAL

8 '

A

QUIEN , , CORRESPONDA:

I Por medio de la presente se hace constar que el (la):

DR. SERGIO HUERTA OCHOA del Departamento de BlOTECNOLOGíA

de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social:

TITULO Caracterización de péptidos obtenidos a partir de la

recuperación de proteína de subproductos de la industria pesquera, mediante la hidrólisis enzimática con alcalase@

ALUMNO Pulido Sánchez Mónica Alejandra

MATR~CULA 93329665

LICENCIATURA Ingeniería de los Alimentos

PERIODO

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de MBxico, D.F. a veinticinco de Noviembre de mil novecientos noventa y ocho.

A T E N T A M E N T E 'Cara Abierta al Tiempo"

Octubre 2, 1997 a Noviembre 3, 1998.

I

. , , .

P

s-

‘31.

N I C E

Pig.

INTRODUCCI~N ... I

*

CONCEPTOS GENERALES ... 1

&TODOS

DE OBTENCI~N DE HIDROLIZADOS DE PESCADO ... EL PROCESO DE HIDR~LISIS

Y

su

CONTROL ... ... 8

CARACTER~STICAS GENERALES DE LAS ENZIMAS ...

...

9

PROTEAS AS.. ...

...

.... 11

CII&TICA DE LAS REACCIONES CATALEADAS POR ENZIMAS ... 13

FUNDAMENTO DE UNA HIDR~LISIS ENZIMÁTICA 16 SELECCI~N DE LA ENZIMA A UTILIZAR ... 19

ELECTROFORÉSIS EN GEL DE UNA D~MENSI~N ... OBJETIVOS.. ... .<.. ... ... ... ... 23

MET

OD

O LOG

í~

... ... 24

ANÁLISIS BROMATOLÓGICO ... ... 24

PREPARACI~N DE SUSTRATOS ... ... ... 24

PREPARACI~N DE LA SOLUCI~N DE ENZIMA 24 ~ ... _i

TRABAJOS PREVIOS

REALIZADOS

EN HEMOGLOBINA ... 24

DETERMINACIÓN

DE L A CIh.ÉTiCA EKZIMÁTICA DE .ALCALASE @ UTiLIZANDO COMO

SUSTRATO

DESECHO DE PESCADO ... MÉTODO ELECTROFORÉTICO ... 28

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS ... ... 30

... 31

RESULTADOS Y DISCUSIONES.. ... 31 ANÁLISIS BROMATOL~GICO ... CARACTERIZACI~N DE LA ENZIMA ALCALASE @ UTILIZANDO~~MO SUSTRATO ALTERNO

HEMOGLOBINA.,

... CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA ALCALASE @

UTILIZANDO

COMO ... 32 38 SUSTRATO DESECHO DE PESCADO ...

MUESTRAS

DE

HIDR~LISIS

EN

EL:GEL SDS-PAGE ... 50

51

usos

ALTERNATIVOS DE LOS

HIDROLIZADOS

DE PROTEÍNA DE PESCADO ... ... CONCLUSIONES ... ... 52

RECOMENDACIONES.. ... 53

BIBLH)GRAF~. ... ... 54

INTRODUCCION

CONCEPTOS G~NERALES

PROTEiNAS

DE

ORIGEN

ANIMAL

Los

productos de origen animal (came, pollo, pescado, lácteos y huevos),

han

incrementado

en la dieta de los seres humanos desde un 5 0 9 ? en 1910 hasta UII 66%

en

1970, y el

porcentaje se

ha

estabilizado en ese nivel (Altschul, 1981)

.

La proteína de origen animal es única como

una

fuente nutricional de proteína para el ser

humano

E

l

consumo de proteína animal varía de menos de 10 g/cap/día

en

algunos países

no industrialidos hasta más de 60 g en países indumialízados. Se vuelve entonces

indispensable asegurar para toda la población

la

alimentación adeeurdq por lo que se tiene

que incrementar tiempo,

esfuerzo

y mejorar la tecnoiogk (Aitschut, 1981).

Sin

embargo, en un estudio mundial sobre la alimentación y n u ~ c i ó n (NRC,1977) se

ha

observado que alrededor de 450 millones de

persona,

no reciben la alimentación suficiente.

En algunas sociedades,

el

4O?h de los niños mueren antes de

llegar

a los 5 años

principalmente

por

causas de mal nutrición

IMPACTO MJTRICIONAL DEL CONSUMO DE PROTEINA

El ser humano

posee

en su tracto gastrointestinal, enzimas proteolíticas (entre otras) que

hidrolizan a las proteínas en sus constituyentes “aminoácidos”. Estos aminoácidos son

absorbidos por las células de la mucosa intestinal a través de un mecanismo selectivo.

En trabajos realizados por

Nasset

(1962), se demostró que antes de que las proteínas pudieran ser absorbidas por el tracto gastrointestinal, este debía secretar no solamente

enzimas digestivas, sino también mucoproteínas y mezclas de aminoácidos que constituyen una “matriz molecular” a través de la cual las proteínas provenientes de la dieta pueden ser absorbidas

Así,

las proteínas endógenas aparentemente regulan la concentración de

aminoácidos disponibles para la absorción de las proteínas ingeridas. Mediante este mecanismo el ser humano se provee de las cantidades y concentraciones óptimas de aininoácidos para la &tesis de otias proteínas biológicas, sin embxgo, se ve modificado por el estado de salud 5 el estado nutricional del organismo

Urn mgestión de mezclas incompletas de proteína de bajo _valor biológico, trae como consecuencia una mala absorción de las mismas por el tracto gastrointestinal (Harper,1974) El consumo de “cantidades adecuadas de proteína animal” es una ventaja

nutncional ya que se pueden sintetizar

hormonas

y &mas. Después de que los aminoácidos son canalizados al hígado, comienza

una

síntesis de un gran complejo de proteínas y lipoproteínas,

las

d e s

son

utilizadas por el organismo para la formacibn de

céluias nuevas

y para reemplazar

las

células viejas

’

VALOR

3IOLÓGICO

DE

LAS

PROTEINAS

d

.

Para poder apreciar

la

contribución de la proteína animal en la nutrición, debemos

considerar el

concepto

de valor

biológica

de

las

pmiehs.

E

l

valor biológico de

una

proteína se expresa como el porcentaje de nitrógeno absorbido

retenido por el organismo para el mantenimiento de los tejidos y la integridad de

los

órganos

El valor biológico

es

función

de

la composición de aminoicidos (Gutbrie, 1979). Mientras más aminokidos esenciales pmea un alimento, mayor será su valor biológico (Albanesc y

Orto, 1973) En la tabla I se representa el valor biológico de fuentes de proteína animal Así, el consumo de protei^ animal, combmadas adecuadamente con otros nutrienies (proteínas de ongen vegetal) provee de los aminoácidos d o s para O p t ¡ las condiciones fisiológicas y metabólicas (Finot, 1973)

TABLA

I.

