AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y SEROTIPIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS DEL GÉNERO Salmonella EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA
TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS – UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO – META
DIANA ALEXANDRA PACHÓN CUBILLOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
PROGRAMA PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA BOGOTÁ
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AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y SEROTIPIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS DEL GÉNERO Salmonella EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA
TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS – UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO – META
DIANA ALEXANDRA PACHÓN CUBILLOS
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para Optar el Título de
Microbiólogo Agrícola y Veterinario
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
PROGRAMA PROFESIONAL DE MICROBÍOLOGIA AGRÍCOLA Y VETERINARIA BOGOTÁ D.C.
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NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946
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AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y SEROTIPIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS DEL GÉNERO Salmonella sp. EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y
TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS –
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO – META
DIANA ALEXANDRA PACHON CUBILLOS
APROBADO
______________________________ ______________________________ Bact. MS.c. Adriana Pulido Villamarín MV. Carlos Alfonso Moreno Torres Director. Revisor Consultor
Pontificia Universidad Javeriana. Universidad Nacional de Colombia
______________________________ ______________________________ MV. MS.c. Rubiela Castañeda Salazar Biol. PhD. Julio Mario Hoyos Hoyos
Jurado Jurado
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AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y SEROTIPIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS DEL GÉNERO Salmonella sp. EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y
TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS –
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO – META
DIANA ALEXANDRA PACHÓN CUBILLOS
APROBADO
______________________________ _____________________________ INGRID SCHULER., Ph.D Bact. M.SC., M Ed. Janeth Arias P.
Decana Académica Directora
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A Dios por llenarme de bendiciones cada día y llevarme de su mano por el camino que me permitirá alcanzar todos mis objetivos.
A mi madre por ser el mayor ejemplo de fortaleza, constancia, dedicación y superación; por todo su esfuerzo para que juntas alcanzáramos esta meta, por su confianza y dedicación y por haberme hecho el ser humano que soy ahora.
A mi padre por que desde el cielo me ha acompañado durante todos estos años, por su ejemplo de entereza, sabiduría y fortaleza.
A mi hermano por su apoyo, confianza y compañía durante todos los años de mi vida, a mi abuelita por estar siempre a mi lado haciendo de mi un ser humano fuerte y perseverante, a mi sobrinito por ser la luz de mi vida.
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AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Adriana Pulido Villamarín, por haberme dado la confianza para la realización de este proyecto, por su dedicación, compromiso y apoyo incondicional, aportando todos sus conocimientos para la realización de este trabajo.
Al Dr. Carlos Moreno Torres por el aporte de sus conocimientos y constancia para concluir con éxito este trabajo.
Al laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia, a su directora Dra. Judith Figueroa Ramírez y Dra. Derly Fierro Toscano por haberme dado la oportunidad de trabajar en sus instalaciones, ya que sin su colaboración esto no hubiera sido posible.
Agradecimiento especial a Becton Dickinson LTDA por la dotación de medios de cultivo, kit de identificación y sensidiscos.
A todo el personal de la Estación de Biología Tropical Roberto Franco por toda su colaboración y especialmente a su directora profesora María Cristina Ardila por sus aportes al trabajo.
8
TABLA DE CONTENIDOS
Página
1. INTRODUCCIÓN 17
2. MARCO TEÓRICO 19
2.1. FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE 19
2.2. GÉNERO Salmonella 20
2.2.1. Caracterización morfológica y bioquímica 21
2.2.2. Clasificación taxonómica 22
2.2.3. Estructura Antigénica 22
2.2.4. Factores de virulencia 24
2.2.5. Patogénesis y patogenicidad 24
2.2.6. Salmonelosis 27
2.2.7. Diagnóstico 27
2.2.7.1. Métodos de aislamiento de Salmonella sp. 28
2.2.7.2. Identificación bioquímica 34
2.2.7.2.1. Diagnóstico presuntivo de la presencia de Salmonella sp. 35
2.2.7.3. Serotipificación 37
2.2.7.3.1. Esquema de Kauffmann - White 38
2.2.8. Sensibilidad Frente a agentes antimicrobianos 39
2.2.8.1. Resistencia de los microorganismos a los antimicrobianos 40
2.2.8.2. Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos 41
2.2.8.2.1. Principios del método de difusión en agar (Kirby-Bauer) 41
2.2.8.2.2. Interpretación de pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos por el método de difusión en agar. 42
2.2.8.2.3. Selección de los agentes antimicrobianos 42
2.3. EL GÉNERO Salmonella sp. ASOCIADO A LOS REPTILES 43
2.4. ESPECIES EN ESTUDIO 47
2.4.1. Caimán del Orinoco (Crocodylus intermedius) 47
2.4.2. Testudinos 48
2.4.3. Bacterias asociadas a enfermedades en reptiles 49
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 51
3.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 51
3.2 JUSTIFICACIÓN 52
4. OBJETIVOS 53
4.1 OBJETIVO GENERAL 53
9
Página
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 53
5. MÉTODOLOGÍA 54
5.1. ÁREA DE ESTUDIO 54
5.2. POBLACIÓN MUESTRAL 54
5.3. TOMA DE MUESTRAS 54
5.3.1. Obtención de muestras por hisopado cloacal 56
5.3.2. Muestreo de agua y sedimento de los estanques 57
5.3.3. Muestreo de arena y materia fecal de los estanques 58
5.4. FASE ANALÍTICA 59
5.4.1. Aislamiento e identificación de Salmonella sp. 59
5.4.1.1. Pre enriquecimiento no selectivo 59
5.4.1.2. Enriquecimiento selectivo 59
5.4.1.3. Aislamiento primario en medio selectivo y diferencial 59
5.4.1.4. Identificación bioquímica 63
5.4.1.5. Serotipificación 63
5.4.1.6. Prueba de susceptibilidad a antibióticos 64
6. RESULTADOS Y DISCUSION 66
6.1. ANÁLISIS DE DATOS 66
6.2. IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL GÉNERO Salmonella sp. POR TÉCNICA BBL CRYSTAL® 66
6.3. POSITIVIDAD A Salmonella sp. EN ESTANQUES DE CROCODYLIA Y TESTUDINEA 67
6.4. PRESENCIA DE Salmonella sp. SEGÚN LA ESPECIE 69
6.5. AISLAMIENTOS DE Salmonella sp. SEGÚN EL TIPO DE MUESTRA PARA EJEMPLARES DE CROCODYLIA Y TESTUDINOS 71
6.5.1. Aislamientos de Salmonella sp. en estanques de Crocodylia según grupos etáreos 74
6.6. SEROTIPIFICACIÓN 75
6.7. PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS 77
6.8. MICROORGANISMOS DIFERENTES A Salmonella sp. AISLADOS EN LOS ESTANQUES DE LA ESTACIÓN 80
7. CONCLUSIONES 85
8. RECOMENDACIONES 86
9. REFERENCIAS 87
10. ANEXOS 106
10
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla Nº 1. Propiedades bioquímicas diferenciales de las subespecies de
Salmonella sp. 34
Tabla Nº 2. Resultados de las pruebas bioquímicas clave para la identificación de
microorganismos pertenecientes al género Salmonella sp. 37
