Búsqueda de hongos degradadores de 2,4,6-trinitrotolueno (TNT) y pentaeritritol tetranitrato (PETN) a partir de diferentes ambientes

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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

BUSQUEDA DE HONGOS DEGRADADORES DE 2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) Y PENTAERITRITOL TETRANITRATO (PETN) A PARTIR DE DIFERENTES AMBIENTES

JUAN PABLO ROSAS MORALES

JOHAN SEBASTIÁN SÁENZ MEDINA

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial Para optar el título de

MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

Bogotá D.C.

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2 BUSQUEDA DE HONGOS DEGRADADORES DE 2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) Y PENTAERITRITOL TETRANITRATO (PETN) A PARTIR DE DIFERENTES AMBIENTES

JUAN PABLO ROSAS MORALES JOHAN SEBASTIÁN SÁENZ MEDINA

APROBADO

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BUSQUEDA DE HONGOS DEGRADADORES DE 2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) Y PENTAERITRITOL TETRANITRATO (PETN) A PARTIR DE DIFERENTES AMBIENTES

JUAN PABLO ROSAS MORALES JOHAN SEBASTIÁN SÁENZ MEDINA

APROBADO

______________________ FABIO ROLDAN Ph.D

Microbiólogo Director

_______________________ AURA MARINA PEDROZA Ph.D

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4 TABLA DE CONTENIDO

1. RESUMEN………..6

2. INTRODUCCIÓN………8

3. JUSTIFICACIÓN...9

4. MARCO TEORICO………...10

5. OBJETIVOS………...14

5.1. Objetivo General………14

5.2. Objetivo Especifico ………...14

6. MATERIALES Y METODOS…………...15

6.1. Origen de las muestras………...15

6.1.1. Muestras impactadas con explosivos……….15

6.1.2. Muestras no impactadas con explosivos………15

6.1.3. Cepas de colección………15

6.2. Aislamiento de hongos de suelo………..………….16

6.3. Aislamiento de hongos a partir de muestras no impactadas……….….……....16

6.4. Conservación de las cepas………16

6.5. Pruebas de tolerancia a explosivos……….………….16

6.6. Pruebas de degradación ………….………..………16

6.7. Extraccion de los explosivos y analisis cromatografico………17

7. DISCUSION Y RESULTADOS………..……18

7.1. Aislamiento de hongos a aprtir de muestras impactadas……….18

7.2. Aislamiento de hongos apartir de muestras no impactadas………...20

7.3. Tolerancia a los explosivos………...20

7.4. Degradacion de los Explosivos……….24

7.4.1. Degradacion de TNT………..24

7.4.2. Degradacion de PETN………...26

7.4.3. Degradacion de Pentolita………..27

8. CONCLUSIONES………29

9. RECOMENDACIONES………...………30

10. BIBLIOGRAFIA……….31

11. ANEXOS………...32

Anexo 1………32

Anexo 2………35

Anexo 3………36

Anexo 4………37

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6 1.RESUMEN

La fabricación de explosivos con fines militares y mineros, ha hecho que este tipo de moléculas altamente persistentes lleguen al ambiente y sea necesario diseñar estrategias con el fin de remediar sitios contaminados. Dentro de estas tecnologías se encuentra la biorremediación con hongos, en especial de la podredumbre blanca, por

su capacidad de mineralizar eficientemente el TNT convirtiéndolo a CO2 y agua. Son

muy pocos los estudios que se han llevado a cabo con hongos de suelo y por esto el objetivo del presente estudio fue aislar y evaluar hongos degradadores de TNT y PETN a partir de diferentes ambientes. Se recolectaron muestras de suelo impactadas con TNT y PETN, a las cuales se realizaron recuentos de hongos utilizando agar Extracto de Malta (MEA) suplementado con TNT, PETN y Pentolita a 50, 100 y 300

mg/L. Se obtuvieron recuentos en el orden de 103 UFC/g para todas las

concentraciones de PETN evaluadas, para TNT se obtuvieron recuentos en el orden

de 10-102 UFC/g en las concentraciones probadas y para Pentolita se obtuvieron

recuentos en el orden de 101-102 en las concentraciones de 50 y 100 mg/L mientras

que en 300 mg/L no se observó crecimiento. Se seleccionaron 25 morfotipos macroscópicamente diferentes que crecieron en las concentraciones evaluadas más altas. Se aislaron 5 cepas a partir de muestras no impactadas con explosivos y se obtuvieron 2 cepas de colección. A todos las cepas seleccionadas se evaluó la capacidad de crecer en diferentes concentraciones (100, 300 y 500 mg/L) de TNT, PETN y Pentolita, midiendo el crecimiento radial diariamente. Se observó que el TNT causa una fuerte inhibición sobre el crecimiento, al igual que la pentolita; efecto que no se observo con PETN. La formación de cristales con 500 mg/L de TNT permitió observar la posible biotransformacion del explosivo por medio de la formación de halos de solubilización y coloración del agar en la cepa H10. Se seleccionaron las cepas S2, S3, S4 y H10 por presentar el menor porcentaje de inhibición y como los mejores candidatos para las pruebas de degradación y la cepa S24 que presento altos porcentajes de inhibición en TNT. A estas cinco cepas se les evaluó la capacidad de degradar 100 mg/L de explosivo en el medio de cultivo YMG. Todas las cepas removieron de 60 a 70% del TNT y 100% del TNT cuando estaba mezclado con PETN

(7)
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8 1. INTRODUCCIÓN

Los explosivos son compuestos químicos, que pueden liberar una gran cantidad de energía en forma de gas, y por esta razón son ampliamente utilizados en la industria militar y civil (1). El incremento de la producción de este tipo de sustancias se dio con el inicio de la primera guerra mundial y la creación de fábricas únicamente dedicadas a su producción. El 2,4,6-trinitrotolueno (TNT) y pentaeritritol tetranitrato (PETN) son compuestos explosivos y altamente persistentes, que pueden llegar a contaminar suelos y aguas subterráneas, en especial el TNT posee una toxicidad alta para la mayoría de los organismos, debido su carácter citotóxico y mutagénico (1), por otro lado no se ha podido establecer si el PETN es igualmente toxico (2). Se han desarrollado diferentes estrategias con el objetivo de remediar sitios contaminados con explosivos, como la adsorción a matrices de carbón activado, procesos de oxidación avanzada, biorremediación, fitorremediación e incineración siendo ésta ultima la más usada, sin embargo ha resultado altamente costosa debido a la extracción, transporte y energía requerida (3-5). La biorremediación presenta ventajas debido a su bajo costo, facilidad en las operaciones, y por ser ambientalmente amigable, por lo que se han encaminado esfuerzos tanto por buscar cepas capaces de degradar o transformar los explosivos como por elucidar las rutas metabólicas encargadas de su degradación (6).