Valor

biológico de proteínas representativas.

‘

CALDDAD PROTEICA DEL PEsCADo

En la d i d a d

es

reconocido el alto vaior nutritivo del pescado, hecho que se debe al gran contenido de aminoácidos esenciales en sus proteínas, las que,

por

tal motivo, se consideran de

una

excelente calidad El contenido de aminoácidos esenciales del pescado, se ha

comparado con el de otras fuentes proteicas de origen animal o vegetal, resultando que el valor nutritivo de &e

es

similar, y en algunos casos supefior, ai de los estándares internacionales, como se desprende de la tabla comparativa

il

(Rivera, 1990)

' TABLA

ii.

Comparación del perfil de aminoácidos de diferentes fuentes proteicas con

el de estándares internacionales

.

*

MACARELA Shing Sbm Jey 1981

Cálculos globales indican

un

volumen potencial de captura mundial de pescado, entre 5 y

16 millones de toneladas al año (Yañez, 1984), cifra que coloca al

pescado

como el

recurso

con el potencial más alto para ser utilizado como materia prima en la elaboración de productos proteicos.

En la tabla III, se muestra el porcentaje de tejido muscular de diferentes especies, y se observa que este porcentaje es mayor en el pescado que en

res

o pollo. Tan solo la cantidad

de

energía obtenida de un pescado es equivalente a 113 de la obtenida de una

res

o un cerdo (Altschul, 1981)

TABLA iii. Porcentaje de tejido muscular de diferentes especies.

ESPECIE DESECEO

TEdIDo

MUSCULAR.

-,.;

.4

NI

M .4 L

("A)

("/I

(keaü100 g)

. ....

Pescado

f"'

_13.7

-- 80.9 I12

Cerdo

I

- 7 1 31 402

._

. . . 51 - 323

ReS 15

Pollo _{32 64.7} 84

. . . .. ..

lavcllyAmmrrmao(1974)

La

cantidad de proteha contenida en el pescado varía

de

d o

a

las divasas especies, como se desprende de la composición bromatológica que se presenta ai

la

tabla

N.

TABLA

N

Análisis bromatológico de algunas especies de pescado

.

De una pesca mundial anual de 71 millones de toneladas, 20 millones son capturados

específicamente para su conversión en harina de pescado y el resto, posiblemente mfmos del SO??, es actualmente usado en fiesm para la alimentación humana. Muchas especies de pescado usadas para la manufactura de harina, están limitadas al

uso en

la formulación de alimentos para animales, ya que la harina no posee las

características

funcionales y organolépticas necesarias para ser incorporada en la alimentación humana, o en

la

manufactura de otro tipo de productos en

los

que se usen materiales proteicos, además de que no es soluble, ni dispersable en agua, y de poseer un olor desagradable y un bajo valor

agregado en general

A nivel internacional, al igual que en México, se han planteado alternativas para la industrialización deespecies de pescado no utilizadas, así

como

de los desechos del mismo

En

nuestro país, se pueden señalar los intentos de Productos Pesqueros Mexicanos, S A de C

V

(1979) para introducir en el mercado nacional pulpa de pescado para consumo inmediato, también

se

ha intentado producir pastas de pescado en las que se usa como materia prima principal la pulpa de pescado, a la que se le adiciona sazonadores y

aglutinantes, i.palmente se ha intentado introducir pastel de pescado, salchichas de prwdo, _jamón de pescado (Bojorquez, 1979), sin obtener el éxito esperado al encontrar

como barrera el rechazo de estos productos por parte del consumidor, debido a los habitos

Por io ant& se

&ve

necesario busur altanativas

pan

el mejor tprovscbrm#ai

.

ode

este recurso, lo cual se puede lograr a través del desarrollo básico

de

tecnobgh que

permitan obtener un producto de mayor valor agregado y con una gama de aplicaciones más amplia y novedosa que los intentados hasta ahora (Rivera, 1990), una posibilidad

atractiva es la abstención de hidrolizados de pescado con

las

cualidades nuttitivas,

organolépticas y funcionales necesarias para su adecuado aprovechamiento

HIDROLIZADOS DE PROTE~NA

d

Las proteínas al ser hidrolizadas, forman agregados de diferentes

pesos

moleculares (tabla.

V),

entre los que se encuentran péptidos, mezclas de péptidodamino8cidos, mezclas de aminoácidos libres (Braun, 1994)

TABLA

V.

Productos del hidrolizado de proteína

'Rotdos&suao bHiQoliLadourmaculpodunQpg.DatowSpeQihta,NY

= p e s o m o l & d € i ~ p G l H P L c

Los

hidrolizados de proteína poseen un gran número de propiedades funcionales, lo cual los

hace atractivos

como

una fuente de proteína para la nutrición de los seres humanos (Sven

Fr~kjaer, 1994)

La proteína del pescado ha sido puesta a pnieba,

en

diferentes estudios como matexia prima para

la

producción de hidrolizados (Lalasidis, 1978) Los hidrolizados de proteína

de

pescado podrían ser incorporados en alimentos tradicionalmente consumidos por el ser

humano, podrían ser utilizados en la formulación de alimento para el ganado, para la

agricultura

Así

mismo, podrían ser usados

en

la formulación de.medios de cultivo para

microorganismos, como sustrato en proceso fermentativos, en medios para el cultivo de tejidos, en la estabilización de vacunas,

en

productos veterinarios, como atrayentes de

insectos, en cosmetología y en la elaboración de dietas especiales para pacientes con

pru'.iemas de absirición intestinal o para fenilcetoníiricos (Rivera, 1390)

Sin embargo, si se pretende utilizar los hidrolizados proteicos en la industria alimentaria,

estos deben ser preparados por métodos que conserven sus cualidades nutritivas, por esta razón el proceso de hidrólisis debe realizarse en condiciones controladas @vera, 1990).

MÉTODOS

DE

OBTENClbN

DE

HlDROLIZADOS

DE

PESCADO

Los

procesos tradicionales para solubilizar proteína de pescado involucran el colocar el pescado en contacto con altas concentraciones de sal en grandes tanques de concreto, en donde la proteólisis ocurre espontáneamente por acción de las enzimas presentes en el

pescado, lográndose que aproximadamente el 50% de la proteína sea convertida a su forma

soluble, estos procesos tienen una duración aproximada de un año

en

promedio dando como r e d d o un líquido café claro el cual es separado del material sólido residual (Rivera,

1990)

Las desventajas de estos proceso son la siguientes

a) Por ser necesario una largo periodo

de

fermentación, los costos

de

producción son elevados,

b) Se tienen bajos rendimientos (5Ph de hidrólisis);

c) Una gran cantidad de proteína es desperdiciada por la baja eficiencia del proceso; d)

La

producción de

los

compuestos que

dam

el sabor y aroma no

es

controlada; e)

No

son utilizados pescados que son considerados de desecho, y

f)

Es

necesario utilizar altas concentraciones de sal para evitar

la

contaminación microbiana

.

a) HIDR~LISIS QU~MICA

Se ha intentado solubilizar la proteína de pescado por medios químicos (Tannembaum,

1970), se ha visto que los productos obtenidos les falta el sabor característico de los fermentados tradicionales, por lo que no son aceptables.