Tabla Nº 3: Especies de Crocodylia y Testudines muestreadas y número de cepas
de Salmonella sp. aisladas para cada especie según estanques muestreados 55
Tabla Nº 4: Comportamiento de los microorganismos del género Salmonella sp. aislados a partir de muestras de ejemplares de Orden Testudinata frente a los
antibióticos utilizados mediante el método de Kirby – Bauer 77
Tabla Nº 5: Comportamiento de los microorganismos del género Salmonella sp. aislados a partir de muestras de ejemplares de Orden Crocodylia frente a los
antibióticos utilizados mediante el método de Kirby – Bauer. 78
11
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura Nº 1. Septicemia por Salmonella sp. en Crocodylia 46
Figura Nº 2. Septicemia por Salmonella sp. en Testudinos 46
Figura Nº 3. Caimán del Orinoco o Caimán Llanero (C. intermedius) 48
Figura Nº 4. Ejemplares de Orden Testudinata encontrados en la E.B.T.R.F 49
Figura Nº 5. Toma de muestras: hisopados cloacales en Testudinos. 56
Figura Nº 6. Muestreo de ejemplares neonatos de Crocodylus intermedius mediante hisopado cloacal. 57
Figura Nº 7. Muestreo de agua y sedimento de los estanques. 58
Figura Nº 7A y 7B. Muestreo en los estanques de Crocodylia neonatos y Testudinos 58
Figura Nº 7C Muestreo en estanques de Crocodylia Adultos y Juveniles 58
Figura Nº 8. Muestreo de arena y materia fecal encontrada en los encierros de los animales en estudio. 59
Figura Nº 9. Identificación de colonias compatibles con Salmonella sp. en medios de cultivo selectivos. 60
Figura Nº 9 A. CRHOMagar Orientación 60
Figura Nº 9 B. Agar MacConkey 60
Figura Nº 10. Características morfológicas de las enterobacterias del género Salmonella sp. aisladas en los medios de cultivo diferenciales. 61
Figura Nº 10 A. CHROMagar Salmonella. 61
Figura Nº 10 B. Agar Hektoen Entérico. 61
Figura Nº 11. Microorganismos diferentes a Salmonella sp. aislados en las muestras. 62
Figura Nº 11 A. Staphylococcus saprophyticus. 62
Figura Nº 11 B. Escherichia coli. 62
Figura Nº 11 C. Enterococcus sp. 62
Figura Nº 11 D. Klebsiella sp. 62
Figura Nº 11 E. Citrobacter sp. 62
12
Página
Figura Nº 12. Lectura de pruebas de identificación Crystal® para
microorganismos entéricos/no fermentadores. 63 Figura Nº 12 A. Identificación a partir de agua y sedimento del estanque
de Testudinos número 21. 63 Figura Nº 12 B. Lectura en muestra de hisopado cloacal de caimán
neonato en el estanque número 47 63 Figura Nº 13. Esquema de una lámina hemoclasificadora utilizada para
la serotipificación de las cepas de Salmonella sp. y modo en que se empleó. 64 Figura Nº 14. Antibiograma 65 Figura Nº 15. Porcentaje de presentación de Salmonella sp. en los
estanques de la E.B.T.R.F. 67 Figura Nº 16. Estanques de Tortugas positivos y negativos
a Salmonella sp. 69 Figura Nº 17. Estanques de C. intermedius positivos y negativos a
Salmonella sp. en la E.B.T.R.F. 70
Figura Nº 18. Aislamiento de Salmonella sp. según el origen
de la muestra en Testudinea 72 Figura Nº 19. Aislamiento de Salmonella sp. según el origen de la muestra
en estanques de C. intermedius 72
Figura Nº 20. Porcentaje de aislamientos positivos a Salmonella sp.
en los estanques de Crocodylia según los grupos etáreos. 74 Figura Nº 21. Serotipificación de Salmonella sp. aislada en la E.B.T.R.F 76
Figura Nº 22. Pruebas de Sensibilidad a antimicrobianos 78 Figura Nº 23. Microorganismos diferentes a Salmonella sp
aislados en los estanques de C. intermedius y Testudinos de la E.B.T.R.F 80 Figura Nº 24. Microorganismos aislados las muestras de agua y sedimento
en los estanques de Testudinea muestreados 81 Figura Nº 25. Microorganismos aislados en las muestras
de arena y materia fecal en los estanques de Testudinea muestreados 81 Figura Nº 26: Microorganismos aislados en las muestras de hisopados
cloacales de ejemplares de Testudinata muestreados 82 Figura Nº 27: Microorganismos aislados en las muestars de agua y
[image:12.595.110.509.55.746.2]sedimento de los estanques de C. intermedius muestreados 82 Figura Nº 28: Microorganismos aislados en las muestras de arena y
13
Figura Nº 29: Microorganismos aislados en las muestras de hisopados
cloacales de ejemplares de C. intermedius muestreados. 83
14
ÍNDICE DE ANEXOS
Página
ANEXO N º 1. Plano de la E.B.T.R.F 106
ANEXO Nº 2. Apariencia de los microorganismos en CHROMagar Orientación 107
ANEXO Nº 3. Sistema de Identificación BBL Crystal para Entericos/No Fermentadores. 108
Anexo 3.1. Procedimiento para la identificación de los microorganismos por sistema BBL Crystal. 108
Anexo 3.2. Ficha técnica de reacciones de color para lectura de resultados. 109
Anexo 3.3. Calculo del número de perfil 109
ANEXO Nº 4. Esquema de Kauffmann – White 110
ANEXO Nº 5. Interpretación de pruebas de sensibilidad a antimicrobianos 112
ANEXO Nº 6. Resultados obtenidos por estanque en cada muestreo. 114
15
RESUMEN
Durante mucho tiempo las enterobacterias pertenecientes al género Salmonella han sido reportadas como patógenos para humanos y animales tanto domésticos como silvestres; aunque también hacen parte de la flora normal intestinal de reptiles, especialmente de tortugas.
La Estación de Biología Tropical Roberto Franco de la Universidad Nacional de Colombia, ubicada en la ciudad de Villavicencio, lidera el programa de recuperación del Caimán Llanero (Crocodylus intermedius) que se encuentra en inminente peligro de extinción y además cuenta con una colección viva de Testudinos de diferentes géneros. Con el fin de evidenciar la presencia del enteropatógeno en la Estación, se procedió a aislar microorganismos del género Salmonella a partir de muestras de origen ambiental y cloacal de las especies allí encontradas, utilizando la metodología microbiológica estándar; posteriormente se procedió a serotipificar los aislamientos por el método convencional de Kauffmann-White especialmente a nivel de antígeno somático y finalmente se realizó la prueba de sensibilidad a antimicrobianos para cada cepa encontrada en la Estación.
Los resultados reportan una prevalencia del 52% de Salmonella sp. en el total de la población muestreada, con una mayor positividad a partir de muestras de agua/sedimento y las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos determinaron que el 100% de los aislamientos fueron sensibles a la norfloxacina. Teniendo en cuenta que microorganismos del serogrupo C2 fueron los más prevalentes (41,4%) y conscientes del riesgo zoonótico se dio inicio a la implementación de un manual de bioseguridad para la estación y así prevenir todo riesgo para la población animal y humana.
16
ABSTRACT
Salmonella sp. has been reported as pathogens for human and animals domestic as wild; in spite of being part of the normal intestinal flora of reptiles especially of turtles.
The Estación de Biología Tropical Roberto Franco located in the city of Villavicencio is part of the Universidad Nacional de Colombia, and it leads the program of recovery of the Caiman Llanero (Crocodylus intermedius), which is in imminent extinction danger and also bill with an alive collection of Testudinos of different families.
With the purpose of evidencing the presence of the enteropathogen, we proceeded to isolate microorganisms of the gender Salmonella sp. starting from samples of environmental and cloacae origin using the standard methodology; we proceeded to serotyping the isolations for the conventional method of Kaufmann-White and finally we did an antimicrobial susceptibility test for each strain found in the Estación.