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2. JUSTIFICACIÓN

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10 3. MARCO TEÓRICO

Un explosivo es un compuesto químico que bajo la influencia de un choque térmico o químico se descompone rápidamente con la generación de grandes cantidades de gas y energía térmica (1). Desde el surgimiento de la química orgánica en 1830 se han logrado sintetizar algunos compuestos por nitración como el TNT y el PETN, que por sus propiedades explosivas se han usado con propósitos militares y civiles.

El TNT es un compuesto nitroaromático producto de la nitración del tolueno. Esta nitración se da mediante una reacción de sustitución electrofílica, la cual requiere la presencia de ácidos nítrico y sulfúrico altamente concentrados (9). El PETN es un compuesto, siendo el más estable de los esteres de nitrato, el cual es sintetizado en

dos pasos principales de condensación y esterificación (10). (Figura 1) (Tabla 1).

Figura 1. Estructura química del TNT y PETN

El TNT es un compuesto química y térmicamente estable, con un bajo punto de fusión y como la mayoría de nitroaromaticos presenta baja solubilidad en el agua, además de una baja volatilidad expresada en los valores de presión de vapor y constante de Henry (11). Por otro lado el coeficiente de partición octanol/agua muestra que no se asocia fuertemente al suelo, por lo que presenta gran movilidad en el ambiente. El PETN es un compuesto altamente hidrofóbico, insoluble en agua, presenta un valor de

log Kow de 1.6, lo que sugiere que se adsorbe débilmente al suelo con una

consecuente movilidad en el ambiente (10). (Tabla 1).

El TNT y PETN llegan al ambiente por las aguas residuales y desechos sólidos producidos durante su fabricación, procesamiento, destrucción y reciclaje de explosivos. Una vez en el ambiente estos compuestos pueden sufrir distintos procesos en los que se incluyen, disolución, adsorción, volatilización, transformación,

TNT

2,4,6-trinitrotoluneno

PETN

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degradación biótica o abiótica y bioacumulación (1). La permanencia en el ambiente de estos explosivos o de sus subproductos puede generar un peligro potencial para los diferentes niveles tróficos como para la salud humana, por lo que la Agencia de

Protección Ambiental (EPA del inglés Envinronmental Protection Agency) de los

Estados Unidos, incluye dentro de su lista de prioridades nacionales aquellos sitos en los que exista contaminación con TNT. Adicionalmente clasifica al TNT en el grupo C: (compuesto posiblemente carcinogénico) (12). Estudios con PETN muestran que es un compuesto con una toxicidad baja y sin efectos cancerígenos en modelos animales, además la EPA no lo clasifica como un compuesto potencialmente toxico, ni tampoco incluye sitios contaminados con PETN dentro de la NPL.

Tabla 1. Algunas Propiedades Físico químicas del TNT y PETN

Propiedad fisicoquímicas TNT PETN

Peso molecular (gmol-1) 227.13 316.17

Punto de Fusión (ºC) 80.1 143.3

Solubilidad en agua a 25 ºC (mg.L-1) 130 43 coeficiente octanol/agua (Log Kow) 1.6 3.71 Constante de Henrry`s (Atm.m3. mol-1) 4.57 × 10–7 1.7 × 10–9

Presión de vapor a 25ºC (mm Hg) 1.99 × 10–4 5.38 × 10–9

Tomada de: Rivera y colaboradores, 2009

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12

de éstos contaminantes en el suelo y aguas (6), pues representa ventajas en cuanto a costos, seguridad y efectividad frente a los otros métodos.

Durante los últimos 25 años se ha investigado sobre las rutas de degradación y los organismos involucrados en la degradación de explosivos. La degradación de TNT en condiciones aerobias ha sido ampliamente reportada por cepas del genero

Pseudomonas sp, mostrando la capacidad de reducir el TNT a ADNTs o por la

remoción de grupos NO2 por medio de nitroreductasas (14). Además se conocen

otras vías que pueden transformar el TNT de manera oxidativa produciendo acido 4-amino-2,6- dinitrobenzoico. Por otro lado, en condiciones anaerobias es más frecuente encontrar microorganismos que puedan llevar a cabo transformaciones del TNT debido al carácter electronegativo de la molécula, siendo así el triaminotolueno el principal producto de degradación (15).

Diferentes estudios han demostrado que los hongos degradan TNT por cometabolismo siendo capaces primero de reducir uno o dos grupos nitro del compuesto. El principal producto de esta reducción son los aminodinitrotoluenos

(ADNTs) y sus intermediaros son nitrosodinitrotolueno (NODNTs) y

hidroxilaminadinitrotolueno (OHADNTs) (16-17). La subsecuente transformación de los compuestos dependerá de la especie del hongo, las condiciones de cultivo y el tiempo de incubación (18). Los productos de la reducción del TNT por hongos son bien conocidos, pero los mecanismos por los cuales se lleva a cabo están aún en discusión. Se ha propuesto que la membrana celular forma un sistema de reducción el cual está relacionado con el sistema de secreción de protones (19). Por lo anterior se plantea que las enzimas ligninolíticas no están involucradas en los primeros pasos de la reducción del explosivo ya que hongos no ligninoliticos pueden llevar a cabo estas primeras reducciones.