La

hidrólisis ácida o alcalina

-

que

es un método puramente químico

-

puede destruir los aminoácidos con forma “L“

produciendo D- aminoácidos, e incluso formar sustancias tóxicas como la lisino-alanina.

(Lahl y Grindstaff, 1989). Esto es especialmente perjudicial para los hidrolizados.de

proteína, donde las proporciones de aminoácidos, dipéptidos, y-tripéptidos, son críticas para obtener una absorción efectiva de _los mismos (Matthews et al, 1976). Tanto _en los

procesos ácidos como alcaiinos la principal desventaja, es el hecho de que posteriormente es necesario neutralizar el sobrenadante obtenido,

lo

que provoca que

los

‘costos se eleven

(Rivera, 1990). Un hidrolizado obtenido por métodos químicos presenta una composición de aminoácidos diferente a la de la proteína de la cual deriva, esto es por que se da una racriniz~zción y des?mcción de alpnos aminoácidos (serina, cisteína; metionina, trionina)

(BaSo~i, 1976) Este efecto es

nihs

pronunciado con la presencia de otros conlpuestos, especialmente carbohidratos. Después de una hidrólisis ácida, la glutamina y asparagina se

convierten en sus respectivos ácidos (Finot, 1973).

I

b) HlDR6LISIS ENZIMATICA

Considerando los problemas que se suscitan con la hidrólisis química, Roe1 en 1969 evaluó la posibilidad de realizar la solubilización directa de un coflcentrado protéico de pescado con ayuda de microorganismos. En el mismo año, Hale estudió el comportamiento de 20

&mas proteolíticas comerciales en la hidrólisis de proteína de pescado, encontrando que, la más activa &e la pepsina.

En 1973 Ar8er observó, en un sistema de

hidrólisk

de proteína de pescado, con

una

proteasa de Bacillus subtilis, que .el aumento de la cuenta microbians podía controlarse modificando el pH, encontrando que en condiciones de aidkidad el crecimiento microbian0 se detuvo totalmente.

Ante el hecho de que

en

varios sistemas involucran la interacción de

una

enzima soluble y un sustrato insoluble,

la velocidad de reacción es proporcional

a la cantidad de

enzima

absorbida, Archer evaluó sí esto se presentaba en d sistema con

&lo

de pescado, encontrando que

la

enzima interacciona con el sustrato a b s o r b i i rápidamente en las partículas sólidas, dando como resultado la solubilizaci6n de la prokina y _{posteriormente} la proteolísis de los fragmentos de proteína en solución.

La hidrólisis enzimática es un método válido para la recuperación de proteína de subproductos de la industria alimenticia. Ésta tiene diversas ventajas sobre la hidrólisis química, ya que gracias a UM proteólisis controlada, es posible obtener perfiles de péptidos

bien definidos, pues se puede manipular la hidr6lisis y _las

propiedades

de los prdluctos resultantes (Lahi, 1994).

La hidrólisis enzimática de proteinas es un proceso complejo que depende de la temperatura, pH, agitación, concentración de enzima y _{de proteína}

Varias

enzimas son ahora conocidas comercialmente con variables

pH

óptimos, desde pH 2

de la pepsina hasta pH 8.5 de Alcalase (3.

La

pepsina y la bromelina son activadas óptimamente a pH neutro y a temperatura de 7PC, una temperatura arriba de la temperatura de sobrevivencia de muchas bacterias.

En general, el pescado es mezclado con la enzima en el recipiente de digestión, después se adiciona un volumen igual de agua, una vez que la hidrólisis ha sido completada la mezcla es calentada a IOPC para inactiva la enzima y para esterilizar la suspensión.

Los

huesos

son removidos por un tamiz. Esta suspensión contiene residuos insolubles en una solución

de aniinc.kidos y péptidoc la cual es coiicenlrada y secada. Aiternativmente la sucpención puede ser separada en una fiacción soluble y una insoluble por centrifugación. La fracción

soluble obtenida es concentrada y secadawvera, 1989).

~~

En condiciones de digestión

para

la enzima, el tejido

dd

pescado convertido rápdamente

de

una

mezcla viscosa

a

un líquido libre fluido después de unos pocos minutos. Subsecuentemente la proporción de hidrólisis disminuye entrando

a

una

fase

estacionaria sin UM hidrolisis aparente,

tal

cinética

es

típica del hidrolizado del músculo de pescado(Rivera, 1989)

EL PROCESO DE HIDR~LISIS Y

su

CONTROL

d

La

hidrólisis de proteína a escala comercial, generalmente se lleva a

cabo

en procesos "Batch, utilizando grandes recipientes en donde existe la mezcla del sustrato con la

-

enzima.

El proceso puede

ser

controlado a través de los parámetros de hidrólisis.

En

la

producción comercial, los parámetros críticos a controlar son-nincipalmente tempenaira, tiempo, pH y grado de hidrólisis. I& condiciones de hidrólisis son controladas

con

el

fin de obtener características específicas tales como son distribución

de

aminoácidos, distribución de pesos moleculares, y la cantidad de proteína resimial intacta. La tempemtun de procesamiento se selecciona normalmente para OptimUar la cinética de la enzima

seleccionada.

El

pH de operación también es determinado

para

encontrar un rango óptimo en donde la enzima tenga una máxima actividad.

La

elección de

una

enzima, tmbién esta determinada por

la

combinación de su eficacia y economía. Una concentración elevada de enzima puede ser utilizada para incrementar la velocidad del proceso de hidrólisis

(Lahl, 1994).

Otra consideración que se tiene que tomar en cuenta durante la hidrólisis, es el crecimiento

de microorganismos. Actualmente el problema de UM infección es controlada con

procesos más rápidos, con un mayor control en la temperatura y pH, y una mayor atención a

las

condiciones sanitarias (Braun, 1994).

El material

y condiciones de hidrólisis deben ser también controlados para cuidar el sabor, solubilidad y ciertas propiedades físicas del hidrolizado.

