Efectos de tratamientos térmicos en combinación con los aceites esenciales de clavo y tomillo sobre la supervivencia de listeria monocytogenes evaluada in vitro y en una sopa comercial

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EFECTO DE TRATAMIENTOS TÉRMICOS EN COMBINACIÓN CON LOS ACEITES ESENCIALES DE CLAVO Y TOMILLO SOBRE LA

SUPERVIVENCIA DE Listeria monocytogenes EVALUADA IN VITRO Y EN

UNA SOPA COMERCIAL.

JUAN PABLO HUERTAS BAQUERO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL Cartagena, España.

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EFECTO DE TRATAMIENTOS TÉRMICOS EN COMBINACIÓN CON LOS ACEITES ESENCIALES DE CLAVO Y TOMILLO SOBRE LA

SUPERVIVENCIA DE Listeria monocytogenes EVALUADA IN VITRO Y EN

UNA SOPA COMERCIAL

JUAN PABLO HUERTAS BAQUERO

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL Cartagena, España.

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NOTA DE ADVERTENCIA

―La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por qué no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia‖.

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EFECTO DE TRATAMIENTOS TÉRMICOS EN COMBINACIÓN CON LOS ACEITES ESENCIALES DE CLAVO Y TOMILLO SOBRE LA

SUPERVIVENCIA DE Listeria monocytogenes EVALUADA IN VITRO Y EN

UNA SOPA COMERCIAL

JUAN PABLO HUERTAS BAQUERO

APROBADO

__________________ _______________________ Dra. Ingrid Schuler Phd Dra. Janeth Arias Palacios M.Sc,

Bióloga Bacterióloga Decana Académica Directora de carrera

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL Cartagena, España.

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Después de 5 años de dura lucha por fin alcanzo la cima de esta metar. Es uno de los momentos cumbre anhelado por muchos y hoy soy yo el que vive ese momento, pero esto no hubiera sido posible sin la presencia de muchas personas (algunas aun hoy presentes, otras se perdieron y otras fueron llamadas ante el gran jefe), no sé si estaría mal decir que -―Soy una obra viviente, a la cual muchos contribuyen a darle forma y color, a partir de

pinceladas de sentimientos bellos y cinceladas de palabras de justicia y verdad”- pero es la única forma de definir lo que quiero expresar. Debido a lo anterior dedico este trabajo a:

Dios el arquitecto de todo, sin el nada de esto podría ser.

Mi mamita donde quiera estés, ya hemos logrado la segunda gran meta, te extraño y sé que no estás muy lejos de mi porque estas en mí y a mi lado, protegiéndome y apoyándome.

Mi padre, gordo gracias por tu amor y tu apoyo, en el momento más crítico de nuestras vidas asumiste el rol de papa y mamá y como todo lo que haces no te quedo grande, se cuantos sacrificios has hecho por nosotros se cuantas preocupaciones pasaste y solo por sacarnos adelante, como te dije delante de más de 50 personas mis metas, sueños, anhelos y logros son también tuyos este es mi regalo al mejor padre del mundo.

Mi hermano, mijo se que aunque no andamos muy juntos, el sentimiento de amor es muy grande y siempre estamos como una sombra detrás del otro para protegernos y cuidarnos, sin usted, aunque no lo crea, esto no se hubiera hecho real, gracias.

Mi abuelita, mi tío y la familia Huertas la mejor familia del mundo, su apoyo incondicional para con nosotros tres es una bendición, ustedes son más que tíos y primos padres madres y hermanos, Gustavito y Raulito 5 años y medio después el trato ha sido cumplido y ese trato más que con ustedes fue conmigo.

Edna, una gran mujer, sin tu presencia en mi camino creo que nada de esto sería lo que es, pero más que todo te agradezco que AMES A MI PADRE Y LO HAGAS FELIZ creo que eso es lo que más ánimo me da pues la felicidad de él es la mía y todo es gracias a ti. Debo agradecer tu apoyo, tus consejos y el ánimo que me das en cada paso para seguir adelante creo que sin eso no hubiera podido poner esta bandera. Gracias por considerarme un hijo más estando siempre pendiente de mí, haciéndolo de corazón y no de obligación. También agradezco a tu familia unas personas que me quieren y los quiero unos amigos y compañeros geniales una familia que nos adopto en su seno a mi padre y a mí.

Dorita, sin ti este gran sueño hubiera sido un poco imposible, tu eres un ángel que apareció en mi camino en el momento adecuado sin tu presencia tal vez nada de esto sería real.

Familia Forero Vargas, mi segunda familia, una familia que ha estado para mí y conmigo en todo momento, una familia que me tomo como un hijo más creo que solo puedo decir que los amo mucho.

Mis amigos los cuales no necesito plasmar sus nombres, pues ellos saben quiénes son, algunos desde el colegio y otros desde la universidad gente que plasmaron su huella, y de los cuales tuve y tengo el privilegio y el honor de decir son mis amigos y aun mas porque desde la distancia me lo muestran.

Marta poco tiempo pero tu ayuda y tu apoyo en un mundo desconocido para mí fue y es muy importante.

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Agradecimientos

 Al Dr. Pablo Fernández, por darme la oportunidad de trabajar en su laboratorio, con su grupo de investigación e iniciar una nueva etapa en mi vida. Por confiar en mí y por toda la ayuda brindada tanto profesional como personal.

 A la Dra. Janeth, por decirme donde buscar el pony y darme la oportunidad de venir a buscarlo. Una persona que desde que la conocí no fue una profesora fue una amiga, por siempre tener una palabra para iluminar cualquier camino.

 A Leymaya, tanto que agradecerle, su apoyo cognoscitivo en el proyecto fue importante pero su amistad fue esencial, por estar conmigo en todo momento y en toda situación, por brindarme la mano cuando el mundo quería venirse encima, por siempre estar ahí para escucharme y darme animo Pieza fundamental en este proyecto y en mi nueva vida.

 Al Dr. Alfredo Palop, por tener su despacho abierto a las miles de dudas que surgieron durante el proyecto, su ayuda fue de gran valor para comprender muchas cosas.

 A May, Vera, Mª Dolores, Marina y Raquel, sin lugar a dudas el mejor grupo de laboratorio que existe, ¿que hubiera sido de mi sin su amistad, sin el cotilleo?, creo que hubiera sido imposible soportar tanto trabajo. Por siempre tener algún tema para amenizar el día, y bueno por tender la mano ante los miles de problemas y dudas que surgieron.

 A Fermín, (dios mío para el un agradecimiento aparte) por soportar y arreglar cada cosa que sin querer se dañaba o se averiaba (insisto Fermín yo no fui), por enseñarme que en la vida toca ser y saber de todo un poco (microbiólogo, ingeniero, electricista, etc.) e igual que los demás gracias por su amistad.

 A todos aquellos que en algún momento trabajaron conmigo en el laboratorio, por su compañía y amistad, personas que dejaron huella en mi: João, Clementina, Lola, José, Navarrete, Cifre, Lola y Loli, Sergio, Salva, Caro, Justine, y muchos más que tal vez se me pasaran pero nunca se les olvidará.

 Juan D parce fundamental tu amistad, bacano tener un parcerazo como tú, bacan gracias.

 Alicia & Grillo, 2 grandes amigos, espero su amistad perdure en el tiempo pues personas con sus cualidades no existen muchas. Gracias por estar en todo momento un abrazo tios.

 A mis amigos de GPR, por brindarme su amistad, un chiste en el pasillo y estar pendientes de cómo iba todo.

 Al personal docente de la PUJ, Martha, María M, Ana K, y todos aquellos que ayudaron en mi formación.

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RESUMEN

Los consumidores de hoy en día están exigiendo alimentos mínimamente procesados sin aditivos químicos y que no sean expuestos a tratamientos agresivos como las altas temperaturas, los cuales pueden modificar sus características nutricionales y organolépticas. El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto de los aceites A.E. provenientes de las plantas de clavo y tomillo en combinación con tratamientos térmicos, para el control de uno de los principales patógenos de interés en la industria alimentaria como lo es L.monocytogenes. Para

poder determinar el efecto de este tratamiento se aplicaron tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y 60ºC solos y en combinación con los A.E. a dos concentraciones sobre la cepa L.monocytogenes CETC 4032. Después de cada

tratamiento se recuperó el microorganismo en un medio no selectivo y en uno selectivo, obteniéndose que al exponer el microorganismo luego de los tratamientos en un medio de recuperación con un factor de inhibición, se observa una mayor reducción en la población. A nivel de los aceites esenciales se obtuvo que el aceite de tomillo inhibió por completo la población inicial del microorganismo a una concentración de 0.01% desde el tiempo 0 del tratamiento. Para el aceite esencial de clavo se obtuvo una reducción in vitro de 4-log de 3,29

min en un medio de recuperación no selectivo y de 2,5 en un medio selectivo a una concentración de 0,01%. Al aplicar el tratamiento anterior con una concentración de 0,05% del A.E. en una crema de calabacín se obtuvo una reducción decimal de 3-log en 1 min. Los resultados obtenidos en la investigación nos permiten concluir que los A.E. evaluados presentan gran eficacia en la disminución de la población de L.monocytogenes CETC 4032 siendo más efectivo

