Determinación del efecto antioxidante del extracto etanólico de la hojas de stevia rebaudiana bertoni frente al 2,2 difenil 1 picrilhidrazil

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. AC IA. Y. BI. O. Q U. IM. IC A. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. Determinación del efecto antioxidante del extracto etanólico de la hojas de Stevia rebaudiana. R M. Bertoni frente al 2,2-difenil-1-picrilhidrazil.. FA. TESIS II. O TE. C. A. D E. PARA OPTAR EL GRADO ACADEMICO DE. BI B. LI. BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUIMICA AUTORES:. •. Avila Parrera Anderson Gianfranco.. •. Julca Majo Alan Víctor Raúl.. •. Mg. Q.F. Marilú Roxana Soto Vásquez.. ASESORA:. Trujillo – Perú 2016. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. A nuestros padres por apoyarnos en estos años encaminándonos siempre a ser buenas personas y también a hacer frente a los problemas que se nos. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. Y. BI. O. Q U. IM. IC A. presenten en la carrera y en la vida.. A nuestra asesora que en este andar por la vida, influyó con sus lecciones y experiencias en formarnos como unas persona de bien y preparadas para los retos que pone la vida, a ella le dedicamos cada una de estas páginas de nuestra tesis. Los autores. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTOS. Expresamos nuestros sinceros agradecimientos a todas las personas que nos ayudaron en el. IC A. desarrollo de nuestra tesis y en especial a:. IM. Nuestros padres por darnos todo su apoyo incondicional.. Q U. A nuestra asesora Mg. Q.F. Marilú Roxana Soto Vásquez por brindarnos la oportunidad de. BI. O. realizar este trabajo de investigación y guiarnos en el desarrollo del mismo.. Y. A todas aquellas personas que de una u otra manera contribuyeron en la realización del. Los autores. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. presente trabajo.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. JURADO DICTAMINADOR. PRESIDENTE. O. Q U. IM. IC A. Q..F. José Gilberto Gavidia Valencia. MIEMBRO. FA. MIEMBRO. BI B. LI. O TE. C. A. D E. Q.F. Marilú Roxana Soto Vásquez. R M. AC IA. Y. BI. Q.F. Iván Miguel Quispe Díaz. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:. De conformidad con las disposiciones legales y vigentes de reglamentos de Grados y Títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo –. IC A. La Libertad, sometemos a vuestro elevado criterio el presente trabajo de investigación. IM. titulado:. O. Q U. Determinación del efecto antioxidante del extracto etanólico de la hojas de Stevia. AC IA. Y. BI. rebaudiana Bertoni frente al 2,2-difenil-1-picrilhidrazil. Sea propicia esta oportunidad para manifestar el más profundo agradecimiento a. R M. nuestra Alma Mater y a toda su plana docente, por su meritoria labor de educadores y por la. FA. formación profesional que nos han brindado a través de sus enseñanzas.. D E. De manera muy especial agradecemos la valiosa colaboración de los señores. C. A. miembros del jurado.. O TE. Dejamos de vuestra consideración Señores Miembros del Jurado, la respectiva. BI B. LI. calificación del presente informe.. Trujillo,………….………….del. 2016. Autor. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE. i. AGRADECIMIENTO………………………………………………………………….... ii. JURADO DICTAMINADOR………………………………………………………….... iii. IC A. DEDICATORIA…………………………………………………………………………. iv. Q U. IM. PRESENTACIÓN……………………………………………………………………….. vi. Y. BI. O. RESUMEN………………………………………………………………………………. vii. AC IA. ABSTRACT……………………………………………………………………………... 1. FA. R M. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………….. 5. D E. MATERIAL Y MÉTODO………………………………………………………………. O TE. C. A. RESULTADOS………………………………………………………………………….. 15. BI B. LI. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………….. 13. CONCLUSIONES………………………………………………………………………. 17. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………………... 18. ANEXOS………………………………………………………………………………... 22. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN En la actualidad cientos de plantas son utilizadas en la medicina, pero la ciencia moderna quiere conocer los principios activos responsables para procurar su síntesis o proponer modificaciones estructurales en busca de una mayor actividad. Para evaluar el efecto antifúngico, se utilizó 1 kg de hojas de Stevia rebaudiana Bertoni. IC A. recolectadas en el Campamento San José - Proyecto Especial CHAVIMOCHIC. El extracto. Q U. IM. etanólico de las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni se prepararon mediante el método. O. Soxhlet, luego se realizó la identificación de metabolitos secundarios mediante el método. Y. BI. de Martínez M. y Cuellar A; después se desarrolló el efecto antioxidante in vitro mediante. AC IA. el método desarrollado por Brand – Williams et al.frente al 2,2-difenil-1-picrilhidrazil.. R M. Los metabolitos secundarios que se encontraron el extracto etanólico de las hojas de Stevia. D E. FA. rebaudiana Bertoni fueron los compuestos fenólicos, catequinas, taninos y flavonoides.. A. El extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni a las concentraciones de 6.3, 12.6,. O TE. C. 18.9, 25.2 y 31.5 mg/mL presentaron efecto antioxidante in vitro frente al 2,2-difenil-1-. BI B. LI. picrilhidrazil. El coeficiente de inhibición al 50% fue de 17.2 mg/mL. De esto se deduce que el extracto etanólico de hojas de Stevia rebaudiana Bertoni tiene efecto antioxidante. Palabras claves: Stevia rebaudiana Bertoni, antioxidante, Coeficiente de inhibición al 50%, metabolitos secundarios.