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oxidación de un electrón de compuestos fenólicos y no fenólicos. La enzima lacasa

oxida moléculas con bajo potencial de reducción (E0= 780 Mv), a diferencia LiP y MnP

que tienden a oxidar compuestos con un alto potencial de reducción (E0= 1100-1500

Mv (20). Acorde con la estructura de diferentes sustratos, estas enzimas no son específicas y pueden oxidar un amplio rango de moléculas. Basados en el producto de las enzimas ligninolíticas estas se pueden clasificar en tres grupos de hongos de la podredumbre blanca, grupo LiP-MnP, el más eficiente degradador de lignina, el grupo LiP-Lacasa y el grupo MnP-Lacasa.

Recientemente se han propuesto diferentes técnicas de biorremediación de ambientes con TNT, una de éstas es el uso de hongos ligninoíiticos, la cual se basa en la combinación de bioaumentación y bioestimulación. Para este tipo de tecnologías se

ha usado Phanerochaete chrysosporium con el cual se ha demostrado en condiciones

de laboratorio y a escala piloto que la biorremediación de suelos contaminados es posible. Sin embargo, es importante distinguir entre la mineralización y la transformación de los compuestos, ya que experimentos muestran que el 85% del TNT inicial ha sido transformado durante un periodo de 30 a 90 días, pero sólo del 5 a 20% fue mineralizado (21-22) . Por lo tanto es necesario enfocar esfuerzos en aislar organismos capaces de llevar eficientemente procesos de transformación y mineralización de estos explosivos.

La degradación de PETN ha sido reportada por la cepa Enterobacter cloacae PB2, la

cual fue aislada de suelos contaminados con explosivos, es capaz de de usar el PETN como fuente de nitrógeno ya que posee la enzima nitrato ester redusctasa que lleva a cabo la remoción secuencial de dos grupos nitro (23). Sin embargo, en nuestro conocimiento no existen estudios en la literatura sobre la degradación de PETN por hongos, pero cabe mencionar los ensayos sobre la degradación del glicerol tetranitrato (GNT) un explosivo con similares características estructurales debido a

que tiene el grupo ester de nitrato (C-O-NO2) al igual que PETN. Los hongos

Geotrichum candidum y P. chrysosporium han mostrado la remoción secuencial de

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14 4. OBJETIVOS

5.1 Objetivo general

Aislar hongos degradadores de TNT y PETN a partir de diversos ambientes.

5.2 Objetivos específicos

• Establecer las condiciones para la recuperación de los hongos posibles

degradadores de TNT y PETN.

• Seleccionar los hongos capaces de crecer en altas concentraciones de TNT y

PETN.

• Evaluar la capacidad degradadora de TNT y PETN de los hongos

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5. MATERIALES Y METODOS

6.1 Origen de las muestras.

6.1.3 Muestras impactadas con explosivos

Se recolectaron tres muestras en una planta de fabricación de explosivos en Sibate, Cundinamarca, Colombia. La muestras corresponden la zona de Fitorremediación (M1), campo de prueba de la planta (M2) y al canal de cristalización de la misma (M3) (7, 26).

Tabla 2. Características fisicoquímicas de las muestras impactas. Muestra Con. TNT

(mg/Kg) Con. PETN (mg/Kg) pH Salinidad (mg/L)

M1 N.D* 35,3± 30,7 7,42 0.47

M2 1,0 ± 0,1 3,1 ± 2,8 7,88 0.63

M3 5,2 ±1,2 0,0 7,34 0.22

*Concentración no determinada

6.1.2 Muestras no impactadas con explosivos

Se recolectaron de forma oportunista trozos de madera de arboles en estado de descomposición en la hacienda la Victoria Ubicada en la Dorada, Caldas. Las muestras se transportaron al laboratorio dentro de bolsas humedecidas y se mantuvieron en refrigeración hasta el procesamiento de las muestras.

6.1.3 Cepas de colección

Dos cepas, Trametes sp y Earliella sp fueron suministradas por la doctora Amanda

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16 6.2 Aislamiento de hongosde suelo

Se tomaron 10 g de suelo y se suspendieron en 90 mL de solución salina al 0,9%, y

se realizaron diluciones seriadas hasta 10-3. Se inocularon 0,1 mL de cada una de las

soluciones en Agar Extracto de Malta (MEA) (Oxoid) suplementado con 200 mg L-1 de

Penicilina G y 200 mg L-1 de Estreptomicina sulfatada (Aldrich, Sigma) (27). Se

adicionaron TNT, PETN o Pentolita (TNT-PETN, 1:1) a concentraciones de 0, 50, 100 y 300 mg/L. Después de 8 días de incubación a 24±1,4°C se realizaron los recuentos de UFC/g de cada muestra. Todos los experimentos se realizaron por duplicado.

6.3 Aislamiento de hongos a partir de muestras no impactadas

Las muestras de madera se desinfectaron con alcohol etílico (70%) y se sembraron en MEA con antibióticos. Se incubaron a 24±1,4°C duran te 8 días. Posteriormente se realizaron aislamientos con el fin de purificar los hongos obtenidos (28).

6.4 Conservación de las cepas

Las cepas fueron conservadas usando un disco de agar colonizado con micelio, suspendido en 1 mL de agua estéril, mantenidos a una temperatura de 4°C (29) y almacenados en el cepario de USBA.

6.5 Pruebas de Tolerancia a explosivos

La cepas seleccionadas se sembraron utilizando discos de agar colonizado con micelio en MEA suplementado con antibióticos, más TNT, PETN o Pentolita (TNT – PETN, 1:1) a concentraciones de 0, 100, 300, 500 mg/L y se incubaron durante 12 días a 24±1,4°C. Diariamente se realizó seguimiento del crecimiento radial de las cepas en cada una de las concentraciones probadas, mediante la medición del diámetro de la colonia en milímetros(27, 29). Todos los ensayos se realizaron por duplicado.

