Efecto del soporte de inmovilización en los parámetros cinéticos de la reducción de acetofenona empleando gongronella butleri como biocatalizador

(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. ica. FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA. ría. Q. uí m. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA. In g. en. ie. “EFECTO DEL SOPORTE DE INMOVILIZACIÓN EN LOS PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA REDUCCIÓN DE ACETOFENONA EMPLEANDO Gongronella butleri COMO BIOCATALIZADOR”. TESIS. de. PARA OPTAR EL TÍTULO DE. ca. INGENIERO QUÍMICO. lio te. AUTORES:. Br. ELIZABETH DEL JEHOVA CALLE MORALES Br. ERICKA ELIZABETH SEGURA CASANOVA. Bi b. ASESOR:. Dr. MEDARDO ALBERTO QUEZADA ALVAREZ. TRUJILLO - PERÚ 2015. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ica. ÍNDICE. Pág.. uí m. I. INTRODUCCION 1.1. Problemática. 1.3. Química Sostenible. ría. 1.4. Química Sostenible y Biotecnología Blanca. Q. 1.2. La Química y el Desarrollo Sostenible. 1.5 Biotransformaciones. 2 4 5 7 9 10. 1.7. Reducción de Aldehídos y Cetonas usando Células Enteras. 11. en. ie. 1.6. Ventajas de las Biotransformaciones. In g. 1.7.1. ADH Deshidrogenasas. 1.7.2 Regeneración de la Coenzima. de. 1.8. Gongronella butleri. 1.9. Inmovilización de Células. ca. 1.9.1. Tipos de Inmovilizaciones. lio te. 1.10. Objetivos. 12 13 16 17 21 25. 26. 1.10.2. Objetivos Específicos. 26. Bi b. 1.10.1. Objetivo General. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIALES Y MÉTODO. Pág.. Materiales y Equipos. 2.2. Métodos.. 27. ica. 2.1. 29. 29. uí m. 2.2.1. Estado de la colección 2.2.1.1. Medio de cultivo. Q. 2.2.1.2. Preparación del medio sólido de cultivo 3.2.1.3. Esterilización del medio de cultivo. 30 30 31. ría. 3.2.1.4 .Reacción test catalizada por Gongronella butleri en condiciones de no crecimiento (resting cells).. ie. 2.2.2. Cualificación de los equipos de Instrumentación Analítica. 31 32 32. 2.2.2.2. Cualificación del Espectrofotómetro UV. 32. In g. en. 2.2.2.1. Cualificación de la balanza analítica. 2.2.2.3. Cualificación del HPLC. 33 38. 2.2.3.1 Determinación de la Longitud de Onda Óptima. 39. de. 2.2.3. Validación y Cualificación del Método de Análisis. 2.2.3.2. Obtención de las Curvas de Calibración para Acetofenona. ca. y 1-Feniletanol.. 40. lio te. 2.2.3.3 Obtención de las Concentraciones de Acetofenona y. 1-Feniletanol durante la Reacción de Reducción. 41. Bi b. 2.2.4. Metodología Experimental para el Proceso de Biotransformación con Gongronella butleri.. 43. 2.2.4.1. Asentamiento de la Colección.. 43. 2.2.4.2. Crecimiento del Ascomiceto Gongronella butleri. 44. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 46. 2.2.4.4. Curva de Crecimiento del Ascomiceto Gongronella butleri. 47. ica. 2.2.4.3. Replicación del Ascomiceto Gongronella butleri. 2.2.4.5. Preparación del Medio de Reacción. 48. uí m. 2.2.4.6. Inmovilización del Ascomiceto Gongronella butleri 2.2.5. Estudio Cinético de Bioreducción. 53 54. 2.2.5.2. Orden de reacción (n). 57. ría. Q. 2.2.5.1. Velocidad Inicial de Reacción Observada (Vo). en. III. RESULTADOS Y DISCUSIONES. ie. 2.2.5.3. Otras variables de cinética de reacción. Cualificación de los Instrumentos Analíticos. In g. 3.1.. 51. 58. Pág. 60 60. 3.1.2. Cualificación de Espectrofotómetro Ultravioleta- Visible. 62. de. 3.1.1. Cualificación de Balanza Analítica. 3.1.3 Cualificación del Cromatógrafo de Líquidos de. ca. Alta Performancia. 64. 64. 3.1.3.2. Cualificación de Sistema de Inyección. 68. lio te. 3.1.3.1 Cualificación de la Bomba Cuaternaria. 72. 3.1.3.4 Cualificación de la Columna. 74. Bi b. 3.1.3.3. Cualificación del detector UV-Visible. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 3.2 Validación del Método de Análisis.. 76 76. 3.2.2. Validación de Método de Análisis Cromatográfico. 77. ica. 3.2.1. Longitud de Onda Óptima de Análisis.. uí m. 3.2.3. Curvas de Calibración para Acetofenona y 1-Feniletanol. 3.3. Proceso de Biorreducción con Gongronella butleri 3.3.1. Curva de Crecimiento. Q. 3.3.2. Estudio Cinético 3.3.3. Parámetros Cinéticos. ría. 3.3.4. Productividad de la Biotransformación. 80 80 82 96 98. 100. Bi b. lio te. ca. de. In g. en. ie. IV. CONCLUSIONES. 78. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. uí m. ica. RESUMEN. En el presente trabajo se investigó la capacidad reductora del ascomiceto Gongronella butleri en condiciones sostenibles con la finalidad de obtener un. Q. método alternativo de sustitución de los catalizadores tradicionales basados en metales y boranos, los cuales generan bajas productividades y contaminación. ría. debido a los subproductos. La actividad reductasa del ascomiceto se evaluó con la reacción test de reducción de acetofenona. Se empleó una cepa de. ie. Gongronella butleri en cultivo discontinuo con células libres e inmovilizadas en Espuma de Poliuretano y Agar Pterocladia 2,5% p/v para poder evaluar el efecto. en. de estos soportes de inmovilización en los parámetros cinéticos de la reducción de acetofenona y comparar los resultados obtenidos en cada uno de los. In g. soportes con el uso del ascomiceto en su forma libre. El crecimiento del ascomiceto se llevó a cabo en medio de cultivo PDA (Papa dextrosa agar) y la reacción tuvo lugar en la fase estacionaria de crecimiento del ascomiceto. Los. de. ensayos se realizaron empleando un equipo de cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC). Los mejores resultados se obtuvieron cuando se utilizó células inmovilizadas en Espuma de Poliuretano como soporte de inmovilización. ca. llegándose a obtener mayor productividad, mejor rendimiento y conversión en menos tiempo; la cinética de reacción fue de pseudo primer orden. En base a los. lio te. resultados obtenidos podemos concluir que emplear espuma de poliuretano como soporte de inmovilización es la mejor alternativa para lograr nuestra reacción de reducción en condiciones sostenibles, pues sucede a temperatura. Bi b. ambiente y en medios acuosos.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. en. ie. ría. Q. uí m. ica. I. INTRODUCCIÓN. Bi b. lio te. ca. de. In g. I. INTRODUCCIÓN. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN. ica. I.. uí m. 1.1 Problemática. En la última década ha sido creciente el interés en el campo científico e industrial, por los procesos de biotransformación de sustratos orgánicos,. Q. debido a la posibilidad de obtener sustancias con valor agregado, como precursores sintéticos y moléculas bioactivas a partir de sustratos abundantes. y. disponibles. comercialmente. ría. económicos,. (1-4).. La. importancia del empleo de los sistemas biológicos en la síntesis orgánica. clásicos.. Las. reacciones. catalizadas. por. enzimas. son. en. químicos. ie. radica en las ventajas de esta tecnología comparada con los métodos. frecuentemente más quimio-, regio- y estereoselectivas (5); por esta razón, el uso de los sistemas biológicos en la química ha llegado a ser una. In g. alternativa económica para la preparación de compuestos ópticamente activos. La principal aplicación de las biotransformaciones en síntesis orgánica está en la preparación de compuestos enantiopuros, pero también. de. es posible aprovechar las condiciones suaves (temperatura ambiente y presión atmosférica) en las cuales se llevan a cabo estos procesos. ca. biotecnológicos, para efectuar transformaciones de grupos funcionales quirales, evitando condiciones de reacción extremas, que pueden conducir. lio te. a la formación de productos secundarios (1). Esta tecnología utiliza condiciones de reacción amigables con el ambiente, ya que las biotransformaciones se realizan principalmente en medios acuosos y los subproductos son biodegradables o reutilizables. Los. Bi b. aspectos mencionados anteriormente contribuyen a la generación de una química verde, de bajo impacto ambiental (6). Los microorganismos, plantas y organismos superiores poseen la capacidad de realizar modificaciones estructurales sobre los sustratos orgánicos e inorgánicos de. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN. ica. origen sintético o natural. La Biotecnología Blanca es un campo emergente dentro de la moderna Biotecnología, que está implicado en procesos. industriales de producción. Su desarrollo viene determinado por el. uí m. cumplimiento de las nuevas normativas de la Unión Europea sobre control. del medio ambiente y producción de bienes y servicios en condiciones sostenibles. La Biotecnología Blanca se suele definir como la producción. Q. de productos de alto valor añadido o de servicios, en. condiciones. sostenibles tanto desde el punto de vista del empleo de disolventes y de. agresivos. con. el. medio. ambiente,. utilizando. biocatalizadores. no. en. ie. patógenos.(7,8,9). ría. reactivos así como en la obtención de productos no contaminantes y/o no. Los biocatalizadores (enzimas o células, libres o inmovilizadas) son ahora instrumentos indispensables para químicos y biotecnólogos, y están siendo. In g. cada vez más empleados en la síntesis asimétrica de productos farmacéuticos, agroquímicos, vitaminas y fragancias. (10,11) La reducción de cetonas empleando biocatalizadores para obtener. de. alcoholes constituye una alternativa eficiente y atractiva, que opera a condiciones de pH y temperaturas mucho más suaves. La ventaja de las. ca. reacciones biocatalíticas sobre las reacciones químicas tradicionales consiste en que aquellas son estereoselectivas y pueden realizarse a. lio te. presión atmosférica y temperatura ambiente. Dado que muchos procesos biocatalíticos se pueden llevar a cabo en medio acuoso u orgánico/ acuoso empleando disolventes poco tóxicos, justifica que la biocatálisis sea una de las líneas fundamentales en el desarrollo de la Química Sostenible.. Bi b. Además, de las enzimas y células microbianas se pueden inmovilizar y reutilizar lo cual rebaja los costes de producción. (12). 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN. ica. Debido a la enorme importancia de este tipo de compuestos en la síntesis de moléculas bioactivas , la reducción estereoselectivas de cetonas ha adquirido un enorme interés industrial , y a este efecto se han descrito. uí m. numerosas rutas catalíticas ; así, la hidrogenación asimétrica de cetonas catalizadas por metales (13) o el empleo de boranos(14,15) constituyen procesos que han sido descritos de manera eficiente a escala industrial ; poco compatibles con la. Q. no obstante se suelen precisar condiciones. Química Sostenible (Green Chemistry & Engineering) (16, 20), tales como. ría. temperaturas elevadas, el empleo de disolventes y/o reactivos tóxicos y. ie. obtener productos concomitantes.. en. En este sentido, la presente tesis para obtener el título de Ingeniero Químico, pretende contribuir en la determinación de los parámetros cinéticos de la reducción de Acetofenona empleando Gongronella butleri. In g. como biocatalizador midiendo la influencia del soporte de inmovilización.. de. 1.2. La Química y el Desarrollo Sostenible. -. ca. Básicamente el término desarrollo sostenible tiene dos implicaciones:. El uso de recursos naturales a ritmos suficientemente bajos como para. lio te. que no se agote el suministro de largo plazo. (7). -. La generación y disipación de los recursos y emisiones a velocidades. suficientemente bajas, de forma que puedan ser asimiladas por el. Bi b. medio natural. (7,16) El desarrollo sostenible envuelve tres ámbitos fundamentales de acción: el bienestar humano, el bienestar ecológico y sus interrelaciones. Se trata de un enfoque sistémico o integrador del desempeño económico y medioambiental, en el que el crecimiento económico debe ser suficiente. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN. ica. para resolver el problema de la pobreza y, al mismo tiempo, ser sustentable para evitar una crisis medioambiental. Igualmente, se toma en consideración la equidad entre generaciones, esto es, una toma de. uí m. conciencia por parte de la generación actual, de que sus acciones. pueden poner en riesgo la calidad de vida de las generaciones futuras.. Q. (18). Con esta perspectiva, el reto para el químico es desarrollar nuevos. ría. productos y nuevos procesos de acuerdo con los beneficios del desarrollo sostenible. Ello requiere una nueva aproximación consistente. ie. en la reducción de la intensidad material y energética utilizada durante. en. las reacciones químicas, minimizando o eliminando la liberación de sustancias químicas nocivas para la salud y el medio ambiente, y maximizando el uso de recursos renovables y la durabilidad de los. In g. productos obtenidos. (16,20). de. 1.3 Química Sostenible. La Química Sostenible o Química Verde, nueva filosofía en el ejercicio de. ca. la Química, concentra sus esfuerzos en minimizar o eliminar la contaminación derivada de las actividades industriales, mediante la. lio te. elaboración de productos químicos que no atenten contra la salud o el medioambiente. Los objetivos que persiguen son:. Bi b. . Minimizar la generación de subproductos en las trasformaciones. químicas (economía atómica), mediante el desarrollo y rediseño de reacciones químicas. En este sentido, las reacciones libres de solventes, surgen como alternativas viables para rediseñar procesos químicos sustentables.. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN Reducir el uso de solventes, especialmente los que entran en la. ica. . clasificación de tóxicos o persistentes en el medioambiente. Aquí se enfocan los esfuerzos en optimizar los procesos de. uí m. extracción, utilizados comúnmente en los procesos químicos industriales. . Diseñar procesos químicos basados en el uso de materias. Q. primas renovables (derivadas de plantas), en lugar de aquellos procesos basados en materias primas derivadas del petróleo. Mejorar los procesos químicos con tecnologías que contribuyan. ría. . suelo y las aguas.. Adelantar el desarrollo de protocolos y métodos con el fin de. en. . ie. a la disminución de las emisiones que contaminan el aire, el. In g. monitorear la contaminación en tiempo real. (16). El desarrollo de la Química Sostenible se basa en una serie de principios que se enumeran a continuación: (20). de. 1. Es mejor prevenir la formación de residuos que tratarlos o eliminarlos tras su formación.. ca. 2. Los métodos sintéticos deben ser diseñados para conseguir la máxima incorporación en el producto final de todas las materias. lio te. usadas en el proceso.. 