Results reports a prevalence of 52% of Salmonella sp in the population sampled with a bigger detection starting from samples of water/silt. Antimicrobial susceptibility test could determine than 100% of the isolates were sensible to norfloxacine. Knowing that microorganism of serogroup C2 were the most prevalent (41,4%) and aware of the zoonotic risk we begin to the implementation of a biosecurity manual for the Estacion and this way to prevent all risk for the animal and human population.
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1.
INTRODUCCIÓN
Los miembros del género Salmonella están ampliamente distribuidos en la naturaleza, se encuentran como comensales y patógenos en el tracto gastrointestinal de mamíferos domésticos y salvajes, reptiles, aves e insectos, causando un amplio espectro de enfermedades en sus hospederos, considerándose como la principal enterobacteria de importancia en salud pública (Selbitz et al.,1995. Turnbull, 1979).
Para el caso de Latinoamérica y especialmente para Colombia la investigación acerca de microorganismos pertenecientes al género Salmonella se ha centrado en relación con las enfermedades trasmitidas por agua y por alimentos (ETA) y es poco lo que se ha investigado con respecto a la transmisión por reptiles donde esta enterobacteria hace parte de la flora intestinal normal; a pesar que las autoridades reguladoras del medio ambiente reconocen el problema zoonótico que representan las especies silvestres frente a la población humana, las investigaciones en el área biológica y veterinaria son insuficientes (Hernández, 2004)
Los reptiles frecuentemente son portadores asintomáticos de Salmonella sp. y por consiguiente, los casos clínicos de salmonelosis son reportados con menor frecuencia
(Ramsay, et al, 2002). Sin embargo, numerosos estudios han asociado la bacteria con altos
niveles de mortalidad en serpientes y tortugas, y a su vez, un gran porcentaje de investigaciones han implicado la herpetofauna en la transmisión de Salmonella sp. hacia los humanos, lo cual permite establecer la capacidad de generar procesos de infecciones zoonóticas y la importancia de la bacteria a nivel de salud pública (Saelinger y Lewbart, 2006). De manera natural los reptiles son susceptibles a enfermedades que contribuyen a la disminución de las poblaciones; aunque en la mayoría de los casos se desconoce la acción patógena de los microorganismos sobre estas especies silvestres, ignorándose el impacto que tienen las enfermedades bacterianas sobre las mismas, así como el tratamiento ideal para combatir los signos producidos (Mader, 1996). Sin embargo, es de vital
importancia tener en cuenta que la presencia de éste tipo de endopatógenos no se asocia necesariamente con estados de enfermedad (Lax, et al., 1995). Desde el punto de vista
profiláctico, la susceptibilidad a patologías causadas por enterobacterias en reptiles se relaciona con estados de depresión en el animal, que pueden producirce a causa del estrés por el cautiverio, alteración en temperaturas medioambientales, el número de microorganismos presentes, edad, estado nutricional del animal, entre otras (Mader, 1996).
18
disminución de actividad, pérdida de peso progresiva, anorexia, polifagia, regurgitación, diarrea, constipación y letargia. (Jertborn et al 1990).
Estudios sobre Salmonella sp. en especies silvestres demuestran que su presencia es constante, pero se deben conocer las serovariedades implicadas y la sensibilidad que tienen tanto animales cautivos como salvajes para ser afectados por el microorganismo con el fin de minimizar los posibles inconvenientes que se pueden presentar en los programas de recuperación debido a enfermedades asociadas al enteropatógeno; además, parece ser que en los centros donde los reptiles están en condiciones de cautividad, hay más posibilidad de aislamiento de esta bacteria que en estado libre (Ramsay
et al., 2002). La Estación de Biología Tropical Roberto Franco, es el centro de recuperación
de especies silvestres en vía de extinción más importante en el país, ha demostrado una excelente gestión en el manejo de estas poblaciones logrando así minimizar los riegos de extinción de las especies; es una entidad encaminada al cuidado y recuperación de ejemplares de Crocodylus intermedius (Caimán Llanero) y Testudines llevando a cabo investigaciones en el ámbito de salud, nutrición y reproducción que permiten la repoblación de estos ejemplares; sin embargo, las condiciones ex situ de los animales producen estados de inmunosupresión donde microorganismos patógenos como Salmonella sp. pueden llegar a colonizar generando cuadros de enfermedad en los individuos; con base en ello, es necesario tener en cuenta que el conocimiento de la microbiología entérica de estas especies es fundamental para diagnosticar desórdenes en la flora digestiva así como para prevenir infecciones secundarias, todo ello dirigido a optimizar los respectivos programas de conservación de estas especies silvestres (Saelinger y Lewbart, 2006)
Mediante la realización de este estudio se pretende llevar a cabo un análisis sobre la condición de los animales de Orden Crocodylia y Orden Testudinea cautivos en la Estación de Biología Tropical Roberto Franco dependencia de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia, en la ciudad de Villavicencio, debido a que de acuerdo con las listas oficiales de especies amenazadas publicadas por la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN), son las especies de vertebrados más amenazados en Colombia (Min. Medio Ambiente, 2002). Para tal fin, se llevará a cabo el aislamiento e
19
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Familia Enterobacteriaceae
La familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), pertenece al orden XIII Enterobacteriales. Según la segunda edición 2001 del Manual Bergey de Bacteriología Sistemática, está conformada por 41 géneros y más de 100 especies (Quinn et al., 2002),
aunque menos de la mitad tienen interés desde el punto de vista veterinario (Stanchi, 2007).
Su hábitat natural es el intestino y muchos de estos microorganismos provocan enfermedades tanto en los animales productores de alimentos (diarrea de los recién nacidos y salmonelosis), como en los animales de compañía (infecciones y abscesos del tracto urinario) y en el hombre (Biberstein, y Chung Zee, 1990). Esta familia incluye géneros de gran
importancia a nivel epidemiológico como son Escherichia coli, Shigella sp., Salmonella sp, Enterobacter sp., Klebsiella sp., Serratia sp., Proteus sp., Citrobacter sp., Edwarsiella sp., Yesinia sp., Morganella sp., y Arizona sp. entre otras (Jawetz, et al, 2005).
Los microorganismos de esta familia son parecidos en cuanto a su morfología y caracteres tintoriales por ser bacilos pleomórficos Gram negativos y asporógenos de un tamaño de 2 – 3 µm por 0,4 – 0,6 µm, catalasa positivos y oxidasa negativo, por carecer de citocromo c, lo cual es una propiedad bioquímica útil en el aspecto diagnóstico de la familia (Stanchi, 2007; Biberstein y Chung Zee, 1990). Los representantes de este grupo de
microorganismos son anaerobios facultativos; en condiciones anaerobias, su crecimiento depende de que en el medio existan carbohidratos como fuente de carbono; en aerobiosis, la gama de sustratos apropiados para su crecimiento incluye ácidos orgánicos, aminoácidos y carbohidratos (Biberstein y Chung Zee, 1990). Mediante observación
microscópica resulta difícil diferenciar los representantes de un determinado género de los pertenecientes a los demás géneros. Son clave para el diagnóstico los productos resultantes de la fermentación de azúcares; casi todos los microorganismos de este grupo fermentan la glucosa a ácido pirúvico por la vía de Embden Meyerhoff (glicolisis); fermentan la D-glucosa a menudo con producción de gas, reducen los nitratos a nitritos y poseen un contenido de DNA del 39 al 59% de guanina mas citosina (G+C), algunos poseen cápsula (Stanchi, 2007; Biberstein y Chung Zee, 1990).
20
desaminasas y la producción de hidrógeno sulfurado, entre las características más importantes (Biberstein y Chung Zee, 1990).