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT Today hundreds of plants are used in medicine, but modern science wants to know the active ingredients responsible to ensure their synthesis or propose structural changes in search of greater activity. To evaluate the antifungal effect was used 1 kg of leaves of Stevia rebaudiana Bertoni. IC A. collected at Camp San José - Special Project CHAVIMOCHIC. The ethanol extract from. IM. the leaves of Stevia rebaudiana Bertoni were prepared by the Soxhlet method , then the. Q U. identification of secondary metabolites was performed by the method of M. Martinez. BI. O. Cuellar A; then the antioxidant effect in vitro was developed by the method developed by. AC IA. Y. Brand - Williams et al.frente the 2,2- diphenyl -1 - picrylhydrazyl . The ethanolic extract of the leaves Stevia rebaudiana Bertoni secondary metabolites were. R M. found phenolics, catechins , tannins and flavonoids .. D E. FA. The ethanol extract of Stevia rebaudiana Bertoni at concentrations of 6.3, 12.6, 18.9, 25.2. A. and 31.5 mg / mL showed antioxidant effect in vitro against 2, 2- diphenyl -1 -. O TE. C. picrylhydrazyl . The coefficient of 50% inhibition was 17.2 mg / mL.. BI B. effect. LI. It follows that the ethanol extract of leaves of Stevia rebaudiana Bertoni has antioxidant. Keywords: Stevia rebaudiana Bertoni, antioxidant, coefficient 50% inhibition, secondary metabolites.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TESIS I.. INTRODUCCIÓN:. El estilo de vida actual promueve inadecuados hábitos alimenticios, consumiendo alimentos con baja calidad nutricional y capacidad antioxidante, donde se incluye a la comida rápida, alimentos chatarra, enlatados, bebidas con alto contenido de azúcar. Esto ha causado. IC A. problemas en la salud como la desnutrición y la obesidad, así como el aumento de. Q U. IM. enfermedades crónico degenerativas, como una consecuencia del estrés oxidativo1.. BI. O. El estrés oxidativo es una situación en la que existe tanto el aumento en la velocidad de. Y. generación de especies oxidantes, radicales libres (RL) y especies excitadas como una. FA. R M. estado de especies reactivas de oxígeno2,3.. AC IA. disminución de los sistemas de defensa, lo que resulta en mayores concentraciones, en. D E. Un radical libre se define como especies químicas atómicas o moleculares que contiene uno. A. o más electrones no apareados en su orbital externo, ha despertado un gran interés en su. O TE. C. relación con el envejecimiento celular por su relación con enfermedades como la. BI B. LI. arterioesclerosis, cáncer, diabetes, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer4,5. Cuando un exceso de radicales libres se forma, puede causar la destrucción de enzimas tales como superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GPx), y catalasa, generando efectos letales en las células por la oxidación de lípidos, proteínas, DNA y enzimas; ocasionando reacciones en cadena que perpetúa la creación de más radicales libres aumentando el daño de tejidos6.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los radicales libres bombardean diariamente nuestras células, estos son fabricados por nuestro propio cuerpo, pero no para destrucción de nuestro cuerpo, sino para protegerlos de bacterias y virus, así mismo estos son neutralizados fácilmente por nuestro propio sistema. Con este fin el cuerpo produce enzimas (como la catalasa o dismutasa) que son las encargadas de neutralizarlos. Estas enzimas tiene la capacidad de desarmar los radicales libres sin desestabilizar su propio estado es por eso que necesitan años para que un radical. sistema o un mecanismo que. Q U. En consecuencia de estos problemas ha de existir un. IM. IC A. libre pueda causar daños mayores7, 8.. BI. O. contrarrestre los radicales libres formados y sus acciones de oxidación sobre células., este. AC IA. Y. sistema viene a ser el de los antioxidantes. Hay una serie de mecanismo de defensa antioxidante enzimática y no enzimática. Halliwell en 1995 definió al antioxidante como. R M. cualquier sustancia que, en bajas concentraciones comparadas con el sustrato oxidable,. D E. FA. disminuye significativamente o inhibe la oxidación de este sustrato9.. C. A. Los campos de aplicación de los antioxidantes son muy variados; además de terapias. O TE. farmacológicas también tiene interés como suplementos nutricionales, ingredientes. BI B. LI. cosméticos para evitar el envejecimiento cutáneo, alimentos funcionales y como conservantes alimentarios. La industria agroalimentaria se enfrenta continuamente a problemas de estabilidad de alimentos derivados de la oxidación de los mismos; el uso de antioxidantes sintéticos, está muy generalizado pero existe controversia debido a que algunos presentan problemas de toxicidad, por ello los antioxidantes naturales podrían constituir una alternativa10.