U

sabor de los hidrolizados

proteicos enzimáticos se caracteriza por un sabor amargo el cual se asocia a la presencia de péptidos cuyos procesos moleculares son bajos y cuyas -denas tienen grupos aminoácidos hidrofóbicos (Nagodawithana, 1993). Según la regla Q,.formulada por Ney en 1971, un péptido presentará un sabor más amargo si su hidrofobicidad (Q) se encuentra por arriba de

1400 caUmol, y por el contrario, no presentará un sabor amargo, si este valor se encuentra

por debajo de 1300 cal/mol.

'

Eyisten, al menos, 5 variables que influyen en la obtención de péptidos amargos [Adier-

Nissen, 1986):

1.

La

hidrofobicidad del sustrato;

2.

El

grado de hidrólisis, el cual influye en la concentración y longitud de los pkptidos

hidrofóbicos solubles;

3.

La

enzima, la a>al

en

combinación con

el

grado de hidrólisis influye

en

la distnaucón de los péptidos hidrofóbicos;

4

La

especificidad de la enzima, ya que influye en cierto grado en la posición de las cadenas hidrofóbicas (teminales o no terminales); y

5 Cualquier método de separación involucrado en el proceso de hidrólisis' (Nagodawithana, 1993).

CARACTEI~STICAS C E N E ~ L E S

-

DE

LAS ENZIMAS

Una enzima se define como un polipéptido, que _cataba una reacción con cierto grado de. especificidad (Nagodawithana, 1993)

Todas

las

enzimas son proteínas

La

funcionalidad de las enzimas

es

consecuencia directa de la secuencia de aminoácidos de la proteína (estructura primaria), del doblamiento del polipéptido (estmctura secundaria), de las interacciones entre

los

aminoácidos de las cadenas por fuems electrostáticas

e

hidrofóbicas y

por

puentes disulfuro (estructura terciaria) y del arreglo espacial de las subunidades de proteína (estructura c u a t k a )

E

l

tamaño molecular de las enzimas varia, aproximadamente, de entre 13,000

a

varios millones de Daltons, sin embargo la mayona de ellas presenta un peso molecular entre 30,000 y 50,000 Daltons (Page, 1987)

A pesar de que las enzimas son proteínas que contienen cientos de residuos de

aminoácidos, sólo unos pocos residuos están involucrados directamente en la unión

con

sus

Sustrato

La

naturaleza de la reacción que es catalizada por una enzima es dependiente del reconocimiento de los aminoácidos que constituyen el sitio activo Estos residuos determinan la especificidad de la reacción y su mecanismo

L o s

otros residuos de aminoácidos de

la

cadena de polip6ptido dan la adecuada orientación espacial entre el sitio activo y el sustrato (Nagodawithana, 1993)

Una de las principales características de las enzimas es que son catalizadores de reacciones

La

catálisis se define como la aceleración de un proceso que podría

ser

más lento, bajo ciertas condiciones Esta propiedad junto con la de especificidad, son de los principales critenos para seleccionar una enzima Los mecanismos de acción más comunes en la catálisis enzimática, comprenden comportamiento ácido-base, neutralización de cargas, ataque nucleofilico y electrofilico, entre otros

Los

mecanismos de las reacciones hidrolíticas involucran la formación de un intermediario enzima-sustrato (Nagodawithana,

1993)

La especificidad de una reacción enzirnática es consecuencia directa de la estructura del sitio activo y del sustrato (Page, 1987).

La

estructura o forma del sustrato, son muy importante para que la enzima lo reconozca.

Los

residuos de aminoácidos cercanos al sitio activo, pen, que no están involucrados directamente en la catálisis, también juegan un papel importante en proveer el acceso al sustrato.

REPRESPTTACIÓN

ESQUEMA’IICA DE UNA ENZlMAUPARIE

SOMBREADAC0RREs”DE

ALSITIOACTIVO

EFECTO DEL ENTORNO EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

.

Las

reacciones catalizadas por enzimas dependen de las reacciones del entorno, estas características son importantes en sistemas y procesos alimenticios,

en

los cuales, existe un amplia gama de condiciones El conocimiento de cómo una reacción enzimática es afectada

por su entorno, es indispensable para poder optimizar o controiar cuaiquier proceso

enzimático (Nagodawithana, 1993)

Los principales factores que afectan la actividad enzimática son pH, temperatura y fuerza

iónica

El efecto del pH en las reacciones enzimáticas, es causado por

una

ionización reversible del sustrato o los aminoácidos de la enzima, estos efectos se manifiestan como cambios en la actividad enzimática, estabilidad o como

un

cambio en el equilibrio de la reacción.

Los

efectos del pH en las enzimas, también dependen de la presencia o

ausencia

de iones específicos, temperatura, constantes dieléctricas y fuerza iónica.

El

pH óptimo de las enzimas puede variar en un amplio rango, así por ejemplo podemos encontrar enzimas cuyo pH óptimo sea 2 (pepsina) y otras cuyo pH es 10 (fosfatasa alcalina), sin embargo la

iiia) oria de l a s eiiziiiias presenian tin pH óptimo neutral (Whitaker, 1994)

.

.,

Los

efectos espcdficos

de

los dectroliios dependen de las conaatracicmeS

de

i0r wptcs que estabilizan, activan, inactivan, o inhiben una &ma particular Los iones metálicos son

muy importante ya que ellos son cofactores o cosustratos para

las

reacciones enzimáticas, y otros pueden inactivar a las enzimas (Nagodawithana, 1993)

La temperatura es un factor importante en la actividad enzimática

En

general, la velocidad de la reacción incrementará con la temperatura

La

energía de activación de

un

proceso

puede ser calculada según la ecuación de Arrhenius. Con un incremento

en

la temperahira, la movilidad de los segmentos de proteína aument* mientras la fuerza de las interacciones

hidrofóbicas disminuirá Esto trae como consecuencia un decremento en la actividad catalitica, y si aumentamos más la temperatura habrá

una

desactivación La desnaturalización térmica de una proteína trae consigo una agregación de

la

misma la cual

.

no es siempre reversible La temperatura óptima de operación

es

menor si el tiempo de reacción

es

mayor (Draw, 1995)

PROTEAS AS

Las proteasas utilizadas para procesos alimenticios, catalizan la degradación de p&nas, que provienen de las siguientes fuentes principalmente

Pueden estar presentes en el alimento,

Pueden ser excretadas por microorganismos que se encuentren en el alimento,

Las proteasas se clasifican de acuerdo a

su

fuente (animal, vegetal, microbiana),

su

acción

catalítica

(endopeptidasas o exopeptidasas), y la naturaleza del sitio catdítico.

En

la

nomenclatura internacional,

las

proteasas (o hidrolasas peptidicas) se encuentran en la subclase 3 4, la cual se divide en 3 4 11-19 para las exopeptidasas, y

en

3 4 21-24 para las

endopeptidasas

Las endopeptidasas son

las proteasas más utilizadas en

los

proctsos alimenticios.