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Tabla de Contenido

1. INTRODUCCIÓN ... 22

2. MARCO TEÓRICO ... 24

2.1 Generalidades ... 24

2.1.2 Enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) ... 24

2.2 Listeria monocytogenes ... 25

2.2.1 Historia ... 25

2.2.2 Morfología ... 25

2.2.3 Factores de crecimiento... 26

2.2.4 Clasificación ... 26

2.2.5 Reservorio ... 28

2.2.6 Alimentos ... 28

2.2.6.1 Leche y productos lácteos ... 30

2.2.6.2 Carne y productos carnicos ... 31

2.2.6.3 Otros Alimentos ... 32

2.2.7 Métodos de detección ... 33

2.2.7.1 Métodos de aislamiento ... 35

2.2.7.2 Identificación de colonias aisladas ... 36

2.2.8 Virulencia ... 37

2.2.8.1 Entrada a las células del hospedero ... 39

2.2.8.2 Escape del fagosoma y desarrollo intracelular. ... 39

2.2.8.3 Desplazamiento intracitoplasmático ... 40

2.2.8.4 Diseminación célula-célula ... 40

2.2.9 Listeriosis ... 41

2.2.9.1 No invasivo (gastroenteritis) ... 41

2.2.9.2 Invasivo ... 42

2.2.9.3 Tratamiento ... 42

2.3 Métodos más usados para el control de L.monocytogenes en alimentos ……43

2.3.1 Tratamientos térmicos (control microbiano por calor) ... 43

2.3.2 Cinética de muerte: Valores D y Z ... 43

2.3.2.1 Tiempo de reducción decimal (Valor D) ... 44

2.3.2.2 Valor Z ... 45

2.3.3 Termorresistómetro ... 46

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2.4 Antimicrobianos naturales ... 49

2.4.1 Aceites esenciales... 50

2.4.1.1 Mecanismos de acción de los aceites esenciales ... 50

2.4.1.2 Eugenol (clavo) ... 52

2.4.1.3 Carvacrol y Timol (Tomillo) ... 54

2.5 Modelo y distribución Weibull ... 58

2.6 Factor de exactitud (Af) ... 62

3. JUSTIFICACIÓN ... 64

4. OBJETIVOS ... 66

5. HIPOTESIS ... 67

5.1 Predicciones ... 67

6. MATERIALES Y METODOS ... 68

6.1 Materiales ... 68

6.1.1 Microorganismo ... 68

6.1.2 Medios de cultivo ... 68

6.1.3 Aceites esenciales... 69

6.1.4 Equipos ... 69

6.1.5 Materiales ... 69

6.2 Metodología ... 70

6.2.1 Activación del microorganismo ... 70

6.2.2 Preparación de la suspensión para el termorresistómetro ... 70

6.2.2 Recuento inicial ... 70

6.2.3 Realización de los tratamientos Isotérmicos a 55 y 60ºC ... 71

6.2.4 Realización de los tratamientos no isotérmicos a 55 y 60ºC ... 72

6.2.5 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación con los aceites esenciales de tomillo y clavo... 75

6.2.6 Tratamientos sobre el alimento ... 77

6.3 Análisis Estadístico de los datos ... 78

7 Resultados y Discusión ... 78

7.1.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC ... 79

7.1.2 Tratamientos no isotérmicos (N.I) a 55 y 60ºC ... 84

7.1.2.1 Predicciones ... 89

7.2 Tratamientos isotérmicos en combinación con los aceites esenciales. ... 99

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7.2.2 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60 ºC en combinación con el aceite

esencial de clavo ... 101

7.3 Tratamientos sobre el alimento ... 107

7.3.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC. ... 108

8. Conclusiones ... 118

9. Recomendaciones ... 119

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INDICE DE TABLAS

TABLA 1. TIEMPO DE MUESTREO EN LOS TRATAMIENTOS ISOTÉRMICOS POR

TEMPERATURA ... 71 TABLA 2. DILUCIONES A REALIZAR Y SEMBRAR PARA EL TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A

55ºC (EN BASE 10) ... 72 TABLA 3. DILUCIONES A REALIZAR Y SEMBRAR PARA EL TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A

60ºC (EN BASE 10) ... 72 TABLA 4. PERFIL DE TEMPERATURAS PARA LOS TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS. RANGO

DE TEMPERATURAS Y VELOCIDADES POR PERFIL. ... 73 TABLA 5. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC, TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A

SEMBRAR (EN BASE 10). ... 74 TABLA 6.TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC, TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A

SEMBRAR (EN BASE 10). ... 74 TABLA 7 TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC CON A.E. CLAVO AL 0.01%, TIEMPO DE

MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA. ... 75 TABLA 8. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC CON A.E. CLAVO AL 0.05%, TIEMPO DE

MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA+NACL. ... 75 TABLA 9. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC CON A.E. TOMILLO AL 0.01%, TIEMPO

DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA. ... 76 TABLA 10. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC CON A.E. TOMILLO AL 0.01%, TIEMPO

DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA+NACL. ... 76 TABLA 11. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC CON A.E. CLAVO AL 0.01%, TIEMPO DE

MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA. ... 76 TABLA 12. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC CON A.E. CLAVO AL 0.01%, TIEMPO DE

MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA+NACL. ... 77 TABLA 13. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC CON A.E. TOMILLO 0.01% Y 0.05%,

TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10). ... 77 TABLA 14. VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, INDICE DE

CORRELACIÓN (RO) Y R2 PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN

TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC. ... 80 TABLA 15. VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, INDICE DE

CORRELACIÓN (RO) Y R2 PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN

TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC. ... 82 TABLA 16. VALORES Z OBTENIDOS PARA TRATAMIENTOS ISOTÉRMICOS. ... 83 TABLA 17. . VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, INDICE DE

CORRELACIÓN (RO) Y R2 PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN

TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC. ... 86 TABLA 18. VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, INDICE DE

CORRELACIÓN (RO) Y R2 PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN

TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC. ... 89 TABLA 19. VALORES Z OBTENIDOS PARA TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS. ... 89 TABLA 20. INTEGRACIÓN DE LA LETALIDAD ALCANZADA EN UN CALENTAMIENTO NO

ISOTÉRMICO HASTA 55ºC CON UN PERFIL ISOTÉRMICO A LA MISMA TEMPERATURA Y PREDICCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SUPERVIVIENTES EN FUNCIÓN AL CÁLCULO DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN EL MEDIO BHIA. ... 91

(13)

PREDICCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SUPERVIVIENTES EN FUNCIÓN AL CÁLCULO DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO BHIA+NACL. ... 92

TABLA 22. INTEGRACIÓN DE LA LETALIDAD ALCANZADA EN UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO HASTA 60ºC CON UN PERFIL ISOTÉRMICO A LA MISMA TEMPERATURA Y PREDICCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SUPERVIVIENTES EN FUNCIÓN AL CÁLCULO DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO BHIA. ... 93

TABLA 23. INTEGRACIÓN DE LA LETALIDAD ALCANZADA EN UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO HASTA 60ºC CON UN PERFIL ISOTÉRMICO A LA MISMA TEMPERATURA Y PREDICCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SUPERVIVIENTES EN FUNCIÓN AL CÁLCULO DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO BHIA+NACL. ... 94

TABLA 24. PARÁMETROS DE LA DISTRIBUCIÓN WEIBULL ESTIMADOS A PARTIR DE LAS

CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A UN

TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC Y UNA CONCENTRACIÓN DE 0,01% DE ACEITE

ESENCIAL DE CLAVO. ... 102 TABLA 25. PARÁMETROS DE LA DISTRIBUCIÓN WEIBULL ESTIMADOS A PARTIR DE LAS

CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A UN

TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC Y UNA CONCENTRACIÓN DE 0,01% DE ACEITE

ESENCIAL DE CLAVO ... 104 TABLA 26. VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, ÍNDICE DE

CORRELACIÓN (RO) Y R2 PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN

TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC SOBRE CREMA DE CALABACÍN. ... 108 TABLA 27. VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, ÍNDICE DE

CORRELACIÓN (RO) Y R2 PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN

TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC SOBRE CREMA DE CALABACÍN. ... 109 TABLA 28. VALORES Z OBTENIDOS PARA TRATAMIENTOS ISOTÉRMICOS EN CREMA DE

CALABACÍN. ... 109 TABLA 29. PARÁMETROS DE LA DISTRIBUCIÓN WEIBULL ESTIMADOS A PARTIR DE LAS

CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE

CALABACÍN EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC CON UNA

CONCENTRACIÓN DE 0,05% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO. ... 114 TABLA 30. PARÁMETROS DE LA DISTRIBUCIÓN WEIBULL ESTIMADOS A PARTIR DE LAS

CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE

CALABACÍN EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC CON UNA

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INDICE DE FIGURAS

FIGURA 1. HABITAT DE L.MONOCYTOGENES Y VIAS DE CONTAMINACIÓN ... 28

FIGURA 2. RESUMEN MODIFICADO DE TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS GENERALES DE AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN PARA LISTERIA SPP. Y LISTERIA MONOCYTOGENES EN MUESTRAS AMBIENTALES Y DE ALIMENTOS. ... 34

FIGURA 3. SISTEMA METODOLÓGICO PARA LA IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA DE LISTERIA SPP. MODIFICADO ... 37

