NUEVAS ALTERNATIVAS EN LA PRODUCCIÓN DE LA VACUNA
ANTITETÁNICA
Fabio Eduardo Palacios Benavides
Microbiólogo Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ D.C
NUEVAS ALTERNATIVAS EN LA PRODUCCIÓN DE LA VACUNA
ANTITETÁNICA
Fabio Eduardo Palacios Benavides
Microbiólogo Industrial
_________________ _____________________
Ingrid Schuller Janeth Arias Palacios
NUEVAS ALTERNATIVAS EN LA PRODUCCIÓN DE LA VACUNA
ANTITETÁNICA
Fabio Eduardo Palacios Benavides
Microbiólogo Industrial
_________________ _____________________
Ivonne Gutiérrez RojasJaneth Arias Palacios
Nota de Advertencia
"La Universidad no se hace responsable
por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo
velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y
porque las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar
la verdad y la justicia".
A…mis padres que siempre me
AGRADECIMIENTOS
TABLA DE CONTENIDO
1. RESUMEN ... 1 2. INTRODUCCIÓN, JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .. 2 3. OBJETIVOS ... 4
3.1 Objetivo General 4
3.2 Objetivos Específicos 4
4. METODOLOGÍA ... 5 5. MARCO TEÓRICO ... 6
5.1 Clostridium tetani 6
5.2 Toxina tetánica 6
5.3 Tétanos 8
5.4 Toxoide tetánico 9
5.5 Vacuna antitetánica 10
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 11
6.1 Alternativas de producción 11
6.1.1. Fragmento antígeno funcional de la toxina tetánica 11
6.1.2 Co - expresión del fragmento C de la toxina tetánica en Escherichia coli y su evaluación como subunidad candidata para una vacuna antitetánica 13
6.2 Alternativas en formulación 15
6.2.2 Vacuna conjugada con cobalamina 15
6.2.3 Tecnología de encapsulación para la elaborar una vacuna antitetánica de
una sola dosis 18
6.2.4 Administración oral del toxoide tetánico usando biliosomas que inducen
una inmunidad sistémica y de mucosas 20
1. RESUMEN
2.INTRODUCCIÓN, JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL
PROBLEMA
El tétanos es una enfermedad producida por Clostridium tetani, produce esporas las cuales se encuentran en suelos y en el tracto digestivo de seres humanos y animales (1). Las esporas entran al cuerpo a través de heridas en la piel, donde germinan y producen la tetanoespasmina, una neurotoxina que viaja por lossistemas sanguíneo y linfático,hasta llegar al sistema nervioso central. La tetanoespasmina produce rigidez muscular generalizada,espasmos, fiebre, hipertensión, taquicardia y sudoración profusa. Los espasmos producidos en los músculos respiratoriosproducen insuficiencia respiratoria con un bloqueo neuromuscular (1), la cual si no se trata, conduce a la muerte por falla respiratoria. La inmunización contra el tétanos es dependiente de anticuerposya sea activa (vacuna antitetánica) o pasiva (inmunoglobulina antitetánica específica). Las vacunas se basan en el toxoide tetánico, neurotoxina modificada que induce la formación de la antitoxina protectora (2).
extremadamente raras (2). Además de disminuir la exposición del personal que fabrica la vacuna a contraer el tétanos, debido a que en el proceso tradicional se utiliza una cepa altamente toxigénica del microrganismo patógeno, Clostridium
tetani.
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo General
Documentar nuevas alternativas en la producción de la vacuna antitetánica frente a los métodos tradicionales, mediante revisión bibliográfica.
3.2 Objetivos Específicos
Identificar los diferentes procesos de fermentación, purificación y formulación utilizados para la elaboración del toxoide tetánico.
4. METODOLOGÍA
Se analizó y preparó la búsqueda de acuerdo a las palabras clave (toxoide tetánico, toxina tetánica, vacuna antitetánica, Clostridium tetani)que son los términos que más artículos arrojaron en lascuatro bases de datosconsultadas (Science Direct, Medline (Ebsco – Hobst), Medline (Proquest), Springerlink). Se usaron tanto en español, como en inglés y portugués, abarcando artículos desde el 2006 al 2012, para un número cercano a 20 artículos seleccionados. Se utilizaron varias mezclas de los cinco criterios de búsqueda, de la siguiente manera:
Clostridiumtetani AND tetanus vaccine 45 artículos, de los cuales se discriminaron 8, en la bases de datos Science Direct; para el parámetro Clostridiumtetani AND tetanus toxoid arrojó 54 artículos de los cuales se escogieron 6, mientras que para los parámetros Tetanus AND tetanus vaccine en Medline (Ebsco – Host) arrojó una búsqueda de 23 artículos, de los cuales se escogieron 1 artículo.