Las Enterobacterias pueden comportarse como apatógenas, patógenas oportunistas y patógenas importantes. Las primeras, pueden encontrarse como contaminantes de muestras clínicas, siendo aisladas del ambiente y/o materia fecal, como es el caso de Hafnia; las enterobacterias patógenas oportunistas ocasionalmente producen enfermedad a nivel del tracto digestivo, mientras que las patógenas importantes pueden causar daños entéricos y sistémicos, por poseer una estructura antigénica compleja y producir varias toxinas y otros factores de virulencia (Baümler et al. 1998, Muñoz et al, 2002, Biberstein y Chung Zee, 1990).
2.2. El Género Salmonella
El género Salmonella recibe su nombre en honor al microbiólogo americano Daniel Elmer Salmon (1850-1914), quien en 1876 fue reconocido como el primer doctor en medicina veterinaria graduado en una universidad de los Estados Unidos. Junto a Theobald Smith (1859-1934), conocido por su trabajo con anafilaxis, fueron quienes descubrieron los gérmenes designados como salmonelas, en 1885, aislándolos de cerdos con cólera (Stanchi, 2007)
Salmonella sp. es la enterobacteria de mayor importancia a nivel de salud pública por producir trastornos del tracto gastrointestinal y septicemia no solo en el ser humano, sino en todas las especies animales (Selbitz et al; 1995; Turnbull, 1979, Lujan y Blas, 2007)
Los microorganismos del género Salmonella están extensamente diseminados en la naturaleza como comensales y como patógenos del aparato digestivo de los mamíferos domésticos y silvestres, aves, reptiles e insectos, en los cuales pueden llegar a producir una amplia gama de enfermedades. Todas las salmonelas son potencialmente patógenas (Stanchi 2007; Smithet al. 1952; Mahajan et al. 2003) al ser parásitos intracelulares y por
medio de los macrófagos en los que se encuentran, se diseminan por todo el organismo afectado aprovechando la vía linfática y sanguínea (Smith et al. 1952; Suter, 1956; Stanchi, 2007). En
medicina humana están descritas diversas presentaciones de salmonelosis: fiebre entérica, septicemia, y finalmente gastroenteritis; mientras tanto, en medicina veterinaria se ha determinado que esta bacteria puede provocar septicemia, enteritis aguda, subaguda y crónica, y abortos en diferentes especies animales (Stanchi, 2007). Las diversas
21
con el patógeno, teniendo en cuenta que la fuente de contaminación ambiental es invariablemente la materia fecal (Stanchi 2007 ; Smith et al. 1952; CDC. 2007).
2.2.1 Caracterización morfológica y bioquímica
Los miembros del género Salmonella son bacilos Gram-negativos, de 0,7-1,5 x 2,0-5µm, no fermentadores de lactosa, anaerobios facultativos, no esporulados (Terragno et al, 2003);
generalmente móviles por flagelos perítricos con la excepción deSalmonella gallinarum y Salmonella pullorum, responsables de la tifoidea aviar y pullorosis respectivamente (Stanchi 2007, Terragno et al, 2003).
Poseen metabolismo fermentativo y oxidativo; fermentan glucosa con producción de ácido y gas (excepto S. typhi), también fermentan L-arabinosa, maltosa, manitol, D-manosa, L-ramnosa, Dsorbitol, trehalosa, D-xilosa y D-dulcitol (Terragno et al, 2003). Son
oxidasa negativo, catalasa positivo, indol y Voges- Proskauer (VP) negativo, rojo de metilo y citrato de Simmons positivo, producen H2S, son urea negativo, lisina ornitina y
descarboxilasa positivo (Terragno et al, 2003). Entre otras características bioquímicas se
encuentran la reducción de nitratos a nitritos, no desaminan la fenilalanina y son tetrationato reductasa (Jawetz, et al, 2005).
Las salmonelas se multiplican bien en medios ordinarios, las colonias post incubación por 18 a 24 horas a 32oC son de 2 a 3 mm de diámetro salvo algunos serotipos que producen colonias pequeñas; con algunas excepciones no presentan cápsula (Smith et al.
1952; Suter 1956). Los miembros del género Salmonella crecen en un amplio rango de
temperaturas (7 - 28oC), el rango de pH ideal para su crecimiento es entre 6,6 y 8,2; son incapaces de tolerar altas concentraciones de sal y sobreviven en agua congelada durante periodos prolongados (Jawetz et al. 2005).
Los criterios para la identificación bioquímica de Salmonella sp. son relativamente estándar, sin embargo puede haber variaciones en los medios de cultivo y algunas pruebas bioquímicas, por lo cual como alternativa se están introduciendo cada vez más los métodos moleculares que permiten un diagnóstico más rápido y pueden ser más simples de realizar, pero tienen como desventaja que son de costo elevado (Terragno et al,
22
2.2.2. Clasificación taxonómica
La más reciente clasificación del género Salmonella está basada en estudios realizados sobre la base de técnicas de hibridación del DNA de la bacteria y se ha concluido que éste está conformado por dos especies:
1) Salmonella enterica, dividida en seis subespecies aisladas de:
a. Subepecie I. S. enterica subsp. enterica: Humanos y Animales de sangre caliente b. Subespecie II. S. enterica subsp. salamae: Animales de sangre fría y del ambiente. c. Subsespecie III a. S. enterica subsp. arizonae: Animales de sangre fría y del
ambiente.
d. Subespecie III b: S. enterica subsp. diarizonae. Animales de sangre fría y del ambiente.
e. Subespecie IV. S. enterica subsp. houtenae. Animales de sangre fría y del ambiente.
f. Subespecie VI. S. enterica subsp. indica. Animales de sangre fría y del ambiente.
2) Salmonella bongori. Subespecie V: No constituye un patógeno para los humanos, pero si ha sido implicada en ciertas patologías en animales (Popoff y Le Minor, 1992; Grimont y Weill; 2007; Stanchi 2007; Farmer 2003 y Terragno et al 2003)
Es de suma importancia aclarar que, aunque existan solo dos especies de salmonelas según su hibridación de DNA, tanto las especies como las subespecies mencionadas se encuentran constituidas por más de 2400 variedades serológicas, determinadas según las distintas asociaciones de los antígenos somáticos O y flagelares H (Stanchi, 2007).
También puede hacerse una clasificación de las salmonelas desde el punto de vista epidemiológico en tres grupos:
1) Sin ninguna afinidad por hospedador 2) Afectan únicamente al ser humano
3) Adaptadas a un hospedador animal únicamente (Stanchi 2007; Terragno et al 2003).