FIGURA 4. REPRESENTACIÓN ESQUÉMATICA DE LA BIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN INTRACELULAR POR L.MONOCYTOGENES ... 38

FIGURA 5. REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LA FISIOPATOLOGÍA DE LA INFECCIÓN POR LISTERIA SPP. ... 41

FIGURA 6. GRÁFICA DE SUPERVIVENCIA ... 44

FIGURA 7. GRAFICA DE VALOR D. ... 45

FIGURA 8. GRAFICA DE TERMO RESISTENCIA Y VALOR Z. ... 46

FIGURA 9. LOCALIZACIÓN Y MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS COMPONENTES DE A.E SOBRE LA CÉLULA BACTERIANA. ... 51

FIGURA 10. EUGENOL ... 53

FIGURA 11. ESQUEMA SUGERIDO DE ACCIÓN SUGERIDO PARA EL CARVACROL SOBRE LA MEMBRANA CITOPLASMÁTICA ... 55

FIGURA 12. TIMOL ... 56

FIGURA 13. CARVACROL ... 56

FIGURA 14. EJEMPLO MODIFICADO DE CONCAVIDADES. ... 61

FIGURA 15. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES ISOTÉRMICAS (55ºC) EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL ... 79

FIGURA 16. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES ISOTÉRMICAS (60ºC) EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL. ... 81

FIGURA 17. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES NO ISOTÉRMICAS (N.I) A 55ºC EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL. ... 85

FIGURA 18. COMPORTAMIENTO DE LA POBLACIÓN DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 DURANTE EL PERFIL N.I A 55ºC EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL... 85

FIGURA 19. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES NO ISOTÉRMICAS (N.I) A 60ºC EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL. ... 88

FIGURA 20. CURVA DE SUPERVIVENCIA L.MONOCYTOGENES CETC 4032 DESPUÉS DE UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC EN MEDIO BHIA. ... 92

FIGURA 21. CURVA DE SUPERVIVENCIA L.MONOCYTOGENES CETC 4032 DESPUÉS DE UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC EN MEDIO BHIA+NACL. ... 93

FIGURA 22. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 DESPUÉS DE UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC EN MEDIO BHIA. ... 94

FIGURA 23. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 DESPUÉS DE UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC EN MEDIO BHIA+NACL. ... 95

FIGURA 24. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO BHIA, A PARTIR DE LOS RESULTADOS DE ESTA INVESTIGACIÓN A CON EL MODELO DE BIGELOW PARA TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS Y UN AUMENTO DE TEMPERATURA DE 3ºC/MIN. ... 97 FIGURA 25. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO

(15)

MODELO DE BIGELOW PARA TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS Y UN AUMENTO DE TEMPERATURA DE 3ºC/MIN. ... 98 FIGURA 26. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A

UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC CON 0,01% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO

EN MEDIO BHIA A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN

DE WEIBULL. ... 102 FIGURA 27. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A

UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC CON 0,01% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO

EN MEDIO BHIA+NACL A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA

DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL... 103 FIGURA 28. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A

UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC CON 0,01% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO

EN MEDIO BHIA A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN

DE WEIBULL ... 104 FIGURA 29. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A

UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC CON 0,01% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO

EN MEDIO BHIA+NACL A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA

DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL... 105 FIGURA 30. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES

ISOTÉRMICAS (55ºC) EN CREMA DE CALABACÍN Y CRECIMIENTO EN MEDIO

SELECTIVO Y NO SELECTIVO. ... 108 FIGURA 31. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES

ISOTÉRMICAS (60ºC) EN CREMA DE CALABACÍN Y CRECIMIENTO EN MEDIO

SELECTIVO Y NO SELECTIVO. ... 109 FIGURA 32. COMPARACIÓN ENTRE LAS CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE

L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE CALABACÍN E IN VITRO A 55ºC. ... 111

FIGURA 33. COMPARACIÓN ENTRE LAS CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE

L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE CALABACÍN E IN VITRO A 60ºC. ... 111

FIGURA 34. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A

UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO EN CREMA DE CALABACÍN A 55ºC CON 0,05% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN NO SELECTIVO A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL. ... 113 FIGURA 35. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A

UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO EN CREMA DE CALABACÍN A 55ºC CON 0,05% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN SELECTIVO A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL. ... 113 FIGURA 36. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A

UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO EN CREMA DE CALABACÍN A 60ºC CON 0,05% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN NO SELECTIVO A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL. ... 114 FIGURA 37. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A

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1. INTRODUCCIÓN

Con el descubrimiento de los microorganismos gracias a la invención del microscopio por parte de Anthony Van Leeuwenhoek (1632-1723), la visión del mundo tal y como se conocía en ese tiempo cambió drásticamente, las teorías que formularon investigadores como el filósofo romano Lucrecio (circa 98-55 a.C.) y

el médico Girolamo Fracastoro (1478-1553) sobre la presencia de ―criaturas vivas invisibles‖ causantes de enfermedades fueron confirmadas.

Desde aquellos tiempos hasta la actualidad el ser humano se ha visto favorecido y afectado por los microorganismos. Beneficiado porque aprovecha las cualidades (metabólicas, genéticas, etc.) de algunos de estos para la elaboración de alimentos (pan, queso, cerveza, etc.), elaboración de medicamentos (antibióticos, vitaminas, vacunas, etc.) y en la actualidad como agentes recuperadores de ambientes y ecosistemas contaminados por la actividad industrial del hombre en una rama de la microbiología llamada biorremediación. Pero como se dijo anteriormente, también se ha visto afectado a nivel salubre debido a las enfermedades que estos provocan y que han generado grandes acontecimientos históricos como la peste negra en 1347. Con el descubrimiento del microscopio y la creación de la microbiología, el ser humano se ha preocupado por mejorar los niveles de la salud desde diferentes puntos, algunos de ellos como la industria farmacéutica, la industria alimentaria y la medicina entre otros.

Una de las ramas de la microbiología encaminada a asegurar la salud del hombre y de los animales es la microbiología de alimentos, esta rama es la encargada de verificar que los alimentos producidos por el sector agroalimentario, sean seguros, confiables e inocuos para la salud previniendo la generación de brotes epidemiológicos de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA), como por ejemplo: el cólera, la listeriosis, la salmonelosis, entre otras.

(17)

microbiológico de los alimentos. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que estos compuestos ó sustancias derivadas de estos son peligrosos para la salud, como por ejemplo las nitrosaminas, compuesto cancerígeno proveniente de la transformación de los nitritos.

Por otro lado, en la última década, los consumidores reclaman alimentos naturales mínimamente procesados, es decir, que mantengan sus características organolépticas y nutricionales intactas, pero que a su vez sean inocuos con un mayor tiempo de frescura sin la adición de compuestos químicos ó aplicación de técnicas agresivas, como la exposición a altas temperaturas.

En este sentido, los investigadores han explorado varias alternativas, como la combinación de tratamientos, por ejemplo: temperaturas moderadas con pH, aw,

(18)

2. MARCO TEÓRICO 2.1 Generalidades

2.1.2 Enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs)

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) son uno de los mayores problemas de la salud mundial, pueden causar una enfermedad pasajera o pueden ser tan graves que pueden llegar a causar la muerte. Estas enfermedades resultan por la ingestión de alimentos o bebidas contaminadas con agentes químicos (plaguicidas, fertilizantes, etc.) o por agentes biológicos (microorganismos, parásitos, y/o algunas substancias toxicas que estos producen).

Las ETAs pueden ser de 3 tipos:

Infecciones: Son aquellas enfermedades causadas por la ingestión de alimentos contaminados por microorganismos perjudiciales (patógenos) vivos (virus, bacterias, parásitos) Ej.: Salmonella spp, Listeria monocytogenes, el virus de la

Hepatitis A (Anónimo 1, 2007).

Intoxicaciones: Son aquellas enfermedades causadas por la ingestión de toxinas formadas en tejidos de plantas o animales, o de productos metabólicos de microorganismos en los alimentos, o por sustancias químicas que se incorporan a ellos de modo accidental, incidental o intencional desde su producción hasta su consumo. Ocurren cuando estas toxinas o venenos de bacterias o mohos todavía están presentes en los alimentos ingeridos, las toxinas no son detectadas por el consumidor, pues no tienen olor ni sabor y algunas pueden soportar los tratamientos térmicos realizados a los alimentos como por ejemplo la cocción, a estas toxinas se les denomina toxinas termorresisentes. Entre los microorganismos que producen toxinas se encuentran: Clostridium botulinum (toxina botulínica), Escherichia coli (toxina shiga), toxinas del pez globo (Michanie, 2007; Anónimo

1, 2007).

(19)

poseen la capacidad de producir, sintetizar o liberar toxinas unas vez ingeridas. Ej.

Vibrio cholerae (cólera) (Anónimo 1, 2007).

2.2 Listeria monocytogenes

2.2.1 Historia

La primera descripción de Listeria monocytogenes fue en 1926 debida a un brote

epidemiológico en unos cerdos de guinea y conejos, y no fue reconocida como un serio problema de salud, hasta que causó un gran brote invasivo con una alta tasa de mortalidad en las provincias marítimas de Canadá. Este fue el primer brote que demostró que este microorganismo es un patógeno alimentario y se ha demostrado que muchos de los casos de listeriosis son producidos por la ingestión de alimentos contaminados. Después de este brote, se dio un gran interés en investigar y conocer la epidemiología de este organismo, para proteger a los consumidores de la manera más efectiva contra el mismo, (Swatiman et al., 2007).