3. En tanto sea posible, se deben diseñar metodologías sintéticas para el uso y la generación de substancias de escasa toxicidad. Bi b. humana y ambiental.. 4. Se deben diseñar productos químicos que, preservando la eficacia de su función presenten una toxicidad escasa.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN. ica. 5. Las sustancias auxiliares (disolventes, agentes de separación, etc.) deben resultar innecesarias en lo posible o cuanto menos deben ser inocuas.. uí m. 6. Las necesidades energéticas deben ser consideradas en relación a. sus impactos ambientales y económicos, y deben ser minimizadas. Los métodos de síntesis deben llevarse a cabo en condiciones de. Q. temperatura ambiente y presión atmosférica.. 7. Las materias de partida deben ser renovables y no extinguibles, en. 8. Evitar. derivaciones. ría. la medida en que esto sea posible técnica y económicamente. innecesarias. de. grupos,. ie. protección/desprotección, etc.). (bloqueo. en. 9. Los reactivos catalíticos deben ser tan selectivos como sea posible. 10. Los productos químicos han de ser diseñados de manera que al final de su función no persistan en el medio ambiente, sino que se. In g. fragmenten en productos inocuos para el medio ambiente. 11. Se deben desarrollar las metodologías analíticas que permitan el seguimiento en tiempo real del proceso y el control previo de la. de. posible formación de substancias peligrosas. 12. Las sustancias y las formas de su uso en un proceso químico deben. ca. ser elegidas de manera que resulte mínima la posibilidad de accidentes químicos incluyendo emisiones, explosiones e incendios.. lio te. 1.4 Química Sostenible y Biotecnología Blanca La Biotecnología Blanca es la que se aplica a la industria y sus procesos. Engloba muchos sectores industriales (químico, alimentación, energía,. Bi b. medioambiente,. etc.). y. tiene. como. objetivo. sustituir. tecnologías. contaminantes por otras limpias. Utiliza organismos vivos, biocatalizadores y enzimas para obtener productos más fáciles de degradar, que requieran menos energía y generen menos residuos. Las ventajas de utilizarlos son. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN. ica. que mejoran la eficiencia de los procesos químicos. Así, mientras que los procesos químicos convencionales requieren alta presión y temperatura, los microorganismos y sus enzimas trabajan a presión y temperaturas son. biodegradables. y. pueden. trabajar. en. condiciones. uí m. normales,. extremas. (21). Los procesos industriales basados en procesos biotecnológicos suelen ser. Q. altamente sostenibles. Así lo reconoce la OCDE en sus publicaciones como la ya clásica “Biothecnology for clean industrial products & products:. ría. towards industrial sustainability” de 1998, donde hace notar que la biotecnología es una herramienta poderosa para alcanzar el desarrollo. ie. industrial sostenible. Ello se debe a que muchos de sus desarrollos están. en. basados en: (21). El uso directo de materias primas obtenidas de fuentes sostenibles.. -. La obtención de productos como los polímeros biodegradables, de un. In g. -. alto valor añadido a partir de aceites vegetales, fibras, hidratos de carbono, etc.. La conversión de la biomasa en productos intermedios de síntesis tales. de. -. como la glucosa, etanol, etc. La potencial producción por semisíntesis de productos agroindustriales. ca. -. lio te. o farmacéuticos.. Existe una estrecha relación entre las Biotransformaciones y la Química Sostenible debido en concreto a los siguientes puntos fundamentales. Bi b. del trabajo en Biotecnología: (16-21). -. Minimización de residuos y control de eluyentes.. -. Simplificación de los procesos de purificación del producto final.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN Obtención de buenos rendimientos.. -. Reducción al mínimo de la formación de los productos concomitantes.. -. Trabajar con disolventes no contaminantes.. -. Evitar o reducir al mínimo el riesgo de producción de fuegos,. uí m. ica. -. explosiones o emisiones contaminantes.. Q. 1.5 Biotransformaciones. ría. Las biotransformaciones son reacciones químicas catalizadas por células o enzimas aisladas en las que se aprovechan las cualidades propias de los. ie. biocatalizadores, principalmente su regio- y estereoespecificidad y su. en. capacidad para llevar a cabo reacciones en condiciones no extremas de pH y temperaturas. Las biotransformaciones pueden ser usadas para lograr conversiones específicas de sustratos complejos usando células vegetales,. In g. animales o microbianas o enzimas purificadas. (22). Además, la biocatálisis al emplear células enteras como biocatalizadores. de. en las aplicaciones comerciales se ha limitado en gran medida a casos especiales en que el microorganismo contiene la enzima necesaria para. ca. reacciones de una sola etapa o donde la célula es un productor natural de una sustancia química como el etanol o un producto complejo natural,. lio te. como la tetraciclina. (22). Esta utilidad reducida se ha asociado con la falta de herramientas experimentales generales y eficaces para desarrollo de cepas microbianas. Bi b. para aplicaciones industriales. Sin embargo, los enormes avances en ingeniería metabólica, la genómica, la metabólica, la proteínica, la evolución dirigida, etc., en los últimos años han abierto la puerta a la creación apropiada de microorganismos con fines industriales.(22). Estos. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN. ica. avances están a favor de la introducción de procesos con células enteras llamándose entonces biotecnología blanca. Hoy en día, algunos procesos industriales están utilizando células enteras como biocatalizadores, por. uí m. ejemplo: nicotinamida a partir de 3-cianopirdina utilizando Rhodococcus. rhodochrous, acrilamida a partir del acrilonitrilo utilizando R. rhodochrous,. Q. entre otros. (23). Los procesos de biotransformación pueden ser diseñados en bioreactores. ría. específicos para cada requerimiento, algunos procesos se llevan a cabo mediante enzimas solubles o inmovilizadas en un soporte, lo cual permite. ie. realizar procesos en continuo, en ocasiones también se utilizan células. en. procariotas o eucariotas, ya sea en crecimiento o en reposo, en suspensión o inmovilizadas. Los procesos de biotransformación pueden ser muy útiles para reciclar sustancias de desecho de las industrias y originar productos. In g. de mayor valor añadido. (23). 1.6. Ventajas de las Biotransformaciones. de. Entre las principales ventajas que presentan las Biotransformaciones (Biotecnología) con respecto a los procesos químicos tradicionales. lio te. ca. podemos mencionar: (6-22). a) Reduce el número de pasos de síntesis dada la gran selectividad de los biocatalizadores.. Bi b. b) Evita la producción de subproductos. Esto es importante en la síntesis de productos quirales dada la gran estereoselectividad de los biocatalizadores.. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN. ica. c) Necesitan condiciones suaves de proceso pues los catalizadores trabajan a temperatura ambiente, presión atmosférica, en medio acuoso o en disolventes poco contaminantes.. uí m. d) Utiliza catalizadores muy activos y lo más selectivo posible, siendo los biocatalizadores poco contaminantes.. e) Desarrolla metodologías analíticas que permiten el seguimiento en. Q. tiempo real del proceso y el control previo de la posible formación de. ría. substancias peligrosas.. 1.7. Reducción de Aldehídos y Cetonas usando Células Enteras. ie. En vez del aislamiento, el cual requiere de una sofisticada regeneración de. en. la coenzima, se emplean mayormente células microbianas. Ellas contienen múltiples deshidrogenasas, las cuales están aptas de aceptar sustratos no naturales, además tienen todas las coenzimas necesarias y. In g. las rutas metabólicas para su regeneración. Por lo tanto la regeneración o reciclado de la coenzima puede ser omitida ya que se realiza. de. automáticamente gracias al metabolismo de la célula viva. Además, fuentes económicamente cómodas del carbono tales como sacarosa o glucosa pueden ser usados como sustratos auxiliares para. ca. reacciones asimétricas de reducción. Por otro lado, todas las enzimas y. lio te. coenzimas están bien protegidas dentro de su entorno celular natural. (23) Sin embargo, estas ventajas tienen que ser tomadas en cuenta junto con algunos inconvenientes importantes:. Bi b. . La productividad de las conversiones microbianas son generalmente. bajas, ya que la mayoría de los sustratos no naturales son tóxicos para los organismos vivos, y por lo tanto solo son toleradas a bajas concentraciones (0,1-0,3% por volumen a prox.). 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN La gran cantidad de biomasa presente en el medio de reacción. ica. . causa bajos rendimientos y la recuperación del producto se torna. problemático, sobre todo cuando el producto es almacenado dentro. uí m. de las células y no se elimina al medio de reacción. Debido a que. solo una menor fracción (normalmente 0,5-2,0%) del sustrato auxiliar se utiliza para la regeneración de la coenzima, la mayor parte se. Q. metaboliza, formando subproductos polares, que a menudo impiden la purificación del producto. Por lo tanto, el control de la reacción se . ría. hace más dificultoso.. Finalmente, es más probable que diferentes cepas de un. ie. microorganismo cuenten con diferentes especificidades, por lo que. en. es importante usar exactamente el mismo cultivo para obtener resultados comparables con la literatura. (23). In g. 1.7.1. ADH Deshidrogenasas. Las alcohol deshidrogenasas son un grupo de enzimas deshidrogenasas que facilitan la interconversión entre alcoholes y aldehídos o cetonas con. siete. de. la reducción de dinucleótido de nicotinamida y adenina. Son un grupo de enzimas. que. están. frecuentemente. presentes. en. muchos. ca. organismos y facilitan la interconversión entre alcoholes y aldehídos o cetonas con la reducción de NAD⁺ a NADH. (24). Bi b. lio te. La reacción catalizada es:. Alcohol + NAD⁺. Aldehído o Cetona + NADH. Como cofactores en la reacción es posible la utilización de zinc o hierro dependiendo del tipo de alcohol deshidrogenasa. Son enzimas muy interesantes y de gran proyección industrial catalizan las reacciones redox ya que son enzimas intracelulares. Estas enzimas tienen gran número. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN Biotransformaciones. El proceso. ica. de aplicaciones en el campo de las. permite la creación de alcoholes homoquirales de gran interés como. intermedios de síntesis. Al ser enzimas intracelulares, dependen de una. uí m. coenzima como NAD(P)H, PPQ, etc. que se consume en cantidades equimoleculares respecto al sustrato a reducir. Esto implica que. la. regeneración de la coenzima hace al proceso económicamente inviable. Q. con enzimas libres sin la regeneración del cofactor (el precio aproximado de un mol de NADH es de 3 000$ USA y el de un mol de NADPH. ría. 25 000$ USA). (30). ie. En la biotransformación, alcohol deshidrogenasas se utilizan a menudo para la síntesis de los estereoisómeros enantioméricamente puros de. en. alcoholes quirales. A menudo, se pueden lograr alta quimio y enantioselectividad. Un ejemplo es la alcohol deshidrogenasa de. In g. Lactobacillus brevis, que se describe como un biocatalizador versátil. (30) 1.7.2 Regeneración de la Coenzima. de. La principal función de las coenzimas es actuar como intermediarios metabólicos. El metabolismo conlleva una amplia gama de reacciones químicas, pero la mayoría corresponden a unos tipos básicos de. ca. reacciones que implican la transferencia de grupos funcionales. Esta química común permite a las células utilizar un pequeño conjunto de. lio te. intermediarios metabólicos para transportar grupos químicos entre las diferentes reacciones. Estos intermediarios en la transferencia de grupos. Bi b. son las coenzimas. (25). Cada clase de reacción de transferencia de grupo se lleva a cabo por una coenzima particular, que es el sustrato de un conjunto de enzimas que la producen, y un conjunto de enzimas que la consumen. Un ejemplo de esto son las deshidrogenasas, que utilizan la nicotinamida adenina dinucleótido. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN. ica. (NADH) como cofactor. Aquí, cientos de enzimas diferentes eliminan los electrones de sus sustratos y reducen el NAD⁺ a NADH. Esta coenzima reducida es entonces un sustrato para cualquiera de las reductasas. uí m. presentes en la célula que necesitan reducir sus sustratos. (25). Estos cofactores se consumen de manera equimolecular con el sustrato,. Q. por lo que, debido a su elevado precio, requieren el diseño de sistemas que permitan su reciclado. Debido a este hecho, se suelen utilizar en. ría. forma de células enteras, puesto que de esta forma el propio metabolismo celular se encarga de la regeneración de los cofactores; el. ie. proceso resulta, por tanto, mucho más ventajoso desde el punto de vista económico, no sólo por este hecho, sino también porque se reducen los. Es. por. ello. por. lo. que. se. que. éstas poseen sistemas para la. utilizan células enteras como. In g. biocatalizadores ya. en. costes implicados en el aislamiento y purificación de la enzima. (26). regeneración de la coenzima. El único problema existente es que dentro de las células suele haber más de una enzima que bajos. Bi b. lio te. ca. e.e. (27). de. cataliza el proceso, obteniéndose en algunos casos. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. en. ie. ría. Q. uí m. ica. I. INTRODUCCIÓN. Bi b. lio te. ca. de. In g. Figura 1.1. Sistema de Reciclado del Cofactor. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ica. I. INTRODUCCIÓN. 