Las

endopeptidasas rompen las cadenas de polipéptidos

en

al@ enlace

distribuido

a

lo largo de la cadena, mientras que

las

exopeptidasas hidroh los aminoácidos terminales

-

1. Endopeptidasas

Las 4 principales clases de endopeptidasas son serin proteasas (EC3 4 2i), cistein proteasas

(EC3 4 22), pioteasas aspárticas (EC 3

4

23)). metaloproteasas (EC 3 4 24)

Como

su nombre

lo

indica, las proteasas serin, cistein y aspática, tienen en su cadena lateral serina, cisteina y ácido aspártico, como parte esencial del sitio activo Una modificación o bloqueo de esta cadena lateral, trae como consecuencia una inactivación total de la enzima

.. !

Las

serin

proteasas

preaentan

una actividad máxima apH's akalinos;

las

cistein pmteam,

sin embargo, presentan una actividad máxima a pH neutral

Las

proteasas aspbths,"

en

cambio, presentan una actividad catalítica máxima, a pH's ácidos . I '

Las

metaloproteasas contienen un metal (generalmente Zn) y tienen

una

actividad óptima a un pH

cerca

del neutro.

Los

iones calcio generalmente estabilizan a estas enzimas y son

inhibidas por agentes qdantes como

lo

es el

EDTA.

2. Exopeptidasas.

.

Las

exopeptidasas son importantes en el procesamiento de alimentos, ya que quitan los

residuos amargos

a

los hidrolizados proteicos, en este

aspecto

Ins gminopePtidasas y carbopeptidasas, pueda ser aplicadas con gran éxito (Nag&* 1993).

En

cuanto a su clasificación en comparación de su sitio activo, mecanismo

de

acción y estructura tridimensional, se

conocen

4 clases reconocidas por la UNÓn Internacional de Bioquímica, y junto

con

es& clases existen 6 familias de proteasas reconodas. Cada

familia tiene su caracterísiica o residuo de aminoácido funcional el cual está situado en

una

configuración particular del sitio activo. (Tabla i)(Beyond,l989)

TABLA

VI.

Familia de enzimas proteoliticas.

La

actividad de las proteasas debería ser dada en unidades internacionales (iü), es decir, como los microequivalentes de enlaces peptídicos rotos por minuto. Sin embargo, por

razones históricas existe una amplia gama de unidades arbitrarias según los ensayos

-

I

.

tiempo Por ejemplo, la actividad de las proteasas neutras o aidinas es comúnmente

determinada por el

ensayo

propuesto por Anson (1939) En este método, la hemoglobina

desnaturalizada es digerida a pii 7 5 y a 2 f C por 10 min

La

cantidad de producto soluble

en

TCA es determinado con el reactivo de Folin y Ciocakeau

En

contraste, una unidad

Anson (AU) es la cantidad de enzima que digiere a la hemoglobina a tal grado que la cantidad de producto soluble en TCA liberado por minuto da el mismo color que 1 mmol

de tirosina

La

actividad especifica de una preparación enzimática esta dada

en

Unidades Anson por gramo de preparación (Nagodawithana, 1993)

Las

preparaciones de proteasas, así como las de otras enzimas, deben

ser

almacenadas en lugares secos y

fnos

o en refngeración, de acuerdo a las instrucciones dadas por el

proveedor A nivel industrial, las preparaciones enzimáticas deben ser preparadas al momento de utilizarse, y no deben ser mezcladas o diluidas con otros reactivos antes de ser

utilizadas En

los

experimentos de laboratorio, sin embargo,

es

necesario

realizar

algunas diluciones debido a las pequefías cantidades que se wesitan, y

em

este caso, la solución

diluida debe ser preparada inmediatamente antes de

ser

utilizada Se

ha

demostrado, que las proteasas

en

solución pueden perder mucha actividad, a pesar

de

permanecer solo unos pocos días en el refrigerador, debido a que las proteasas son susceptibles a la inactivacion

por autólisis o,

como

en

el caso de las cistein proteasas, a la inactivacion por oxidacibn (Nagodawithana, 1993)

d

CmÉTICA DE LAS REACCIONES CATALIZADAS

POR

ENZIMAS.

ECUACI~N DE MICHAELIS WEN.

Es necesario conocer

las

caractensticas cinéticas de una reacción enzimática para poder modificar enzimáticamente cualquier alimento. La cinética enzimática es la rama de la enzimología que tiene que ver con los factores que afectan las reacciones cataiizadas por enzimas. Los factores más importantes .wn la concentración de enzima, de sustrato, pH y temperatura. Cuando todos estos factores se analizan adecuadamente,

es

posible conocer mucho acerca de la naturaleza de la enzima. Así por ejemplo, ai variar la concentración de

sustrato es posible deducir los mecanismos cinéticos de la reacción, es decir, el orden en el cuál el sustrato se une a su enzima.

Un

estudio del efecto de la variación de

pH

y temperatura en las constantes cinéticas, da información a cerca de da identidad de los aminoácidos del sitio activo (Segel, 1993).

La primera ecuación general para reacciones que involucran enzimas fie descrita en 1903

por Henri. ILa ecuación de Henri indica que la velocidad inicial es dii-ecjamente yroporciunai a la concentración de enzima, pero incrementa de una forma no lineal cuando se incrementa la concentración de sustrato amba de la velocidad máxima.

La

derivación de la ecuación de Henri, se

basó

en

los

siguientes puntos

La

enzima es un catalizador

La enzima y el sustrato reaccionan rápidamente para formar un complejo enzima- sustrato

Solamente existe un sustrato y un complejo enzima-sustrato, el cual al romperse forma enzima libre y producto

La enzima. sustrato y _{complejo enzima-sustrato, están en equilibrio,}

_{Ib decir, la}

velocidad a la cual ES se disocia a E + S es más rápida que la velocidad a la cual ES se

rompe para dar

E

+ P

La concentración de sustrato es mucho más grande que la concentración de enzima, por lo que la formación del complejo

ES

no altera la concentración de S

La velocidad de la reacción

es

limitada por

el

rompimiento de

ES

para dar enzima libre y producto

La

velocidad

es

medida durante las etapas iniciales de la reacción, en donde las reacciones reversibles son insignificantes

.

La

ecuación de Henri es v

1+[S1

ks

donde: [SI= Concentración de sustrato.

v = velocidad inicial a una concentración de sustrato dada.

Ks=

la constante de disociación del complejo ES.

K=

constante característica de la enzima.

Michaelis y Menten, posteriormente hicieron una modificación a la ecuación de Henrt

v =

K s + S

Si

puede ser observada cuando toda l a enzima esta presente como

ES

r- - 1 -,.