Para el criterio de la búsqueda Tetanus toxoid AND Clostridium tetani en la base de datos Medline (proquest) se escogieron 12 artículos de los cuales se seleccionaron 3,y paraTetanus toxoid (Science Direct) se escogieron 21 artículos de los cuales se escogieron 2
5. MARCO TEÓRICO
5.1 Clostridium tetani
Clostridium tetani es una bacteria Gram positiva anaerobia estricta, de forma
bacilar,formadora de esporas altamente resistentes las cuales requieren de autoclavado para su destrucción, exposición prolongada al yodo, peróxido de hidrógeno, formalina o glutaraldehído (9). Clostridium tetani es un microorganismo de amplia distribución en suelos de zonas cálidas y húmedas a nivel mundial, presente en el tracto gastrointestinal de seres humanos, animales, y heces.Produce una neurotoxoinfección aguda y altamente mortal con tasas cercanas entre 20-50% (8). La dosis letal LD50 en humanos es de2.5ng/kg (11).En cultivos realizados a partir de heridas, ha sido posible recuperar Clostridium
tetanien aproximadamente un 30% (10).
Al contrario de Clostridium tetani, quees sensible al calor y altas concentraciones de oxígeno, las esporas de Clostridium tetanison resistentes al calor y a tensiones ambientales ricas en oxígeno. Estas germinan en el interior del cuerpo en células vegetativas, las cuales secretan la tetanoespasmina (TeNT) y tetanolisina (TLY) (12).
5.2 Toxina tetánica
Clostridium tetani, produce una exotoxina proteica,tetanoespasmina, que afecta al
Ala456por proteasas de Clostridium o por proteasas exógenas como las encontradas naturalmente en el intestino (13).
La neurotoxina activa se compone de dos cadenas conectadas por un puente disulfuro. La cadena pesada (Cadena H, 100kDa) es responsable de la unión a las células neuronales y de la translocación de la cadena liviana (Cadena L – 50KDa) en la neurona, siendo la parte catalítica de las neurotoxinas; contiene el motivo zinc enlazante compuesto de dos anillos imidazólicos His-Glu-X-X-d-His con un enlace de hidrógeno unido a una molécula de ácido glutámico, en el cual, el átomo de Zn es coordinado por otra molécula de ácido glutámico conservada en todas las neurotoxinas clostridiales. El residuo Glu coordina a la molécula de agua directamente implicada en la hidrólisis proteolítica (13).Las células se lisan liberando la toxina, por lo cual la proteasa de Clostridium tetani rompe un enlace peptídico y forma el puente disulfuro del dominio N, obteniéndose dos cadenas de polipéptidos, también unidas por enlaces no covalentes, unidas en formas de muescas (12)
Estudios cristalográficos han revelado la esctructura cristalográfica del dominio C-terminal de la tetanoespasmina, compuesta de tres distintos dominios: una cadena
L que contiene hélices α y hebras que incluyen un motivo de unión zinc
catalítico; el extremo N-terminal el cual es parte de la cadena H (Hn), que forma
dos hélices α usualmente largas altamente retorcidas y el dominio C-terminal de la cadena H (Hc), conformada por dos subdominios involucrados en el reconocimiento del receptor (13).
Estos subdominios producen una unión de alta afinidad,un subdominio se une a una glicoproteína, mientras que el otro subdominio se une a los polisialogangliósidos de membrana (13)
La tetanoespasminalleva a cabo la hidrólisisde la Proteína de Membrana Asociada a Vesículas (PMAV/sinaptobrevina), equipadas con ATPasas de tipo vacuolar, las cuales crean un gradiente de protones,que conduce específicamente el transporte de las vesículas,facilitando la exocitosis celular en conjunto con una docena de proteínas reguladoras llamadas SNARE.Las membranas vesiculares se fusionan con la membrana plasmática, y difunden su contenido en el medio circundante (11).La tetanoespasmina bloquea la neuroexocitosis e impide la liberación de neurotransmisores como el ácido - - aminobutírico (GABA) en las sinapsis interneuronales, al tiempo que bloquea la liberación de la acetilcolina en las sinapsis neuromusculares.