1.8. Gongronella butleri. uí m. Gongronella butleri es un ascomiceto aislado en Indonesia descrito como productor de numerosas sustancias entre las que cabe destacar el. Q. quitosano y cuatro antibióticos derivados del ácido pentanodioico. (27) Es un microorganismo mesófilo teniendo en cuenta sus necesidades de. ría. crecimiento óptimo. Este ascomiceto pertenece a un grupo taxonómico que presentan mayor actividad reductasa mientras que las bacterias y levaduras son poco activos frente a la reacción test propuesta. Posee. ie. colonia blanca de micelio denso, algodonoso, margen de crecimiento de. en. color crema. (27). Gongronella butleri se ha usado en reducción estereoselectiva de cetonas. In g. por ejemplo en la reacción de reducción de ciclohexanona transformada con alta conversión para obtener ciclohexanol dado que presenta una buena actividad enzimática obteniéndose buenos resultados lo cual indica. de. la alta afinidad de este ascomiceto por este sustrato. (30) Para la reducción estereoselectiva de compuestos. carbonílicos se. ca. seleccionó una cepa de Gongronella butleri, por ser la más interesante de acuerdo a su productividad, su tolerancia a altas concentraciones de. lio te. cetonas y la ausencia de productos secundarios en la reducción de. Bi b. cetonas. (28). 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN. ica. 1.9. Inmovilización de Células Los biocatalizadores inmovilizados son enzimas o células (o combinación. uí m. de ellos) confinados o localizados en cierta región definida del espacio,. con retención de su actividad catalítica y, si es necesario, de su viabilidad, y que pueden ser usados de modo repetido y continuo. (29). Q. Para que la célula este confinada en una región definida es necesario formar una fase sólida dispersa, macroscópica, de alta densidad y. ría. catalíticamente activa, dentro de, o en contacto con, un medio reactivo líquido libre de biocatalizador. Se dice que el biocatalizador. está. ie. compartimentalizado. Las características de la fase sólida son tales que el. en. transporte de reactivos hacia y desde el biocatalizador está gobernado por difusión exclusivamente. Por la. resistencia al transporte difusional se. establecen en la partícula gradientes de concentración o de pH, con lo que. In g. el ambiente que rodea a la partícula de biocatalizador inmovilizado difiere grandemente del seno de la fase líquida (29). de. Las células libres en suspensión presentan un rápido decaimiento en su actividad catalítica; sin embargo, las células inmovilizadas presentan una estabilidad mayor, y por lo. tanto la inmovilización es un requisito. ca. necesario para poder reutilizar las células. (29). lio te. Una característica general de cualquier sistema con catalizadores inmovilizados es que el transporte de sustratos y productos se produce por mecanismos. difusionales.. Como. se. mencionó. anteriormente. la. Bi b. inmovilización permite la utilización continua del biocatalizador, dado que este queda fácilmente retenido en el interior del reactor, mientras se mantiene un flujo continuo de entrada y salida de líquido. Esto hace que en caso de células los reactores continuos puedan operar con caudales superiores a los correspondientes al límite del lavado que se observa. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN. ica. cuando se opera con células libres. En el caso de reacciones en discontinuo la inmovilización favorece la re-utilización del biocatalizador. Otro aspecto importante es que con la inmovilización se puede aumentar. uí m. sensiblemente la concentración del biocatalizador, con respecto a un. proceso en el que el mismo se encuentre en suspensión. De los dos puntos anteriores se deduce que en sistemas operando en continuo, los. Q. biocatalizadores inmovilizados permiten aumentar sensiblemente las productividades de los correspondientes bioreactores, dado que permiten. ría. operar a mayor concentración de catalizador (por tanto, mayor. Cuando se emplean. ie. concentración de sustrato), y con caudales más altos. (27) enzimas inmovilizadas es frecuente observar un. en. aumento de su estabilidad y de su resistencia a la desnaturalización y proteólisis cuando se encuentran inmovilizadas. En el caso de células, se. In g. suelen reducir los efectos de contaminación accidental del cultivo, dado que la población de células contaminantes que se encuentran en suspensión, y en concentración mucho menor que la población de células. de. inmovilizadas, puede ser eliminada mucho más fácilmente del reactor. (27) Los procesos biocatalizados por células enteras se pueden realizar en. ca. diversas condiciones:. Condiciones de fermentación en medio sólido o líquido. . Con las células inmovilizadas. . Con las células en condiciones de no-crecimiento, denominada. lio te. . antiguamente resting cells conditions.. Bi b. . Con las células liofilizadas. La metodología de células inmovilizadas es la más usada a la hora de realizar un proceso industrial escalable pues la inmovilización permite la separación del catalizador del medio de reacción de un modo fácil y. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN. ica. rápido. Los biocatalizadores deben poder obtenerse con un rendimiento razonable de inmovilización (carga de catalizador (células/g.catal)), conducir a rendimientos y/o productividades razonables y presentar bajas. uí m. limitaciones a la transferencia de masa a nivel intraparticular (difusión) y. una elevada estabilidad operacional. Desde el punto de vista económico, la ventaja principal del proceso de inmovilización es el número de. Q. reutilizaciones que se pueden hacer de las células, ya que permitirá su comercialización como catalizador. La reutilización industrial de las células. ría. solo se lleva a cabo cuando el biocatalizador puede separarse del seno de reacción de una manera fácil y sencilla, además de mantener la actividad.. ie. (33) En el caso de las células se necesita además que el catalizador. en. pueda lavarse intraparticularmente a fin de minimizar los efectos de toxicidad intracelular de los reactivos y/o productos. Estos aspectos determinan la vida media de los catalizadores y dependen tanto del. misma. (34). In g. método de inmovilización como de la matriz en que se lleva a cabo la. de. Las propiedades de un biocatalizador inmovilizado se encuentran definidas por las propiedades de las células y las características del soporte. La interacción especifica entre el soporte de inmovilización y el. ca. biocatalizador, dan lugar a un derivado inmovilizado con distintas propiedades químicas, bioquímicas, mecánicas y cinéticas. Por ello. lio te. existen diversos tipos de inmovilización de células y el método concreto a elegir depende del tipo de células que queramos inmovilizar y del tipo de. Bi b. reacción que se vaya a llevar a cabo. (34) Los métodos de inmovilización de biocatalizadores se pueden dividir en cinco grandes grupos, en función del mecanismo es que se basan.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN Adsorción sobre una superficie porosa.- La inmovilización se produce. ica. a.. por interacción de tipo iónico o fuerzas de atracción débiles, sobre la superficie del soporte.. Unión covalente a superficies.