2.2.3. Estructura antigénica
23
géneros. Al estar este antígeno relacionado con la virulencia de las cepas se le denomina Antígeno Vi (Koneman y Allen. 1999), que puede interferir con la aglutinación por
antisueros O y que se relacionan con invasividad (Jawetz et al, 2005).
a. Ag Somático (O de pared celular): Es un polisacárido, termostable, tipo-especifico, que se halla en todas las especies (Stanchi 2007). Se distinguen dos clases:
mayores (determinantes del serogrupo) y menores (se hallan en algunas Salmonelas y serogrupos de éstas), son compartidos por diferentes serovares y no determinan los serogrupos (Stanchi 2007), aunque existen numerosos antígenos O, son
los factores O principales los que sirven para caracterizar los diferentes tipos antigénicos. (Por ejemplo O4: se refiere al grupo B, O9: Grupo D, entre otros) (Muñoz et
al. 2002). El complejo de antígenos O determina el subgrupo somático al que
pertenecen los géneros de Salmonella, sp., Arizona sp., Citrobacter sp., Escherichia sp., Providencia spp. Serratia sp. entre otros (Bayley y Schott, 1982).
b. Ag Flagelar (H): Es proteico y termolábil, constituido por flagelina, cuya composición en aminoácidos es constante para un tipo antigénico determinado (Bayley
y Schott, 1982). Por lo general, los microorganismos que tienen este antígeno, poseen
dos fases diferenciables por medio de aglutinación en tubo de ensayo (Stanchi 2007; y
Terragno et al, 2003); esto depende de dos genes estructurales que corresponden a la fase
1 y a la fase 2 que hacen referencia a estados motiles y no motiles de la bacteria. En el primer caso (H1), lo más relevante es que se trata de un Ag específico de especie (según Kauffmann y White) y su síntesis reside en el gen hag1, que sólo se expresa durante las primeras 24 h del crecimiento, en lo que se refiere al H2, es compartido por varias especies de Salmonella y el gen que codifica para su producción es el Hag2, el cmismo que se manifiesta a partir de las 24 h posteriores al inicio del desarrollo. La mayoría de las cepas del género Salmonella pueden expresar las dos especificidades de su antígeno H (difásicos), sin embargo existen algunas que logran expresar solamente uno (monofásicos) (Parra et al. 2002). Cada
Salmonella sp. expresa alternativamente estos dos tipos de antígenos mediante un mecanismo denominado “cambio de fase” (Quinn et al., 2002, Smith et al., 1952).
c. Ag capsular (K): Es un antígeno termolábil aunque existen pocas excepciones
(Bayley y Schott, 1982); es llamado en Salmonella el Ag (Vi), que protege a la bacteria
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minutos, a fin de desnaturalizar dicha cubierta y luego poder realizar la prueba de aglutinación con el Ag somático correspondiente (Stanchi 2007; Terragno et al, 2003). De allí
que la expresión de este factor depende de al menos dos genes (ViA + ViB), siendo necesario que existan los dos en la bacteria para que la expresión tenga lugar (Parra et al. 2002).
2.2.4. Factores de virulencia
Para Salmonella sp. se conocen varios factores de virulencia, uno de ellos es la producción de al menos tres toxinas: las enterotoxinas que son sustancias liberadas al intestino y que ocasionan síntomas gastrointestinales como cólico y diarrea, las endotoxinas que hacen parte de la membrana externa de la bacteria y cuya actividad biológica está asociada con los lipopolisacáridos (LPS) y por último, las citotoxinas que están asociadas con la superficie celular, las cuales inhiben la síntesis proteica en la célula hospedadora y pueden estar implicadas en la adherencia a las células epiteliales, constituyendo esta última un segundo factor de virulencia de Salmonella sp.(Madigan et al 1997;
Salyers y Whitt 2002). También se ha descrito en algunas subespecies de Salmonella (S.
typhimurium) la formación de pseudópodos en la célula hospedera, lo que trae como resultado la internalización de la bacteria en vesículas endocíticas; adicionalmente, la producción de adhesinas que incluyen fimbrias codificadas por el plásmido de virulencia pSLT, permiten la unión de la bacteria a las microvellosidades de los enterocitos, fimbrias polares largas que se encargan de la unión de la bacteria a las placas de Peyer, y las fimbrias agregativas delgadas llamadas curli que también pueden estar implicadas en la unión a las vellosidades de los enterocitos (Madigan et al 1997, Salyers y Whitt 2002).
Otros factores relacionados con la adherencia son los polisacáridos de superficie celular (O) y el antígeno Vi, un polisacárido capsular compuesto de ácido N-acetilglucosamin-urónico el cual ayuda a prevenir la fagocitosis y puede proteger la bacteria de las formas reactivas de oxígeno al interior de los fagocitos, las cepas negativas para el antígeno Vi son menos infecciosas y virulentas que las positivas para este antígeno (Parry et al. 2002).
La respuesta de tolerancia al ácido, es otro aspecto importante de la virulencia de Salmonella sp. lo que le permite a la bacteria atravesar el ambiente ácido del estómago, requisito necesario para la infección (Salyers y Whitt 2002).
2.2.5. Patogénesis y patogenicidad
Todos los serotipos de Salmonella sp. conocidos son patogénicos para el hombre y los animales (Parker y Collier, 1990). La virulencia de la bacteria se relaciona con su capacidad de
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los fagocitos como la destrucción por la acción del complemento, lo cual facilita la difusión de las salmonelas en el organismo del hospedador (Henrici 1999, Quinn et al. 2002; Smith et al.,
1952).
El complejo proceso de invasión es mediado por los productos de la expresión de varios genes cromosómicos, mientras que la capacidad de crecer en el interior de las células hospedadoras depende de la presencia de plásmidos de virulencia (Vadillo et al 2002, Smith et al
1952. y Quinn et al, 2002). Algunos factores que determinan el carácter patógeno de ciertas
especies del género Salmonella se conocen, al menos parcialmente, y se encuadran en las que se denominan genéricamente Islas de Patogenicidad (o grupos de genes relacionados con la virulencia) que se encuentran en organismos patógenos pero que están ausentes o solo presentes de forma esporádica en las especies saprófitas (Vadillo et al 2002; Terragno et al 2003).
La Salmonella sp. cuenta con 5 islas de patogenicicidad, tres de ellas conteniendo genes de virulencia (Salyers y Whitt, 2002):
§ Isla SPI1: Contiene genes inv responsables de la internalización de las células, estos genes así como otros de la misma isla de patogenicidad (spa, prg y org) codifican para un sistema de secreción tipo III; también contienen genes que codifican proteínas que son inyectadas en la célula eucariótica por este tipo de sistema de secreción, como por ejemplo el gen sptP que codifica para una tirosina fosfatasa que altera las señales de transducción en células de la mucosa, produciendo diarrea. De igual forma posee genes involucrados en la regulación de genes de virulencia (hila, invF, sira y phoPQ), algunos de los cuales controlan la expresión de genes localizados en otras partes del cromosoma de la bacteria. Los genes contenidos en esta isla parecen ser importantes en las etapas iniciales de la infección en la cual las bacterias invaden las células de la mucosa.
§ Isla SPI2: Codifica un sistema de secreción tipo III, diferente al codificado por la isla SPI1, usado por la bacteria al interior del fagosoma para evitar la fusión fagosoma-lisosoma; también codifica las proteínas que inyecta a la célula eucariótica. Esta isla de patogenicidad parece tener mayor importancia en la fase sistémica de la infección.
§ Isla SPI3: Codifica un trasportador de Mg2+ de alta afinidad, el cual puede ser de importancia en la supervivencia de la célula al interior de fagosomas. No codifica sistema de secreción.
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Las células blanco revisten el último tramo del intestino delgado y el primer tramo del intestino grueso; si la célula blanco está “libre” con respecto al número de salmonelas, es posible que se produzca una enfermedad. Los microorganismos del género Salmonella segregan exotoxinas, las cuales una vez ha tenido lugar la adherencia, determinan que la enfermedad generada sea diarreica o septicémica. Las cepas que producen diarrea se multiplican, segregan una toxina semejante a la toxina LT (termolábil) que altera la síntesis de los nucleótidos cíclicos, haciendo que el microorganismo invada la célula, ya en el interior, las Salmonelas segregan la citotoxina que provoca la muerte celular y su desprendimiento de la mucosa intestinal, desencadenando un flujo de iones y líquido hacia la luz intestinal, lo que a su vez ocasiona diarrea. (Hirsh 2006, Biberstein y Chung Zee, 1990) La
gravedad de la enfermedad depende del número de células blanco afectadas (Blaser y
Newman 1982, y Biberstein y Chung Zee 1990). Aproximadamente 107 organismos viables son
requeridos normalmente para el inicio de una gastroenteritis en humanos; en animales, se desconoce la dosis infectiva pero depende de la especie (Blaser y Newman 1982); en
animales, los síntomas de la enfermedad son dolor abdominal y diarrea acompañada de señales de muerte celular (sangre, restos de células y células inflamatorias) (Biberstein y Chung Zee1990).