6.6 Pruebas de degradación

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utilizando 4 discos de agar colonizados con micelio en 120 mL de caldo YMG (Extracto de Malta 10 g/L, Extracto de Levadura 4 g/L Y Glucosa 4 g/L) (Oxoid) preparado por componentes y suplementado con antibióticos. Luego de 4 días de incubación se adicionaron 100 mg/L de TNT, PENT o Pentolita. Los caldos de cultivo se agitaron a 110 rpm, a 24±1,4°C en oscuridad. Se tomaron muestras de cada unidad experimental a las 0, 4, 8, 22, y 30 h. se realizo control de adsorción bajo el mismo procedimiento anterior, esterilizando la biomasa por autoclave a 121°C a 15 psi durante 15 min antes de adicionar los explosivos y para el control abiótico se utilizo el caldo de cultivo sin inocular. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

6.7 Extracción y análisis de los explosivos por HPLC

Para la determinación de los explosivos se siguió el método 8330B de la EPA (30). Para la extracción se tomaron 5 mL del caldo de cultivo los cuales se mezclaron con 5 mL de Acetonitrilo a 200 rpm durante 15 min. Las muestras se pasaron por filtros de Nylon (0.22µm) y se analizaron por cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) (Prominence 20-A, Shimadzu) utilizado una columna C-18 de fase reversa (5µm x 4,6mm x 250mm, Shimadzu Co.), fase móvil metanol-agua 1:1 con gradiente lineal, flujo de 1,2 mL/min y temperatura de 40°C en la col umna. Los compuestos: TNT, PETN, ADNT y DNT fueron monitoreados con un detector de Arreglo de Diodos (PDA) a 210nm y sus tiempos de retención fueron comparados contra patrones

primarios (AccuStandard®). Se utilizaron curvas patrón para cuantificar los

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18 7 RESULTADOS y DISCUSIÓN

7.1 Aislamiento de hongos a partir de muestras impactadas

No se observaron recuentos significativamente diferentes entre las muestras de suelo

con PETN (50, 100 y 300 mg/L) o control, encontrándose ambos en el orden de 103

UFC/g (Figura 2A, 2B, 2C). En presencia de TNT y Pentolita a las concentraciones

probadas, se observan diferencias significativas de los recuentos frente al control. A una concentración de 300 mg/L de TNT y Pentolita se recuperó solo una colonia a

partir de la muestra M2 y a concentraciones de 100 y 50 mg/L se obtuvieron

recuentos entre el orden de 10-1 a 10-2 UFC/g de suelo para todas las muestras

(Figura 2A, 2B, 2C) (Anexo 2). La relación entre la concentración de TNT y el número de colonias, muestra que a mayor concentración en el medio menor es el número de colonias que es posible recuperar, posiblemente debido al carácter citotoxico y

mutagénico del TNT. Según Weber y colaboradores (2002), existe un mayor efecto

inhibitorio del TNT sobre la germinación de esporas fúngicas que sobre el crecimiento miceliar, ya que de 71 cepas evaluadas 50 de ellas presentaron una fuerte inhibición (27). Por otro lado, en el presente estudio la concentración de PETN no mostró un efecto negativo sobre la recuperación de colonias respecto al control debido a su bajo carácter toxico, aunque algunos autores lo consideran potencialmente toxico debido a que se ha demostrado que afecta a bacterias pero no a células animales (2).

mg / L

0 50 100 300

Lo

g

U

F

C

/g

0 1 2 3 4 5

Control Pentolita PETN TNT

mg / L

0 50 100 300

Lo

g

U

F

C

/g

0 1 2 3 4 5

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Figura 2. Recuentos de hongos en TNT, PETN y Pentolita a concentraciones de 50, 100 y 300 mg/L para las muestras (A) Fitorremediacion (M1) (B) Campo de Prueba (M2) y (C) Canal PC (M3).

Medios de cultivo ricos en nutrientes, como el agar Extracto de Malta (MEA) suplementado con explosivos, han sido utilizado por casi todos los autores para la búsqueda de hongos degradadores de TNT ya que permiten una mayor recuperación de diferentes morfotipos en comparación con medios minerales (sin fuente de carbono ni nitrógeno) debido que el mecanismo de degradación de TNT por hongos se da por cometabolismo (27). Por lo tanto en el presente estudio se llevó a cabo la misma aproximación para PETN y Pentolita ya que en nuestro conocimiento no existen reportes de aislamiento de hongos degradadores de estos dos explosivos.

En total se aislaron 25 morfotipos denominados con la letra S, macroscópicamente diferentes los cuales se recuperaron a partir de las concentraciones más altas probadas de los tres explosivos en las que eran capaces de crecer. Se seleccionaron 7 cepas a partir de TNT a concentraciones de 50 y 100 mg/L, 13 corresponden a

PETN a 300mg/Ly 5 a Pentolita a concentraciones de 50 y 100 mg/L(Anexo 3). De

manera similar Weber y colaboradores (2002) seleccionaron 52 morfotipos diferentes a partir de suelos impactados con explosivos, utilizando únicamente 50 mg/L de TNT en MEA. Bennett (1995) seleccionó 4 morfotipos diferentes a partir de un compostaje contaminado con explosivos utilizando agar V8RBS (Jugo V8, Rosa de Bengala y

mg / L

0 50 100 300

Lo

g

U

F

C

/g

0 1 2 3 4 5

(20)

20

Estreptomicina) y SIRBD (medio para el aislamiento en suelo con rosa de bengala y dicloran) suplementado con 100mg/L de TNT (6), al igual en el presente estudio concentraciones de 50 y 100 mg/L de TNT permitieron la recuperación de hongos.

Por otro lado, en nuestro conocimiento no hay estudios en los cuales se hayan recuperado hongos utilizando PETN y Pentolita por lo que el presente estudio es el primer reporte en el que se aislaron y seleccionan hongos utilizando agar rico en nutrientes suplementado con PETN y Pentolita.

7.2 Aislamiento de muestras no impactadas

De las 12 muestras de madera recolectadas en La Dorada, Caldas se aislaron 5 hongos los cuales se denominaron con la letra H. La metodología de aislamiento no fue altamente selectiva para encontrar hongos de grupos fisiológicos específicos, como lo son hongos de podredumbre blanca, café, hongos saprofitos, o ectomicorrizicos debido a no se realizaron pruebas que confirmaran la producción de enzimas implicadas en la degradación de madera. Aunque se pretendía encontrar hongos relacionados con la degradación de madera debido a que han sido reportados como capaces de mineralizar el TNT (18).