5.3Tétanos
Las esporas de Clostridium tetani entran al cuerpo a través de rupturas cutáneas ybajo condiciones anaeróbicas favorables como heridas sucias y necróticas produce tetanoespasmina(1), esta afecta el sistema nervioso central, alterando la sinapsis de las neuronas motoras del sistema nervioso central (SNC), falla la coordinación de los reflejos motores y la contracción muscular, produciéndose los espasmos tetánicos (5).
sudoración profusa (9).El tétanos también puede presentarse como una complicación asociada a quemaduras, infecciones puerperales, infecciones in situ asociadas a cirugías y muñones remanentes del cordón umbilical en tétanos neonatal. Clínicamente puede presentarse en cuatro formas: generalizada, localizada, cefálica y neonatal. El tétanos produjo en 2009 cerca de 257 000muertes anuales de neonatos en países en desarrollo (11).
5.4 Toxoide tetánico
El proceso convencional para la elaboración de la vacuna antitetánica usando el toxoide tetánico, comprende cepas toxigénicas de C. tetani, en un medio líquido que favorece la producción de la toxina y su posterior extracción mediante ultrafiltración en membranas, posteriormente, se inactiva con formaldehídoy fases subsiguientes de purificación yesterilización.Para aumentar su inmunogenicidad se adsorbe el toxoide sobre sales de aluminio o calcio, precipitándose tanto con sulfato de amonio, como por precipitación alcohólica, adsorción y desorción en gel.Se administra intramuscularmente,induciendo la formación de una antitoxina protectora. Su potencia se expresa en unidades internacionales (UI) de protección determinada en cobayos o ratones inmunizados expuestos a la toxina tetánica (2).
5.5 Vacuna antitetánica
La protección contra el tétanos es dependiente de anticuerpos y sólo puede lograrse mediante inmunización activa (vacuna) o pasiva (inmunoglobulina antitetánica específica).La vacuna combinada (DPT), destinada especialmente para niños menores de un año, fue incluida en los programas de vacunación de larga duración de la Organización Mundial De La Salud (OMS) desde la concepción de estos programas en 1974 (2). Sin embargo, estudios de inmunogenicidad determinaron un efecto tiempo decreciente; por lo que expertos recomendaron la administración de dosis posteriores en un periodo de 10 años.
Actualmente la OMS recomienda en su calendario de vacunación infantil 5 dosis: serie primaria de 3 dosis de DTP3 (DTwP o DTaP) administrada en el periodo de lactancia (niños menores de un año), se complementa con una dosis de refuerzo (entre los 4 y los 7 años) y otra durante la adolescencia (entre los 12 y 15 años)
(2). Otro esquema de vacunación propuesto se detalla a
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Dentro de los métodos de producción alternosse encuentran la microencapsulación (permiteel empaquetamiento demúltiples antígenos mediante el uso de proteínas recombinantes), péptidos sintéticos, ADN recombinante, uso de esporas bacterianas como vehículos para el transporte y liberación de la vacuna, la co-expresión de fragmentos de la toxina tetánica en Escherichia
colijunto con tiorredoxina y nuevos adyuvantes altamente compatibles con el antígeno, algunos de estos métodos incluyen: conjugados con el toxoide, fragmentos antígeno funcionales (FAF) a partir de la toxina tetánica, microencapsulación con ácido poliláctico (PLA)junto al toxoide tetánico;tecnologías de producción en estudio y desarrollo de la vacuna antitetánica cuya finalidad eslaobtención de un producto de liberaciónprolongada y controlada del toxoide, generando el desarrollo de una respuesta inmune efectiva, productora de anticuerpos frente al tétanos.Sin embargo, el desarrollo de estas alternativas promisorias, en muchas de ellas como los FAF debe determinarse la estabilidad del compuesto en periodos prolongados de tiempo, además que aún no son alternativas que compitan en costo – beneficio con la vacunación tradicional aún empleada.
6.1 Alternativas de producción
6.1.1. Fragmento antígeno funcional de la toxina tetánica
Matsuda obtuvo ocho secuencias de aminoácidos, de las cuales seleccionó la secuencia obtenida al separar un enlace peptídico que conectaba dos secuencias parciales de aminoacidos, unidas a dos residuos de cisteína participantes en la formación del puente disulfuro,presente en el extremo N- terminal de la toxina, por lo cual el puente disulfurofue clivado en conjunto con los enlaces no covalentes entre los grupos unidos por el puente disulfuro de la toxina tetánica (17).