Adicionalmente, es posible que las cepas que producen septicemia provoquen o no diarrea, destrucción de las células blanco, o ambas cosas. La acción de la enterotoxina se basa en la interrupción de la síntesis de proteínas provocando la muerte celular
(Biberstein y Chung Zee1990). Los síntomas que se presentan, aunque no siempre, suelen ser
septicemia y shock; las cepas que producen esta forma clínica de enfermedad eluden la destrucción por parte del hospedador y se multiplican en el interior de los macrófagos del hígado, bazo y también en el interior de los vasos sanguíneos (Hinton, 1971). Su destrucción
en la corriente sanguínea se encuentra obstaculizada en parte por las unidades repetitivas del antígeno O del LPS, posiblemente porque se impide la unión entre el complejo de ataque a la membrana del sistema del complemento y la membrana externa de la bacteria (Barrow y Lovely 1991).
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neutralizar las que son producidas por el fagosoma (Blaser y Newman 1982, Biberstein y Chung Zee1990 y
Quinn et al 2002). La multiplicación del microorganismo origina una endotoxemia, la cual
explica la mayoría de los síntomas y el curso de la enfermedad (Stanchi, 2007).
2.2.6. Salmonelosis
Constituye un grupo de infecciones producidas por microorganismos del género Salmonella sp. adquiridas por la ingestión de alimentos o bebidas contaminadas y caracterizadas por presentar síndromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales sistémicas, con frecuencia severas (Saravia 2008). Las manifestaciones
clínicas de las salmonelosis en humanos y animales se presentan básicamente bajo tres modalidades las denominadas fiebres entéricas, entre las cuales la más común es la fiebre tifoidea producida por la S. typhi, las gastroenteritis producidas por varias subespecies y la forma septicémica, caracterizada por la bacteremia asociada a lesiones focales (Saravia 2008). Dentro de las manifestaciones clínicas comunes está la fiebre
acompañada de dolor abdominal, evacuaciones intestinales líquidas frecuentes, de aspecto verdoso, fétidas, mucoides y en ocasiones con estrías de sangre (Saravia 2008, Report, 1989,1993).
2.2.7. Diagnóstico
Existe un gran número de métodos diagnósticos diferentes que pueden realizarse para la determinación de Salmonella sp., sin embargo, según la mayor parte de estudios realizados, el cultivo microbiológico es la prueba más comúnmente empleada para el aislamiento de la bacteria a partir de tejidos y excrementos. El método ideal debe tener una alta sensibilidad y especificidad, y ser al mismo tiempo simple, rápido y económico. Ningún método cumple con todos los criterios y ninguno es óptimo para todas las condiciones, dado que pueden presentarse alteraciones en los medios de cultivo y algunas pruebas bioquímicas; por lo tanto es aconsejable apoyarse también en los nuevos métodos de diagnóstico que están innovando para el aislamiento de Salmonella sp. mediante el uso de pruebas serológicas y moleculares como ELISA y PCR respectivamente; esta última tiene la capacidad de detectar un pequeño número de organismos del género Salmonella (102 a 104). Estos métodos arrojan resultados favorables y confiables en menos tiempo, pero tienen la desventaja de ser costosos (Ward
et al 2005 y Terragno et al 2003).
Ante la sospecha de salmonelosis, el material que debe remitirse al laboratorio es variado: se enviará en caso de infección intestinal, muestra de heces; en enfermedad sistémica, se recoge una muestra de sangre para realizar un cultivo estándar (Biberstein y
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agua con esta enterobacteria, para lo cual se requiere la remisión de una muestra al laboratorio para ser analizada convenientemente (Stanchi 2007); el diagnóstico incluye
aislamiento, identificación bioquímica y serotipificación de las cepas aisladas (Stanchi 2007, Luna 1991).
2.2.7.1. Métodos para el aislamiento de
Salmonella
sp.
Los métodos para el aislamiento de la bacteria están divididos en tres etapas sucesivas las cuales son: (1) Enriquecimiento No Selectivo, (2) Enriquecimiento Selectivo, (3) Siembra en Placa con medios sólidos selectivos y diferenciales. Posteriormente se lleva a cabo el estudio de las características Bioquímicas de las colonias sospechosas en los medios adecuados para su identificación, y finalmente el Análisis Antigénico (Luna, 1991).
1) Preenriquecimiento en medio no selectivo: Se utiliza cuando la muestra en estudio ha sufrido un proceso de desecación o irradiación, cuando ha estado congelada por mucho tiempo o si el pH del medio es muy bajo, este tratamiento puede determinar que las bacterias presentes en la muestra se encuentren en un estado semilatente y tiene como finalidad la revitalización de los microorganismos afectados por las diferentes condiciones de tratamientos industriales o de almacenamiento, permitiendo que las células bacterianas comiencen el proceso de multiplicación normal sin estar expuestas a sustancias inhibidoras o selectivas que puedan llegar a ser tóxicas para estas bacterias “debilitadas”, sustancias que si están presentes en los medios selectivos de enriquecimiento. Se realiza en caldo peptonado bufferado o lactosado al 0,2%, para incrementar la recuperación de especies de salmonelas deterioradas por técnicas de elaboración, preservación, preservantes, presión osmótica alta, cambios bruscos de pH, etc. (Luna 1991; Hurtado 2001).
2) Medios de enriquecimiento selectivo: Se realiza en caldos de enriquecimiento, los cuales estimulan el crecimiento de formas compatibles con Salmonella sp, e inhiben el desarrollo de bacterias intestinales y coliformes. Entre los caldos mayormente usados para el enriquecimiento selectivo de Salmonella sp. se encuentran:
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· Caldo Rappaport - Vassiliadis: Medio para el enriquecimiento selectivo de salmonelas con excepción de S. typhi y S. paratyphi A, en alimentos y otros materiales. Mediante la utilización de este caldo, es posible obtener algunas ventajas sobre otros medios nutritivos de enriquecimiento, obteniéndose un rendimiento de alrededor del 100%, especialmente a una temperatura de 43oC y previo enriquecimiento (Van Schothorst et al, 2004). El medio cuenta con una baja
concentración de verde de malaquita, cloruro de magnesio, y harina de soya para así obtener un mayor porcentaje de recuperación de Salmonella sp. Además la reducción del pH a 5,2 mejora la selectividad (Trichopoulos 1972; Iveson 1964).
· Caldo tetrationato: Medio que junto con el tiosulfato excedente, inhibe de igual forma coliformes y otras bacterias acompañantes, sin alterar las bacterias reductoras de tetrationato como Salmonella sp. y Proteus sp. Adicionalmente, las sales biliares que contiene inhiben considerablemente a todos los microorganismos de presencia obligatoria en el intestino (Palumbo y Alford, 1970)
· Caldo de enriquecimiento Gram negativos (GN) según Hajna: Favorece la recuperación de los organismos Gram negativos, especialmente Shigella y Salmonella sp., pues en su composición tiene triptona que actúa como nutriente en el medio, citrato y desoxicolato de sodio, con acción bactericida para organismos Gram positivos, especialmente Estreptococos fecales, todo tipo de bacilos esporulantes e inhiben el desarrollo de coliformes. Los fosfatos sirven de buffer, evitando la acidificación precoz del medio de cultivo a cargo de productos metabólicos ácidos. Adicionalmente, la elevada concentración de manitol sobre la dextrosa ayuda a limitar el crecimiento de Proteus y acelera el de Shigella y Salmonella sp. (Hurtado, 2001)
Es necesario tener en cuenta que el caldo de enriquecimiento usado puede afectar la recuperación de algunos serotipos de Salmonella sp., por ejemplo, ciertos serotipos pueden ser inhibidos por el tetrationato si el inóculo es pequeño (S. paratyphi A, S. houten, S. uccle, S. luton, S. gallinarum, S. meleagridis y S. treforest, entre otras)(Van Schothorst, et al, 1977).