2.2.2 Morfología

El género Listeria está constituido por bacilos Gram positivos cortos y regulares,

de 0.4 a 0.5 m de ancho por 0.5 a 2.0 m de largo que pueden disponerse individualmente o en cadenas cortas, presentando a menudo formas en ―V‖ en cultivos viejos. Pueden aparecer en filamentos cortos y la capacidad de coloración puede perderse (Blanco, 1994), no esporulados, aerobios y anaerobios facultativos, son catalasa positivos, productores de acido L(+) láctico en el metabolismo fermentativo de la glucosa, oxidasa negativos, esculina positivos (Blanco, 1994), L monocytogenes, L.seeligeri y L.ivanovii son  hemolíticos en

agar sangre con 5% vol/vol de sangre de caballo o cordero. L.monocytogenes y L.seeligeri presentan un pequeño halo de hemólisis alrededor de las colonias que,

en numerosas ocasiones, es difícil de observar de tal forma que se hace necesario retirar la colonia para poder detectarlo, L.ivanovii presenta un amplio doble halo

de β-hemólisis. Para diferenciar más claramente entre estas especies, se utiliza un test de potenciación de su actividad hemolítica con Staphylococcus aureus

(20)

test de CAMP(Michanie, 2007). Mientras L. ivanovii presenta un característico

efecto de potenciación en forma de ―pala‖ con R. equi, en L. monocytogenes y L. seeligeri se observa un efecto en forma de cerilla. Con S. aureus tan sólo L. monocytogenes y L. seeligeri muestran una potenciación de su actividad

hemolítica (Blanco, 1994).

Son móviles por flagelos perítricos que se expresan mejor a 20-25ºC que a temperaturas más elevadas, son bastantes resistentes a agresiones fisico-químicas lo que les confiere una gran resistencia en el medio ambiente y puede sobrevivir por prolongados periodos de tiempo (15 años) siempre que se encuentren en presencia de materia orgánica y que las condiciones de pH, temperatura, aw, etc.

Sean favorables. (Blanco, 1994).

2.2.3 Factores de crecimiento

El género Listeria spp. presenta una temperatura mínima de crecimiento de 0.4ºC

(Blanco, 1994), otros documentos reportan que la temperatura mínima es de -1.5 (Michanie, 2007), si bien la temperatura óptima es de 37ºC y la temperatura máxima es de 45ºC, el rango de pH es de 4.3 a 9.4 siendo el pH 7 el óptimo para su desarrollo y la actividad de agua (aw) mínima que permite su crecimiento es de

0.92(Michanie, 2007; Anónimo 4, 2007). La atmósfera ideal para su desarrollo es de microaereofilia, pero tolera las condiciones aerobias, puede crecer en concentraciones altas de CO2 (Ej.30%) pero en concentraciones de 100% de CO2

es inhibida.

2.2.4 Clasificación

La clasificación del género listeria ha sufrido muchas variaciones, a lo largo de más de 30 años, y se le ha incluido en diferentes familias y géneros dentro del

Bergey`s manual of determinative bacteriology. En la séptima edición de 1957,

fue incluido dentro de la familia Corynobacteriaceae debido a sus características

morfológicas. Con el tiempo y gracias a estudios de taxonomía numérica y de

(21)

Los estudios quimiotaxonómicos demostraron que el género Listeria posee un

bajo contenido de Guanina+Citosina (G+C) 36-42%, carencia de ácidos micólicos y presencia de ácidos lipoteicoicos, presencia de peptidoglicano de la variedad A1 asociados a ácidos teicoicos del tipo polirribitol-fosfato, y por poseer como menaquinona principal la MK7. Todo esto, conllevó a la confirmación de la estrecha relación de este género con los géneros Lactobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Enterococcus, Lactococcus gracias a la proximidad que

los estudios de taxonomía numérica presentan y a la semejanza en las propiedades quimitaxonómicas. Con esto, en 1974 en la siguiente edición del manual Bergey

aparece incluido en la sección 16 como género de afiliación incierta cerca de los géneros anteriormente mencionados y con los cuales posee relación, (Blanco, 1994; Garcia, 1995; Domínguez, 2001).

Gracias a los avances de tecnologías genéticas (hibridación DNA-DNA, análisis del ARNr 16S) se demostró la escasa relación filogenética entre el género Listeria

y las corinebacterias y la cercanía con los géneros Brochotrix y Lactobacillus

(Blanco, 1994). Gracias a estos avances, se ubicó este género en la familia Listeriaceae, que está ubicado en la subrama del genero Clostridium de las

bacterias Gram positivas, basado en el bajo contenido de G+C en su genoma (Gasanov et al., 2005). Las cuatro secuencias disponibles hasta hoy de L.monocytogenes (cepas Ende, F6854, F2365, H7858) tienen un tamaño promedio

entre 2,893,921 bp y 2,953,211 bp con un contenido aproximado de G+C del 38% y cerca de 2900 genes codificadores de proteínas. La cantidad de G+C de

L.welshimeri y de L.innocua son de 36.4% y 37% respectivamente. Los análisis

de los genomas, de estas bacterias del género Listeriaceae permitieron evidenciar

(22)

filogenia cercana entre los genomas de las bacterias del género Listeria

(Buchrieser, 2007).

Actualmente, el género listeria se halla constituido por seis especies:

L.monocytogenes, L.inonocua,L.seeligeri, L.welshimeri, L.grayi y L.ivanovii con

sus dos subespecies indoniencis e ivanovii (Blanco, 1994).

2.2.5 Reservorio

Listeria monocytogenes es un microorganismo ubicuo,está de modo saprofito en

gran cantidad de nichos medioambientales, considerándose su hábitat principal el suelo y la materia vegetal en descomposición y en aguas continentales (Fig.1). También se encuentra normalmente en la flora intestinal de animales y está en las heces de un 2 a 6% de la población. Se encuentra también en ensilados y en el entorno de la producción de alimentos (Fig.1) (Blanco, 1994; Michanie, 2007).

Figura 1. Habitat de L.monocytogenes y vias de contaminación (Reguera et al.,

1995)

2.2.6 Alimentos

(23)

microorganismo son salchichas, fiambres, leche, leche pasteurizada y derivados lácteos, carne y productos cárnicos, y debido a su presencia en aguas servidas se puede encontrar en vegetales regados con agua contaminadas y no tratadas (Blanco, 1994; Michanie, 2007).

Diversos factores, son un reflejo de los cambios sufridos en el estilo de vida de los consumidores, entre estos se pueden incluir: (i) progresos médicos que han producido un cambio demográfico, incrementando la proporción de población de edad avanzada e inmunocomprometida; (ii) cambios en el sistema de producción primaria de alimentos (producción a gran escala de materias primas, modificación de las técnicas de procesado de los alimentos, expansión de la industria alimentaria y desarrollo de sistemas de almacenamiento en frío); (iii) modificaciones en los hábitos de alimentación (incremento en la demanda por parte de los consumidores de alimentos listos para comer, precocinados, refrigerados o congelados pero con un mínimo requerimiento de tiempo de cocinado antes de su consumo); (iv) realización de la compra una vez a la semana (Domínguez, 2001).

Como ya se comentó antes al ser este un microorganismo ubicuo y encontrarse presente de manera normal en la flora intestinal en algunos organismos, los enfermos y portadores sanos (animales y humanos) son una de la fuentes más importantes de contaminación en la industria alimentaria, debido a la diseminación en el ambiente de L.monocytogenes por parte de estos a través de la

orina, heces y otras secreciones (Fig.1) (Blanco, 1994).

Se han aislado colonias de L.monocytogenes, de agua por la descongelación de

(24)

Otro punto de contaminación de los alimentos, es la contaminación cruzada por la mala higiene de equipos y personal que laboran en plantas de producción, en seis plantas de delicatesen en Francia, se identificó contaminación cruzada entre alimentos crudos y cocinados por los procedimientos inadecuados de limpieza y desinfección, como fuentes importantes de contaminación (Mena et al., 2003)

2.2.6.1 Leche y productos lácteos

La leche y los productos lácteos son los alimentos en los cuales se han realizado mas investigaciones, debido a su alta incidencia en relación a los brotes de listeriosis presentados entre 1983 y 1987 en USA y Suiza.

L.monocytogenes por ser un microorganismo ubicuo puede contaminar a las vacas

lecheras provocándoles mastitis, la cual puede presentarse con ó sin alteración mamaria y/o de la leche de los animales afectados y Listeria spp. puede seguir

siendo excretada en la leche aun 3 meses después de la desaparición de los síntomas (Fig.1).

En los demás productos lácteos su presencia se debe a 2 factores: uno es la utilización de leche contaminada y mal tratada como materia prima para la elaboración de derivados lácteos (queso, leches achocolatadas, postres, etc.) y dos a la capacidad que tiene este microorganismo de crecer a temperaturas de refrigeración, y alcanzar niveles de hasta 107 ufc/mL durante el almacenamiento si el producto está contaminado (Blanco, 1994).