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los compuestos antioxidantes tienen la capacidad de inhibir o interrumpir las reacciones de transformación que causan daños a las biomoléculas. En los últimos años los antioxidantes naturales provenientes de plantas como por ejemplo, ácido ascórbico (vitamina C), αTocoferol (vitamina E), glutatión, carotenoides, y flavonoides, han sido frecuentemente usados en diferentes campos de la industria farmacéutica, alimentos y en medicina11.. IC A. Muchos de estos, presentan una actividad comparable con antioxidantes sintéticos de mayor. IM. uso comercial como el 2-terbutil-hidroxitolueno (BHT) y el 2-terbutil-hidroxianisol (BHA);. Q U. los cuales sin embargo, pese a sus propiedades antioxidantes presentan la desventaja de. BI. O. tener efectos toxicológicos. Un gran número de contribuciones sobre el reporte de extractos. R M. significativamente en los últimos años12.. AC IA. Y. y/o sustancias validadas por sus propiedades antioxidantes se ha incrementado. FA. Los compuestos fenólicos son un grupo muy común de metabolitos secundarios presentes. D E. en las plantas, estos incluyen a los fenoles simples, polifenoles, flavonoides, taninos, entre. C. A. otros. Una gran cantidad frutas y vegetales frescos, así como los granos de cereales,. O TE. contienen cantidades importantes de fenoles naturales. Los flavonoides son el mayor grupo. BI B. LI. de fenoles vegetales y los más estudiados. Se han identificado dos rutas biosintéticas para los compuestos fenólicos, una es la del ácido shikímico y otra es la poliquetídica. Algunos compuestos fenólicos se sintetizan mediante las dos rutas, lo cual se conoce como biogénesis mixta13. La acción de los flavonoides como antioxidante depende mucho de su capacidad de reducir los radicales libres y quelar metales, impidiendo las reacciones catalizadoras de los. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. radicales libres, de allí que sus actividades terapéuticas han sido reportadas en diversas investigaciones14, 15. La capacidad de los polifenoles para modular la actividad de diferentes enzimas, y para interferir consecuentemente en mecanismos de señalización y en distintos procesos celulares, puede deberse, al menos en parte, a las características fisicoquímicas de estos. IC A. compuestos, que les permiten participar en distintas reacciones metabólicas celulares de. IM. óxido-reducción. Sus propiedades antioxidantes justifican muchos de sus efectos. hepatoprotectoras,. O. antimutagénicas,. anticarcinogénicas,. antitumorales,. BI. antifúngicas,. antiinflamatorias,. Y. antivirales,. antihipercolesterolémicas. e. AC IA. antibacterianas,. Q U. beneficiosos. Las propiedades más representativas de estos compuestos son antioxidantes,. R M. inmunoestimulantes16.. FA. En un estudio de Shukla y colaboradores realizaron un estudio sobre la actividad. D E. antioxidante del extracto de hojas de Stevia rebaudiana en comparación con el ácido. O TE. reacciones en cadena17.. C. A. ascórbico observándose que tiene el poder de eliminar radicales libres e inhibir sus. BI B. LI. Tiempo atrás Kim y colaboradores habían comprobado que las hojas de Stevia rebaudiana contienen altos niveles de ácido fólico (52,18 mg/100 g) y compuestos de pirogalol (951,27 mg/100 g) en base seca, concluyendo que la Stevia rebaudiana es una fuente de antioxidantes naturales benéficos a la salud18. Teniendo en cuenta la gran incidencia de enfermedades crónicas degenerativas que se extiende en la población peruana como en el mundo se cree conveniente utilizar productos. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. naturales que su adquisición sea de bajo costo y con una alta concentración de antioxidantes para poder contrarrestar a los radicales libres presentes en las enfermedades degenerativas. 1.1. PROBLEMA. ¿Presenta el extracto etanólico de las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni efecto antioxidante frente al 2,2.difenil-1-picrilhidrazil?. •. Variable independiente: efecto antioxidante.. IM. Variable dependiente: concentración de los extractos.. Y. BI. O. Q U. •. IC A. 1.2. IDENTIFICACIÓN DE VARIABLES.. AC IA. 1.3. HIPÓTESIS.. R M. El extracto etanólico de las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni presenta efecto antioxidante. D E. FA. frente al 2,2-difenil-1-picrilhidrazil.. A. 1.4. OBJETIVO.. Determinar el efecto antioxidante del extracto etanólico de las hojas de Stevia. LI. •. O TE. C. 1.4.1. Objetivo general.. BI B. rebaudiana Bertoni frente al 2,2-difenil-1-picrilhidrazil.. 1.4.2. Objetivos específicos. •. Realizar la marcha fitoquímica preliminar del extracto etanólico de las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni.. •. Determinar el porcentaje de inhibición del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil a las concentraciones de 6.3, 12.6, 18.9, 25.2 y 31.5 mg/mL del extracto etanólico.. •. Determinar la concentración del extracto etanólico que neutraliza al 50 por ciento los radicales del 2,2-difenil-1-picrilhidrazil.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II.. MATERIAL Y MÉTODO. 