3) Medios de cultivo selectivos y diferenciales
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lactosa como Salmonella sp. y Shigella sp. El agente inhibidor en estos medios son sales biliares (Stanchi, 2007).
a. Agar eosina azul de metileno (EMB), permite demostrar la presencia de enterobacterias patógenas y propiciar su aislamiento, sin embargo, no es confirmativo, solo permite una orientación al diagnóstico. El modo de acción del medio se basa en que sus componentes lactosa y sacarosa permiten diferenciar las enterobacterias de acuerdo con su capacidad de fermentarlos y por el aspecto y el color de sus colonias. Los colorantes empleados inhiben notablemente el desarrollo de gérmenes Gram Positivos. Las colonias de Salmonella sp. se observan en el medio incoloras o con tonalidad ambar (Bonnie, 2001).
b. Agar MacConkey (McK), las sales biliares y el cristal violeta ejercen una inhibición significativa sobre las bacterias Gram Positivas. La lactosa y el indicador rojo neutro permiten comprobar la degradación de ese disacárido; las colonias lactosa positivas (Escherichia coli) aparecen rojas con halo turbio; las lactosa negativas (Salmonella spp.) son incoloras (Stanchi, 2007).
c. Agar desoxicolato, es un medio altamente selectivo por ser el desoxicolato sódico supresor del crecimiento de coliformes y Gram positivos. Las colonias típicas de la Salmonella sp. son pequeñas, incoloras, elevadas y opacas; algunas cepas producen precipitado negro en el centro (Stanchi, 2007).
d. BD BBLTM CHROMagarTM Orientacion®: Medio de cultivo para el aislamiento e identificación de patógenos del tracto urinario. Pemite la identificación de Escherichia coli, Enterococcus, grupos KES (Klebsiella - Enterobacter . Serratia) y PMP (Proteus – Morganella - Providencia), Staphylococcus saprophyticus y Streptococcus agalactiae aunque requiere de pruebas confirmatorias. Algunos de estos microorganismos producen enzimas para el metabolismo de lactosa, glucósidos o ambos. Otros organismos no producen ningún tipo de enzima, por ejemplo E. coli contiene enzimas para el metabolismo de lactosa pero es β glucosidasa negativo; algunos miembros de la familia Enterobacteriacea, como Salmonella sp. y algunos cocos Gram positivos son β glucosidasa positivo pero no poseen las enzimas para la fermentación de la lactosa. Adicionalmente, la enzima triptófano deaminasa es típicamente encontrada en el grupo PMP.
El medio contiene sustratos cromógenos que pemiten la diferenciación de los microorganismos mediante la degradación de enzimas especificas de cada uno
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§ Medios de cultivo diferenciales: Permiten diferenciar bioquímicamente las bacterias por su actividad metabólica. Poseen un sustrato, sobre el cual actúa o no la bacteria, y esa actividad se revela por variación del pH del medio o por alguna actividad enzimática que modifica su aspecto. En el proceso de recuperación de Salmonella sp., los aislamientos sospechosos por ser No fermentadores de lactosa en el Medio Selectivo, son sembrados en medios diferenciales que permiten la observación de colonias características y propias de la bacteria (Stanchi, 2007). Los
medios más reconocidos para el aislamiento de Salmonella sp. son:
a. Agar Hektoen entérico: Medio de cultivo selectivo y diferencial empleado para la demostración y aislamiento de bacterias intestinales patógenas, a partir de los más diversos materiales tales como heces y alimentos entre otros (Merck, 1994). Las colonias
del género Salmonella se desarrollan con producción de ácido sulfhídrico (H2S) y un
halo trasparente alrededor dando características de un “ojo de pescado” (Merck,1994 ,
Murray y Shea 2004). Frente a otros medios de cultivo selectivos, el agar para
enterobacterias Hektoen aún cuando posee suficiente efecto supresor de la flora acompañante, ejerce escasa inhibición de Salmonella sp. y Shigella sp. y por lo tanto, permite la obtención de altos rendimientos en estos gérmenes (King y Meztger 1968, Taylor y Schelhart 1971).
Debido a los dos indicadores, Azul de bromotimol y Fucsina ácida, las colonias lactosa-positivas muestran una expresiva diferencia cromática frente a las colonias lactosa negativas; de igual forma ocurre en el caso de colonias que fermentan lentamente la lactosa y más fácilmente la sacarosa y la salicina, sustancias reaccionantes fácilmente fermentables, lo que impide hallazgos de patógenos falsamente positivos. La combinación de tiosulfato, como sustancia reaccionante y una sal de hierro como indicador, da una coloración negra a las colonias H2S
positivas. Una mezcla de sales biliares inhibe la flora acompañante (Merck,1994, Murray y Shea 2004).
b. Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD): Medio para el aislamiento y diferenciación de enterobacteriáceas patógenas, especialmente especies de Shigella sp. y Salmonella sp. El efecto inhibidor de este medio de cultivo es débil; el desoxicolato genera la inhibición de bacterias coliformes y permite la dispersión de cepas de Proteus que puede llegar a confundirse con las colonias producidas por Salmonella; adicionalmente, la diferenciación entre Salmonella sp. y Shigella sp. se da porque la primera produce fermentación de Xilosa, descarboxilación de Lisina y genera ácido sulfhídrico (Hurtado, 2001). La forma de acción del medio se basa en que la degradación
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el indicador rojo de fenol. El tiosulfato y la sal de hierro, revelan la formación de ácido sulfhídrico por la precipitación de sulfuro de hierro (negro) en las colonias. Las bacterias que descarboxilan la lisina, se reconocen por la presencia de un color rojo – purpúreo, debido al aumento del pH alrededor de sus colonias (Merck,1994, Murray y Shea
2004). Varias de estas reacciones pueden presentarse simultáneamente o
suscesivamente, lo que puede dar lugar a diversos matices de color del indicador de pH, ó a un viraje de amarillo a rojo en el transcurso de una incubación más prolongada. Las colonias de Salmonella sp. se observan con pigmentación rosa o roja, algunas veces transparentes con o sin centro negro y/o completamente negras
(Murray y Shea 2004). Las colonias sospechosas de Shigella son transparentes y del
mismo color que el medio de cultivo. Este género bacteriano al no fermentar la xilosa, la lactosa ni la sacarosa, no da lugar a que vire a amarillo el rojo fenol; como tampoco decarboxilan la lisina, no se produce color rojo púrpura alrededor de las colonias, al no haberse producido cadaverina (Murray y Shea 2004).
c. Agar Salmonella – Shigella (SS): Es un medio selectivo y diferencial. La selectividad está dada por las sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de coliformes y el desarrollo invasor del Proteus sp. Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa y la formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio. Salmonella sp, desarrolla colonias traslúcidas ocasionalmente opacas, algunas con centro negro a causa de la producción de ácido sulfhídrico (Meljem, 1995, Murray y Shea 2004). ). Las colonias
sospechosas de Shigella son transparentes, translúcidas u opacas y suelen ser lisas
(Murray y Shea 2004).