En estudios realizados por Mena et al. 2003 en Portugal, obtuvieron como

resultado que de 6 muestras de leche cruda 1 estaba contaminada con Listeria

(incidencia del 16.7%), de 28 muestras de leche pasteurizada ninguna presentó presencia del microorganismo, de 371 muestras de quesos fabricados a partir de leche pasteurizada 6 resultaron positivas (incidencia 1.6%) y de 50 muestras de queso fresco 2 dieron positivas en presencia del microorganismo (incidencia del 4.0%) y en España un estudio realizado por Vitas et al., 2003 obtuvieron que de

(25)

L.innocua, 1 L.welshimeri, 1 L.seeligeri. La leche fresca pertenece a los productos

crudos que sufren un proceso de cocción o calentamiento antes de su uso o consumo (Vitas et al., 2003) lo cual es reflejado por la ausencia de Listeria en

las muestras de la lache pasteurizada, y la presencia de listeria en productos a partir de este tipo de materias primas es a causa de la contaminación cruzada durante elaboración de los productos.

La leche cruda permite una presencia medianamente alta de patógenos por el proceso de obtención, transporte y contaminación cruzada, pero como es un producto que no se consumirá crudo y sufrirá un proceso de calentamiento (pasteurización, UHT, entre otros) que asegurara la destrucción del 100% de patógenos no se tiene mucha relevancia sobre la misma.

2.2.6.2 Carne y productos carnicos

Se ha aislado L.monocytogenes de muy diversos tipos de carne. La carne de ave y

sus derivados, son los mas susceptibles y los que mayor incidencia presentan entre los diferentes alimentos investigados y la contaminación aumenta a medida que avanza el procesado y distribución del producto, aunque los recuentos obtenidos no son superiores a 102 UFC/mL (Vitas et al.,2003; Mena et al., 2003).

Las carnes rojas presentan una mayor presencia de Listeria spp. siendo esta mayor

en la carne de porcino que en las de vacuno y ovino, aunque los recuentos no son superiores a 5 UFC/mL. En productos derivados como el paté se han llegado a obtener recuentos de hasta 106 UFC/g (Blanco, 1994).

Mena et al. 2003, analizaron 105 muestras de carne, 15 fueron de pollo crudo

(músculo) de las cuales 9 dieron positivo (+) para la presencia de Listeria

(incidencia del 60%), 17 de carne roja (músculo) de las cuales 3 dieron positivo (+) para la de Listeria (incidencia del 17.7%), 4 muestras de jamón de las cuales

solo 1 dio positivo (+) para la presencia de Listeria (incidencia del 25%), 44

(26)

cuales 3 dieron positivo (+) para la presencia de Listeria (incidencia del 12.0%) y

en España un estudio realizado por Vitas, y col. 2003 obtuvieron que de 295 muestras de carne cruda obtuvieron presencia de: 103 L.monocytogenes, 103 L.innocua, 45 L.welshimeri, 4 L.seeligeri, de 158 muestras de carne de ave de

corral (pollo y pavo) obtuvieron presencia de 57 L.monocytogenes, 106 L.innocua,

6 L.welshimeri, 2 L.seeligeri.

Para las carnes crudas se acepta una presencia moderada de patógenos por los procesos que sufre el producto para su obtención (matanza, destripado, etc.) y la preparación de las porciones (picado, troceado, etc.) pero como estos productos sufrirán un proceso de cocción y su temperatura interna alcanzará los 70ºC y asumiendo que el proceso es listericida si realiza de manera correcta (Vitas et al.,

2003; Mena et al., 2003).

2.2.6.3 Otros Alimentos

Se han encontrado reportes de L.monocytogenes en productos refrigerados

precocidos, listos para comer, congelados, y verduras y hortalizas crudas. (Blanco, 1994; Domínguez, 2001)

La presencia en alimentos listos para consumo (ALC) ó ready to eat , refrigerados y congelados se debe a que estos alimentos se consumen, sin ningún tratamiento térmico o tratamientos muy suaves, que no aseguran la eliminación de

L.monocytogenes (Blanco, 1994).

Las investigaciones de Vitas et al.. 2003 y de Mena et al.. 2003, concuerdan en

que los ALC poseen una alta probabilidad de causar listeriosis en los consumidores, aunque estos productos sufran procesos de conservación y/o maduración, y procesos de cocción que aseguren su inocuidad para los consumidores, el riesgo radica en la contaminación directa ó cruzada por contacto con superficies de equipos en los cuales se han manipulado alimentos crudos los cuales presentan una alta probabilidad de contaminación con Listeria spp. Otros

(27)

de colonización y contaminación de alimentos por parte de Listeria monocytogenes debido a su capacidad psicotrofa y a la generación de un ambiente

adecuado para su desarrollo y multiplicación debido a la ausencia de microorganismos patógenos, y valores de pH y aw adecuados (Vitas et al., 2003).

Algunos autores y entidades recomiendan cero tolerancia en 25 g de productos que posean un tiempo de vida útil mayor a una semana, debido a que investigaciones en microbiología predictiva han demostrado, que a una temperatura de almacenamiento de 0-5ºC y por más de 5 días la concentración final de listeria puede ser de 103 ufc/g partiendo de una concentración de 10 células, y si el almacenamiento es a 10ºC se puede alcanzar una concentración de 107 ufc/g , si el tiempo es menor recomiendan una concentración < 100 ufc/g, (Vitas et al.,2003).

Para los productos de carne cocinada y ALC, debido a sus cualidades y métodos de conservación como se ha descrito anteriormente, son un medio idóneo para el crecimiento de L.monocytogenes en todo el concepto microbiológico y por eso

deben tener un control igual que el de productos que posean duración de más de una semana (Vitas et al., 2003; Mena et al., 2003).

2.2.7 Métodos de detección

Desde la aparición de ETAs, ha habido una constante investigación, búsqueda y diseño de métodos más rápidos y más sensibles para la detección de microorganismos patógenos, sobre todo en la industria alimentaria, debido a las normas de gobiernos y organismos internacionales de ofrecer, alimentos inocuos para el consumidor y para mejorar su aceptación en el mercado ofreciendo tiempos de vida útil más largos.

Existen variados y diferentes procedimientos y protocolos avalados por agencias internacionales como FDA, ISO, para el aislamiento de Listeria monocytogenes,

(28)

microorganismos está encaminado a las tecnologías genéticas que se basan en el análisis del RNA y DNA (Gasanov et al., 2004).

Figura 2. Resumen modificado de técnicas y procedimientos generales de aislamiento, identificación y tipificación para Listeria spp. y Listeria monocytogenes en muestras ambientales y de alimentos (Gasanov et al., 2004).

La mayoría de pruebas, protocolos y test usados para la detección de microorganismos en la industria alimentaria no diferencian las especies de

Listeria. Estos protocolos son regulados y certificados por agencias

gubernamentales como la FDA (Food and Drug Administration) o la USDA (US deparment of agricultura) en Estados unidos ó la ANZFA (Australian and New Zeland food administration) en Australia. Desde la perspectiva de higiene la presencia de alguna especie no patógenica de Listeria como L.innocua puede

indicar la potencial transmisión o presencia de L.monocytogenes (Gasanov et al.,

2004).

(29)

en métodos de cultivo y anticuerpos, pero el reto de la industria alimentaría es usar métodos moleculares. Algunas de las desventajas de los método moleculares, es el costo de equipos y reactivos y que es necesario tener personal altamente entrenado y capacitado para este tipo de pruebas, aparte no diferencia entre células vivas y muertas, alguna de sus ventajas, es que no se basa en la expresión de factores antigénicos, enzimáticos o proteicos, es fiable y se basa en las diferencias entre los genomas y se pueden realizar en la misma fracción de tiempo que toman los métodos convencionales (Gasanov et al., 2004).

2.2.7.1 Métodos de aislamiento

Históricamente, el aislamiento de Listera spp. de muestras de alimentos y

ambientales ha sido un reto debido a la capacidad de este microorganismo de crecer a bajas temperaturas. Por lo que, antiguamente se solía aislar de las muestra clínicas poniéndolo a crecer en medios de cultivo a 4ºC por largos periodos de tiempo hasta poder evidenciar el crecimiento de colonias. Este tipo de método, toma demasiado tiempo y no permite la recuperación de células de Listeria spp.

dañadas. Hay tres elementos claves: enriquecimiento, tiempo de aislamiento y recuperación de células dañadas, los cuales son factores que se han de tener en cuenta en los procesos de aislamiento si se desean obtener los mejores resultados para el control de Listeria spp. en la industria alimentaria.