2.1.Materiales y equipos 2.1.1. Material biológico: •. Material botánico: Se utilizó 1 kg de hojas de Stevia rebaudiana Bertoni (Stevia), recolectadas del Campamento San José – Proyecto. IC A. Especial CHAVIMOCHIC.. Q U. Materiales de vidrio de uso común en laboratorio.. BI. O. •. IM. 2.1.2. Material de vidrio:. AC IA. Y. 2.1.3. Equipos e instrumentos: Balanza analítica OHAUS.. •. Balanza triple brazo OHAUS.. •. Baño maría MEMMERT. •. Cocina eléctrica.. •. Refrigeradora ELECTROLUX.. O TE. C. A. D E. FA. R M. •. BI B. LI. 2.1.4. Reactivos y solventes •. Agua destilada. •. Ácido clorhídrico q. p.. •. Alcohol 96º.. •. Alcohol amílico q. p.. •. Magnesio metálico.. •. Tricloruro férrico 5 %.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.Método 2.2.1. Recolección de la muestra: La especie de Stevia rebaudiana Bertoni se recolectó del Campamento San José – Proyecto Especial CHAVIMOCHIC. La recolección de la especie se realizó por el método convencional o clásico de herborización, seleccionando el material en el campo.. IC A. 2.2.2. Identificación y determinación taxonómica de la especie:. Q U. IM. Un ejemplar completo de la planta fue identificada y depositada en el Herbarium. BI. O. Truxillense (HUT) de la Universidad Nacional de Trujillo, con el código N° 58297.. •. AC IA. Y. 2.2.3. Preparación de la muestra:. Selección de la muestra: El material vegetal recolectado fue. R M. transportado al laboratorio de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia. D E. FA. y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, en donde se. C. Lavado de la droga: Luego de la separación de las sustancias extrañas,. O TE. •. A. eliminó las sustancias extrañas presentes en el material vegetal.. LI. se procedió a lavar el material vegetal con agua destilada, seguido de una. BI B. desinfección utilizando hipoclorito de sodio a una concentración de 200 ppm durante 5 minutos. Posteriormente se realizó un enjuague con suficiente agua destilada estéril, esto es para retirar los residuos de hipoclorito.. •. Secado: Una vez lavado las hojas, se procedió a adecuar la droga en bolsas de papel Kraft con orificios y se colocó en la estufa a una. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. temperatura de 40 °C y se realizó la determinación de peso cada 24 horas hasta valores constantes. •. Pulverización: Una vez secada las hojas estas fueron pulverizarán con ayuda de un mortero.. •. Tamizaje: El material obtenido de la pulverización, se pasó a través de los tamices Nº 2, 1.2, 0.7, 0.3. Almacenamiento: El polvo de las hojas se guardó en frascos de vidrio. IC A. •. Q U. IM. de color ámbar de boca ancha19.. BI. O. 2.2.4. Extracción por Soxhlet. AC IA. Y. Se pesó 20 g de las hojas de Stevia Rebaudiana Bertoni previamente pulverizadas y tamizadas, luego se sometió a humectación con 20 mL de etanol. FA. R M. 96 º, se dejó en reposo por 1 hora. Una vez humectada la muestra se vertió en un. D E. cartucho de papel de filtro, se colocó en el extractor del equipo de soxhlet y se. A. extrajo con 150 mL de etanol 96 º. Se sometió a extracción continua durante 3. O TE. C. horas. El extracto obtenido se filtró con papel filtro Whatman N° 4. Se obtuvo. LI. un extracto etanólico de color verde20.. BI B. 2.2.5. Estudio fitoquímico: Luego de la preparación del extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni se realizó la marcha fitoquímica a través de las reacciones químicas de identificación mediante cambios de color o formación de precipitados, destinadas a determinar la presencia de metabolitos secundarios: flavonoides (ensayo de Shinoda), compuestos fenólicos (ensayo de Cloruro férrico), catequinas (ensayo de catequinas) y taninos (ensayo de gelatina).. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. •. Ensayo de Catequinas: Se tomó I gota de la solución alcohólica, con la ayuda de un capilar y se aplicó sobre papel filtro. Sobre la mancha se aplicó solución de carbonato de sodio, luego se observó a la luz UV.. •. Ensayo del Cloruro Férrico: A una alícuota del extracto alcohólico se le añadió III gotas de una solución de tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica. Si el extracto es alcohólico, el ensayo determinó tanto. IC A. fenoles como taninos y si el extracto es acuoso, el ensayo determinó. Q U. Ensayo de la Gelatina: Se tomó 5 mL de extracto etanólico de las hojas de. BI. O. •. IM. fundamentalmente taninos.. Y. Stevia rebaudiana Bertoni, se añadió 5 mL de solución de gelatina 1 % y 5. R M. Ensayo de Shinoda: La alícuota del extracto se diluyó con 1 mL de ácido. FA. •. AC IA. mL de NaCl 10%.. D E. clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico.. A. Después de la reacción se esperó 5 minutos, se añadió 1 mL de alcohol. O TE. C. amílico, se mezclaron las fases y se dejó reposar hasta que se separen21.. LI. 2.2.6. Determinación de los sólidos totales: Se tomó 5 mL de extracto etanólico de. BI B. las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni y se llevó a una cápsula previamente tarada a 105 ºC, se evaporó sobre baño de agua hasta que el residuo quedo aparentemente seco. Se pesó entonces hacia una estufa y se dejó hasta peso constante (aproximadamente 3 horas). Se retiró la cápsula de la estufa y se colocó en una desecadora hasta que alcance la temperatura ambiente22.