Los principios generales de la cinética de las reacciones químicas, son aplicables a las reacciones catalizadas por enzimas; pero éstas muestran un razgo característico. la

I saturación con el sustrato.

Si examinamos la curva de

Vo

vs. ‘[Sustrato], encontramos tres regiones distintas, donde la velocidad responde de una forma característica al increment.0 de la concentración de sustrato (fig. (a)). A muy bajas concentraciones de sustrato ([S]<O.OiKm) la curva Vo vs. [Sustrato] es esencialmente lineal, esto es, la velocidad es directamente proporcional a& concentración de sustrato (fig.

e)).

Esta es la región de cinética de primer orden. A muy

altas concentraciones de sustrato ([S]>lOOKm), la velocidad es esencialmente independiente de la concentración de sustrato, y se aproxima asintóticamente a una velocidad constante. Esta es la región de cinética de orden cero (fig. (c)). A

concentraciones intermedias de sustrato, la relación entre Vo y [SI no sigue una reacción de primer orden ni una de orden cero. (Segel,1993).

’

Fig 1. -0 de la mncenbaci6n de

sumato sobre la velocidad de una reaa2ón catalizada enzimáticamene.

La teoría de Michaelis Menten supone que la enzima

E,

se combina en primer lugar con el sustrato

S,

para formar el complejo enzima-sustrato ES, a continuación este último se escinde en una segunda etapa, para formar enzima libre y producto P. Se supone que estas reacciones son reversibles.

La ecuación de Michaelis Menten es la ecuación

de

velocidad para las reacciones catalizadas por enzimas que sólo actúan sobre un sustrato; relaciona la velocidad inicial, la velocidad máxima y la concentración inicial del sustrato a través de una constante llamada ‘Constante de Michaelis Menten”.

15

!

U'

14

La

ecuación de Michaelis Menten puede transformarse algebraicamente en otras formas

que son más útiles para la expresión de los datos experimentales Una de las transformaciones más usuales se obtiene, tomando los recíprocos de ambos miembros de la

ecuación de Michaelis Menten obteniendo

.

Esta ecuación es la de Linewaver-Burk. Cuando _1No se representa fiente a

_l/[S].

se obtiene

una

línea recta. La pendiente de la recta es KmN- y la interUecci6n sobre el eje ]No,

es

IN&; la intersección del eje

i/[S]

es

-]/Km. Tal representación tiene la ventaja

de que permite una detenninación mucho más exacta del valor

de

Vmáx, ya que la representación sencilla de Vo frente

[SI

d o se obtiene un valor aproximado.

FUNDAMENTOS DE UNA EIDR~LISIS ENZIMATICA

Lac: proteasas catalizan In degradacih hidrolítica de _la cadena de péptidcs

Ri H H H R1 H H U

I I I PROTEASA I I 1 I

- C - C - N - C f & N - C

-

-

C - C - N - C

+

H2N-C

se muestren los

En la

figura,

no se observas los

mecanismos

de

la

catatisis,

unmmatc

productos y reactantes netos

De

acuerdo a Svendsen (1976)

la

catálisis de las serin proteasas (la principal clase de proteasas) ocurre en 3

reacciones

consecutivas (1) Formación del complejo de Mochales entre la cadena de péptido original (el sustrato) y la enzima (2) Rompimiento del puente péptidico para liberar uno de los 2 péptidos resultantes (3) Un ataque nucleofilico ai complejo péptidico sobrante para liberar asi a la enzima.

, .

Si

el sustrato

lo

simbolizamos como S y a los péptidos

resultantes,

P

y

F,

y si la

reacción ocurre en un sistema acuoso el cual impida que

la

reacción será reversible, la reacción hidrolítica puede ser simplificada por el esquema siguiente:

.

K+1 K+2 K+3

2

E

+

S

,

ES-EP

+

E-P’ -E+P-OH

+

E-P’

K-1 +

n2o

De esta serie de reacciones, la segunda de las tres,

es

la deteminan& . Esto significa que la reacción total es determinada por

K

+2 y que

Km

es aproximadamente igual a la

contante de disociación, K-IíK+l, En otras palabras, se lleva a cabo

una

cinética clásica de Michaelis-Menten.

En la reacción anterior, no solo el agua, sino también los grupos amino libres pueden

reaccionar como nucleófilos, mientras Ocurre la siguiente reacción de transpeptidación.

R~ H

n

holW~ Ri

n

I I I I I

- C - C - N - C -

+

HzO, \-C-CoO-

+

&Pi- C -

II I I I

n o

r4 H _Rz

Existe una competencia entre el agua y el HzN-, y

a

pesar de que la hidrólisis se ve

favorecida por el alta concentración de H20, el ataque nucleoflico del HzN- a menudo ocurre más rápido

El grupo carboxil libre y el grupo amino libre formados después de la hidrólisis serán de

una forma más o de una forma menos ionizables dependiendo del pH de la reacción Los

\alore$ de pk (25°C) de -COO13 y +HIN- en los polipeptidos se estima que son 3 1

-

3 6

y 7 5

-

7 8 respectivamente

El grupo carboxilo estará

.

.

.

No

Parcialmente disociado a pH 2 disociado debajo de pH 2

-

5

El grupo amino estará

.

Completamente protonado debajo de pH 6 1 Parcialmente protonado a pH 6

-

9 5

.

No

protonado arriba de pH 9 5

Por lo anterior se puede observar que en la

hidróiisis

de la proteína se

da

una liberación o toma de H+ Esto quiere decir que el pH cambiará durante

la reacción

de hidrólisis, excepto en la región alrededor de pH 5-6, donde la toma y liberación de protones se

cancelan una a

la

Otra Debajo de pH 3 1

-

3 6 el grupo carboxilo estará menos de la mitad

disociado y el grupo amino estará completamente protonado, y si

no

se umiroia el pH. habrá un incremento del mismo, ya que se tendrh UM toma

de

H+

de

alrededor de 0.5 a 1

equivalente por cada puente W d i c o hidrolizado Por el contrario, a valores de pH arriba de 7 5

-

7 8 (25°C) el grupo amino estará menos de la mitad protonado pero el grupo

carboxilo estará completamente disociado,

lo cual

permitirá una iibgpción de H+ de 0.5 a

1 equivalente por cada puente péptidico hidrolizado, y como consxuencia el pH d d si no es controlado

Siempre que se lleve a cabo una hidrólisis con

un

sustrato y

una

enzima determinada, se tendrá que describir, bajo los llamados “parámetros

de

hidróüsis”, los cuales son

concentración de sustrato, proporción enzima-sustrato, pH y temperatura Estos cuatro parámetros de hidrólisis son determinantes

en

cuanto a que tan rápido proceda la reacción, así como para otras características del proceso

La

concentración de sustrato se abrevia con una S, y es usualmente dada como un por

ciento en peso de la masa total de la mezcla de reacción _cuando esta se inicia.