Las pruebas aprobadas por agencias reguladoras, deben detectar por lo menos una célula de Listeria en 25 g de muestra ó producto a analizar. Esta sensibilidad solo

se puede lograr usando métodos y medios en el cual el microorganismo sea capaz de llegar a una concentración de 104 UFC/mL el cual es un límite detectable. Dos de los protocolos más usados para la detección de Listeria spp. en cualquier

(30)

2.2.7.2 Identificación de colonias aisladas

Los métodos de enriquecimiento, demoran entre 30 y 48 horas y como se dijo anteriormente, debe continuarse con la identificación de los microorganismos aislados. Después de seleccionar un método de enriquecimiento validado para

Listeria se debe considerar la extensión en la cual el método ha sido validado, en

pocas palabras continuar usando protocolos validados y aceptados por agencias reguladoras. Mientras varios países tienen sus propios esquemas de validación, la AOAC en Washington, es la autoridad más reconocida en el mundo. La AOAC de métodos oficiales, posee una gran variedad de métodos para la búsqueda de

Listeria que incluye métodos rápidos como inmunoensayos hasta pruebas basadas

en genética

(31)

Figura 3. Sistema metodológico para la identificación fenotípica de Listeria spp. modificado (Gasanov et al., 2004)

2.2.8 Virulencia

L.monocytogenes puede invadir el ojo y la piel del hombre después de una

exposición directa, se ha observado en accidentes de laboratorio, veterinario y personal que labora en mataderos. Pero en la mayoría de casos de listeriosis en humanos la puerta de entrada es la parte superior del tracto gastrointestinal por el consumo de alimentos contaminados con dosis muy altas del microorganismos (106 UFC/mL ó g de alimento consumido) (Garza et al., 2002; Álamo et al.,

2006).

(32)

permite que parte de su población alcance el torrente sanguíneo y se disemine por vía hematógena. Luego de la translocación del intestino el hígado es el primer órgano blanco donde se multiplica activamente antes de que la infección sea controlada por la inmunidad mediada por células, luego de alcanzar el hígado los otros tres órganos blancos de este patógeno son la placenta, el cerebro y el sistema nervioso, (Álamo et al., 2006; Reguera et al., 1995).

Cuando la bacteria se interna en la célula, sea por fagocitosis o fagocitosis inducida, queda englobada en un fagosoma monomembranal, del cual luego escapa asegurando su libertad en el citosol, multiplicándose libremente en el citoplasma, luego se desplaza por el interior hacia el exterior de la célula hospedora alcanzando las células subyacentes, quedando nuevamente englobadas en el nuevo hospedador dentro de un fagosoma bimembranal. En concreto, los eventos implicados en el proceso infectivo global, son (Vazquez et al., 2001;

Garza et al., 2002) (figura 4):

i) Entrada a las células del hospedador.

ii) Escape del fagosoma y desarrollo intracelular. iii) Desplazamiento intracitoplasmático.

iv) Diseminación célula-célula.

(33)

2.2.8.1 Entrada a las células del hospedador

La forma en la cual el microorganismo ingresa a las células no fagocíticas es semejante a la clásica fagocitosis, ya que implica la interacción del ligando del primero con el receptor de las segundas, como ya se dijo las placas de peyer y las células M son el primer sitio de invasión, posteriormente el bacilo es englobado por los macrófagos residentes. Las proteínas que participan en la internalización inducida de Listeria en la célula, son las internalinas A y B que son codificadas

por los genes InlA e InlB. Luego de su ingreso las células quedan internadas en un fagosoma constituido de una sola membrana, que luego interactuara con un lisosoma para la destrucción de las bacterias pero este microorganismo es capaz de escapar antes que esto suceda (Garza et al., 2002; Domínguez, 2001).

2.2.8.2 Escape del fagosoma y desarrollo intracelular.

Dentro del fagosoma la bacteria queda englobada alrededor de 30 minutos en el caso de L.monocytogenes, el fagosoma se acidifica rápidamente por medio de

ATPasas de protones. La supervivencia bacteriana y su posterior multiplicación en el citosol van a ser el resultado de una competición entre la fusión del fagosoma-lisosoma y la exposición oxidativa de las células hospedadoras (Domínguez, 2001), los mecanismos para evitar esto son la expresión de los genes (hly) de las toxinas líticas (listeriosina O con interacción sinérgica de fosfolipasas)

para la destrucción del fagosoma y la expresión de dos enzimas, catalasa y superóxido dismutasa, que la protegen de la oxidación fagolisosómica (Garza et al., 2002).

(34)

2.2.8.3 Desplazamiento intracitoplasmático

Dentro del citoplasma la bacteria expresa otro gen de virulencia denominado ActA, que es una proteína que manipula los componentes del citoesqueleto de la célula hospedadora para su tránsito intracelular e intercelular. Durante la internalización, el microorganismo absorbe varios filamentos cortos de actina (Garza et al., 2002), y durante su división se observa una densa nube de actina que

la rodea. Asociada con la replicación bacteriana se va a producir una redistribución de los filamentos de actina, concentrándose en uno de los polos de la bacteria (Domínguez, 2001), formándose estructuras (actínicas) semejantes a la cola de una cometa.

Posteriormente, se produce una polimerización continua de la actina en dicho polo que mediante un mecanismo similar al de los cohetes, propulsa las bacterias por el citoplasma (Domínguez, 2001), aportando una fuerza locomotora que logra velocidades de 0.05 a 0.3 m/seg (Garza et al., 2002).

2.2.8.4 Diseminación célula-célula

La adquisición de movilidad asociada a la polimerización de los filamentos de actina alcanza la membrana plasmática de la célula infectada para poder invadir a las células vecinas (Garza et al., 2002; Álamo et al., 2006).

Los bacilos se desplazan a través del citoplasma hacia la membrana citoplasmática, utilizando los filamentos de actina polimerizados, una vez logran este objetivo, la empujan progresivamente provocando que se produzcan prolongaciones alargadas llamadas filópodos o protruciones, desde cuyo interior continúan ejerciendo presión, de esta manera dichas proyecciones terminan siendo fagocitadas por las células adyacentes (Garza et al., 2002). Como consecuencia de

(35)

2.2.9 Listeriosis

A pesar de la amplia presencia de la bacteria en el ambiente la enfermedad no es frecuente y afecta principalmente a adultos inmunocomprometidos, mujeres embarazadas, recién nacidos, granjeros, veterinarios y enfermos crónicos (Michanie, 2007).

La listeriosis presenta dos tipos de cuadros: invasivo y no-invasivo, el cuadro invasivo suele ocurrir en personas con sistemas inmunes muy débiles (VIH positivos, gerontes, embarazadas, fetos y neonatos, personas que padecen cáncer, diabetes, cirrosis, y en las que reciben medicamentos inmunodepresores o han sido sometidas a transplantes), y la no invasiva ocurre en cualquier persona que haya consumido una alta dosis de Listeria monocytogenes (Garza et al., 2002).

Figura 5. Representación esquemática de la fisiopatología de la infección por Listeria spp. (Vasquez et al., 2001)

2.2.9.1 No invasivo (gastroenteritis)

(36)

2.2.9.2 Invasivo

Las infecciones invasivas tienen un tiempo de incubación de 1 a 90 días, se presentan síntomas parecidos a una gripe, diarrea con presencia de vomito, tiene una mortalidad del 30% y una tasa de hospitalización del 92%, la concentración de microorganismo para causar la enfermedad es de 100-1000 células.

Las enfermedades que puede causar son (Garza et al., 2002; Michanie, 2007) :

I. Infecciones durante el embarazo. II. Granulomatosis linfatiséptica.

III. Sepsis de origen desconocido (septicemia).

IV. Meningoencefalitis, cerebritis, y romboencefalitis. V. Infecciones focales.

2.2.9.3 Tratamiento

L.monocytogenes es susceptible a gran cantidad de antimicrobianos y su

resistencia es ocasional, excepto a las tetraciclinas, estudios han comprobado que es capaz de adquirir genes de resistencia provenientes de Enterococcus spp. y Streptococcus spp. entre otros, lo cual puede aportarle resistencia a gentamicina,

estreptomicina, eritromicina y sulfametoaxol (Michanie, 2007).

Algunos autores reportan que la combinación de penicilina, ampicilina y opcionalmente un amino glucósido (ej.gentamicina) es el más efectivo, algunos otros adicionan el tratamiento con quinolonas, macrolidos y trimetropim-sulfametaxol, y otros recomiendan que la asociación ampicilina-cotrimoxazol, subrayando que es superior a la combinación de ampicilina-penicilina-gentamicina, ya que reduce la mortalidad y las secuelas cerebrales (Garza et al.,

(37)

2.3 Métodos más usados para el control de L.monocytogenes en alimentos

2.3.1 Tratamientos térmicos (control microbiano por calor)

La principal causa de deterioro de los alimentos es el ataque por diferentes microorganismos (bacterias, levaduras, mohos), y estos alimentos pueden resultar perjudiciales para la salud del consumidor.

El fuego y el agua en ebullición se han utilizado para esterilizar y desinfectar desde la época de los griegos, siendo el calor aún hoy en día uno de los métodos más comunes para la destrucción de microorganismos (Prescott et al., 1999),

debido a que los microorganismos mueren rápidamente cuando son sometidos a temperaturas superiores a las de su óptima de crecimiento. Esto permite utilizar altas temperaturas para eliminarlos por termodestrucción, la sensibilidad de los microorganismos a los tratamientos térmicos es diferente, las esporas son más termorresistentes que las células vegetativas y los microorganismos Gram-positivos lo son más que los Gram-negativos (Anónimo 2, 2007).