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 𝐶𝐶 =. Donde:. (𝑊𝑊𝑐𝑐+𝑚𝑚 − 𝑊𝑊𝑐𝑐 ) 𝑥𝑥 1000 𝑉𝑉𝑚𝑚. : Concentración (mg/mL). W c+m. : Peso del crisol más peso de la muestra (g). Wc. : Peso de la muestra (g). Vm. : Volumen de la muestra (5 mL). IC A. C. IM. 2.2.7. Efecto antioxidante in vitro, por el método desarrollado por Brand –. O. Q U. Williams et al. (2005)24.. Y. BI. Fundamento: El fundamento del método consiste en que el radical libre estable. AC IA. 2,2 - difenil -1- picrylhidrazil (DPPH) en una solución de etanol 96º, tiene un. R M. electrón desapareado y es de color azul-violeta, decolorándose hacia amarillo. D E. FA. pálido por la reacción de la presencia de una sustancia antioxidante.. A. La reducción del DPPH se monitorea por la disminución en la absorbancia a. O TE. C. una longitud de onda característica. En su forma de radical libre, el DPPH. LI. absorbe a 515 nm y cuando sufre reducción por un antioxidante, esta absorción. BI B. va disminuyendo o desaparece; en consecuencia, la disminución o desaparición del DPPH proporciona un índice para estimar la capacidad antioxidante del compuesto de prueba 23.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 1. Reacción química ente el radical DPPH y la especie antioxidante.. IM. IC A. Antioxidante. DPPH (Forma oxidada). O. Q U. DPPH (Forma reducida). Y. BI. Fuente: Molyneux J. Sci. Technol. 2004 25.. AC IA. 2.2.6.1. Preparación de la solución control. R M. Se pesó 2,2 mg del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) y se disolvió. FA. en etanol 96°. Luego se aforó con etanol a 100 mL, obteniéndose una. D E. concentración de 60 mM. Seguidamente se protegió de la luz y se llevó a. O TE. C. A. leer al espectrofotómetro THERMO modelo GENESSIS 10 UV a una longitud de onda de 515 nm. Se realizó la lectura por triplicado23, 24.. BI B. LI. 2.2.6.2. Preparación de la solución problema A partir de los sólidos totales del extracto etanólico de las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni, se preparó una solución madre de 100 mg/mL disuelto en etanol 96º. De esta solución madre se preparó diluciones de 6.3, 12.6, 18.9, 25.2 y 31.5 mg/mL, disueltas en etanol 96 º. Luego se colocó en tubos de ensayo 5 mL de solución de DPPH 60 µM y se agregó a cada uno de ellos 10 µL de cada una de las diluciones preparadas anteriormente.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Se dejó en reposo durante 30 minutos. Luego se realizó tres lecturas por cada muestra en el espectrofotómetro THERMO modelo GENESSIS 10 UV a una longitud de onda de 515 nm. 2.2.6.3. Preparación del blanco Se utilizó el etanol 96° como blanco para calibrar el espectrofotómetro THERMO modelo GENESSIS 10 UV.. IC A. 2.2.6.4. Cálculo del porcentaje de inhibición del radical DPPH. Q U. IM. Posteriormente se utilizó los valores de absorbancia de los tubos problema y. O. la absorbancia del tubo control para calcular el porcentaje de radicales. Y. BI. DPPH que fueron capturados por 10 μL de la muestra. Se calculó el. R M. AC IA. porcentaje de radicales DPPH capturados, con la siguiente fórmula23, 24.. D E. FA. % 𝑖𝑖𝑖𝑖ℎ𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖ó𝑛𝑛 𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟 𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷 =. A. Donde:. 𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 − 𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎 𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑥𝑥 100 𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐. O TE. C. Abs. control = Absorbancia del DPPH. BI B. LI. Abs. muestra = Absorbancia de la muestra luego de 30 minutos. 2.2.8. Cálculo del coeficiente de inhibición al 50% del 2,2 - difenil -1picrylhidrazil (DPPH) El IC 50 , es la cantidad de muestra que captura radicales de DPPH en un 50%. Así un menor valor de IC 50 indica una mayor capacidad antioxidante, porque requiere menos cantidad de muestra para capturar un 50% de radicales DPPH.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El IC 50 se reemplazó en la ecuación que se obtuvo de la curva de concentración vs % inhibición23, 24. 2.2.9. Análisis estadístico Se empleará el programa de Microsoft Excel® 2013 de Microsoft Office® para la. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. Y. BI. O. Q U. IM. IC A. realizar el análisis estadístico correspondiente a media aritmética.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III.. RESULTADOS. Tabla 1. Metabolitos secundarios del extracto etanólico de las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni.. ENSAYOS. RESULTADOS. OBSERVACIONES. +. Coloración verde intenso. +. Coloración naranja en la fase. Compuestos fenólicos Cloruro férrico Flavonoides. Shinoda. IC A. ETABOLITOS. Gelatina. +. Catequinas. Catequinas. +. Precipitado blanco. BI. O. Taninos. Q U. IM. amílica. R M. + –. FA. Leyenda: Resultado positivo Resultado negativo. carmelita a la luz UV.. AC IA. Y. Presencia de mancha verde. Volumen de porción del ensayo (mL). Masa de la cápsula más el residuo (g). Masa de la cápsula vacía (g). % Sólidos totales. 5 5 5 5 5. 57.61 42.08 54.05 66.91 55.16. 57.43 41.92 53.86 66.74 54.99. 3.6 3.2 3.8 3.4 3.5. BI B. LI. N° Repetición. O TE. C. A. D E. Tabla 2. Sólidos totales del extracto etanólico de las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni. 1 2 3 4 Promedio. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 3. Porcentaje de inhibición, de la reacción del extracto etanólico de las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni con el reactivo del DPPH.. Concentración (mg/mL). % Inhibición. 0.5673 0.4303 0.2095 0.1378 0.1041. 6.3 12.6 18.9 25.2 31.5. 20.4 39.6 55.4 70.6 85.4. IM. IC A. Promedio de absorbancia. BI. O. Q U. Gráfico 1. Coeficiente de inhibición al 50% (CI 50 ) del extracto etanólico de las hojas Stevia rebaudiana Bertoni. R M. 70.0%. FA. 60.0%. D E. 50.0%. A. 40.0%. LI. 10.0%. O TE. 20.0%. IC50 = 17.2 mg/mL. C. 30.0%. BI B. % Inhibición del radical DPPH. 80.0%. AC IA. y = 0.0256x + 0.0598 R² = 0.9972. 90.0%. Y. 100.0%. 0.0%. 0. 5. 10. 15. 20. 25. 30. 35. Concentración del extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni (mg/mL). Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV.. DISCUSIÓN. Los antioxidantes son micronutrientes que han adquirido importancia en los últimos años por la capacidad de neutralizar a los radicales libres. Los radicales libres han sido implicados en la etiología de varios de las principales enfermedades humanas como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares, trastornos neuronales, la diabetes y la artritis25.. IC A. En la tabla 1 se puede observar algunos metabolitos secundarios que presenta la droga,. Q U. IM. dentro de los cuales se tiene a los compuestos fenólicos, flavonoides, taninos y catequinas.. O. Se puede contrastar la existencia de los diferentes metabolitos secundarios con el estudio de. Y. BI. Rojas reportando que la hoja de Stevia contienen una mezcla compleja de diterpenos,. AC IA. triterpenos, estigmasterol, taninos, aceites volátiles y ocho glucósidos diterpenicos dulces:. R M. un esteviósido, esteviolviósido, rebaudiósidos A, B, C, D, E y dulcósido A. El glicósido es. FA. una molécula obtenida por condensación entre dos monosacárido, mientras que un terpeno. D E. es un lípido derivado del hidrocarburo isopreno26.. O TE. C. A. En la tabla 2 y 3 se presenta los sólidos totales y el porcentaje de inhibición, de la reacción del extracto etanólico de las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni con el reactivo del DPPH. BI B. LI. respectivamente. El desarrollo de los sólidos totales sirvió para determinar la concentración del extracto etanólico, también para concentrar los metabolitos según su polaridad, siendo 3,5 mg/mL el porcentaje de sólidos totales y el IC 50 de 17.2 mg/mL, donde se comprobó que el extracto etanólico de Stevia rebaudiana Bertoni presenta efecto antioxidante27. El efecto antioxidante de las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni se explicaría por la presencia de compuestos fenólicos, flavonoides, taninos y catequinas.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los compuestos fenólicos y flavonoides han demostrado tener una gran actividad biológica, principalmente como antioxidantes. El estudio de Gutiérrez A, se observó que las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni tienen capacidad de neutralizar el radical hidroxilo, los radicales superóxido y el óxido nítrico. Además, las hojas de stevia tienen flavonoides y otros polifenoles, componentes con elevada actividad antioxidante utilizando el método de DPPH27.. IC A. Según el estudio de Ruíz J, los extractos etanólicos de variedades de Stevia rebaudiana. Q U. IM. Bertoni adaptada al cultivo en el sur de México se encontró que eran eficaces eliminadores. O. de radicales frente al DPPH, además posee una buena potencia y reducción de la actividad. Y. BI. quelante. La alta actividad antioxidante de la Stevia rebaudiana Bertoni ha mejorado el. AC IA. interés potencial en esta fuente natural de edulcorantes para mejorar la eficacia de. R M. diferentes productos nutracéuticos y como agentes farmacológicos. El consumo de la Stevia. FA. rebaudiana Bertoni puede desempeñar un papel en la prevención de enfermedades. D E. humanas en las que los radicales libres están implicados como el cáncer, cardiovascular la. C. A. enfermedad, y el envejecimiento28.. O TE. Otro estudio según Periche A y col. nos informan que la infusión de las hojas de Stevia. BI B. LI. rebaudiana Bertoni se ve afectada tanto por el tiempo como por la temperatura de infusión para la extracción de antioxidantes, por lo que se recomienda la extracción a una mayor temperatura, esto optimiza la extracción de fenoles y flavonoides que presentan actividad antioxidante29. En un estudio de Periche y col. concluyeron la actividad antioxidante de polifenoles, taninos y catequinas en un extracto acuoso de hojas de Stevia, menciona que taninos tienen propiedades para neutralizar las especies reactivas de oxigeno al igual que las catequinas30.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. V.. CONCLUSIONES. 1. El extracto etanólico de hojas de Stevia rebaudiana Bertoni tiene efecto antioxidante frente al 2,2-difenil-1-picrilhidrazil. 2. En los resultados de identificación de compuestos fitoquímicos del extracto. catequinas, compuestos fenólicos, taninos, resinas y taninos.. IC A. etanólico de hojas de Stevia rebaudiana Bertoni se presenta la presencia de. Q U. IM. 3. La concentración 17.5 mg/mL del extracto etanólico de hojas de Stevia rebaudiana. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. Y. BI. O. Bertoni neutraliza el 50 % de los radicales del 2,2-difenil-1-picrilhidrazil.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. VI.. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1. Delgado L. Importancia de los antioxidantes dietarios en la disminución del estrés oxidativo. [Revisado el 12 de Diciembre del 2015]. Investigación y ciencia de la Universidad Autónoma de Aguascalientes. México. Revista. Número 50. Pp.: 1015.. IC A. 2. Rodríguez, J. Radicales libres en la biomedicina y estrés oxidativo. [Revisado el 23. IM. de Noviembre del 2015]. Vol. 30, N° 1. Pp.: 12-18.. Q U. 3. Gutiérrez V. Daño oxidativo, radicales libres y antioxidantes. [Revisado el 22 de. BI. O. Diciembre del 2015]. Revista Cubana. 2002; Vol. 31, N° 2. Pp. 54-56.. AC IA. Y. 4. Medina, R. Radicales libres de Oxigeno: Bioquímica inorgánica y biomédica. Bioquímica. 1ra ed. México. Mc Graw-Hill Interamericana. 2001. Pag: 779-792.. D E. 2006. N.8. Pp: 161-172.. FA. R M. 5. Avello, M. Radicales libres, antioxidantes naturales y mecanismos de protección.. A. 6. Nur, A. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity.. O TE. C. [Revisado el 17 de marzo del 2014]. Saudi Pharmaceutical Journal. Volume 21, Nº. LI. 2, April 2013. Estados Unidos. Pp. 143–152.. BI B. 7. Morales M. Crece joven ¿Dónde encontrar los antioxidantes? [Revisado el 18 de Noviembre del 2015]. Revista Cubana. 2010; Vol. 31, N° 2. Pp. 42-51. Disponible en: http://www.crecejoven.com/nutricion--encontrar-antioxidantes. 8. Jave, W. Antioxidantes y radicales. Que es un antioxidantes? [Actualizado el 28 de Noviembre del 2015]. Saudi Pharmaceutical Journal. Volumen 11, Nº 4, Mayo 2011. Estados Unidos. Pp. 141-149. Disponible en: http://www.aula21.net/Nutriweb/antioxiradic.htm.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 9. Halliwell, B. Antioxidants in human health and disease. Revista Annu. 2010. Volumen 5. N.8. Pp: 33-50. Disponible:http://www.tdx.cesca.es/TESIS_UVAILABLE/TDX-0707104145921//borras.pdf. 10. Castro J. Ventajas de la medicina natural. [Actualizado el 18 de Noviembre del 2015]. Volumen 4, N. 2. Pp 20–27. http://remedios.innatia.com/c-remedios-mente/a-ventajas-medicina-. IC A. Disponible:. Q U. IM. natural-10194.html.. O. 11. Karre, A. Natural antioxidants in meat and poultry products. [Revisado el 17 de. Y. BI. enero del 2015]. Meat Science. Volumen 94, Nº 2, June 2013, Pp 220–227.. AC IA. Disponible: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0309174013000302.. R M. 12. Mahmoud, A. Anti-inflammatory and antioxidant activities of Moringa peregrine. FA. Seeds. [Revisado el 17 de marzo del 2014]. Free Radicals and Antioxidants.. D E. Volume 1, Nº 2, April–June 2011, Pp 49–61.. C. A. Disponible: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S223125361112010X.. O TE. 13. Dueñas, L. Extracción y caracterización de principios activos de estructura fenólica. BI B. LI. con propiedades antioxidantes y antibacterianas, a partir de residuos del procesamiento de alcachofas. Ecuador. Pp. 2-5. Disponible: http://www.espe.edu.ec/portal/files/sitio_congreso_2011/papers/V4.pdf. 14. Martínez A. Flavonoides. Colombia. 2005. Soporte [en línea]. Disponible en: http://farmacia.udea.edu.co/~ff/flavonoides2001.pdf. 15. Villar del Fresno, A. Farmacognosia vegetal. Madrid. Síntesis S.A.1999. pag: 215,216.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 16. Quiñones, G. Los polifenoles, compuestos de origen natural con efectos saludables sobre el sistema cardiovascular. Nutrición hospitalaria. Volumen 27. Nº2. Pp. 7689. Disponible: http://digital.csic.es/bitstream/10261/101372/1/Los%20polifenoles.pdf. 17. Shukla, S. Antioxidant ability and total phenolic content of aqueous leaf extract of. Pp: 807-811.. Q U. IM. Disponible: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21377849.. IC A. Stevia rebaudiana Bertoni. 2012. Experimental and Toxicologic Pathology. Vol 64.. O. 18. Kim, I. The antioxidant activity and the bioactive compound content of Stevia. Y. BI. rebaudiana water extracts. 2011. Food Science and Technology. Volumen 44.. AC IA. Número 13. Pag 32.. R M. 19. Miranda M, Cuellar A. Manual de Prácticas de Laboratorio. Farmacognosia y. Metodologia Científica:. D E. 20. Moura, M. Metodo. FA. Productos Naturales. 1ª ed. Cuba. Editorial Universidad de la Habana. 2000. Determinação. da Atividade. C. A. Antioxidante Total em Frutas pela Captura do Radical Livre DPPH. Comunicado. O TE. Tecnico on line 127. 2007. Pp: 4-8.. BI B. LI. 21. Miranda M, Cuellar A. Mención en Productos Naturales y Terapéuticos. 1ª ed. Cuba. Editorial Universidad de la Habana. 2002. Pp. 45-46 22. Miranda M. Farmacognosia y Productos naturales. 1ª ed. Cuba. Ed. Félix Varela. 2001. Pp. 12-13. 23. Brand-Williams W., M. Cuvelier y C. Berset; Use of a Free Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity, Lebensm. Wiss. U. Technol.: 28, 25-30. 1997.