7.3 Tolerancia a los explosivos

En total 31 cepas fueron evaluadas por su tolerancia a los explosivos, de las cuales 24 correspondieron a aislamientos de muestras de suelo impactado, 5 de muestras no

impactadas y 2 cepas de colección (Trametes sp y Earliella sp). 15 de las cepas

evaluadas crecieron en la concentración de 100mg/Lde TNT durante el tiempo que el

control (medio sin explosivo) logro su máximo crecimiento en caja de petri (85mm) y solo 12 de éstas fueron capaces de crecer sobre los cristales del explosivo que se

forman a una concentración de 500 mg/L en el agar. Únicamente la cepa H10

presento solubilización de los cristales y la formación de un halo color café alrededor

de la colonia (figura 3A). Weber y col. (2002) mostraron que de 71 cepas

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explosivo mediante la solubil en el agar , lo que fue asocia

Cylindrocarpon, Fusarium, G

observo biotransformacion anteriormente reportada.

Las 31 cepas evaluadas pr probadas, en las cuales no posible evidenciar visualmen halos de solubilización, ni la

Figura 3. Pruebas de toleran solubilizacón en MEA supleme PETN y Pentolita a 100, 300 y 5

El PETN no presento una radial frente al control de los alrededor del 30% a una con mostró una inhibición signific que se obtuvieron porcenta

explosivo (Anexo 4A), el mi

Pentolita, ya que las cepas (Anexo 4C) Se esperaba qu fuera aproximadamente la m

A

A

bilización de los cristales y la aparición de un

ciado a los géneros Absidia, Cunninghamella

, Gliocladium y Trichoderma (27). En el prese

n de TNT en agar a una menor concen

presentaron crecimiento en las concentracio no se observo la formación de cristales, por

ente la biotransformación del explosivo por la la producción del color café en el agar.

ancia a explosivos de la cepa H10 (A) forma mentado con 500 mg/L de TNT (B) Crecimiento y 500 mg/L.

a inhibición significativamente diferente en los hongos ya que la máxima inhibición que s

oncentración de 500 mg/L (Anexo4B). Por o

ificativamente mayor al control sobre el crecim ntajes de inhibición entre el 38 y 100% a

mismo efecto sobre el crecimiento radial se as se inhiben entre 41 y 100% a 500 mg/L que la inhibición sobre el crecimiento radial mitad del causado por el TNT debido a la c

B

B

un halo color café

ella, Acremonium,

esente estudio se entración que la

ciones de PETN or lo que no fue r la producción de

ación de halo de nto radial en TNT,

(22)

22

explosivo, por lo que no queda claro por qué en algunos de los hongos la inhibición a altas concentraciones de Pentolita es más fuerte, posiblemente la mezcla de los dos explosivos tiene un efecto sinérgico en la inhibición del crecimiento radial.

Excepto para la cepa S5, S10 y S11, el aumento en la concentración de PETN no mostró un efecto significativo sobre el porcentaje de inhibición de todas las cepas (Anexo 4B, 6). Para TNT, a una concentración de 300 y 500 mg/L no existen diferencias significativas en los porcentajes de inhibición, sin embargo entre 0, 100 y 300 mg/L existen diferencias significativas sobre los porcentajes de inhibición de las cepas evaluadas, otras pruebas de tolerancia a los explosivos realizadas con los hongos más resistentes corroboraron que este efecto no se presenta en el rango de

300 a 1000 mg/L de TNT (Figura 4). Un tendencia similar se observó en pentolita,

posiblemente porque la concentración teórica agregada no es representativa a la que se encuentra disuelta en el agar debido a la baja solubilidad de estos explosivos, de este modo el microorganismo no estará en contacto con la concentración total teórica (27). Bayman y Radkar (1996) reportaron que el TNT causa una inhibición del

crecimiento radial mayor al 50% a una concentración de 100mg/Ldel explosivo (29), a

diferencia en el presente estudio 5 de las cepas evaluadas (S2, S3, S4, S23 y H10) se

inhiben menos del 60% a una concentración de 500 mg/L(Figura 4)(Anexo 4), lo que

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|

Figura 4. Inhibición del crecimiento radial de las cepas S2, S3, S4, S24 y H10 por (A) TNT, (B) PETN y (C) Pentolita a 100, 300, 500 y 1000 mg/L.

Se confirmó la tolerancia a los explosivos de 5 cepas (S2, S3,S4, S24 y H10) aumentando la concentración hasta 1000 mg/L, únicamente con los hongos considerados más resistentes, con excepción de la cepa S24 utilizada como control,

debido a su baja tolerancia a TNT (100% de inhibición a 300 mg/L) (Figura 4), se

observó una tendencia similar a la primera prueba para todos los explosivos. Se considero que la cepa S2 era la más tolerante a TNT en las diferentes

concentraciones, seguida de S4, H10, S3 y S24 consecutivamente. (Tabla 3).

mg / L

100 300 500 700 900 1100

% in hi bi ci on 0 20 40 60 80 100 120 S2 S 24 S4 S3 H10

mg / L

100 300 500 700 900 1100

% in hi bi ci on 0 20 40 60 80 100 120

mg / L

100 300 500 700 900 1100

% in hi bi ci on 0 20 40 60 80 100 120

A B

(24)

24 Tabla 3. Porcentajes de inhibición de 5 hongos seleccionados para pruebas de

degradación

Cepa % de Inhibición a 500 mg/L

TNT PETN Pentolita

S2 43,7 0 100

S3 75 19,4 88,3

S4 64,3 0 85

S24 100 32,2 100

H10 73 26 66,7

7.4 Degradación de los Explosivos

7.4.1 Degradación de TNT

Se mostró la capacidad de degradación de TNT, PETN y Pentolita de las 5 cepas, 4 de ellas fueron seleccionadas por presentar la menor inhibición de su crecimiento (S2, S3, S4 y H10) y una usada como control (S24), durante 30 horas en medio YMG a

una concentración inicial 100 mg/L-1 del explosivo. Todas las cepas fueron capaces de

degradar el TNT, obteniendo porcentajes entre el 58 -71%. Igualmente se observo la producción de metabolitos, detectándose ADNTs y DNTs, en donde la concentración final de ADNTs fue considerablemente mayor que la concentración de DNT´s para

todas las cepas (Tabla 4) (Anexo 5).Durante las primeras 8 horas se obtuvo una alta

tasa de degradación de TNT, mientas que en las horas siguientes no se evidenciaron

cambios significativos en la concentración, encontrándose alrededor de 38 mg/L-1 para

la cepa H10 (Figura 5.), resultados similares se presentaron para las demás cepas.

(25)

Figura 5. Degradación de TNT y formación de metabolitos en medio de cultivo YMG con 100 mg/L del explosivo por la cepa H10.

Durante las primeras 8 h las cepas S2, S4 y H10 produjeron una coloraciòn roja oscura que luego desapareció en los siguientes muestreos. Este fenómeno y la detección de DNTs durante el ensayo podría sugerir que la degradación de TNT no solo se da por la vía OHADNTs sino también por la formación del complejo Meisenheimer, en donde se remueve un grupo nitro y se observan estos pigmentos. Estos resultados son muy interesantes ya que ésta vía de degradación ha sido

ampliamente reportada en bacterias pero únicamente en el hongo Irpex lacteus (19,

34).

Tabla 4. Degradación de TNT por los 5 hongos seleccionados en medio YMG después de 30 h. de incubación. Concentración inicial de TNT 100mg/L.

Cepa % remoción TNT Concentración ADNT (mg/L) Concentración DNT (mg/L)

S2 60.2 36.14 9.35

S3 71.2 7.74 12.75

S4 57.5 30.57 9.79

S24 59.6 51.50 9.27

H10 64.1 23.36 9.51

tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

C

on

ce

nt

ra

ci

ón

(

m

g

/ L

)

0 20 40 60 80 100 120 140

(26)

26

Después de 30 horas no se logro una degradación completa del TNT, posiblemente a que cuando la transformación de TNT se realiza de manera reductiva con la formación ADNTs, algunos intermediarios como NODNTs y OHADNTs, pueden llegar a inhibir la degradación de TNT (36).

La cepa S24, que presento altos porcentajes de inhibición en concentraciones de 300, 500 y 1000 mg/L de TNT, mostró una remoción del 56.9% y la mayor producción de ADNTs al cabo de 30h, por otro lado la cepa S2, que presento los menores

porcentajes de inhibición a las mismas concentraciones (Tabla 3), no tuvo el mayor

porcentaje de remoción del explosivo ni la mayor producción de ADNTs, mientras que la cepa S3 que se inhibe más del 80% a 500 mg/L del explosivo es la que mayor porcentaje de remoción alcanza. No queda claro si existe una relación entre la capacidad de tolerar altas concentraciones del explosivo con la habilidad de degradarlo.

7.4.2 Degradación de PETN

Los resultados obtenidos para PETN presentaron una alta variabilidad que se refleja en una alta dispersión de los datos. Este fenómeno fue asociado a la baja solubilidad del explosivo y que es posible observar en las curvas de degradación. Los datos que se presentan son los datos crudos y no permitirían asegurar que los hongos evaluados poseen la capacidad de degradar PETN bajo las condiciones del experimento. La extracción del control abiótico muestra un porcentaje de recuperación

alrededor del 60% (Figura 6), debido posiblemente a la baja solubilidad del explosivo

(43 mg/L) (11), a pesar que este fue previamente disuelto en acetonitrilo, solvente miscible con el agua, lo que permite una mayor solubilidad . Sin embargo, no se observò una degradación significativa a través del tiempo ni variabilidad en el control. Tanto el tratamiento como el control de adsorción para todas las cepas presentaron una alta variabilidad entre las unidades experimentales, posiblemente porque el explosivo es adsorbido o presenta otros procesos de sorción y desorción con la

biomasa (Anexo 6). La cepa S24, tanto en caja como en medio líquido presento la

(27)

posiblemente por adsorción tanto en el control como en el tratamiento, lo que indicaría

que la biomasa es un interferente para la recuperación del explosivo (Figura 6).

Figura 6. Degradación de PETN en medio de cultivo YMG suplementado con 100mg/L del explosivo por la cepa H10.

7.4.3 Degradación de Pentolita

La concentración inicial de los explosivos afecta la capacidad de los hongos para degradarlos, ya que en los experimentos realizados a una concentración inicial de 100 mg/L de TNT, ninguna de las cepas evaluadas degradaron el 100% del explosivo en un periodo de 30 h, mientras que a una concentración inicial de 50 mg/L de TNT,

todas las cepas evaluadas degradan el 100% (Tabla 5) del explosivo durante el

mismo periodo de tiempo, con la subsecuente producción de ADNTs, posiblemente porque la biomasa obtenida en los 4 días de inoculo no alcanza a ser lo suficientemente abundante para evitar la inhibición que causa el TNT en la respiración de los hongos, como habían reportado anteriormente Stahl y Aust (1993) (37). No se detecto la presencia de DNTs durante las 30 horas a pesar que se produjo una coloración roja oscura en las cepas S2, S4, H10, posiblemente porque la

concentración de DNTs es inferior al límite de detección (≤ 5 mg/L) (Anexo 7), ya que

tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

m

g/

L

0 20 40 60 80 100 120 140

PETN

(28)

28

en los experimentos con TNT a 100 mg/L, la máxima concentración de DNTs está alrededor de 9 mg/L para todas las cepas evaluadas.

*Los datos para PETN no fueron calculados

Figura 6. Degradación de (A) TNT en presencia de (B) PETN y sus metabolitos en medio de cultivo YMG suplementado con 50 mg/L de los explosivo por la cepa H10.

Tabla 4. Degradación de Pentolita (TNT + PETN*) por 5 hongos en medio YMG a las 30 h. de incubación. Concentración inicial de Pentolita 100mg/L.

Cepa % remoción TNT Concentración ADNT (mg/L) Concentración DNT (mg/L)

S2 100 23,85 0

S3 100 8,23 0

S4 100 44,15 0

S24 100 51,3 0

H10 100 18,63 0

tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci ón ( m g/ L) 0 20 40 60 80 100 120 140 TNT ADNTs ADNT Control Adsorsión Control Abiotico tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci ón ( m g/ L) 0 20 40 60 80 100 120 140 PETN Control Adsorsión Control Abiotico

(29)

8 CONCLUSIONES

• El uso de un agar rico en nutrientes como el agar Extracto de Malta (MEA)

suplementado con 50 y 100 mg/L de TNT o Pentolita permitió la recuperación de hongos con capacidad de degradar TNT.

• El rango de concentraciones de lo explosivos (TNT y Pentolita) evaluado en la

prueba de tolerancia permitió seleccionar los hongos con menor inhibición sobre su crecimiento. Por otro lado, para PENT no se observo inhibición del crecimiento radial en el rango seleccionado

De las 31 cepas evaluadas provenientes de ambientes impactados y no impactados con explosivos se seleccionaron las 5 cepas (S2, S3, S4, S23 y H10) que presentaron la mayor tolerancia (menor inhibición). Estas cepas fueron aisladas principalmente en suelos impactados (4 de 5) y en medios con TNT y Pentolita

• Todas las cepas seleccionadas mostraron degradación de TNT con la consecuente

(30)

30 9 RECOMENDACIONES

• Evaluar concentraciones más elevadas de PETN tanto para la recuperación

de cepas y pruebas de tolerancia.

• Buscar una metodología que permita aumentar la solubilidad del PETN en

los medios de cultivo (p.e:uso de surfactantes).

• Evaluar si la degradación es llevada a cabo por enzimas asociadas a la

membrana o por enzimas extracelulares

• Evaluar la capacidad de degradar explosivos en liquido de hongos de la

podredumbre blanca como Trametes sp y Earliella sp. Realizar curvas de

calibración para la cuantificación de metabolitos relacionados en la degradación de PETN.

• Implementar una metodología de extracción para muestras con bajas

(31)

10 BIBLIOGRAFÍA

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(32)

32

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(33)

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37. Stahl JD, Aust SD. Metabolism and Detoxification of TNT by Phanerochaete chrysosporium.

(34)

34

ANEXO 1

Curvas patrón para (A) TNT, (B) PETN, (C) 2,6-DNT, (D) 2,4-DNT, (E) 2,4-ADNT

Concentración TNT (mg/L)

5.000 20.000 50.000 100.00 150.000 200.000 250.000

A B S a 2 10 m n 130373.8 336295.0 1962965.3 3662553.3 5648910.9 7451278.2 8743291.5 0.9971130 = R 1.58685 -x * 2.7782e = f(x) 2 -005

Concentración PETN (mg/L)

5.000 20.000 50.000 100.00 150.000 200.000 250.000

(35)

Concentración 2,6-DNT (mg/L)

5.000 20.000 50.000 100.00 150.000 200.000 250.000

A

B

S

a

2

10

m

n

118506.8 281124.7 1774392.7 3302858.0 5093297.9 6736287.0 7949122.5

0.9975525 =

R

1.131 -x 3.06038e =

f(x) 2

-005

Concentración 2,4-DNT (mg/L)

5.000 100.00 150.000 200.000 250.000

A

B

S

a

2

10

m

n

141568.2 3231581.8 4459109.5 6368327.2 7791258.4

0.9977671 =

R

0.597591 x

3.19856e =

f(x) 2

-005 +

(36)

36 Concentración 2,4-ADNT (mg/L)

5.000 20.000 50.000 100.00 150.000 200.000 250.000

A

B

S

a

2

10

m

n

165459.6 310176.8 1973352.6 3827733.2 5322639.3 7613821.9 9244107.8

0.9982847 =

R

0.0806649 x

* 2.68625e = f(x)

2

(37)

ANEXO 2.

Recuentos de hongos en agar MEA Suplementado con antibióticos de las muestras M1, M2 y M3.

Muestra Explosivo Replica 50 mg/L 100 mg/L 300mg/L 0 mg/L

MI

TNT A 5x10

1 1x101 0

6x103 B 3x10 1 1x101 0

PETN A 5x10

3 4x103 4x103

B 4x103 4x103 5x103

9x103

Pentolita A 1x10

2 0 0

B 7x102 1x101 0

M2

TNT A 3x10

2 1x101 0

11x103

B 1x102 0 1x101

PETN A 7x10

3 6x103 5x103

B 9x103 11x103 6x103

7x103

Pentolita A 2x10

1 1x101 0

B 2x102 2101 0

M3

TNT A 1x10

1 0 0

1x103

B 1x101 0 0

PETN A 2x10

3 1x103 1x103

B 4x103 3x103 1x103

3x103

Pentolita A 1x10

1 0 0

(38)

38 Anexo 3.

Origen de las cepas S1-S25, aisladas de muestras impactadas con explosivos.

Cepa Muestra Explosivo Concentración (mg/L)

S1 M2 PENTOLITA 100

S2 M1 PENTOLITA 100

S3 M1 PENTOLITA 50

S4 M3 PENTOLITA 100

S5 M2 PENTOLITA 100

S6 M1 PETN 300

S7 M1 PETN 300

S8 M1 PETN 300

S9 M2 PETN 300

S10 M2 PETN 300

S11 M1 PETN 300

S12 M1 PETN 300

S13 M2 PETN 300

S14 M3 PETN 300

S15 M3 PETN 300

S16 M3 PETN 300

S17 M3 PETN 300

S18 M3 PETN 300

S19 M3 TNT 50

S20 M2 TNT 300

S21 M1 TNT 100

S22 M1 TNT 50

S23 M3 TNT 50

S24 M2 TNT 100

(39)

ANEXO 4.

Graficas integradas de las pruebas de tolerancia representadas en porcentaje de inhibición, para todas las cepas evaluadas

mg / L

0 100 200 300 400 500 600

%

in

hi

bi

ci

òn

0 20 40 60 80 100 120

mg / L

0 100 200 300 400 500 600

%

in

hi

bi

ci

òn

0 20 40 60 80 100 120

mg / L

0 100 200 300 400 500 600

%

in

hi

bi

ci

òn

0 20 40 60 80 100 120

A

B

(40)

40 Anexo 5.

Cinéticas de degradación de TNT, para los 5 hongos evaluados, (A) S2, (B) S3, (C)

S4, (D) S24 (E) H10

tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci ón ( m g/ L) 0 20 40 60 80 100 120 140 tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci ón ( m g/ L) 0 20 40 60 80 100 120 140 tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci ón ( m g/ L) 0 20 40 60 80 100 120 140 tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci ón ( m g/ L) 0 20 40 60 80 100 120 140 tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci ón ( m g / L ) 0 20 40 60 80 100 120 140 TNT ADNTs DNTs

(41)

Anexo 6.

Cinéticas de degradación de PETN, para los 5 hongos evaluados, (A) S2, (B) S3, (C)

S4, (D) S24 (E) H10

tiempo (días)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci ón ( m g/ L) 0 20 40 60 80 100 120 140 tiempo (días)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci ón ( m g/ L) 0 20 40 60 80 100 120 140 PETN Control Adsroción Control Abiotico tiempo (días)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci on ( m g/ L) 0 20 40 60 80 100 120 140 tiempo (días)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci ón ( m g/ L) 0 20 40 60 80 100 120 140 tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

(42)

42 Anexo 7.

Cinéticas de degradación de Pentolita, para los 5 hongos evaluados, (A) S2, (B) S3,

(C) S4, (D) S24 (E) H10. Columna derecha TNT, columna izquierda PETN.

tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci ón ( m g/ L) 0 20 40 60 80 100 120 140 TNT ADNTs DNTs Control Adsorción Control Abiotico tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci ón ( m g/ L) 0 20 40 60 80 100 120 140 tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci ón ( m g/ L) 0 20 40 60 80 100 120 140 tiempo (días)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci on ( m g/ L) 0 20 40 60 80 100 120 140 PETN Control Adsorción Control Abiotico tiempo (días)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci on ( m g/ L) 0 20 40 60 80 100 120 140 tiempo (días)

0 5 10 15 20 25 30 35

(43)

tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci ón ( m g/ L) 0 20 40 60 80 100 120 140 tiempo (días)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci on ( m g/ L) 0 20 40 60 80 100 120 140 PETN Control Adsorción Control Abiotico tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

C on ce nt ra ci ón ( m g/ L) 0 20 40 60 80 100 120 140 TNT ADNT Control Adsorsión Control Abiotico tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

Figure

TABLA DE CONTENIDO

TABLA DE

CONTENIDO p.4
Tabla 1. Algunas Propiedades Físico químicas del TNT y PETN

Tabla 1.

Algunas Propiedades Físico químicas del TNT y PETN p.11
Tabla 2. Características fisicoquímicas de las muestras impactas.

Tabla 2.

Características fisicoquímicas de las muestras impactas. p.15
Figura 2.  Recuentos de hongos en TNT, PETN y Pentolita a concentraciones de 50, 100 y PC (M3).300 mg/L para las muestras (A) Fitorremediacion (M1) (B) Campo de Prueba (M2) y (C) Canal

Figura 2.

Recuentos de hongos en TNT, PETN y Pentolita a concentraciones de 50, 100 y PC (M3).300 mg/L para las muestras (A) Fitorremediacion (M1) (B) Campo de Prueba (M2) y (C) Canal p.19
Figura 3. Pruebas de toleransolubilizacón en MEA suplemePETN y Pentolita a 100, 300 y 5ancia a explosivos de la cepa H10  (A) formamentado con 500 mg/L de TNT (B) Crecimiento y 500 mg/L

Figura 3.

Pruebas de toleransolubilizacón en MEA suplemePETN y Pentolita a 100, 300 y 5ancia a explosivos de la cepa H10 (A) formamentado con 500 mg/L de TNT (B) Crecimiento y 500 mg/L p.21
Figura 4.  Inhibición del crecimiento radial de las cepas S2, S3, S4, S24 y H10 por (A) TNT,(B) PETN y (C) Pentolita a 100, 300, 500 y 1000 mg/L

Figura 4.

Inhibición del crecimiento radial de las cepas S2, S3, S4, S24 y H10 por (A) TNT,(B) PETN y (C) Pentolita a 100, 300, 500 y 1000 mg/L p.23
Tabla 3. Porcentajes  de inhibición de 5 hongos seleccionados para pruebas de degradación

Tabla 3.

Porcentajes de inhibición de 5 hongos seleccionados para pruebas de degradación p.24
Figura 5. Degradación de TNT y formación de metabolitos en medio de cultivo YMG con 100 mg/L del explosivo por la cepa H10

Figura 5.

Degradación de TNT y formación de metabolitos en medio de cultivo YMG con 100 mg/L del explosivo por la cepa H10 p.25
Tabla 4. Degradación de TNT por los 5 hongos seleccionados en medio YMG después de 30 h

Tabla 4.

Degradación de TNT por los 5 hongos seleccionados en medio YMG después de 30 h p.25
Figura 6. Degradación de PETN en medio de cultivo YMG suplementado con 100mg/L del explosivo por la cepa H10

Figura 6.

Degradación de PETN en medio de cultivo YMG suplementado con 100mg/L del explosivo por la cepa H10 p.27
Tabla 4. Degradación de Pentolita (TNT + PETN*)  por 5 hongos en medio YMG a las 30 h

Tabla 4.

Degradación de Pentolita (TNT + PETN*) por 5 hongos en medio YMG a las 30 h p.28
Figura 6. Degradación de (A) TNT en presencia de (B) PETN  y sus metabolitos en medio de cultivo YMG suplementado con 50 mg/L de los explosivo por la cepa H10

Figura 6.

Degradación de (A) TNT en presencia de (B) PETN y sus metabolitos en medio de cultivo YMG suplementado con 50 mg/L de los explosivo por la cepa H10 p.28

Referencias

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