La

proporción enzima-sustrato, es usualmente más característica de la velocidad de la reacción que la concentración por si misma de enzima Esto es porque el proceso de hidrólisis se

llevan a cabo a menudo a altas concentraciones de sustrato donde prevalece

una

saturación del mismo

Las condiciones iniciales de la reacción son declaradas, ai tener bien definidos al sustrato,

la enzima y los parámetros de hidrólisis. Durante la reacción estos parámetros tenderán a

cambiar de sus valores iniciales. En el curso de la reacción, el grado de hidrólisis

,

el cual

es una medida de que tanto se ha dado la degradación hidrolítiq incrementa de cero y

usualmente sigue una curvatura ligera. Esta curva, la cual desnibe el grado de hidrólisis

en función del tiempo, se llama curva de hidrólisis (Adler-Nissen, 1986).

SELECCI~N

DE

LA

ENZIMA A UTILIZAR

La hidrólisis enzimática al representar una alternativa para la recuperación de proteína, y

en

vista del

interés

económico y

nutritional

hacia el aprovechamiento de proteína de

subproductos de la industria pesquera, es necesario la selección de U M enzima que

produzca los péptidos con las características nutricionales y funCional~ requeridas

Se han realizado varios estudios utilizando enzimas de diferente origen para soiubilizar la proteína del pescado

Las

enzimas más exitosas han sido a) origen animal pepsina y

mpsina, b) origen vegetar bromelina y papaina y, c) origen microbiauo. Se

han

u t i l i 0

enzimas de Asoernillus flavus, Actinomices fiadiac,

Therm

oactinomices vulgaris, Streptomices miceus, Bacillus licheniformis, Bacillus wlvmma y Bacillus subtillis

A nivel nacional

las

enzimas de origen animal tiene precios elevados,

ya

que su produwión

se ve reducida a niveles muy bajos por ser

un

subprodudo de

los

procesos implementados con el fin de obtener carne, además es necesario

_importarias;

por

ello su utiiiiión se.

ve

reducida a la industria farmacéutica, la que requiere voiúatmes

muy

pequeños

de

enzima

Con las enzimas de origen vegetal se presenta el problema

de

que las plantas de

las

que se

obtienen, &n sujetas a factores climatológicos y ciclos de producción que limitan su disponibilidad, e igualmente son importadas Además de que ser cultivos cuyos h t o s se

destinan para consumo humano, lo que hace más crítica la situación

En este sentido las enzimas proteolíticas de origen microbiano, poseen un gran potencial,

ya que pueden generarse anualmente grandes cantidades, sin necesidad de

extensas

áreas de

cultivo, ni de ciclos de producción ni variaciones climatológicas

Por otro lado, como ya se ha mencionado, uno de los principales problemas en la hidrólisis

de proteínas, es la formación de compuestos que generan

sabores

amargos, debido al alto

contenido de aminoácidos hidrofóbicos en el

hidrolizado

Además se

ha

observado que el

tipo de enzima usada para la hidrólisis tiene influencia en la presencia de sabores amargos

. .

Además, considerando lascaracterísticas de las proteasas animales y vegetales antes mencionadas, las proteasas microbianas pueden y deben ser utilizadas para desarrollar

proceso dirigidos a la producción de concentrados de péptidos solubles y aminoácidos.

Las enzimas se caracterizan por sus curvas de actividad de pH y temperatura. Estas curvas junto

c m

las wnw de estabilidad son indicadores útiles para definir las condiciones bajo

las ciraies una enzima debe ser aplicada.(Kivera, 1990)

La enzima ALCALASE

8,

es una proteasa grado alimenticio.

Es

una proteasa del tipo

senna, caracterizada por un excelente rendimiento a temperaturas elevadas y aldinidad

moderada para un substrato alterno de cam'na, se produce mediante fermentación

sumergida de una cepa seleccionada de Bacillus licheniformis. La enzima Alcalase @ se

presenta en diferentes productos granulados y líquidos, su actividad proteolítica se

19

expresa

en Unidades Anson (AV), su actividad óptima se presenta a pH's aicrlinos y ea un rango de temperatura entre 55 y 65" C, dando también homogeneidad en la hidróiisis de los

desechos de la industria pesquera

Alcalase @ es fácilmente. soluble en los líquidos detergentes a cualquier concentración, temperatura e índice de pH de

uso

normal. En cuanto a su toxicología, ésta se produce a base de microorganismos

no

toxicogénicos y no patógenos por

lo

que esta clasificada como no tóxica, y es fácilmente biodegradable.

Alcalase @ está clasificada en "Chemical Abstract Service" como una "wbtilisina" (CAS

núm. 9014-01-1) . El ' número correspondiente de "Enzyme Classification" (Unión Internacional de Bioquímica)

es

EC núm. 3.4.21.62.

*

DETERMINACI~N DE PROTE~NA

POR

EL

MÉTODO

DE UIWRY.

Dentro de los métodos más utilizados para la determinación de proteína, se encuentra el método de Lowry. El constituyente activo del reactivo de Folin Ciocaiteu,

es

el ácido

fosfomoiibdico-tungstico. Este ácido se reduce por acción de ciatas proteinas, dando un sin

número de especies reducidas,

las

cuales se caracterizan por tener un color azui.

Los

iones de cobre presentes en el reactivo, quelan con el puente peptídico y esto facilita la transferencia de electrones entre el constituyente activo y la proteína, dando así la

formación de un cromógeno.

La

reacción tiene que realizarse en condiciones aidinas. Los residuos de aminoácidos con los que reacciona son tnptofano, tirosina, cisteina, cistina, histidina

La

principal ventaja del método de Lowry es su gran sensibilidad, y su principal desventaja

es el número de sustancias que interfieren. El rango sobre el cual el

color es

lineal es limitado, pero esto se puede solucionar utilizando diluciones. Entre una de las alternativas para eliminar trasferencias, se encuentra la precipitación de

las

proteínas

con

al ácido tricloroacético

(TCA),

dejando a la sustancia que interfiere en solución (Sterens, 1980).

ELECTROFORESIS EN GEL DE UNA DIMENSIdN

SDS-PAGE

(gel de electroforesis duodecil sulfato de sodio-poliacrilarnida), es un método

?\relente pare! identificar, nionitorear, cuantificar y aislar proteinas especificas en mezclas

complejas. SDS-PAGE es utilizado comúnmente para la estimación de pesos nioleculares de subunidades de proteína y para determinar _su composición.