2.3.2 Cinética de muerte: Valores D y Z

Al someter a una población bacteriana a la acción del calor, a una temperatura constante, el número de supervivientes es una función exponencial del tiempo de tratamiento: a intervalos iguales de calentamiento la población se reduce en igual proporción. La cinética de destrucción microbiana es, por tanto, una cinética de reacción de primer orden (Anónimo 1, 2007; Garza, 2007):

Nt = N0 e-kt

Siendo:

Nt: número de microorganismos trás ―t‖ minutos de tratamiento.

N0: número inicial de microorganismos.

k: constante de inactivación. t: tiempo de tratamiento.

(38)

obtiene una línea recta. Esta representación se denomina gráfica de supervivencia (Palop, 2007).

Figura 6. Gráfica de supervivencia (Palop, 2007) 2.3.2.1 Tiempo de reducción decimal (Valor D)

Para definir la termorresistencia microbiana se creó un parámetro al que se denominó ―tiempo de reducción decimal o valor DT‖ que se definió como el tiempo que es preciso tratar a una población microbiana a la temperatura T para

reducir su recuento a la décima parte, o lo que es lo mismo, para que la línea de

supervivencia atraviese un ciclo logarítmico. Si consideramos N0 como el número

de células al inicio del tratamiento y NX el número de células sobrevivientes

después de un tratamiento de t minutos a una temperatura T, el valor D se calcula:

� = �

� �0 ��

DT= x/Log(N0/NX) ó DT=-1/m (donde m es la pendiente de la grafica de

(39)

Figura 7. Grafica de valor D (anónimo 1, 2007). 2.3.2.2 Valor Z

Si aumentamos la temperatura del tratamiento, el valor D disminuye de forma logarítmica. Por tanto, representando el logaritmo de los valores DT frente a la

temperatura de tratamiento, obtendremos una línea recta denominada gráfica de termodestrucción. La gráfica de termodestrucción permite conocer la termorresistencia que presentará el microorganismo a cualquier temperatura de tratamiento y su pendiente indica la termodependencia de las reacciones que conducen a su destrucción. A partir de la gráfica de termodestrucción se define el valor z como el número de ºC que hay que aumentar a la temperatura de tratamiento para reducir el valor DT a la décima parte, es decir, para que la línea de termodestrucción atraviese un ciclo logarítmico, el valor z se calcula:

ΔT

z =

log DT2– log DT1

o simplemente Z=-1/m (donde m es la pendiente de la gráfica de

(40)

Figura 8. Grafica de termorresistencia y valor Z. (Anónimo 2, 2007). 2.3.3 Termorresistómetro

El termorresistómetro es un instrumento diseñado para la determinación de la resistencia de los microorganismos al calor. Este instrumento permite la aplicación directa de un tratamiento térmico preestablecido, durante un tiempo determinado en condiciones controladas, a una muestra de alimento o a un medio sintético. (Palop, 2007)

(41)

2.3.4 Factores que influyen sobre la termorresistencia de los microorganismos.

En cualquier tratamiento antimicrobiano puede ocurrir que algunas células sean dañadas pero no mueran debido a que algunas células sean más termorresistentes que las demás por la producción de proteínas de choque térmico ó HSP (Heat Shock Proteins) u otros mecanismos (Hassani, et al., 2007; Millar, et al., 2006).

Aparte de esto, la resistencia de los microorganismos al calor esta supeditada a una serie de factores, entre los cuales están:

-Tipo de microorganismos: Las bacterias esporuladas son las formas mas resistentes, llegando algunas de ellas, a sobrevivir a tratamientos de varios minutos a 120ºC, seguido están las bacterias vegetativas, levaduras y hongos presentan una termorresstencia similar, la mayoría mueren tras estar unos minutos a una temperatura entre 70 y 80ºC (Anonimo 3, 2007; Garza, 2007).

-Temperatura: Algunas investigaciones han demostrado que la termorresistencia de las esporas está influenciada por la temperatura de esporulación, así si la esporulación tiene lugar a la temperatura óptima de crecimiento, o superior, su termorresistencia será mayor que si el crecimiento hubiera tenido lugar en temperaturas más bajas. Las formas vegetativas presentan un comportamiento similar a las esporuladas pues en general, cuanto más se aproxima a la temperatura óptima de crecimiento durante la fase de crecimiento más elevada es su termorresistencia (Garza, 2007; Der Lin et al., 2003).

-pH del medio de tratamiento: Quizás el factor más importante que afecta la termorresistencia sea el pH. La resistencia de los microorganismos es generalmente máxima a valores de pH próximos a la neutralidad, entre 6.0 y 8.0, y decrece cuando el medio es ácido (Garza, 2007). Investigaciones de Hassani et al.

2003 y de Hassani et al. 2007, demostraron que a un pH ácido la termorresistencia

(42)

como en las células vegetativas, lo que se refleja en la necesidad de utilizar temperaturas de tratamiento más elevadas o tiempos más prolongados (Garza, 2007). Fernández, y col. 2006, realizaron un modelo en el cual el efecto del aw

sobre la termorresistencia de L.monocytogenes varía dependiendo de la

temperatura del tratamiento.

-Composición del medio: El contenido de azúcares, la adición de conservantes, la presencia y el tipo de ácidos orgánicos y la presencia de sales, tienen un efecto importante sobre la termorresistencia de los microorganismos. El azúcar en concentraciones altas protege a las células contra la inactivación térmica pero no solo la concentración influye, sino también el tipo de azúcar interviene significativamente en el efecto protector (Garza, 2007). La sal en los alimentos juega un rol importante pues el primer efecto que tiene sobre las células es la plasmolisis, luego tiene otros efectos como deshidratación, interferencia enzimática, retiro de oxígeno y la toxicidad de los iones, cloro y sodio, cuando el cloruro de sodio es ionizado (Der lin et al., 2003). Schultze, et al.. 2006,

determinaron en su investigación que el D60 de L.monocytogenes en una mezcla

de frankfurter con una concentración de 8.5% es de 2.2 minutos y a concentraciones de 11 y 23% fue de 1.7 minutos, lo que desmiente que una mayor concentración de grasas produce un aumento de la termorresistencia de los microorganismos.

Listeria spp. es capaz de sobrevivir a bajas temperaturas debido al cambio de

composición que realiza en su membrana (Gandhi et al., 2006). Según la teoría de

membrana fluida, la membrana en los organismos, al estar a temperaturas altas aumenta su proporción de ácidos grasos saturados, y a bajas temperaturas las de ácidos grasos insaturados y hopanoides. Listeria spp. a bajas temperaturas,

aumenta la proporción de C15:0 a expensas de C17:0 cuando la temperatura es

reducida de la ideal (7ºC), todo esto con el objeto de mantener la fluidez adecuada de la membrana (Gandhi et al., 2006) ajustándose al modelo de mosaico fluido de

(43)

Las condiciones conocidas que afectan la resistencia a los tratamientos térmicos por parte de Listeria spp son, entre otros, el estado en el ciclo de crecimiento,

temperatura alta (19 ò 37ºC) durante el crecimiento (debido a que afecta la biosíntesis de lípidos), la composición membranal y síntesis de proteínas, exposición a otros estreses y las células que se encuentran en fase estacionaria, influyen en la resistencia a la inactivación térmica por parte de este microorganismo. La termotolerancia tiende a aumentar significativamente después de un shock térmico (30 minutos a 48ºC) en células crecidas a 4ºC. El caldo de crecimiento juega un papel importante, pues afecta la tasa de crecimiento y la composición de constituyentes celulares que determinan la termotolerancia de las células bacterianas. (Doyle, 1999; Doyle et al., 2000).

2.4 Antimicrobianos naturales

Los antimicrobianos son sustancias que pueden inhibir o detener el crecimiento de microorganismos, estos pueden ser de origen natural (animal, vegetal y microbiano) ó sintético (ácidos orgánicos y ésteres) (Raybaudi et al., 2006).

Se estima que en la parte aérea de las plantas, la filosfera y especialmente en las hojas, existen alrededor de 106-107 células/cm2 (108 células/g) de microorganismos, principalmente bacterias. Globalmente las plantas producen más de 100.000 productos naturales de bajo peso molecular, también conocidos como metabolitos secundarios. Esta diversidad tan rica resulta de un proceso evolutivo para la adquisición de defensa mejorada frente a los ataques de microorganismos, insectos y otros animales (Domingo et al., 2003).

(44)

2.4.1 Aceites esenciales

Los aceites esenciales (A.E.) son compuestos lipídicos muy olorosos obtenidos mediante la extracción de diferentes partes de plantas (flores, yemas, semillas, hojas, ramas, corteza, hierba, madrea, frutos, raíces, etc.) usando solventes orgánicos ó técnicas como la destilación. Estos aceites están compuestos por mezclas de ésteres, aldehídos, cetonas, terpenos, hidrocarburos cíclicos y alcoholes. Además son compuestos muy solubles en alcohol pero poco solubles en agua (Castillejos, 2005; Raybaudi et al., 2006).

Los A.E que contenían un aldehído o un fenol como principal componente fueron los más activos frente a bacterias del tracto respiratorio, seguido por los alcoholes y, con una menor acción antimicrobiana, los aceites que contenían mayoritariamente cetonas, ésteres o hidrocarburos. La actividad de un aceite esencial está relacionada con sus constituyentes principales (estos pueden constituir hasta un 85% del total, mientras que el resto se presentan como trazas), la configuración estructural y grupos funcionales de sus compuestos, y con posibles sinergias entre los compuestos. En consecuencia hay que diferenciar entre la mezcla total del aceite esencial de una planta y cada uno de sus componentes activos (Castillejos, 2005; Raybaudi et al., 2006).