- La inmovilización también se realiza. uí m. b.. sobre la superficie del soporte, pero la interacción entre el catalizador y el soporte es mediante enlace covalente.. Reticulado entre células y polímeros (CLEA).- En este grupo no. Q. c.. existe soporte propiamente dicho. Las partículas del biocatalizador. ría. inmovilizado se logran unir mediante interacción directa, bien por. procesos de floculación.. Atrapamiento en una matriz.- Es la formación de una estructura. en. d.. ie. enlace covalente o bien en el caso de algunas células, mediante. tridimensional, en presencia del biocatalizador, que queda atrapado de forma uniforme en su interior. con. membranas. In g. e. Sistemas. (micro. encapsulación,. membranas. preformadas).- En los dos casos el biocatalizador se inmoviliza en el interior de un espacio limitado por una membrana. En el primer caso. de. las microcápsulas se producen en presencia del biocatalizador, que queda incorporado en su interior. En el segundo caso, el. ca. biocatalizador se introduce en el interior de un sistema con membranas previamente formadas.. lio te. De todas ellas, la más utilizada es el atrapamiento en una matriz macroscópica. Para que se obtengan buenas conversiones es necesario que el sustrato y los productos sean capaces de difundir a través de la. Bi b. matriz macroscópica sin una gran resistencia a la transferencia de masa a nivel intraparticular. Dependiendo del tipo de reactor, el soporte puede usarse. en. distintas. formas:. esferas,. láminas,. fibras. o. cilindros. seleccionando la que resulte más conveniente para disminuir la difusión interparticular o en la capa límite. (34). 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN. ica. El método de atrapamiento óptimo es aquel en el que se causa el menor trauma posible a la célula. Esto implica que en el proceso no haya un choque térmico fuerte o cambios en la presión osmótica, en el pH, en la. uí m. fuerza iónica, etc. Las matrices más comunes empleadas son: Hidrogeles. (alignato, carragenano, quitosano, etc.), Termogeles (agar, agarosa,. Q. celulosa, gelatina) y Polímeros (poliacrilamida, poliuretano, alcohol). (34) 1.9.1. Tipos de Inmovilizaciones:. ría. Para obtener biocatalizadores inmovilizados que retengan actividad y sean estables es necesario aplicar un método de inmovilización adecuado, que. ie. dependerá del tipo de actividad catalítica de interés. Existen diversos. Inmovilización por Atrapamiento empleando Termogeles. In g. . en. métodos para inmovilizar células, los cuales pueden ser: (29). Esta técnica de inmovilización consiste en la formación de un gel en presencia de la enzima. Las condiciones deben ser idóneas para producir. de. un gel con poros más pequeños que la enzima, de manera que ésta quede atrapada dentro de la matriz del gel; además estos poros deben ser. ca. suficientemente grandes para permitir la difusión y transformación del sustrato, y finalmente la liberación del producto. El atrapamiento puede ser. lio te. en geles o en fibras, que suelen ser más resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra incluida dentro de las. Bi b. microcavidades de una fibra sintética. El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteración en su estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN. del proceso no altera los grupos reactivos de la. ica. polimerización, así como la comprobación de que la naturaleza química proteína. (32). uí m. El agar y la agarosa son hidrocoloides que gelifican al disminuir la temperatura, por lo que se conocen como Termogeles. El agar se obtiene. de algas marinas de los géneros Gelidium, Gelidiella, Pterocladia,. Q. Gracilaria y Gracilopsis, y está compuesto de agarosa (agarobiosa) y agaropectina. La primera tiene un peso molecular mayor de 100 kDa y es. ría. la responsable de la gelificación del agar. La agaropectina por el contrario. ie. tiene un 5-8 % de sulfatos y un peso molecular ˂20 kDa. (35) El agar posee las siguientes propiedades: Es insoluble en agua fría, pero. en. se hincha mucho al absorber agua hasta veinte veces su peso. Se disuelve con facilidad en agua hirviendo y al enfriarse se convierte en un. In g. gel firme -el agar es el agente gelificante natural más fuerte, basta un 0,5% de agar en agua para la formación del gel-. Una solución de agar al 1,5% es clara; cuando ésta se calienta a una temperatura entre 32 - 42°C. de. se forma un gel resistente, que una vez formado no se funde, a menos que se someta a una temperatura mayor de 85°C. Las soluciones de agar tienen una viscosidad relativamente baja y una transición de sol a gel bien. ca. definida que se realiza entre los 32 - 42°C, esta transición es reversible a. lio te. una temperatura de 85°C. (32). Según el origen del agar, este gelifica a distinta temperatura. Ello se debe a la presencia de grupos metoxilo en el C6 de la L-galactosa de forma que. Bi b. cuanto mayor es el número de grupos metoxilo menor es la temperatura de gelificación, al producirse esta por la formación de enlaces hidrogeno entre cadenas. Así el agar de Gelidiella, que es el menos metoxilado, gelifica a 42-45 ºC mientras en el extremo opuesto está el de Pterocladia que lo hace entre 33-35 ºC. (27). 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Inmovilización por adsorción en Espuma de Poliuretano. uí m. . ica. I. INTRODUCCIÓN. En la adsorción, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de. Q. hidrógeno. Consiste en poner en contacto una solución acuosa de enzimas o una suspensión de microorganismo con un adsorbente activo, y. ría. después de un tiempo, una vez efectuada la adsorción, se lava el complejo formado para eliminar cualquier cantidad de biocatalizador que. ie. no se haya inmovilizado. (31). en. Los principales factores que influyen en la adsorción, son:. In g. 1. el pH del medio: controla el número y la naturaleza de las cargas que presenta la superficie de la proteína y del sólido; 2. la fuerza iónica: al aumentar la fuerza iónica se produce la desorción de. de. la enzima, ya que los iones inorgánicos se unen con más fuerza al soporte que la proteína;. 3. el diámetro de poro: debe ser aproximadamente dos veces el tamaño. ca. del eje mayor de la enzima; 4. la presencia de iones que actúen como cofactores de la enzima, ya que. lio te. pueden incrementar la carga enzimática del derivado. (31). Bi b. En el caso particular de microorganismo pueden desarrollarse polímeros. extracelulares que favorecen la adsorción. De manera general se puede decir que la adsorción es un método de inmovilización muy suave, y que por tanto no suele afectar la actividad de las enzimas ni la viabilidad de las células. El problema más importante que presenta es su reversibilidad,. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN. ica. dado que a menudo cambios en el pH, fuerza iónica o temperatura pueden afectar la desorción del soporte. La adsorción de enzimas y células se ha. estudiado sobre una gran variedad de soportes de distinta naturaleza. uí m. (tanto de carácter orgánico como inorgánico) y estructura física, y en muchos casos con pre-tratamiento para favorecer la inmovilización. (36). Q. La Espuma de Poliuretano ha sido utilizada para inmovilizar diversas células por ejemplo: bacterias como el Acetobacter aceti, Pseudomonas,. ría. microalgas como Prototheca zopfil empleada en degradar hidrocarburos. La unión de los microorganismos al poliuretano no se hace por una. ie. interacción puramente química como serían los enlaces de Van der Waals sino por el desarrollo de unas sustancias poliméricas extracelulares (EPS). en. que crean un verdadero entramado responsable de que la biomasa siga a la espuma. La generación de los EPS y muy probablemente la. In g. composición química de los mismos depende de la materia orgánica que se suministra como fuente de carbono y nitrógeno en el medio de cultivo.. Bi b. lio te. ca. de. (37). 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ica. I. INTRODUCCIÓN. uí m. 1.10. OBJETIVOS. 1.10.1. Objetivo General. ría. Q. Desarrollar un método de inmovilización de células que permita mejorar los parámetros cinéticos de la reacción de reducción de la Acetofenona en condiciones sostenibles.. ie. 1.10.2. Objetivos Específicos. en.  Aislar y caracterizar un microorganismo con actividad reductasa.. de. In g.  Realizar la curva de crecimiento de Gongronella butleri, para encontrar el tiempo en el cual se encuentra en mejores condiciones para realizar la reacción de reducción de la acetofenona.. ca.  Inmovilizar Gongronella butleri en diferentes soportes: (Agar Pterocladia 2,5% y Espuma de Poliuretano).. lio te.  Desarrollar cinéticas de reacción para evaluar la influencia en los parámetros cinéticos de la reacción.. Bi b.  Desarrollar métodos validados de análisis instrumental (HPLC, UVVIS). para. monitorear. la. reacción. de. reducció. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Bi b. lio te. ca. de. In g. en. ie. ría. Q. uí m. ica. II. OBJETIVOS. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ie. ría. Q. uí m. ica. II. MATERIALES Y MÉTODO. Bi b. lio te. ca. de. In g. en. II. MATERIALES Y MÉTODO. 26. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Materiales y Equipos:. uí m. 2.1.. ica. II. MATERIALES Y MÉTODO. Materiales de vidrio..  Matraces Erlenmeyer de 100mL y 250mL. Marcas: Pírex, Kyntel y. Q. LBY Boro 3.3.  Fiolas de 25mL. 50 mL, 100 mL y 250mL. Marcas: Kyntel y. ría. Fortuna..  Vasos de Precipitación graduados de 50mL, 100mL, 250 mL, 400. ie. mL y 1L. Marcas: Pírex, Kyntel y Duran.. en.  Viales encapsulados para cromatografía líquida de 2mL. Marca: Agilent. Color: Ámbar..  Pipetas de 10mL y 25 mL. Marcas: Pírex y Qualicolor.. In g.  Frascos para medio de cultivo de 250mL, 500 mL y 1000mL. Marca: Boeco..  Tubos de ensayo de 13*100mm- Marca: PYREX. de.  Varillas de agitación  Lunas de reloj.. ca.  Embudos de vidrio de vástago corto 70mm de diámetro.. lio te. Materiales de Plástico  Tubos tipo Falcon de 15mL. Marca: Fisher Brand. Bi b.  Placas Petri estériles. Marca: Miniplast-ein-shener  Probetas graduadas de 25mL, 50mL, 100mL, 250mL y 500mL.  Espátulas  Puntas para micropipeta azules amarillas  Racks para viales. 27. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIALES Y MÉTODO. ica.  Crio tubos  Porta puntas de micropipeta. uí m.  Sacabocados  Gradillas para tubos. Q. Material Auxiliar.. ría.  Guantes de látex  Gafas de seguridad. ie.  Porta objetos  Cinta parafilm. en.  Asas de siembra metálicas.  Filtros para viales de PTFE 0,2µm. In g.  Cinta para esterilización con vapor  Tapones para matraces. Papel aluminio. Algodón  Jeringas desechables de 1mL. Marca: Qualimaxx. de.  Mascarillas.  Bolsas para eliminación de puntas de pipeta contaminadas. ca.  Bolsas para eliminación de residuos. lio te. Instrumental de Laboratorio  Balanza Analítica. Marca: Sartorius AG Germany CPA 224S  HPLC Agilent 1100 series. Bi b.  Incubadora de agitación orbital JSAC 40, de temperatura y RPM controlados.  Incubadora tipo estufa (JSGI-150T)  Autoclave JSR. Marca JSAC-40. 28. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIALES Y MÉTODO. ica.  Espectrofotómetro UV-VIS. Marca: HEWLETT 8452A PACKARD DIODE ARRAY. uí m.  Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución. MARCA: Agilent 1100  Agitador de Tubos (Vortex)  Estufa. Marca: SP. . Pipet 4u (20-200 µL). . DragonMed(20-200 µL). . Microlit(20-200 µL). . Pipeta pump de 10mL.. ría. Lab Mate+(100-1000µL). ie. . Q.  Juego de micropipetas de volumen variable:. en.  Centrífuga. MARCA: EBA 20.  Columna Cromatográfica mediterránea C-18 de fase reversa. In g.  Refrigeradoras. Marcas: INRESA Y DAEVOO  pH-metro portable. MARCA: Ph-009 (II) ATC  Termómetro de -10°C hasta 400°C. de.  Mechero Bunsen. ca. 2.2 Métodos.. lio te. 2.2.1. Estado de la colección. La cepa microbiana utilizada en esta tesis se encontró almacenada a 5°C. Bi b. en solución glicerol-agua al 30%v/v. Para ello se colocó en cada criotubo 1ml de solución glicerol-agua al 30%v/v y cubitos de medio sólido que contienen microorganismo que ha crecido previamente en placas petri. Se utilizó glicerol por ser no tóxico para las células y por contar a nivel molecular con espacios intersticiales amplios, generando una mejor. 29. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIALES Y MÉTODO. ica. residencia del ascomiceto, evitándose problemas de presionamiento. uí m. entre ellos.. 2.2.1.1 Medios de cultivo. Q. La elección del medio de cultivo con sales minerales y un balance de fuentes de carbono y nitrógeno adecuado, proporciona la posibilidad al. ría. microorganismo de poner en marcha toda su maquinaria enzimática responsable del éxito de nuestra biotransformación. El medio de cultivo. ie. fue recomendado por el Director del Servicio de Biotransformaciones Industriales del Parque Científico de Madrid, el cual tuvo la siguiente. en. composición:. In g. a) Medio de Cultivo PDA para ascomicetos:  Papa blanca…………………………….. 22 g/L. de.  Agar ………………………………………30g/L  Dextrosa………………………………….20g/L. ca.  Agua destilada ………………………….1L. lio te. 2.2.1.2 Preparación del medio sólido de cultivo. Pusimos a hervir rodajas de papa, previamente pesada en agua destilada durante 20 min, luego trasvasamos el líquido a un matraz y agregamos. Bi b. los gramos de dextrosa propuestos. Para la preparación del medio sólido, se añadió, a la composición descrita anteriormente, Agar tipo Americano 30g/L.. 30. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIALES Y MÉTODO. ica. 2.2.1.3. Esterilización del medio de cultivo. uí m. El medio de cultivo empleado debe esterilizarse a 121°C y 1 atm de presión por 20 minutos.. Q. 2.2.1.4 Reacción Test catalizada por células en condiciones de no. ría. crecimiento (Resting Cells).. Para evaluar la actividad reductasa del ascomiceto se seleccionó como. reacción sencilla, que. ie. reacción test, la reducción de la Acetofenona a 1-Feniletanol; por ser una nos permite evaluar de una manera rápida y. en. precisa la actividad de la cepa y que puede ser analizada por cromatografía líquida con detector UV, dada la absorbancia de los. ultravioleta.. In g. electrones pi deslocalizados de los anillos bencénicos frente radiación. de. La concentración inicial de sustrato fue de 10mM, que es lo suficientemente baja como para permitir el crecimiento del ascomiceto y lo suficientemente alta para permitir el grado de biotransformación del. ca. sustrato suficiente para su análisis cromatográfico. Para llevar a cabo esta reacción se dejó crecer al ascomiceto en. lio te. Erlenmeyer de 100mL con 20mL de medio de cultivo estéril, durante 7 días. a 30°C y 200rpm. Luego se adicionó el sustrato hasta una. concentración de 10mM. Después de 72 horas de reacción a las mismas. Bi b. condiciones de agitación y temperatura se tomó una muestra de 3mL, se centrifugó a 400rpm por 15 min, se separó la biomasa del medio líquido, se filtró, y se analizó por cromatografía líquida, para determinar. la. conversión del sustrato.. 31. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIALES Y MÉTODO. ica. 2.2.2. Cualificación de los equipos de Instrumentación Analítica. En la siguiente tesis, se realizó la cualificación de equipos y se validó el. precisión y exactitud de los datos obtenidos.. Q. 2.2.2.1 Cualificación de la Balanza Analítica. uí m. método de análisis, con la finalidad de tener mejor confiabilidad en. ría. Las mediciones de pesos para la siguiente investigación oscilan entre 0 a. Rango de Cualificación: 0 a 100g.. en. -. ie. 100g., es por ello, que se cualificó la balanza en este rango:. Todas las mediciones se realizaron con agua destilada, y se tomaron los. -. In g. siguientes puntos intermedios:. Rango de Cualificación: 0 a 100g.: 0g., 25g., 50g., 75., 100g.,. de. con 4 repeticiones por cada medición realizada.. Con la recta obtenida de peso real vs peso teórico, observamos la. ca. variación de las pendientes al repetir cada cierto tiempo el mismo método de cualificación, y así llevar un control de la exactitud y precisión de la. lio te. balanza analítica.. Bi b. 2.2.2.2. Cualificación del Espectrofotómetro UV. Se preparó una solución madre de 0,528mM de Benzoato de Sodio. Luego, se midió las absorbancias de diferentes concentraciones de benzoato de sodio, esto se realizó directamente en la celda de cuarzo del espectrofotómetro UV-visible a 254 nm. Estas diluciones se realizaron. 32. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIALES Y MÉTODO. ica. agregando de manera cuantificada proporciones de Agua MiliQ (Agua. Ultra pura), y se obtuvo un espectro entre las concentraciones de 0mM. a la repetitividad de los resultados obtenidos.. Q. 2.2.2.3 Cualificación del HPLC. uí m. (Muestra Blanco) hasta 0,528mM. Luego se evaluó su linealidad en base. ría. Antes de realizar cualquier análisis en el HPLC, primero se cualificó las partes del HPLC, con el objetivo de asegurar la confiabilidad de cualquier. ie. análisis al utilizar dicho equipo.. en. a) Cualificación de la Bomba del HPLC.. In g. Se comparó el flujo real con el flujo teórico para cada uno de los 4 canales del equipo cromatográfico. Se pasó Agua MiliQ a través de cada canal y se realizó la cualificación a los siguientes caudales nominales de:. de. 0,5; 10, 1,5 y 2,0 mL/min hasta 4,0 mL/min.. Primero, se desconectó el conducto de desecho que se encuentra a la. ca. salida del detector y se colocó un vaso para evitar caídas del eluyente sobre el detector. Luego, se enumeró y se pesó 5 tubos eppendorf para. lio te. el flujo de 0,50 mL/min, y otra cantidad similar para los flujos de 1,0; 1,5 y 2,0 mL/min hasta 4,0 mL/min. Se activó el funcionamiento de la bomba del equipo. Se estableció el flujo de 0,50 mL/min para el canal “A” y se. Bi b. dejó pasar agua como fase móvil durante el tiempo suficiente para que la presión se estabilice y que por todo el sistema circule el solvente emitido por la bomba a través del canal “A”.. 33. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIALES Y MÉTODO. ica. De manera sincronizada se controló 2 minutos y se recogió el volumen. de eluyente que sale en ese tiempo. Además, se repitió esta operación 5. uí m. veces (al mismo caudal), de tal manera que se obtuvieron las 5 alícuotas. del caudal. Se repitió los pasos anteriores empleando los flujos de 1,0;. Q. 1,50; y 2,0 mL/min hasta 4,0 mL/min.. Posteriormente, se pesó los tubos eppendorf que contienen la fase móvil. ría. recogida (agua). Se determinó volumen experimental recogido (usando la densidad del eluyente a la temperatura del laboratorio) de las 5 lecturas. ie. para cada uno de los flujos utilizados, luego se determinó el valor promedio del volumen experimental recogido para cada caudal utilizado.. en. De esta manera se repitió todos los pasos para el canal “B”, “C” y “D”.. In g. b) Cualificación del Sistema de Inyección Para tener mayor seguridad en los resultados tanto en reproducibilidad y precisión, la cualificación del sistema de inyección se dividió en dos. de. partes: Precisión del inyector y Magnitud del efecto memoria (efecto “carry over”). Precisión del Inyector. ca. -. lio te. Se realizó tal estudio con la columna Teknokroma Mediterránea C185µm*15*0,46, con una fase móvil: Metanol/agua(45/55 v/v), con un flujo de 1mL/min, a una longitud de onda de 254nm, con una temperatura de. Bi b. horno de la columna de 30°C, para un volumen de inyección programado de 10µL.. Primero, se puso en funcionamiento el equipo. Luego, se seleccionó un flujo de 1,00mL/min y se dejó pasar fase móvil durante el tiempo suficiente. 34. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIALES Y MÉTODO. ica. para que la presión se estabilice y para que circule el solvente por todo el. sistema de bombeo. Posteriormente, se inyectó 10 µl de la disolución. uí m. estándar de naftaleno (0,100 mg/mL en acetonitrilo). Por último, se repitió. esta última operación 5 veces con esas condiciones cromatográficas y se anotó el tiempo de retención y el área para cada una de las inyecciones. Magnitud del efecto memoria (efecto “carry over”). ría. -. Q. de la disoluciones estándar.. ie. Este efecto de carry over es ocasionado por arrastre o retención del analito analizado anteriormente. Por lo cual un mal lavado del sistema de. en. inyección después de un análisis, puede ocasionar falsos resultados en. In g. los posteriores análisis cromatográficos.. Primero se programó a un flujo de 1mL/min la inyección de 10µl, Posteriormente, se inyectó la disolución estándar (acetofenona) y luego. de. se inyectó una muestra blanco compuesto de la misma fase móvil. Se observó en el cromatograma de este último si aparece señal en el tiempo de retención de la disolución estándar.. ca. Luego, se realizó la misma evaluación pero esta vez antes de cada inyección de la muestra blanco, se realizó un lavado programado del. lio te. sistema de inyección. Por último, se verificó si sigue presentándose señal y se comparó el sistema de lavado.. Bi b. c) Cualificación del Detector UV-Visible. Se llevó a cabo la evaluación de la linealidad de detección a una longitud de onda determinada en un rango de absorbancia. Esta evaluación se realizó a 254nm, mediante una secuencia de tres inyecciones de cinco. 35. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.