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 25. Moura R, Elesbao R, Sousa E, De Moiras S, Goes C, Jimenez J, Saura F. Metodología Científica: Determinação da Actividade Antioxidante Total em Frutas pela Captura do Radical Livre DPPH. (Revisado 7 de enero 2016). Disponible en http://www.cnpat.embrapa.br/cnpat/down/index.php?pub/Cot_127.pdf. 26. Rojas Montoya, Sergio. Stevia edulcorante orgánico del siglo XXI. Perú. 2009. Editado: Universidad Nacional Agraria La Molina. Pag. 40. IC A. 27. Gutierrez A. Bioquímica, farmacología y toxicología de Stevia rebaudiana Bertoni.. Q U. IM. [Revisado el 23 de abril del 2016]. Universidad Complutense. España. 2015.. O. Disponible en: http:/// TFG/TFG/Memoria/ALEJANDROGUTIERREZCRUZ.pdf. Y. BI. 28. Ruiz J, Moguel Y, Matus A, Segura M. Capacidad antioxidante de extractos foliares. AC IA. de dos variedades de Stevia rebaudiana Bertoni adaptadas al cultivo en México.. R M. N°31. Vol. 3. [revisado el 04 de mayo del 2016]. Universidad Autónoma de Mexico.2015.. Disponible. en:. FA. Yucatán.. D E. http://www.aulamedica.es/gdcr/index.php/nh/article/view/8043/pdf_7898. C. A. 29. Periche, A. Cinética de extracción de compuestos antioxidantes en infusiones de. O TE. hoja de Stevia. 2014. Instituto Universitario de Ingeniería de Alimentos para el. BI B. LI. Desarrollo. Universidad Politécnica de Valencia. España. Disponible. en:. http://www.uclm.es/area/cta/cesia2012/cd/PDFs/4-BIO/BIO-. P14T.pdf 30. Periche y col. Cinética de extracción de compuestos antioxidantes en infusiones de hoja de Stevia. 2010. Instituto Universitario de Ingeniería de Alimentos para el Desarrollo. España. Disponible: http://159.90.80.55/tesis/000130459.pdf. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) R M. AC IA. Y. BI. O. Q U. IM. IC A. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. ANEXOS. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. Y. BI. O. Q U. IM. IC A. Anexo No 1. Certificado botánico de identificación y determinación taxonómica de la especie Stevia Rebaudiana Bertoni.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo No 2. Lugar de recolección de la muestra, Campamento San José - Proyecto. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. Y. BI. O. Q U. IM. IC A. Especial CHAVIMOCHIC.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo Nº 3. Partes de un equipo de soxhlet. Salida de agua Refrigerante Entrada de agua. Solvente puro condensado. Regreso del solvente. FA. R M. AC IA. Y. BI. O. Estufa. Q U. IM. Ascenso de vapores. IC A. Muestra en cartucho. Sifón. BI B. LI. O TE. C. A. D E. Anexo No 4. Recolección de la muestra y preparación del extracto etanolico.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. O. Q U. IM. IC A. Anexo Nº 5. Preparación de diferentes concentraciones del extracto etanólico de hojas de Stevia rebaudiana Bertoni. LI. 0.9 mL 4.1 mL 5.0 mL 6.3 mg/mL. BI B. Solución muestra Solución etanol Volumen total Concentración. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. Y. BI. 35 mg/mL de extracto etanólico de hojas de Stevia rebaudiana Bertoni. 1.8 mL 3.2 mL 5.0 mL 12.6 mg/mL. 2.7 mL 2.3 mL 5.0 mL 18.9 mg/mL. 3.6 mL 1.4 mL 5.0 mL 25.2 mg/mL. 4.5 mL 0.5 mL 5.0 mL 31.5 mg/mL. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo Nº 6. Preparación de las soluciones problema. D E. 12.6 mg/mL MP. 18.9 mg/mL MP. 25.3 mg/mL MP. 31.5 mg/mL MP. C. A. 6.3 mg/mL MP. FA. R M. AC IA. Y. BI. O. Q U. IM. IC A. Extracto etanólico de hojas de Stevia rebaudiana Bertoni. 10 µL. 10 µL. 10 µL. 10 µL. BI B. LI. O TE. 10 µL. 5 mL DPPH. 5 mL DPPH. 5 mL DPPH. 5 mL DPPH. 5 mL DPPH. 60 µM. 60 µM. 60 µM. 60 µM. 60 µM. Se dejará en reposo durante 30 minutos. Leer al espectrofotómetro a una longitud de onda de 515 nm. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo Nº 7. Absorbancias de las diferentes concentraciones de las soluciones de 60 µM DPPH Concentración. abs 0.71137 0.71294 0.71354. 60 µM DPPH. abs promedio 0.7126. Anexo Nº 8. Absorbancia de la solución muestra a diferentes concentraciones. FA. 10 uL Muestra (25.2 mg/mL) + 5 mL DPPH 60 mM. IC A. IM. Q U. O TE. C. A. D E. 10 uL Muestra (31.5 mg/mL) + 5 mL DPPH 60 mM. Anexo Nº 9. Cálculo del Coeficiente de inhibición al 50% (CI 50 ) del extracto etanolico de. BI B. LI. las hojas Stevia rebaudiana Bertoni. Ecuación de la recta: Donde: Reemplazando:. 20.4. 39.6. O. AC IA. R M. 10 uL Muestra (18.9 mg/mL) + 5 mL DPPH 60 mM. % inhibición promedio. Y. 10 uL Muestra (12.6 mg/mL) + 5 mL DPPH 60 mM. Promedio % inhibición Absorbancia 21.3 0.5673 12.9 26.8 37.6 0.4303 39.7 41.6 57.1 0.3176 53.5 55.7 70.6 0.2095 70.5 70.6 85.5 0.1041 84.8 85.8. BI. 10 uL Muestra (6.3 mg/mL) + 5 mL DPPH 60 mM. abs 0.5607 0.6200 0.5213 0.4449 0.4299 0.4160 0.3055 0.3314 0.3160 0.2092 0.2098 0.2095 0.1030 0.1081 0.1012. y = 0.0256 x + 0.0598 y = 50/100 = 0.5 0.5 = 0.0256 x + 0.0598 x = 0.5 - 0.0598 = 17.2 0.0256 CI 50 = 17.2 mg/mL. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/. 55.4. 70.6 85.4.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo No 10. Marcha fitoquímico del extracto etanolico de las hojas de Stevia Rebaudiana Bertoni.. ENSAYO DE GELATINA. R M. AC IA. Y. BI. O. Q U. IM. IC A. ENSAYO CATEQUINAS. ENSAYO Fe 3 Cl. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. ENSAYO SHINODA. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. Y. BI. O. Q U. IM. IC A. Anexo No 11. Lecturas de las muestras problemas en el espectrofotómetro. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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