d. Agar verde brillante: Medio de enriquecimiento altamente selectivo y diferencial para el aislamiento de enterobacterias patógenas como Salmonella sp. a excepción de S. enterica serovar typhi y paratyphi A. En el medio la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente de nitrógeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el rojo de fenol es el indicador de pH, que vira a amarillo cuando hay producción de acido a partir de la fermentación de azúcares; el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el verde brillante actúa como agente selectivo. Las colonias de Salmonella sp. se observan con coloración rosa, blanca o transparente sobre un fondo rojo (Murray y Shea, 2004)
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comensales. Las colonias típicas de Salmonella sp. pueden ser café, gris o negras con o sin brillo metálico, generalmente el medio circundante (halo) es café que posteriormente se torna negro; algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro (Murray y Shea 2004).
f. AGAR XLT4®(DIFCOtm): Medio de cultivo selectivo y diferencial empleado para el
aislamiento e identificación de microorganismos del género Salmonella excepto S. enterica serovar typhi (Dush y Altwegg, 1955). El medio contiene peptona como fuente de
nitrógeno, extracto de levadura como fuente de vitaminas y otros cofactores; la diferenciación de Salmonella sp. de otros microorganismos se basa en la fermentación de la xilosa, lactosa y sucrosa; decarboxilación de la lisina y la producción de sulfuro de hidrógeno, la cual es detectada por la adición de iones férricos. Por su parte, el tiosulfato de sodio es adicionado al medio como fuente de sulfuro inorgánico, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico del medio y el rojo fenol es adicionado como indicador de los cambios de pH resultantes de las reacciones de fermentación y decarboxilación. Al medio base, es adicionado suplemento de agar XLT4, con el fin de inhibir el crecimiento de organismos diferentes a la Salmonella sp. Las colonias típicas de la bacteria (H2S positivas),
aparecen negras o con tonalidad amarilla con centro negro después de 18 – 24 horas de incubación. A medida que pasa el tiempo, las colonias se recubren de pigmento negro por completo o toman una tonalidad rosada hacia la periferia, con centro negro; las colonias de Salmonella sp. de las cepas H2S negativas, aparecen
de color Rosado amarillento. Por su parte, la mayoría de las colonias de Citrobacter sp. que crecen en este medio son amarillas sin evidencia de ennegrecimiento. El crecimiento de Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Proteus, Pseudomona, Providencia, Alteromonas putrefaciens, Yersinia enterocolitica y Acinetobacter calcoaceticus está completamente inhibido, mientras que las especies de Shigella son parcialmente inhibidas; las colonias que aparecen son de tonalidad roja (Becton Dickinson).
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colonias de Salmonella sp. se observan de color rosa – púrpura, mientras que los microorganismos pertenecientes a otros géneros se observan con pigmento verde – azulado, ó son completamente inhibidos (Gaillot, et al; 1999)
2.2.7.2.
Identificación bioquímica
Los microorganismos para crecer requieren de polimerización de proteínas, ácidos nucléicos, polisacáridos y lípidos; estos elementos deben encontrarse preformados en el medio donde se encuentra el microorganismo o deben ser sintetizados por la propia célula. Para realizar el metabolismo se requiere además la maquinaria biosintética para transformar los substratos en materiales básicos o compuestos utilizables para la célula, y la energía para realizar las reacciones químicas (Escobar, 2004).
[image:34.595.126.497.510.701.2]En la identificación final de Salmonella sp. las colonias sospechosas observadas en el medio de cultivo diferencial se someten a pruebas de reacción bioquímica con el fin confirmar la presencia de la bacteria. En general a Salmonella sp. se le realiza un conjunto de pruebas que incluyen producción de indol, rojo de metilo, Voges- Proskauer, Citrato, TSI, hidrólisis de la urea, deaminación de la fenilalanina, decarboxilación de lisina, arginina y ornitina, motilidad, hidrólisis de gelatina, utilización de malonato, fermentación de glucosa con producción de acido y gas, fermentación de lactosa, sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, inositol, sorbitol, arabinosa, rafinosa, maltosa, xilosa, trehalosa, celobiosa, eritritol, hidrolisis de esculina, fermentación de melibiosa, de arabitol, de glicerol, utilización de acetato, lipasa, ADNasa, transformación nitrato-nitrito, oxidasa y fermentación de manosa (Farmer, 2003, Forbes et al, 1998). (Tabla 1).
Tabla Nº 1. Propiedades Bioquímicas Diferenciales de las Subespecies de Salmonella sp.
Fuente: Instituto Nacional de Salud. 2003.
d
d
35
2.2.7.2.1.
Diagnóstico presuntivo de la presencia de
Salmonella
sp
.
A. Pruebas bioquímicas: En la tabla Nº 2 es posible observar las reacciones producidas en la batería de bioquímicas utilizada normalmente para la identificación de enterobacterias pertenecientes al género Salmonella (Koneman y Allen, 1999), la cual consta de
las pruebas descritas a continuación:
TSI (triple azúcar hierro): es un agar diferencial basado en la fermentación de azúcares y la producción de H2S y gas. Contiene glucosa, sacarosa y lactosa; estas últimas en una
concentración 10 veces mayor a la glucosa. El indicador de pH es el rojo de fenol, el cual vira a amarillo por formación de ácido a partir del carbohidrato, el sulfato ferroso es un detector de la producción de ácido sulfhídrico. Por lo general Salmonella sp. da como resultado de esta prueba una reacción alcalina/acido con producción de H2S que se
evidencia por el fondo negro del tubo (K/A H2S++); en ocasiones, como resultado de la
fermentación de glucosa también hay producción de gas (Instituto Nacional de Salud, 2003, MacFaddin, 2000).
LIA (agar lisina hierro): El fundamento de esta prueba es que los procesos de decarboxilación y deaminación en el medio de cultivo tienen lugar con la previa fermentación del carbohidrato que contiene el medio (glucosa) y la acidez producida por esta reacción, si el microorganismo posee las descarboxilasas necesarias, se produce la decarboxilación liberándose como producto final las aminas que alcalinizan el medio de cultivo, por otro lado si el microorganismo posee las deaminasas se efectúa la deaminación y el producto final son ácidos orgánicos que acidifican el medio de cultivo. Salmonella sp. por lo general da como resultado tendido púrpura y fondo púrpura, (K/K), con producción de H2S y gas, es decir, posee la enzima lisina-decarboxilasa (Instituto Nacional de Salud, 2003).
36
Producción de indol: Esta prueba se desarrolla para determinar si la bacteria en estudio está en capacidad de desdoblar el indol de la molécula de triptófano; el indol es uno de los componentes de la degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y amoniaco. La prueba se basa en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehido. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich, utilizados para la identificación de producción de indol por parte de los microorganismos. Salmonella sp. no tiene la capacidad de generar el indol por lo cual no se presenta ninguna reacción en el medio (MacFaddin 2000).
Prueba de motilidad: Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. La movilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos, aunque algunas formas de cocos son móviles. Esta prueba es llevada a cabo en un medio de cultivo semisólido (SIM), donde a su vez es evaluada la producción de indol y de ácido sulfhídrico por los microorganismos. Las bacterias móviles producirán un enturbiamiento homogéneo del medio debido a la distribución aleatoria de los microorganismos. Por el contrario las bacterias inmóviles permanecerán en la misma picadura donde se sembraron (MacFaddin,
2000). La mayoría de las salmonelas son motiles a excepción de S. pullorum y S.
gallinarum, huéspedes específicas de aves, responsables además de las enfermedades pulorosis y tifoidea aviar respectivamente (Infante et al, 1991).