La composición de los aceites esenciales puede variar mucho dependiendo de la variedad (propiedades determinadas genéticamente), la zona geográfica o climatología (medio ambiente), la edad de la planta, la parte utilizada en la extracción, y el método de secado y extracción del aceite (Castillejos, 2005).

2.4.1.1 Mecanismos de acción de los aceites esenciales

Figure

Figura 2. Resumen modificado de  técnicas y procedimientos generales de aislamiento, identificación y tipificación para Listeria spp

Figura 2.

Resumen modificado de técnicas y procedimientos generales de aislamiento, identificación y tipificación para Listeria spp p.28
Figura 3. Sistema metodológico para la identificación fenotípica de Listeria spp. modificado (Gasanov et al., 2004)

Figura 3.

Sistema metodológico para la identificación fenotípica de Listeria spp. modificado (Gasanov et al., 2004) p.31
Tabla 7 Tratamiento no isotérmico a 55ºC con A.E. de clavo al 0.01%, tiempo de muestro y diluciones a sembrar (en base 10) en medio BHIA

Tabla 7

Tratamiento no isotérmico a 55ºC con A.E. de clavo al 0.01%, tiempo de muestro y diluciones a sembrar (en base 10) en medio BHIA p.69
Tabla 12. Tratamiento no isotérmico a 60ºC con A.E. de clavo al 0.01%, tiempo de muestro y diluciones a sembrar (en base 10) en medio BHIA+NaCl

Tabla 12.

Tratamiento no isotérmico a 60ºC con A.E. de clavo al 0.01%, tiempo de muestro y diluciones a sembrar (en base 10) en medio BHIA+NaCl p.71
Tabla 13. Tratamiento no isotérmico a 60ºC con A.E. de tomillo  0.01% y 0.05%, tiempo de muestro y diluciones a sembrar (en base 10)

Tabla 13.

Tratamiento no isotérmico a 60ºC con A.E. de tomillo 0.01% y 0.05%, tiempo de muestro y diluciones a sembrar (en base 10) p.71
Figura 15.  Supervivencia de isotérmicas (55ºC) en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones

Figura 15.

Supervivencia de isotérmicas (55ºC) en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones p.73
Figura 16. Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones isotérmicas (60ºC) en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl

Figura 16.

Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones isotérmicas (60ºC) en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl p.75
Figura 17. Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones no isotérmicas (N.I) a 55ºC en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl

Figura 17.

Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones no isotérmicas (N.I) a 55ºC en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl p.79
Figura 18. Comportamiento de la población de L.monocytogenes CETC 4032 durante el perfil N.I a 55ºC en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl

Figura 18.

Comportamiento de la población de L.monocytogenes CETC 4032 durante el perfil N.I a 55ºC en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl p.79
Figura 19. Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones no isotérmicas (N.I) a 60ºC en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl

Figura 19.

Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones no isotérmicas (N.I) a 60ºC en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl p.82
Figura 20. Curva de supervivencia calentamiento no isotérmico a 55ºC en medio BHIA. L.monocytogenes CETC 4032 después de un

Figura 20.

Curva de supervivencia calentamiento no isotérmico a 55ºC en medio BHIA. L.monocytogenes CETC 4032 después de un p.86
Tabla 21. Integración de la letalidad alcanzada en un calentamiento no isotérmico

Tabla 21.

Integración de la letalidad alcanzada en un calentamiento no isotérmico p.86
Tabla 22. Integración de la letalidad alcanzada en un calentamiento no isotérmico

Tabla 22.

Integración de la letalidad alcanzada en un calentamiento no isotérmico p.87
Figura 21. Curva de supervivencia L.monocytogenes CETC 4032 después de un calentamiento no isotérmico a 55ºC en medio BHIA+NaCl

Figura 21.

Curva de supervivencia L.monocytogenes CETC 4032 después de un calentamiento no isotérmico a 55ºC en medio BHIA+NaCl p.87
Tabla 23. Integración de la letalidad alcanzada en un calentamiento no isotérmico 4032 en medio BHIA+NaCl

Tabla 23.

Integración de la letalidad alcanzada en un calentamiento no isotérmico 4032 en medio BHIA+NaCl p.88
Figura 23. Curva de supervivencia de un calentamiento no isotérmico a 60ºC en medio BHIA+NaCl.L.monocytogenes CETC 4032 después de

Figura 23.

Curva de supervivencia de un calentamiento no isotérmico a 60ºC en medio BHIA+NaCl.L.monocytogenes CETC 4032 después de p.89
Figura 24. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en medio BHIA, a partir de los resultados de esta investigación a con el modelo de Bigelow para tratamientos no isotérmicos y un aumento de temperatura de 3ºC/min

Figura 24.

Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en medio BHIA, a partir de los resultados de esta investigación a con el modelo de Bigelow para tratamientos no isotérmicos y un aumento de temperatura de 3ºC/min p.91
Figura 25. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en medio BHIA+NaCl, a partir de los resultados de esta investigación a con el modelo de Bigelow para tratamientos no isotérmicos y un aumento de temperatura de 3ºC/min

Figura 25.

Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en medio BHIA+NaCl, a partir de los resultados de esta investigación a con el modelo de Bigelow para tratamientos no isotérmicos y un aumento de temperatura de 3ºC/min p.92
Tabla 24. Parámetros de la distribución Weibull estimados a partir de las curvas de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento isotérmico a 55ºC y una concentración de 0,01% de aceite esencial de clavo

Tabla 24.

Parámetros de la distribución Weibull estimados a partir de las curvas de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento isotérmico a 55ºC y una concentración de 0,01% de aceite esencial de clavo p.96
Figura 27. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento isotérmico a 55ºC con 0,01% de aceite esencial de clavo en medio BHIA+NaCl

Figura 27.

Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento isotérmico a 55ºC con 0,01% de aceite esencial de clavo en medio BHIA+NaCl p.97
Tabla 25. Parámetros de la distribución Weibull estimados a partir de las curvas de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento isotérmico a 60ºC y una concentración de 0,01% de aceite esencial de clavo

Tabla 25.

Parámetros de la distribución Weibull estimados a partir de las curvas de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento isotérmico a 60ºC y una concentración de 0,01% de aceite esencial de clavo p.98
Figura 29. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento isotérmico a 60ºC con 0,01% de aceite esencial de clavo en medio BHIA+NaCl

Figura 29.

Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento isotérmico a 60ºC con 0,01% de aceite esencial de clavo en medio BHIA+NaCl p.99
Tabla 26. Valores de intervalos de confianza (IC 95%), D, Índice de correlación isotérmico a 55ºC sobre crema de calabacín.(ro) y R2 para Listeria monocytogenes CETC 4032 en un tratamiento no

Tabla 26.

Valores de intervalos de confianza (IC 95%), D, Índice de correlación isotérmico a 55ºC sobre crema de calabacín.(ro) y R2 para Listeria monocytogenes CETC 4032 en un tratamiento no p.102
Tabla 28. Valores Z obtenidos para tratamientos isotérmicos en crema de calabacín.

Tabla 28.

Valores Z obtenidos para tratamientos isotérmicos en crema de calabacín. p.103
Figura 33. Comparación entre las curvas de supervivencia de CETC 4032 en crema de calabacín e L.monocytogenes in vitro a 60ºC

Figura 33.

Comparación entre las curvas de supervivencia de CETC 4032 en crema de calabacín e L.monocytogenes in vitro a 60ºC p.105
Figura 32. Comparación entre las curvas de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en crema de calabacín e in vitro a 55ºC

Figura 32.

Comparación entre las curvas de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en crema de calabacín e in vitro a 55ºC p.105
Figura 34. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento isotérmico en crema de calabacín a 55ºC con 0,05% de aceite esencial de clavo en medio de recuperación no selectivo

Figura 34.

Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento isotérmico en crema de calabacín a 55ºC con 0,05% de aceite esencial de clavo en medio de recuperación no selectivo p.107
Figura 35. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento isotérmico en crema de calabacín a 55ºC con 0,05% de aceite esencial de clavo en medio de recuperación selectivo

Figura 35.

Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento isotérmico en crema de calabacín a 55ºC con 0,05% de aceite esencial de clavo en medio de recuperación selectivo p.107
Tabla 29. Parámetros de la distribución Weibull estimados a partir de las curvas de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en crema de calabacín expuesta a un tratamiento isotérmico a 55ºC  con una concentración de 0,05% de aceite esencial de clavo

Tabla 29.

Parámetros de la distribución Weibull estimados a partir de las curvas de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en crema de calabacín expuesta a un tratamiento isotérmico a 55ºC con una concentración de 0,05% de aceite esencial de clavo p.108
Tabla 30. Parámetros de la distribución Weibull estimados a partir de las curvas a un tratamiento isotérmico a 60ºC  con una concentración de 0,05% de aceite esencial de clavo

Tabla 30.

Parámetros de la distribución Weibull estimados a partir de las curvas a un tratamiento isotérmico a 60ºC con una concentración de 0,05% de aceite esencial de clavo p.109