En una separación electroforética, se induce a que las partículas cargadas, migren hacia el electrodo de signo opuesto bajo la influencia de un

campo

eléctrico externo. El

movimiento de las partículas se retarda por la interacción de la matriz del gel, en donde

están suspendidas, las cuales actúan como filtros moleculares. Debido a que la fuerza

eléctrica y el filtro molecular son fuerzas opuestas, dan como resultado una migración

diferente para

las

proteínas que constituyen la muestra

En general, la separación por electroforesis en gel, se basa

en

el tamafio, forma y cargas

netas de las macromolkulas Durante la preparación de las muesíras, las proteínas se tratan

con

_SDS

caliente El detergente aniónico se une fuertemente a la mayoría de las proteínas

(1 4 mg de SnS/mg protelna) impartiéndoles

una

carga negativa al complejo resultante

La

interacción c o g D S rompe todos las proteínas unidas por enlaces no covalentes, causando que la molécula se desdoble Si se realiza un tratamiento paralelo con un agente redudor,

como lo es el 2-mercaptoetan01, la proteína sufke una mayor desnaturahción, por lo que se rompe en sus subunidades constituyentes

La migración de los complejos del

SDS

es hacia el ánodo y la velocidad es inversamente

proporcional al iogaritmo de sus

pesos

moleculares Los poiipéptidos

SDS

se mueven a

través de los geles de una manera predecible, los complejos

con

bajo peso

molecular

migran más rápido que los más grandes

Lo

que significa que el peso molecular de

una

proteína puede estimarse por su movilidad en el gd SDS-PAGE

La mayoría de las electroforesis se realizan en cámaras verticales, en un gel que se forma

entre dos platos de vidrio En el gel se pueden

corren

diferentes muestras

U

espesor

dd

gel se logra por espaciadores que se colocan entre los platos de vidrio.

Los

geles

convencionales son del orden de 16 a 20

cm

de longitud, 16 cm de ancho y O 5-3 O mm de

espesor, y pueden llegar a albergar hasta 25 muestras

.

Los

geles de poliacrilamida se forman por la copoiimerización

de

un monómero de

acrilamida CHz%H-CO+J"H, y por la unión con

N,N'

metilenbisacrilamida

CH2=CH=CO-NH-CHz-NH-CO-CH=CH2.

El mecanismo de la formación del gel

es

por

U M polimerización catalizada por un sistema generador de radicales libres compuesto de

persulfato de amonio (el iniciador) y un acelerador, tetrametiletilen-diaina (TEMED). TEh4ED provoca la formación de radicales libres del persulfato y cataliza la polimerización. El oxígeno interfiere con la polimerización (secuestra radicales), por io

que es necesario una adecuada desaereación para remover el oxígeno disuelto de la solución de acrilamida y obtener un gel adecuado:

Las propiedades filtrantes del gel se establecen por la matriz formada por las cadenas de

poliacrilamida. Al incrementar la concentración de acnlamida en un gel, el tamaño de poro

disminuye. El tamaño de poro efectivo en un gel, se define por sus propiedades fikrantes,

es decir, por la resistencia que imparte a la migración de las moléculas de proteína. Un dr:erminado pel, esta caracterizado fisicatnente por un par de f i p r a s

(%T,

% C), donde

%T

es el _peso en porcentaje del monómero (acrilamida+ ligador, en gramos por 100

A),

y %C

es la proporción del ligador (como % del monómero total) en el gel.

Los

límites prácticos

1

E!l

uao

de resctivos de aha Calidad w un pre-requisito

para

obtaia geies reproduQbla de

aita resolución, principalmente para la acrilamida la cual constituye el componente mas abundante en la mezcla del gel-monómero Los componentes del buffer deben de ser de

grado readivo y solo debe utilizarse agua destilada o desionizada para preparar las soluciones

El método de electroforético mas popular

es

el sistema

SDS-PAGE

desarrollado por

Laemmli (1979) Este es un sistema discontinuo que consiste en dos geles Contiguos

pero

diferentes

un

gel para resolver o “separating” (inferior) y un gel “stacking” (superior) Estos geles tienen diferentes poroBades, pH y fuerza iónica, aunado a esto se utilizan

diferentes iones moviles en los buffers de gel y de electrodo.

La

discontinuidad del buffer

actúa para concentrar grandes volúmenes de muestra en el gel “stacking”, obteniendo así

una mayor resolución @eutscher, 1990)

.

OBJETIVOS

GENERAL

Obtención y caracterización, en base al

peso

molecular, de péptidos obtenidos a uartk de la recuucración de ~ k e i m de SubDroductos de la 'ndustna -peSquera mediante la ahidrólisis e&mhtica con

Al

A

ase8

ESPECÍFICOS:

.

Caracterización enzimática de ALCALME @ en términos

de

pii,

temperatura y

tiempo,

utilizando como substrat0

un

homogeneizado de desechos de la industria pesquera.

Caracterización bromatológica general de un homogeneizado de desechos de la industria pesquera.

Separación y caracterización en base a pesos moleculares de los péptidos obtenidos.

Proponer usos alternativos para las diferentes fracciones peptídicas

ME TO DO LOG^

ANALISIS BROMATOL~GICO

El

análisis bromatológico de las muestras de desecho de pescado (DP), se efectuaron de

acuerdo a métodos oficiales Los análisis practicados fueron determinación de Nitrógeno Total por el método de weldah1 de acuerdo con el A O A C (1970); c o a i d o de grasa de

acuerdo a la norma de calidad NMX-F-89-S-1978,

cenizas

con la NMX-F-66-S-1978, y

humedad con la norma NMX-116-SSAI-1994

.

PREPARACIÓN DE

SUSTRATOS:

a) Hemoglobina

como

sushato alterno

Se preparó una solución de hemoglobina ai 2%, disolviendo con agitación suave, 5 g de

hemoglobina (Worthington Biochemical Corp ) en una solución de 80 g de

urea

en 80

ml

de agua Posteriormente se incubo a 37°C por 1 h, se ajusto el pH

según

el experimento a

realizar, con buffer universal O O5

My

se aforó a un volumen de 250

mL

(Beynon,1989)

b) Desecho de pescado:

Se

fileteb

ath

obtenido

en la Central de Abastos de la Nueva Viga.

El

desecho del fileteado fue triturado y homogenizado en una picadora Osteiizer, empacado ai vacío (lotes

200 g) y congelado (-ZOOC) hasta su uso

PREPARACIÓN DE LA SOLUCI()N DE ENZIMA:

La solución enzimática se preparó diluyendo en agua destilada la enzima Alcaiase @,

obtenida de las industrias Novo Nordisk, en una presentación granular con una actividad declarada de 3.0 AU/g.

1. TRABAJOS PREVIOS REALE.4DOS

EN

HEMOGLOBMA

Todos los análisis fueron realizados por triplicado.

1 .-

Método

para determinar la actividad proteolítica sobre hemoglobina: