Maceración de estrujados de uvas en atmósfera hiperbárica de CO2 : efectos sobre bacterias ácido lácticas y levaduras

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MACERACIÓN DE ESTRUJADOS DE UVAS EN ATMOSFERA

HIPERBARICA DE CO2: EFECTOS SOBRE BACTERIAS ACIDO LACTICAS Y LEVADURAS

KATHERIN SOCHA HIGUERA.

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al titulo de Microbiólogo industrial

Microbióloga Industrial

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

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NOTA DE ADVERTENCIA

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

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MACERACIÓN DE ESTRUJADOS DE UVAS EN ATMOSFERA

HIPERBARICA DE CO2: EFECTOS SOBRE BACTERIAS ACIDO LACTICAS Y LEVADURAS

KATHERIN SOCHA HIGUERA

APROBADO

________________________ ________________________ Marco Quijano Rico Christian Suárez

Dipl.Chem.,Ph.D Microbiólogo Industrial Director Codirector

________________________ ________________________ David Gomez M.Sc. Andrea Aguirre M.Sc.

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MACERACIÓN DE ESTRUJADOS DE UVAS EN ATMOSFERA

HIPERBARICA DE CO2: EFECTOS SOBRE BACTERIAS ACIDO LACTICAS Y LEVADURAS

KATHERIN SOCHA HIGUERA

APROBADO

________________________ ________________________ ANGELA UMAÑA M.Phil David Gomez M.Sc.

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Dedico este trabajo a DIOS por su enorme ayuda en todos los momentos de mi vida, por hacer que de los tiempos difíciles tomemos las enseñanzas para poder construir tiempos mejores, por poner

siempre en mi camino personas que hacen mejor mi existir, por darme la oportunidad de aprender de cada segundo que vivo y de darme las herramientas para poder culminar esta etapa tan importante en mi vida. A mi mamá: Ana Edilma Higuera, por darme su inmenso amor, que ha sido el principal instrumento para poder cumplir todas mis metas, por brindarme su apoyo y seguridad, por enseñarme a ser todo lo que soy y por que siempre ha estado en todos lo momentos de mi vida dándome lo mejor de ella. A mi amigo: Ronald Rojas, por su apoyo incondicional y su gran ayuda para que este sueño se hiciera realidad. A todos los que han estado a mi lado,

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Agradezco especialmente a mi director, Dr. Marco Antonio Quijano Rico, por darme la oportunidad de aprender de sus grandes conocimientos, por su hospitalidad y su apoyo incondicional, así como también al equipo de trabajo del Viñedo & Cava Loma de Puntalarga, por su gran colaboración y acogida. A mi codirector, Christian Suárez por su cooperación,

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ABSTRACT

(8)

RESUMEN

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TABLA DE CONTENIDO

1 INTRODUCCIÓN 18

2 MARCO TEÓRICO Y

REVISION DE LITERATURA 20

2.1 Descripción de la uva 20

2.1.1 El raspón 20

2.1.2 Los hollejos 20

2.1.3 Las semillas 21

2.2 Maduración de la uva 21

2.2.1 Periodo herbáceo 21

2.2.2 Envero 21

2.2.3 Periodo de maduración 22

2.2.4 Sobremaduración 22

2.3 Composición de las uvas 22

2.3.1 Agua y sales minerales 22

2.3.2 Hidratos de carbono 22

2.3.3 Ácidos 23

2.3.4 Fenoles 23

2.3.4.1 Ácidos fenólicos 23

2.3.4.2 Flavonoides 24

2.3.5 Compuestos nitrogenados 24

2.3.6 Lípidos y compuestos relacionados 24

2.3.7 Terpenoides 25

2.3.8 Compuestos volátiles de aroma 25

2.3.9 Vitaminas 25

2.4 Estrujado 26

2.5 El mosto 26

2.5.1 Obtención y tratamiento del mosto de uva 26

(10)

2.6 Bacterias ácido lácticas 27

2.7 Levaduras 29

2.7.1 Brettanomyces sp 30

2.8 Defectos del vino 31

2.8.1 Bacterias ácido lácticas 32

2.8.2 Levaduras

2.8.2.1 Brettanomyces sp.

34 36 2.9 Etapas de contaminación durante la elaboración de

vino tinto 38

2.9.1 Contaminación en el vino por Brettanomyces 38 2.10 Métodos empleados para el control de Bacterias

ácido lácticas y Brettanomyces sp 41

2.11 Potencial de CO2 bajo presiones hiperbaricas para el control de bacterias ácido lácticas y levaduras

( Brettanomyces sp ) 42

2.12 Cinética de muerte microbiana 44

2.12.1 Cinética de desactivación microbiana por altas

presiones 45

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y

JUSTIFICACIÓN 46

3.1. Formulación del problema 46

3.2. Justificación 46

4. OBJETIVOS 48

4.1. General 48

4.2. Específicos 48

5. MATERIALES Y MÉTODOS 49

5.1 Sitio de estudio 49

5.2 Muestreo 50

5.2.1 Preparación de muestras 50

5.3 Parámetros de operación del tratamiento

hiperbárico de CO2 50

(11)

5.4.2 Procedimiento 53

5.5 Recuento de bacterias acido lácticas 54

5.6. Recuento de levaduras 55

5.7 Fermentación alcohólica 55

5.8 Análisis microbiológico de los vinos 56

5.8.1 Aislamiento de bacterias ácido lácticas 56

5.8.2 Aislamiento de levaduras salvajes 56

5.8.3 Aislamiento de Brettanomyces sp 56

5.9 Parámetros físico-químicos 57

5.9.1 Determinación del contenido

alcohólico por el método de Roessner 58

5.9.2 Determinación refractométrica del extracto

del vino 58

5.9.3 Determinación potenciométrica del pH 58

5.9.4 Color comparativo 58

5.10 Evaluación sensorial 59

5.11 Análisis estadístico 59

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 60

6.1 Efectos del tratamiento hiperbárico de CO2 sobre células de levaduras y bacterias ácido

lácticas. 60

6.2 Parámetros Físico-Químicos de los vinos 69

6.3 Análisis microbiológico de los vinos 70

6.4 Análisis sensorial 71

7 CONCLUSIONES 77

8 RECOMENDACIONES 79

(12)

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Fermentaciones heterolácticas y homolácticas. 29

Figura 2 Formación de 4 etil fenol y 4 etil guaiacol en el vino. 38

Figura 3 Riesgo de contaminación por bacterias ácido lácticas y levaduras (Brettanomyces) durante las etapas de la elaboración de vino tinto, 2 y 3 riego extremo, 4 riesgo interno. 40

Figura 4 Vista aérea del Viñedo Loma de Puntalarga, Nobsa, Boyacá. 49

Figura 5 Esquema del biorreactor para presiones hiperbáricas de CO2 51

Figura 6 Procedimiento a seguir para el tratamiento en atmósfera hiperbárica de CO2 de muestras de estrujados de uvas 53

Figura 7 Salida de muestra al ciclón de muestreo 54

Figura 8 Toma de muestra en el ciclón de muestreo 54

Figura 9 Equipo de filtración 57

Figura 10 Medio DBDM 57

Figura 11 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, promedio de los tres montajes 61

Figura 12 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias ácido lácticas, promedio de los tres montajes 62

Figura 13 Efectos del tiempo de proceso (a 400Mpa y 25°C) en la sobrevivencia de suspensión celular de R. rubra en medio de Aw=0.94 67

Figura 14 Comparación del efecto del CO2 bajo presión. Bacterias acido lácticas y levaduras. 68

Figura 15: Panel de catadores 72

Figura 16 Claridez de los vinos Pinot noir evaluados 73

Figura 17 Color de los vinos Pinot noir evaluados 73

Figura 18 Olor de los vinos Pinot noir evaluados 74

Figura 19 Sabor de los vinos Pinot noir evaluados 75

(13)

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Estimación aproximada de los porcentajes normales, en

peso, de los componentes de las uvas y del mosto, en el momento

de la vendimia. 27

Tabla 2 Defectos producidos en el vino por parte de las bacterias

ácido lácticas 32

Tabla 3 Características de las levaduras causantes de la flor del

vino. 35

Tabla 4 Defectos en el vino causados por Brettanomyces sp 36 Tabla 5 Métodos para el control de bacterias ácido lácticas y

Brettanomyces sp. 41

Tabla 6 Partes del biorreactor y su función. 52 Tabla 7 Promedio de los resultados del recuento de levaduras en

los tres montajes 60

Tabla 8 Promedio de los resultados del recuento de bacterias ácido

lácticas en los tres montajes 60

Tabla 9 Comparación del efecto del CO2 bajo presión. Bacterias

acido lácticas y levaduras. 67

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ÍNDICE DE ANEXOS

ANEXO 1 Equipos

ANEXO 2 Reactivos

ANEXO 3 Composición de medios de cultivo

3.1 Agar MRS

3.2 Agar YGC

3.3 Agar WL

3.4 Medio DBDM

3.5 Medio YNB

ANEXO 4 protocolo de procedimiento para tratamiento de estrujados de uvas en atmósfera hiperbárica de CO2

ANEXO 5 Tablas de resultados

5.1 Resultados del recuento de levaduras en el Primer Montaje 5.2 Resultados del recuento de levaduras en el Segundo Montaje 5.3 Resultados del recuento de levaduras en el tercer montaje 5.4 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el Primer

Montaje

5.5 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el

Segundo Montaje

5.6 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el Tercer

Montaje

5.7 Efecto de las presiones hiperbáricas de CO2 en el tiempo de

reducción decimal (D) y la tasa de inactivación de levaduras

5.8

Efecto de las presiones hiperbáricas de CO2 en el tiempo de reducción decimal (D) y la tasa de inactivación de bacterias ácido

lácticas

ANEXO 6 Graficas

(15)

6.3 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 3 6.4 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias acido

lácticas, Montaje 1

6.5 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias acido

lácticas, Montaje 2

6.6 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias ácido

lácticas, Montaje 3

6.7 Grafica comparativa del recuento de levaduras de los tres

montajes

6.8 Grafica comparativa del recuento de bacterias acido lácticas de

los tres montajes

ANEXO 7 Evaluación de características sensoriales ANEXO 8 Tabla normalizada de la OIV para la evaluación de

características sensoriales

ANEXO 9 Guía de catación

ANEXO 10 Análisis Estadístico

10.1 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los

recuentos de levaduras en el Montaje Numero 1 10.2 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los

recuentos de levaduras en el Montaje Numero 2 10.3 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los

recuentos de levaduras en el Montaje Numero 3 10.4 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los

promedios de los recuentos de levaduras

10.5 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los

recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 1 10.6 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los

recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 2 10.7 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los

recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 3 10.8 Análisis estadístico de los resultados obtenidos del promedio

de los recuentos de bacterias ácido lácticas

(16)
(17)

INTRODUCCIÓN

En la elaboración de vinos tintos de la variedad Pinot noir en la Loma de Puntalarga, ha sido cada vez más frecuente la aparición de defectos del perfil sensorial como: arratonado, sudor de caballo, pesebrera, tono de alquitrán, medicina, cuero, los cuales se atribuyen generalmente a la acción de levaduras del género Brettanomyces sp y/o a bacterias ácido lácticas del género Lactobacillus. Este problema parece estar asociado a los cambios en el proceso de vinificación que se han hecho para poder desarrollar una fermentación maloláctica con cepas seleccionadas de

Oenococcus oeni, después de la fermentación alcohólica. Debido a la gran sensibilidad de Oenococcus oeni al dióxido de azufre, SO2, es necesario limitar la concentración de este en la masa estrujada alrededor de 20ppm. Bajo estas condiciones el riesgo de desarrollo de

Brettanomyces sp y bacterias ácido lácticas indeseables es muy alto. En efecto, para el control de Brettanomyces sp y bacterias ácido lácticas, en general, se necesitan concentraciones de dióxido de azufre al menos de 40ppm.

Como la fermentación maloláctica con Oenococcus oeni le da a los vinos de Pinot noir características sensoriales muy apreciadas, se requiere evitar el daño causado por levaduras y bacterias lácticas indeseables. Es decir, es necesario reducir considerablemente las poblaciones de esos microorganismos y con ello los daños que pueden introducir en el perfil sensorial.

(18)

de la ecología de la vinificación y las presiones a las cuales se ha utilizado en Puntalarga son tecnológicamente accesibles con facilidad.

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2. MARCO TEORICO Y REVISION DE LITERATURA

2.1 Descripción de la uva.

Es un fruto procedente de una planta fanerógama sarmentosa y caducifoliar de ciclo anual en climas templados (Matiz y Prieto 1993).

El racimo de la uva comprende una parte leñosa o raspón y los granos también llamados bayas que están constituidos por la piel, las semillas, y la pulpa que proporciona el zumo o mosto. El grano de uva esta compuesto por un epicarpio, la piel, película o pellejo, un mesocarpio carnoso, la pulpa y un endocarpio, el cual tapiza los lóculos que contienen las semillas (Galet 2000).

2.1.1. El raspón.

Los tallos, también llamados raspón o escobajo, constan del vástago principal, que por lo común sale de la axila de una hoja, y de los tallitos ramificados, en los que se asientan los granos. Constituyen a la vez las vías de conducción de las sustancias nutricias, que se forman preferentemente en las hojas y durante la etapa de crecimiento y maduración se acumulan en la carne de las uvas como ácidos, azúcar, etc. (Galet 2000).

Las uvas que se consideran bien maduras exhiben por lo general los tallos de color castaño y completamente lignificados (Riberéau et al. 1989).

2.1.2. Los hollejos.

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hollejo es el pigmento contenido en las capas de células y cuya cantidad e intensidad cromática desempeñan un papel relevante en la elaboración del vino tinto (Vogt et al.1986, Reynier 1991).

2.1.3. Las semillas.

En todos los granos de la uva normalmente desarrollados existen semillas cuyo número oscila entre 2 y 4, cuyo peso constituye el 3 o 4% del de los granos, contienen 10-20% de aceite y 5-9% de taninos, pequeñas cuantías de ácidos volátiles y una sustancia resinosa muy amarga que presta al vino un desagradable sabor astringente cuando se disuelve a partir de las semillas (Riberéau et al. 1989, Navarre 1991).

2.2 Maduración de la uva.

El estado de maduración de la uva condiciona la calidad e incluso el tipo de vino, es por tanto, uno de los principales factores de la vinificación. En la mayoría de las regiones vinícolas no se puede obtener vino de excelente calidad, si la uva no esta bien madura. La evolución de la uva se divide en cuatro periodos (Reyner 1991):

2.2.1. Periodo herbáceo. Durante este periodo se forma el grano, la uva es verde, coloreada por la clorofila, y presenta una consistencia dura (Riberéau et al. 1989, Galet 2000).

(21)

2.2.3. Periodo de maduración. Es el periodo comprendido entre el envero y la madurez de la uva en donde, la pulpa acumula rápidamente azúcar y al mismo tiempo disminuye la acidez, se presenta engrosamiento del grano de uva, formación de taninos, coloración del fruto y formación de aromas. Este periodo es irregular y depende de las condiciones meteorológicas (Ribéreau et al. 1989, Galet 2000).

2.2.4. Sobremaduración. Se presenta cuando la uva se deja en la vid después de la madurez normal. Durante este periodo el fruto no recibe nada más de la planta, vive de sus reservas y pierde agua (Vogt et al. 1986 y Galet 2000).

2.3 Composición de las uvas.

2.3.1. Agua y sales minerales.

Por medio del agua las raíces de la vid toman también sales minerales del suelo necesarias para la constitución de la cepa, principalmente se trata de fosfatos de potasio, calcio y magnesio, pero también de pequeñas cuantías de sulfatos, cloruros y silicatos. De acuerdo con la variedad de la uva y el grado de maduración de esta, el contenido de agua oscila entre 780 y 850 g/l (Vogt et al. 1986, Boulton et al. 2002).

2.3.2. Hidratos de carbono.

(22)

concentración, y otros azúcares, que se sabe están presentes debido a la biosíntesis, entre ellos están: arabinosa, ribosa, xilosa, mucosa, maltosa, manosa, melobiosa, rafinosa y estaquiosa (Blouin et al. 2000, Boulton et al. 2002).

2.3.3. Ácidos

La cantidad de ácidos en las uvas o en los productos derivados de ellas es pequeña. La acidez de las uvas sanas esta constituida, por 95%, de los ácidos tartárico y málico, se encuentran igualmente pequeñas cantidades de cítrico, isocítrico, aconitico, glutárico, fumárico, pirrolidin-carboxilico, 2-cetoglutárico y sikímico, que también se encuentran en mostos. En uvas y vinos dañados aparecen los ácidos propionico y butírico (Blouin et al. 2000, Boulton et al. 2002).

2.3.4. Fenoles

Las sustancias fenólicas son muy importantes para las características de la uva y del vino, así como para su calidad. En ellas se incluyen los pigmentos colorantes, los compuestos que forman compuestos de color marrón, los aromas, los gustos astringentes y las conocidas sustancias amargas de las uvas y del vino (Boulton et al. 2002).

2.3.4.1. Ácidos fenólicos

(23)

ácido P-cumárico (30mg/l), después el ácido vainillínico y el cafeico (15mg/l) (Blouin et al. 2000, Boulton et al. 2002).

2.3.4.2. Flavonoides

Los antocianinos, son las sustancias que esencialmente caracterizan las uvas. En la piel de las uvas, incluso de las blancas, hay una mezcla de pigmentos verdes y amarillos. En las uvas rojas y azules se encuentra al iniciarse la maduración un pigmento rojo azulado (enina, enocianina), este corresponde a las sustancias colorantes vegetales rojas y azules comprendidas bajo la denominación común de “antocianina“(Blouin et al. 2000).

La sustancia tánica (enotanino) esta contenida en el escobajo, pieles y semillas y tiene un marcado sabor astringente (Ribéreau et al. 1989).

2.3.5. Compuestos nitrogenados

Los compuestos nitrogenados contenidos en la uva son principalmente las sales amonicas, aminoácidos , péptidos, proteínas y derivados de ácidos nucleicos, resultan de gran interés para la elaboración del vino por ser sustancias nutricias imprescindibles para las levaduras (Blouin et al. 2000).

2.3.6. Lípidos y compuestos relacionados

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2.3.7. Terpenoides

Los grupos de mayor interés en la elaboración del vino, son los monoterpenos y sus derivados. Los monoterpenos son compuestos de 10 átomos de carbono, mucho de los cuales son volátiles y poseedores de aroma (Boulton et al. 2002).

2.3.8. Compuestos volátiles del aroma

En las uvas están presentes muchos compuestos volátiles de aroma y sus precursores, cantidades importantes de estos compuestos, especialmente etanol, alcoholes amílicos, acetato de etilo y derivados del acetaldehído, se producen en todas las fermentaciones por levaduras (Boulton et al. 2002).

Las diversas clases de uvas se diferencian, únicamente en los valores cuantitativos de las sustancias que la componen, así, las variedades de “bouquet “se caracterizan por un elevado contenido en alcoholes y óxidos terpénicos (Ribéreau et al. 1989).

2.3.9. Vitaminas

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2.4 Estrujado

Consiste en romper el hollejo de la uva de modo que libere la pulpa y el zumo, el estrujado puede ser más o menos intenso según el hollejo sea simplemente aplastado o triturado. La estructura de la pulpa puede permanecer casi intacta o por el contrario las gruesas vacuolas de las células ceden todo su zumo (Ochoa et al. 1991, Bryce 2000).

2.5 El mosto

El zumo de uva que fluye al prensar los granos “machacados “es un líquido turbio y dulce que exhibe color entre amarillento claro y rojizo, si se deja en reposo, se clarifica dejando un pozo compuesto principalmente por restos celulares de las uvas. El mosto de uva contiene numerosas sustancias disueltas, entre las que prevalecen por su cantidad e importancia, azúcares como glucosa y fructosa y ácidos como tartárico, málico y cítrico. El “peso” del mosto, su contenido en azúcar, ácidos y otros componentes, dependen de la clase de uva, del tipo de suelo del que procede, de las condiciones atmosféricas que imperaron durante el desarrollo y maduración de los racimos (Matiz et al. 1993, Ribéreau et al. 1989).

2.5.1. Obtención y tratamiento del mosto de uva

(26)

residual esponjando el bagazo y volviendo a prensar (mosto de extracción, post extracto). En los vinos tintos la uva se fermenta sin eliminar el hollejo y el color es extraído durante la fermentación (Lizarazo y Martínez 1996).

2.5.2. Componentes de uvas y mosto

Tabla 1: Estimación aproximada de los porcentajes normales, en peso, de los componentes de las uvas y del mosto, en el momento de la vendimia.

COMPUESTOS BAYAS MOSTO

Agua 74 76

Sales inorgánicas 0.5 0.4

Hidratos de carbono 24 23

Alcoholes 0 0

Ácidos 0.6 0.7

Fenoles 0.2 0.01

Compuestos nitrogenados 0.2 0.1

Lípidos 0.2 0.01

Terpenoides 0.02 0.01

Otros compuestos volátiles 0.01 0.01

Varios 0.1 0.01

Fuente: Boulton et al. 2002. Teoría y práctica de la elaboración del vino

2.6 Bacterias ácido lácticas

(27)

pueden tener 0.5ų de espesor y de 2 a 5ų de longitud (Zambonelli 1988, Álvarez et al. 1998).

Según el catabolismo de los azúcares, las bacterias ácido lácticas tienen carácter homo y heterofermentativo. Las homofermentativas originan ácido láctico (80-90%) utilizando la vía glicolitica de Embden-Meyerhof; y las heterofermentativas metabolizan la glucosa siguiendo la ruta de Warburg-Dickens ( figura 1 ), originando además de ácido láctico, importantes cantidades de anhídrido carbónico, ácido acético, acetaldehído, etanol, acetoina, diacetilo, etc. ( Hernández 1995 )

El manual de Bergeys las ha dividido en cuatro grupos considerando un amplio número de elementos como son: la taxonomía molecular, la determinación de peptidoglicano de la pared celular, la definición de los grupos antigénicos y el isómero de ácido láctico obtenido. Se dividen en los Géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus y Pediococcus

(28)

Figura 1: Fermentaciones heterolacticas y homolacticas

Fuente:Boulton et al. 2002. Teoría y práctica de la elaboración del vino

2.7 Levaduras

(29)

de los vinos dulces y pueden enturbiar o dar sedimentos en los vinos secos; y las de contaminación, que se encuentran en gran cantidad en bodegas de conservación destacándose los géneros Pichia, Hansenulla y

Candida , causantes de velos que se forman en la superficie de los vinos o en paredes empapadas de vino y en contacto con el aire ( Dittrich 1987, Loureiro et al. 2003).

2.7.1. Brettanomyces sp.

Brettanomyces es una levadura que pertenece a los ascomycetos y es la responsable de olores y sabores desagradables principalmente en vinos tintos de la variedad Pinot noir (Gerbaux et al. 2000).

Dekkera es la forma esporulada de la levadura Brettanomyces. El género

Brettanomyces, presenta 5 especies: B. nanus, B. anomalus, B.

custersianus y B. naardenensis y B. bruxellensis, siendo ésta última la que interesa desde el punto de vista enológico (Egli and Kling 2001).

Brettanomyces es un microorganismo fermentador relativamente lento, por esta razón es raramente el organismo dominante durante la fermentación primaria y puede encontrarse al final de la fermentación alcohólica y maloláctica (FML), puede fermentar cantidades pequeñas de azúcares residuales, es frecuentemente encontrada en vinos y puede fermentar bajo condiciones aerobias y anaeróbicas. Es una levadura fuertemente acidogénica, que produce grandes cantidades de ácido acético de la oxidación del etanol (Parish et al. 2003, Chatonnet, 2002).

Brettanomyces puede usar varios sustratos y crecer rápidamente sobre cualquier residuo de azúcar, como glucosa, fructosa, arabinosa y trehalosa encontrada en el vino. La celobiosa, un componente de la celulosa es otro sustrato que puede ser utilizado por Brettanomyces

(Licker et al. 1998).

(30)

medicinal, pelo del caballo, sudor del caballo, antiséptico, plástico, ratón, y metálico (Chassagne 2005, Ibeas et al. 1996).

2.8 Defectos del vino

No siempre se consigue que un vino fermente y madure de manera que satisfaga las expectativas de los conocedores. Desde el prensado hasta el embotellado el vino esta expuesto al peligro de sufrir daños que pueden llegar a motivar su completo deterioro, los microorganismos responsables de esto son todos aquellos indeseables en un lugar y tiempo particular. Obviamente, incluyen los microorganismos que producen aromas y gustos extraños, olores, colores o precipitados, además de sustancias indeseables que pueden incluso afectar a la aptitud del vino para el consumo, es decir, que no solo afectan a los caracteres sensoriales (ejemplo: producción de aminas biogenas), estos compuestos pueden progresar- lo que resulta especialmente característico- y hacer al vino incomestible (Suárez et al. 1990, Boulton et al. 2002).

(31)

2.8.1. Bacterias ácido lácticas

Tabla 2: Defectos producidos en el vino por parte de las bacterias ácido lácticas

DEFECTO AGENTE CARACTERISTICAS SUSTANCIAS RESPONSABLES PICADO LACTICO Bacterias heterolácticas pertenecientes al género Lactobacillus (Guillaume 2001).

Se reconoce por el penetrante sabor ácido dulce y olor de coles fermentadas frescas (Guillaume 2001).

Ácido láctico, acético, glicerina, etanol y diacetilo. Formados por la transformación de azúcares

residuales presentes en el vino (Suárez et al. 1990) (Pardo 2004).

AHILADO O ENFERMEDAD DE LA GRASA

Streptococcus

mucilaginus var.

vini, bacterias heterofermentativas del género Lactobacillus. Especies del género Leuconostoc

(Suárez et al. 1990).

Se caracteriza por el aspecto aceitoso o filante (Suárez, 1990).

Cambio de la consistencia fluida, normal en vinos sanos, en otra mas viscosa (Pardo 2004). Polisacáridos exentos de nitrógeno, integrados por glucanos, glucomananos, y polímeros compuestos de galactosa, manosa, arabinosa y ácido galacturónico (Suárez

et al. 1990)

VUELTA O REBOTE

Bacterias del género

Lactobacillus

(plantarum, brevis)

(Guillaume 2001).

Los vinos presentan enturbiamiento, cambio de color, aspecto

achocolatado negruzco en tintos y oscurecimiento en los blanco, en la

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superficie burbujas de gas (Guillaume 2001).Se observan irisaciones

coloreadas como islotes flotantes de grasa. El sabor y el olor llegan a ser repugnantes, siendo este relacionado con el olor a chucroutte (Guillaume 2001). ENFERMEDAD DEL AMARGOR Lactobacillus casei, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus hilgardii, Leuconostoc gracile, Leuconostoc oenos

(Suárez et al. 1990)

Color del vino rancio, presenta

enturbiamiento y se genera un sedimento castaño.

Sabor amargo elevado (Suárezet al. 1990).

Acroleína en combinación con los polifenoles

(Guillaume 2001).

AMINAS BIOGENICAS

Pediococcus,

Oenococcus oeni, Bacterias

heterolácticas pertenecientes al género

Lactobacillus

(Moreno et al. 2003).

Efectos sobre la salud humana, absorbidas en alta concentración producen dolores de cabeza, alteraciones respiratorias, hiper o hipotensión y fenómenos de alergia. El carbamato de etilo es

considerado como un compuesto

(33)

cancerigeno (Orduña 2000).

la arginina ( Orduña 2000) VINOS CON OLOR A RATON Bacterias heterofermentativas del género

Lactobacillus como

Lactobacillus brevis

y Lactobacillus hilgardii.

( Heresztyn 1986, Boulton et al. 2002).

El olor de estos vinos recuerda el olor de los nidos de ratones o la orina de raton (Boulton et al. 2002).

Formación de piperidinas, 2-acetil-3, 4, 5,6-tetrahidropiridina (Boulton et al. 2002).

DETERIORO PRODUCIDO POR MANITOL

Bacterias lácticas heterofermentativas (Boulton et al. 2002).

Gusto a vinagre y a ester. Producción de viscosidad (Boulton

et al. 2002).

Formación de manitol, butanol, propanol y ácido acético (Boulton et al. 2002).

2.8.2. Levaduras

Las levaduras salvajes podrían no tomarse como contaminantes en vinos, es decir, los géneros que se encuentran en concentraciones mas bien altas sobre las uvas, y que logran fermentaciones alcohólicas limitadas:

Kloeckera, Hansenulla y Hanseniaspora; la influencia de estos

microorganismos sobre la fermentación alcohólica depende de las condiciones de elaboración, el uso de dióxido de azufre y/o los cultivos iniciadores de levaduras vínicas, pero en cualquier caso llegaran a ser inactivas cuando la concentración de etanol alcanza el 5% aproximadamente(Boulton et al. 2002, Pina et al. 2004).

(34)

pueden estar en concentraciones bajas en el vino joven, pero nunca crean problemas durante la conservación (Dittrich 1987, Boulton et al. 2002)

Tabla 3: Características de las levaduras causantes de la flor del vino

MICROORGANISMO CARACTERISTICAS PRINCIPALES

Pichia membranefaciens • Se desarrolla en mostos de uva (Suárez et al.1990).

• A veces puede iniciar una levísima fermentación sobre estos (Montaña et al. 1997, Loureiro et al. 2003).

• En mostos de uva forma un velo muy tenue, liso o con rugosidad, muy fino (Flor del vino) (Suárez et al. 1990).

• Fermentan únicamente glucosa y fructosa (Dittrich 1987).

• Son células de forma oval, alargadas o cilíndricas (Dittrich 1987).

Candida mycoderma • Fermenta débilmente la glucosa (Suárez et al.1990).

• Asimila el etanol como única fuente de carbono (Montaña et al. 1997).

• Produce la enfermedad de flor del vino (Suárez et al. 1990).

• Son células de forma oval, alargadas, cilíndricas (Suárez et al. 1990).

(35)

• Esporas con forma típica de sombrero de hongo (Suárez et al. 1990).

• Fermenta débilmente los

azucares: glucosa, rafinosa, sacarosa (Montaña et al. 1997).

• Forma velo sobre el mosto antes de fermentar (Suárez et al. 1990).

Zygosaccharomyces acidifaciens • Células ovales-alargadas de gran tamaño (Dittrich 1987).

• Presenta poder fermentativo medio (Suárez et al. 1990).

• Forma velo sobre vinos de baja graduación alcohólica (Suárez et al. 1990).

• Se desarrolla en medios con alta concentración de azúcar (Dittrich 1987).

2.8.2.1 Brettanomyces sp.

Tabla 4: Defectos en el vino causados por Brettanomyces sp.

CARACTERÍSTICAS COMPUESTOS RESPONSABLES

Perdida de los sabores frutales, producidos por los esteres.

Se pierde parcialmente el carácter varietal de un vino contaminado por

Brettanomyces (Eder 2003).

ESTERASAS.

Secretadas por Brettanomyces, estas enzimas promueven la perdida de esteres (Eder 2003).

Aroma desagradable, relacionado con el aroma del chucroutte (Berger 2003) (Guillaume 2001).

(36)

El aroma específico depende de la concentración de los compuestos responsables. En concentraciones bajas huele como a pan o palomitas de maíz. En grandes concentraciones como ratón o pelo y sudor de caballo (Heresztyn 1986).

TETRAHIDROPIRIDINAS. Para la síntesis de estas se requiere de los sustratos lisina, etanol o propanol

(Heresztyn 1986).

Aroma y sabor a analgésico y medicina gracias a la presencia del 4 etil fenol, picante y humeante por el 4 etil guaiacol (Eder 2003, Chassagne 2005).

4 etil fenol y 4-etil guaiacol, son fenoles volátiles, formados por la degradación del 4- vinil fenol y 4-vinil guaiacol , respectivamente ( Chatonnet 1992, Gerbeaux et al. 2000, Stender et al.2001, Dias et al. 2003, Loureiro et al, 2003).

Los compuestos fenólicos sólo se producen por Brettanomyces , su presencia en el vino puede servir como una indicación absoluta de contaminación por este microorganismo, en tanto los ácidos grasos volátiles no confirman una directa contaminación por parte de

Brettanomyces , ya que estos compuestos son producidos también por

muchas bacterias ácido lácticas y ácido acéticas, así como las tetrahidropidridinas producidas también por lactobacilos heterofermentativos (Heresztyn 1986 , Peyron1998 , Berger, 2003).

Los vinos tintos tienen un nivel alto de taninos como el ácido ferúlico y cumárico que son extraídos de los hollejos de las uvas durante la fermentación. La levadura del vino Saccharomyces y algunas bacterias ácido lácticas tienen enzimas las cuales degradan estos ácidos a intermediarios débiles llamados 4 vinil fenol y 4 vinil guaiacol (paso 1, figura 2). Estos compuestos son enzimáticamente degradados por

(37)

Figura 2: Formación de 4 etil fenol y 4 etil guaiacol en el vino

Fuente: Gawel, 2004. Brettanomyces character in wine

2.9 Etapas de contaminación durante la elaboración de vino tinto.

2.9.1. Contaminación en el vino por Brettanomyces.

La relación de Brettanomyces con el vino comienza en la vid. Se ha hallado en el hollejo de la uva de todo tipo de cepas de Vitis vinifera y en casi todas aquellas regiones donde se ha estudiado con las técnicas apropiadas, pero no causa ningún tipo de enfermedad ni al fruto ni a la planta, simplemente se aprovecha de las soluciones azucaradas secretadas. Cuando llega la época de la vendimia la levadura llega al lugar adherida a la uva, por lo que es la propia materia prima la que constituye la principal fuente de contaminación (Licker et al. 1998).

(38)

pronto es eclipsada por la levadura Saccharomyces cerevisiae. Posteriormente, tras la fermentación, es muy posible que entre la flora microbiana presente en el vino comience a sobresalir Brettanomyces,

sobre todo si las condiciones higiénicas durante la fermentación no han sido adecuadas (Figura 3) (Caridi et al. 1993).

Las principales habilidades que tiene Brettanomyces para desarrollarse en un vino son la gran capacidad para fermentar azúcares residuales y una extraordinaria adaptación a condiciones ambientales adversas como las que presenta el vino (alta concentración de alcohol, pH ácido, falta de oxígeno, etcétera) Después de la fermentación del mosto aún permanecen trazas de azúcares que pueden ser utilizadas por este tipo de levaduras para su desarrollo, su crecimiento es lento y su metabolismo es complejo. En muchos casos la presencia de este contaminante no implica que el vino vaya a enfermar ni siquiera en un período prolongado. En otros, una barrica o una botella pueden pasar de tener un vino excelente a otro con una alta acidez volátil y unos aromas desagradables en cuestión de semanas. El ácido acético contribuye a aumentar la acidez volátil, el olor a vinagre, también producido por muchas bacterias indeseables, normalmente el aumento en ácido acético conlleva a la aparición de acetato de etilo, que da olores a acetona (Chatonnet 2002, Chatonnet et al. 1992).

(39)

1. Entorno

2. Cepa + uvas. Alto riesgo de contaminación por Bacterias lácticas y

Levaduras (Brettanomyces sp.)

3. Uvas, operaciones de previnificación. Moderado riesgo de

contaminación por Bacterias lácticas y Levaduras (Brettanomyces

sp.)

4. Uvas, operaciones de vinificación y acondicionamiento. Bajo riesgo de contaminación por Bacterias lácticas y Levaduras (Brettanomyces sp.)

Figura 3: Riesgo de contaminación por bacterias ácido lácticas y levaduras

(Brettanomyces) durante las etapas de la elaboración de vino tinto, 2 y 3 riego

externo, 4 riesgo interno

(40)

2.10 Métodos empleados para el control de bacterias ácido lácticas y

Brettanomyces sp.

Tabla 5:Métodos para el control de bacterias ácido lácticas y Brettanomyces sp.

METODO Bacterias ácido lácticas Brettanomyces sp

SO2 Son muy sensibles a este,

comienzan a verse

afectadas a concentraciones bajas de

20ppm (Suárez y Leal 1990).

La adición de 20ppm no tiene ningún efecto en las poblaciones de

Brettanomyces sp, la inhibición del crecimiento de esta levadura se da adicionando 40ppm (Fevillat 1997).

REDUCCION DE LA ACIDEZ

Un pH mas básico disminuye la eficacia del anhídrido sulfuroso como antiséptico. Permitiendo así un mejor desarrollo de las

bacterias lácticas indeseables (Gerbeaux

et al. 2002)

Se crea un ambiente mas favorable para el desarrollo, habría que utilizar el triple de anhídrido sulfuroso para conseguir la misma protección frente a los microorganismos

( Gerbeaux et al. 2002)

NATAMICINA No inhibe el crecimiento estos microorganismos ( Gerbeaux et al. 2002)

Es un fungicida, actúa

sobre Brettanomyces

cuando se utiliza a una concentración de 20mg/l, su eficacia decrece con el tiempo ( Gerbeaux et al. 2000)

LISOZIMA Inhibe el crecimiento de bacterias lácticas a una concentración de 10g/l (Gerbeaux et al. 2000).

Su crecimiento no se ve inhibido por esta (Gerbeaux

(41)

FILTRACION ESTERIL

Estas células se ven atrapadas en filtros de membrana con un tamaño de poro de 0.65 micras.

Se utilizan filtros de membrana con tamaño de poro de 0.45 micras. La filtración despoja del carácter frutal, reduciendo la viscosidad, y creando un tanino más fuerte en el vino tinto (Chatonnet et al. 1999).

DIMETIL DICARBONATO

( DMDC )

Inhibe el crecimiento de estas bacterias. (Egli y Kling 2001).

Su crecimiento se ve inhibido, ya que, el DMDC es esterilizante (Egli y Kling 2001).

2.11 Potencial del CO2 bajo presiones hiperbáricas para el control de bacterias ácido lácticas y levaduras.

Los efectos inhibitorios de gases bajo presión sobre células microbianas han sido extensivamente estudiados. Sin embargo, el mecanismo general de inhibición de microorganismos no es todavía bien entendido, aunque existe la posibilidad de que se ejerza la absorción de gas por las células, así, cuando las células microbianas son presurizadas, el gas gradualmente penetra dentro de las ellas. Este fenómeno de gas puede causar la inactivación de enzimas claves relacionadas con los procesos metabólicos esenciales por cambios en el pH de las células y/o solubilización de sustancias intracelulares tales como fosfolípidos de las paredes de la célula y membrana citoplasmática (Haas et al. 1989).

(42)

tratamiento con gas comprimido (Haas et al. 1989, Nakamura et al.

1994).

El efecto del dióxido de carbono comprimido sobre diferentes tipos de microorganismos ha sido estudiado por diversos investigadores. La inactivación microbiana por CO2 es dependiente de muchos parámetros. Algunas de las condiciones experimentales como temperatura, presión, humedad, contribuye a un efectivo tratamiento por incremento de la difusibilidad de CO2. Dentro de ciertos límites, una prolongada duración de exposición al dióxido de carbono puede permitir la esterilización (Wei.,

et al. 1991) (Lin et al. 1993).

La resistencia microbiana al dióxido de carbono también depende de el tipo de microorganismo, la fase de crecimiento, y el medio de suspensión, este último puede inhibir el efecto bactericida de CO2 comprimido, especialmente en sustratos ricos en proteínas .Varias hipótesis han sido propuestas para explicar la actividad microbicida del dióxido de carbono Lin et al (1993), ha observado que a alta presión, el dióxido de carbono penetra las células haciendo que estás se rompan de repente. Los autores pudieron mejorar la velocidad de ruptura disminuyendo súbitamente la presión de CO2. Nakamura et al (1994) y Kumagai et al (1997) observaron que el mejor resultado de destrucción microbiana fue obtenido cuando la presión de CO2 fue reducida muy rápido. En alimentos con alto contenido de agua, el CO2 disuelto produce ácido carbónico, de acuerdo a la siguiente reacción de equilibrio:

H2O + CO2 ↔ H2CO3↔ H+ + HCO3- ↔ 2H+ + CO32-

Ecuación 1: Producción de acido carbónico

Fuente: Louka, 1999. Effect of compressed carbon dioxide on microbial cell viability

(43)

células. Esto sugiere que la inhibición microbiana puede resultar de alteración en las propiedades de la célula (membrana, citoplasma, enzimas, etc.). Por tanto una reducción en el pH del medio no es suficiente para explicar la acción antimicrobiana con CO2, la cual muestra un efecto inhibitorio específico, mayor que el de otros ácidos usados para bajar la acidez del medio (ácido hidroclórico, ácido fosfórico), estos ácidos no penetran en las células microbianas tan fácilmente como el dióxido de carbono (Louka et al.1999).

2.12 Cinética de muerte microbiana

La cinética de muerte celular es un factor importante que debe tenerse en cuenta a la hora de diseñar procesos de esterilización. En un medioambiente letal, las células de una población no mueren todas a la vez sino que la desactivación del cultivo se produce durante un periodo finito de tiempo que depende del número inicial de células viables y de la severidad de las condiciones impuestas (Doran 1995).

(44)

2.12.1 Cinética de desactivación microbiana por altas presiones

La aplicación de cualquier nueva tecnología en la preservación de alimentos requiere un modelo fiable que describa con presición la tasa de inactivación. El modelo debe poder establecer las condiciones de tratamiento apropiadas para lograr los niveles de inactivación microbiana, permitiendo la producción de estabilidad y seguridad en los alimentos (Mañas et al.2005).

Los parámetros del proceso térmico generalmente han sido calculados a través del modelo cinético de primer orden. Como resultado una curva de supervivencia recta (gráfico de Log de células sobrevivientes vs tiempo de tratamiento) es obtenida, un tiempo de reducción decimal (valor D) y valor Z son usados para calcular los parámetros del proceso (Smelt et al. 2002).

Los primeros experimentos para dilucidar la cinética de destrucción de los microorganismos por las altas presiones se hicieron imitando los modelos muy bien conocidos de los tratamientos térmicos, es decir, representando, a presión constante, el logaritmo de supervivientes frente al tiempo de tratamiento (Mañas et al.2005).

Sin embargo, en los últimos 10 años la conveniencia de la cinética de primer orden para modelos de inactivación por calor, así como para las nuevas tecnologías esta revisándose. Esto es debido a la ocurrente frecuencia de desviaciones (Chen et al. 2003).

(45)

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION.

3.1. Formulación del problema.

Para la realización de la fermentación maloláctica bajo condiciones controladas es necesario reducir considerablemente las dosis usuales de SO2. En estas condiciones diversos microorganismos perjudiciales para las características sensoriales del vino tales como: bacterias ácido lácticas y levaduras por ejemplo del género Brettanomyces, pueden multiplicarse sin grandes limitaciones y causar daños importantes e irremediables en el perfil sensorial de los vinos. La utilización del CO2 hiperbárico para el tratamiento de los estrujados de uvas debe permitir una reducción suficiente de las poblaciones de estos microorganismos para evitar las mencionadas alteraciones del perfil sensorial del vino, o por lo menos reducirlas a niveles aceptables.

3.2. Justificación.

(46)
(47)

4. OBJETIVOS

4.1. GENERAL

Evaluar el potencial del CO2 bajo presión hiperbárica, para el control de poblaciones de levaduras y bacterias ácido lácticas, en uvas estrujadas de la variedad Pinot noir del Viñedo & Cava Loma de Puntalarga.

4.2. ESPECIFICOS

• Establecer el tiempo necesario para reducir en mas de 95% las poblaciones de bacterias ácido lácticas y levaduras bajo las siguientes condiciones: Presión: 35 bar, pH: 3.2-3.3, temperatura 15°C y concentración de azúcares 28°Brix.

• Evaluar la respuesta al tratamiento hiperbárico de CO2 de poblaciones de bacterias ácido lácticas y levaduras por medio de la técnica de “recuento en placa”.

• Evaluar la presencia de Brettanomyces sp. en medio DBDM después de la fermentación alcohólica.

(48)

5. MATERIALES Y METODOS

5.1 Sitio de estudio

El trabajo se llevó a cabo en el viñedo “Loma de Puntalarga” Nobsa, Boyacá (Figura 4), situado a 5°46'47.1” latitud norte y 72°58'36.5” longitud oeste, altitud de 2618 m.s.n.m. la loma esta localizada al borde del denominado Valle del Sol, Valle de Sogamoso en la proximidad del curso del rió Chicamocha en la vertiente occidental de la cordillera oriental de los Andes. En el año se tienen promedios de temperatura y precipitación de 16.5°C y 830mm respectivamente (Chaparro 2001).

Figura 4: Vista aérea del Viñedo Loma de Puntalarga, Nobsa, Boyacá

(49)

5.2 Muestreo

Se escogió aleatoriamente una parcela dentro del viñedo, cultivada con cepas de Pinot noir. Posteriormente se tomaron 100 uvas de diferentes plantas, con el fin de determinar el grado de maduración de la uva, por medio del contenido en azúcar grados Brix (gramos de azúcar en 100 ml de solución: 1° Brix equivale a 10g de azúcar/ L), el cual aumenta con el grado de maduración (Matiz et al. 1993, Bryce 2000).

Una vez conocido el grado de maduración de las uvas se llevo a cabo la vendimia o cosecha, de plantas seleccionadas aleatoriatoriamente. Se procedió con precaución al momento de cortar el racimo de la mata. Los racimos fueron recolectados y depositados en baldes (Matiz et al. 1993, Paipilla et al. 1997,).

5.2.1 Preparación de muestras

Se realizó un despalillado manual de los racimos seleccionando las uvas por color y sanidad. Se pesaron 8Kg de uvas. Y se procedió a realizar un estrujado manual de los granos de uva, se adicionó 0.35g de metabisulfito de sodio, y se procedió a almacenarlo en bolsas de polietileno con 250g de estrujado c/u. Se sellaron y se almacenaron a -18°C.(Gutiérrez et al. 1993, Steild et al. 2001, Archer 2004, Zdenek 2003).

5.3 Parámetros de operación del tratamiento hiperbárico de CO2

En este estudio se empleo el CO2 para probar su poder de inactivación sobre el crecimiento de células microbianas. En los estrujados de uvas. Se experimentó con un método de control de CO2 a una presión de operación de 35 bar, temperatura 15°C, 28°Brix y pH: 3.3.

(50)

realizó recuento en placa de bacterias ácido lácticas y levaduras (Anexo 5) (Montaña et al. 1997, Álvarez et al. 1998, Quijano 2005).

Con el fin de obtener una mayor exactitud en los resultados, el procedimiento se realizó por triplicado (montaje 1,2 y 3)

5.4 Tratamiento de estrujados bajo presión

5.4.1 Biorreactor, partes y sus funciones

Figura 5: Esquema del biorreactor para presiones hiperbáricas de CO2

(51)

Tabla 6: Partes del biorreactor y su función

PARTES DEL BIOREACTOR

FUNCIÓN

A. Válvula Abre el cilindro que contiene el CO2. B. Válvula Regula el paso de CO2.

C. Válvula Permite el paso de CO2 del cilindro al autoclave.

D. Válvula Se utiliza para la extracción de la muestra desde la cámara de presión.

E. Manómetro Un medidor de presión (manómetro de 0-100 bar). F. Válvula de

alivio

Permite regular la presión del biorreactor.

G. Tapones y uniones “T”

Para sellar y conectar tramos de tubería de ¼ de pulgada respectivamente.

H. Conectores Al cilindro de CO2. J. Conducto

central

Paso del CO2, del cilindro al recipiente de la muestra.

K. Filtro Para salida de muestra, en tela de acero inoxidable. L. Recipiente

contenedor del liquido

Fabricado en acero inoxidable 316.

M. Ciclón de muestreo

Para toma de muestras.

N. Cilindro de CO2 Contiene CO2.

O. Doble pared Para la regulación de temperatura, mediante la circulación de un líquido caloportador.

P. Abrazadera Ajusta herméticamente el biorreactor.

(52)

5.4.2 Procedimiento

Figura 6: Procedimiento a seguir para el tratamiento en atmósfera hiperbárica de CO2 de

muestras de estrujados de uvas

Descongelación de muestras 15°C por 15 h

Carga del biorreactor con 750g de estrujado

Cierre hermético del equipo

Expulsión de aire por corriente de CO2 durante 5 minutos

Toma de muestras (minutos) (Figuras 7 y 8)

30 60 90 120 150 180 210 240 300

Recuento

Bacterias ácido lácticas

Levaduras

Lavado y desinfección delciclón de muestreo

Después de cada toma de muestra Presurización con CO2

35 bar, 15°C

(53)

Figura 7: Salida de muestra al ciclón de muestreo

Figura 8: Toma de muestra en el ciclón de muestreo

5.5 Recuento de bacterias ácido lácticas

Para realizar el conteo de bacterias ácido lácticas, se realizaron diluciones seriadas decimales desde 10-1 hasta 10-6en agua peptonada al 0.1%p/v Se sembraron en superficie 0.1ml de estas diluciones en agar MRS (Anexo 3.1) y se incubaron a 30ºC por 72 horas, en microaerofília. La aparición de colonias blancas, Gram positivas y catalasa negativas se considero indicativo de bacterias ácido lácticas (Álvarez et al. 1998 y Carrascal et al. 2002).

(54)

5.6 Recuento de levaduras

Para realizar el conteo de levaduras, se realizaron diluciones seriadas decimales desde 10-1 hasta 10-6en agua peptonada al 0.1%p/v.

Se sembraron en superficie 0.1ml de las diluciones en agar YGC (Anexo 3.2) y se llevaron a incubar a 25°C por 3 días, adicionalmente se realizo coloración de Gram (Lizarazo et al. 1996, Zagorc et al. 2001, Carrascal et al. 2002).

Para la lectura se escogieron placas con 15 a 150 colonias y el número final de levaduras se calculó de acuerdo a la dilución escogida (UFC/ ml)

5.7 Fermentación alcohólica

Una vez establecido el tiempo de tratamiento en el cual se redujeron las poblaciones de levaduras y bacterias ácido lácticas a más de un 95 por ciento, se realizó la fermentación alcohólica. Para realizar la fermentación se procedió a descongelar 1500g de estrujado de uvas (15°C por 15 horas), de los cuales 750g fueron sometidos a tratamiento hiperbárico con CO2 a 35bar, 15°C y 360 minutos, esta muestra llevó el nombre de muestra con tratamiento hiperbárico de CO2.

Los 750g restantes, no tuvieron ningún tratamiento con dióxido de carbono, esta muestra llevó el nombre de “muestra control”.

(55)

5.8 Análisis microbiológico de los vinos

5.8.1 Aislamiento de bacterias ácido lácticas

Para determinar la presencia o ausencia de bacterias ácido lácticas, se realizaron siembras en superficie del producto final (vino con tratamiento hiperbárico de CO2 y vino control) en medio MRS (Anexo 3.1), selectivo para bacterias ácido lácticas, se incubaron a 30°C por 72h en microaerofília. La aparición de colonias blancas, Gram positivas y catalasa negativas se considero indicativo de presencia de bacterias acido lácticas (Álvarez et al.1998; Carrascal et al. 2002, Sanabria et al.

2005).

5.8.2 Aislamiento de levaduras salvajes

Para verificar la presencia o ausencia de levaduras salvajes, se realizo una siembra en superficie de las muestras de vino en agar WL (Anexo 3.3), luego se llevaron a incubar a 25°C por tres días, adicionalmente se realizo coloración de Gram (Carrascal et al. 2002, Sanabria et al. 2005).

5.8.3 Aislamiento de Brettanomyces sp

Para determinar la presencia de Brettanomyces sp se realizaron siembras en superficie de los vinos obtenidos, en agar DBDM (anexo 3.4).

El medio sembrado se llevó a incubar a 25°C por 14 días (Mitrakul et al.

1999, Gerbeaux et al.2000, Rodríguez et al. 2001, Días et al. 2003, Silva

et al. 2004).

(56)

de Brettanomyces sp. (Gerbeaux et al. 2000, Rodríguez et al. 2001, Días

et al. 2003).

Figura 9: Equipo de filtración

Figura 10: Medio DBDM

5.9 Parámetros físico-químicos

(57)

5.9.1 Determinación del contenido alcohólico por el método de Roessner

Para la determinación del grado alcohólico de los vinos se utilizó un areómetro, con escala entre 980 y 1020 g/l, y un refractómetro calibrado, con escala en °Brix (Quijano 2005).

Seguido a esto se aplicó la formula de Roessner:

CETL = [(CRFT°Brix.4,17) + (1000-d)]X 0,365

5.9.2 Determinación refractométrica del extracto del vino

Se utilizó una muestra de 25 ml de vino, y se redujo el volumen en un dispositivo evaporador en corriente de aire caliente a 90°C, hasta aproximadamente 15 ml. Se completó con agua destilada a 25 ml, se mezcló bien, seguido a esto se leyó en el refractómetro el valor en °Brix de la solución. Se expresó el resultado en g/100g (Quijano 2005).

5.9.3 Determinación potenciométrica del pH

Para realizar esta medida se utilizó pH-metro metrohm , pH 0,0-14,0 ±0,1 (Quijano 2005).

5.9.4 Color comparativo

(58)

5.10 Evaluación sensorial

El análisis sensorial se llevó a cabo por 4 jueces entrenados de acuerdo con la metodología establecida en el viñedo & Cava Loma de Puntalarga por un tiempo aproximado de 1-20 años, incluyendo a la autora del presente trabajo. Se evaluaron las características sensoriales de tres muestras correspondientes a vino Pinot noir del Viñedo de Puntalarga, vino con tratamiento hiperbárico con CO2 y vino control. Las pruebas de análisis sensorial se realizaron en un salón ventilado e iluminado, se sirvió aproximadamente 30ml de las muestras a temperatura ambiente en copas de degustación transparentes e incoloras, codificadas con un digito (1, 2,3) (Anexo 8 y 9) (Porras et al 2003, Quijano 2005, Sanabria et al. 2005).

5.11 Análisis estadístico

(59)

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 Efectos del tratamiento hiperbárico de CO2 sobre células de levaduras y bacterias ácido lácticas.

En este trabajo de investigación se evaluó el efecto de la presión de CO2 sobre bacterias ácido lácticas y levaduras como metodología alternativa de tratamiento para mejorar la calidad de vinos de la variedad Pinot noir. Los resultados obtenidos se muestran en las tablas 7 y 8.

Tabla 7: Promedio de los resultados del recuento de levaduras en los tres montajes. TIEMPO EN

MINUTOS

UFC/ml Log 10

UFC/ml

LN UFC/ml

Porcentaje(%) de inhibición

0 42x104 5,619789 12,940042 0

30 25x104 5,392110 12,4157932 40.48

60 88x103 4.942834 11,381297 79.05

90 75x103 4,873126 11,220789 82.14

120 62x103 4,790050 11,0294988 85.24

150 53x103 4,721536 10,871738 87.38

180 39x103 4,587337 10,5627332 90.71

210 37x103 4,552262 10,4819718 91.19

240 30x103 4,472268 10,2977794 92.86

300 20x103 4,308208 9,92001685 95.24

360 9x103 3,3970037 9,1413475 97.86

Tabla 8: Promedio de los resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en los tres

montajes. TIEMPO EN

MINUTOS

UFC/ml Log 10

UFC/ml

LN UFC/ml

Porcentaje de inhibición

0 28x104 5,44715803 12,5425449 0

30 15x104 5,18563658 11,9403695 46.43

60 91x103 4,95744765 11,4149451 67.5

90 85x103 4,92771246 11,3464773 69.64

(60)

150 69x103 4,83674597 11,1370192 75.36

180 52x103 4,71321044 10,8525681 81.43

210 37x103 4,56427143 10,5096234 86.79

240 23x103 4,4366926 10,2158622 91.79

300 17x103 4,23044892 9,74096862 93.93

360 12x103 4,09108047 9,4200609 95.71

Estos resultados mostraron que con un tiempo de residencia de 360 minutos bajo presión de 35 bar, 15°C, 28°Brix y pH 3.3, en estrujados de uvas, se obtuvó una reducción de la población de levaduras del 97.9 por ciento correspondiente a una población final de 9X103 UFC/mL y de 95.7 por ciento de bacterias ácido lácticas con una biomasa final de 12X103 UFC/mL, datos obtenidos del promedio de los tres montajes realizados. Las figuras 11 y 12 muestran que la disminución de la viabilidad celular depende no solo de la presión sino también del tiempo de exposición, se ha reportado que el tiempo requerido para la inactivación completa, depende de factores tales como: tipo de microorganismo (bacteria, hongo), estado en que se encuentra (vegetativa, espora), fase de crecimiento, composición del medio y condiciones del tratamiento (Louka

et al. 1999, Karama et al. 2001 y Spilimbergo et al. 2003).

3 3,5 4 4,5 5 5,5 6

0 100 200 300 400

Tiempo ( min )

L

o

g

UF

C/

m

L

Log UFC/mL

Figura 11: Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, promedio de los tres

(61)

Figura 12: Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias ácido lácticas, promedio

de los tres montajes

Con el fin de comprobar la acción del dióxido de carbono bajo presión sobre las poblaciones de microorganismos evaluadas, se calcularon los valores D y K. El valor K definido como la velocidad de muerte constante o tasa de inactivación, fue calculado del reciproco de la pendiente de la curva de sobrevivencia siguiendo un análisis cinético tradicional, los resultados de este presentaron un valor de 0.0133 min –1 para levaduras y para bacterias ácido lácticas de 0.0097 min –1. Los valores K obtenidos en el tratamiento bajo presiones hiperbáricas de CO2 indican que este tratamiento afecta significativamente la respuesta microbiana, como fue reportado previamente por Shimoda et al. 2001 (Erkmen et al. 2000 y Karaman et al. 2001 ).

El tiempo de reducción decimal, valor D para levaduras y bacterias ácido lácticas hallados a partir del promedio de los montajes, señaló que se necesitan 173 y 238 minutos respectivamente, para reducir una población a su décima parte a una presión de CO2 de 35 bar, 15°C, 28°Brix y pH 3.3, en estrujado de uvas de la variedad Pinot noir, es decir disminuir una unidad logarítmica, lo cual comprueba que las levaduras son menos

3 3,5 4 4,5 5 5,5 6

0 100 200 300 400

Tiempo ( min )

L

og

UFC

/mL

(62)

resistentes a la presión de CO2 que las bacterias ácido lácticas quienes necesitan mayor tiempo de exposición (Anexo 5.7 y 5.8).

Los resultados señalaron que la cinética de inactivación por presión para los dos tipos de microorganismos evaluados sigue un modelo cinético de primer orden debido a la baja dispersión de los datos (Ver anexo 10) demostrado en sus altos coeficientes de correlación (r2>0.9); resultados similares fueron obtenidos por Shimoda et al. 2001, Erkmene et al. (2000) y Karaman et al. (2001).

A pesar que los efectos inactivantes del CO2 sobre los microorganismos son utilizados en la industria alimenticia, el mecanismo de inactivación no ha sido claramente definido. A continuación se presentan algunos posibles mecanismos basados en la información obtenida en la literatura consultada.

Karaman et al. (2001) atribuyeron el poder inactivante de este proceso a la alteración de las proteínas responsables para la replicación, integridad y metabolismo. La alta presión al parecer no rompe enlaces covalentes, pero si altera uniones tipo puentes de hidrógeno y uniones iónicas responsables para mantener a las proteínas en su forma biológicamente activas.

(63)

es difícil esperar que este sea el único mecanismo responsable del efecto letal en las células.

Hass et al. 1989 y Nakamura et al. 1994, observaron que después del tratamiento con gas bajo presión, hay presencia de hoyos y arrugas en las células, esto sugiere que las células o al menos algunas de ellas, son rotas mecánicamente o desgarradas por el tratamiento con gas comprimido.

(64)

Montaña y Ortegón (1997), utilizando la misma técnica que la aquí descrita, pero nitrógeno en cambio de dióxido de carbono, no observaron reducciones significativas en poblaciones naturales de levaduras de mostos de uvas. Los autores aplicaron presiones de 40 y 100 bar hasta por 120 minutos, a una temperatura promedio de 17°C. Estos resultados pueden atribuirse a la inercia química del nitrógeno, frente a la actividad química del dióxido de carbono, en las condiciones experimentales. Dillow

et al. (1999) ya anotaron que la toxicidad del CO2 para microorganismos, en un medio acuoso, esta relacionada esencialmente con la formación de acido carbónico en solución acuosa, que resume la reacción:

H2O + CO2 ↔ H2CO3↔ H+ + HCO3- ↔ 2H+ + CO32-

El equilibrio de esta reacción, es desplazado por incremento de la presión, en la dirección de la formación de ácido carbónico, de acuerdo con el principio de Le Chatelier.

La concentración de H2CO3 en un sistema acuoso es directamente proporcional a la solubilidad del CO2 en el sistema. A su turno, esta dimensión es directamente proporcional a la presión ejercida por el gas sobre el sistema. Además aumenta con el contenido del sistema en etanol, pero disminuye con la temperatura y con la concentración de otras sustancias en solución (glucosa, fructosa, glicerol, taninos) Cavazzani (1985).

(65)

de dicho autor, se observan los efectos baroprotector de la fructosa y glucosa y baropromotor de NaCl, en la inhibición de poblaciones de

(66)

Figura 13: Efectos del tiempo de proceso (a 400Mpa y 25°C) en la sobrevivencia de suspensión celular de R. rubra en medio de Aw=0.94.

Fuente: Knoor, R.1995. Food process design and evaluation

Tabla 9: Comparación del efecto del CO2 bajo presión. Bacterias ácido lácticas y

levaduras.

Tiempo % de células vivas de bacterias acido

lácticas en estrujados de uvas

a 35bar(este trabajo)

% de células vivas de levaduras en estrujados de uvas a 35bar(este

trabajo

%de células vivas de bacterias ácido lácticas en vino a

30bar(Álvarez et al.,1998)

0 100 100 100

30 53.57 59.5 0

60 32.5 20.9 0

90 30.3 17.8 0

120 27.5 14.8 0

150 24.64 12.61 -

180 18.57 9.29 0

210 13.21 8.81 -

240 8.21 7.14 -

300 6.07 4.76 -

(67)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0 100 200 300 400

Tiempo ( min )

P o rcen ta je d e cel u las vi vas

Bacterias acido lacticas en estrujados de uvas a 35bar Levaduras en estrujados de uvas a 35bar

Bacterias acido lacticas en vino 30bar

Figura 14:Comparación del efecto del CO2 bajo presión. Bacterias acido lácticas y levaduras.

Figure

Tabla 1: Estimación aproximada de los porcentajes normales, en peso, de los

Tabla 1:

Estimación aproximada de los porcentajes normales, en peso, de los p.26
Figura 1: Fermentaciones heterolacticas y homolacticas   Fuente: Boulton et al. 2002. Teoría y práctica de la elaboración del vino

Figura 1:

Fermentaciones heterolacticas y homolacticas Fuente: Boulton et al. 2002. Teoría y práctica de la elaboración del vino p.28
Tabla 3: Características de las levaduras causantes de la flor del vino

Tabla 3:

Características de las levaduras causantes de la flor del vino p.34
Tabla 4: Defectos en el vino causados por Brettanomyces sp.

Tabla 4:

Defectos en el vino causados por Brettanomyces sp. p.35
figura 2) (Chatonnet et al.  1992).

figura 2)

(Chatonnet et al. 1992). p.36
Figura 2: Formación de 4 etil fenol y 4 etil guaiacol en el vino

Figura 2:

Formación de 4 etil fenol y 4 etil guaiacol en el vino p.37
Figura 3: Riesgo de contaminación por bacterias ácido lácticas y levaduras (Brettanomyces) durante las etapas de la elaboración de vino tinto, 2 y 3 riego externo, 4 riesgo interno  Fuente: Quijano-Rico  2005

Figura 3:

Riesgo de contaminación por bacterias ácido lácticas y levaduras (Brettanomyces) durante las etapas de la elaboración de vino tinto, 2 y 3 riego externo, 4 riesgo interno Fuente: Quijano-Rico 2005 p.39
Tabla 5: Métodos para el control de bacterias ácido lácticas y Brettanomyces sp.

Tabla 5:

Métodos para el control de bacterias ácido lácticas y Brettanomyces sp. p.40
Figura 4: Vista aérea del Viñedo Loma de Puntalarga, Nobsa, Boyacá

Figura 4:

Vista aérea del Viñedo Loma de Puntalarga, Nobsa, Boyacá p.48
Figura 5: Esquema del biorreactor para presiones hiperbáricas de CO2  Fuente: Montaña 1997, Quijano-Rico 2005

Figura 5:

Esquema del biorreactor para presiones hiperbáricas de CO2 Fuente: Montaña 1997, Quijano-Rico 2005 p.50
Tabla 6: Partes del biorreactor y su función

Tabla 6:

Partes del biorreactor y su función p.51
Figura 6: Procedimiento a seguir para el tratamiento en atmósfera hiperbárica de CO2 de

Figura 6:

Procedimiento a seguir para el tratamiento en atmósfera hiperbárica de CO2 de p.52
Figura 8: Toma de muestra en el ciclón de muestreo

Figura 8:

Toma de muestra en el ciclón de muestreo p.53
Figura 7: Salida de muestra al ciclón de muestreo

Figura 7:

Salida de muestra al ciclón de muestreo p.53
Figura 10: Medio DBDM

Figura 10:

Medio DBDM p.56
Figura 9: Equipo de filtración

Figura 9:

Equipo de filtración p.56
Tabla 7: Promedio de los resultados del recuento de levaduras en los tres montajes.

Tabla 7:

Promedio de los resultados del recuento de levaduras en los tres montajes. p.59
Tabla 8: Promedio de los resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en los tres montajes

Tabla 8:

Promedio de los resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en los tres montajes p.59
Figura 11: Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, promedio de los tres montajes

Figura 11:

Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, promedio de los tres montajes p.60
Figura 12: Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias ácido lácticas, promedio de los tres montajes

Figura 12:

Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias ácido lácticas, promedio de los tres montajes p.61
Tabla 9: Comparación del efecto del CO2 bajo presión. Bacterias ácido lácticas y

Tabla 9:

Comparación del efecto del CO2 bajo presión. Bacterias ácido lácticas y p.66
Figura 14: Comparación del efecto del CO2 bajo presión. Bacterias acido lácticas y levaduras

Figura 14:

Comparación del efecto del CO2 bajo presión. Bacterias acido lácticas y levaduras p.67
Tabla 10: Resultado del análisis físico Químico de los vinos

Tabla 10:

Resultado del análisis físico Químico de los vinos p.68
Figura 15: Panel de catadores

Figura 15:

Panel de catadores p.71
Figura 16: Claridez de los vinos Pinot noir evaluados

Figura 16:

Claridez de los vinos Pinot noir evaluados p.72
Figura 17: Color de los vinos Pinot noir evaluados

Figura 17:

Color de los vinos Pinot noir evaluados p.72
Figura 18: Olor de los vinos Pinot noir evaluados

Figura 18:

Olor de los vinos Pinot noir evaluados p.73
Figura 19: Sabor de los vinos Pinot noir evaluados

Figura 19:

Sabor de los vinos Pinot noir evaluados p.74
Figura 20: Impresión global  de los vinos Pinot noir evaluados

Figura 20:

Impresión global de los vinos Pinot noir evaluados p.75
TABLA NORMALIZADA DE LA OIV ( ORGANIZACIÓN  INTERNACIONAL DEL VINO) PARA LA EVALUACIÓN DE CARACTERISTICAS SENSORIALES

TABLA NORMALIZADA

DE LA OIV ( ORGANIZACIÓN INTERNACIONAL DEL VINO) PARA LA EVALUACIÓN DE CARACTERISTICAS SENSORIALES p.107

Referencias

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