Para ello usó la cepa de Clostridium tetaniHarvard H47 subcepa Biken– ATCC 10779, una cepa que tiene la habilidad de producir altas concentraciones de toxina tetánica.Matsuda (2002) usó la subcepa Biken tanto para la obtención de la toxina tetánica, como para la extracción del plásmido ADN codificante.
Transformóel plásmido digiriéndolo con las enzimas de restricción StuI-Bsp HI,obteniendo un fragmento de 2.7kb codificante para FAF, este fragmento se insertó y se ligó al vector pSN508de Escherichia colipara generar un vector de expresión recombinante, el cual se insertó en E. coli CSH26 transformando esta cepa, en una cepa productora de una gran cantidad de FAF, el cual posteriormente fue purificado (17).
Matsuda obtuvo el FAF, una molécula con un peso entre 90 -110 KDa, obteniendo una inmunopotencia sustancialmente similar a la de la toxina tetánica (1±0.2) obtenida en un ensayo en paralelo entre la vacuna con FAF y la vacuna convencional conel toxoide tetánico, sometiendo ambas vacunastanto a una toxina con un LD50 conocido, así como la determinaciónde la dosis letal mínima en ratones OF1(17).
vacuna convencional, la inmunopotencia fue evaluada en ratones según un método por puntos si: el animal muere en el primer día obtiene 0 puntos, si el animal muere en el segundo día obtiene 1 punto, si el animal muere al tercer día obtiene 2 puntos, si el animal muere o exhibe síntomas serios (convulsión tónica, dificultad para caminar, angustia respiratoria) entre el 4to y 7mo día obtiene 3 puntos, si el animal sobrevive durante una semana con síntomas leves (parálisis local de los músculos adbominales en el sitio opuesto a la inyección) observando al animal colgado de su cola, obtiene 4 puntos y finalmente si animal sobrevive durante una semana sin síntomas obtiene 8 puntos (17)
Las observaciones de los ensayos intradérmicos en conejillos de indias, realizado porMatsuda(2002)durantelas 4 semanas después de la inmunización en el sitio de la inyección,evidenciaron la formación de eritemas y el endurecimiento o necrosis del tejido cutáneo. En cuanto al tratamiento con FAF no obtuvoreacciones intradérmicas adversaso estas fueron notablemente ligeras en comparación con los conejillos de indias a los que se les administró la vacuna convencional (17)
El trabajo de Matsuda provee una vacuna con un solo antígeno en el cual el FAF es el ingrediente activo, tanto como preparación absorbente, u en forma de liofilizado o en forma de vacuna combinada junto a DPT, DT u otros antígenos vacunales, por lo que la vacuna está lista para ser empaquetada en ampolletas o viales, ser distribuida donde sea requerida con efectos adversos reducidos y manteniendo una inmunopotencia similar a la dela vacuna antitetánica convencional.
vacuna contra el tétanos. Yu et al. (2011), construyeron un gen sintético codificante para THc, altamente expresado en Escherichia coli coexpresando thiorredoxina (Trx) (18).
Elaboraron el gen THc sintético (1296 pb), a partir de tres bloques con oligonucleótidos sintéticos por PCR de fusión, codificante de 432 aminoácidos (884 -1315, ~50kDa) de la porción C-terminal, de la cadena pesada de la toxina tetánica. Los bloques fueron subclonados en plásmidos pTIG-Trx obteniendo el plásmido recombinante pTIG-Trx-THc, en el cual se redujo el contenido de A+T (52%), contiene codones sinónimos frecuentemente empleados en E. coli BL21. Para identificar el peso molecular y la reacción con anticuerpos específicos para la toxina tetánica, usaron Western blots, obtuvieron un alto nivel de expresión altamente soluble (15-30% de la proteína celular) (18).
Purificaron la subunidad THc, a partir de la pasta celular de E. coli BL21 por cromatografías tanto de afinidad, la cual capturó eficientemente el fragmento THc y el producto de la fracción, conteniendo aproximadamente el 70% de esta en SDS –PAGE; como de intercambio catiónico, que capturó eficientemente la proteína THc y removió los contaminantes asociados, la cual en SDS – PAGE mostró aproximadamente una pureza del 98% para la proteína, obteniendo una banda de (50kDa) inmunorreactiva al análisis Western blot (18).
dosis 10000 veces del 50% de la dosis letal (LD50) de la toxina tetánica biológicamente activa 3 semanas después de la última inyección (18).
Posteriormente re-enfrentaron los ratones con dos o tres dosis de la neurotoxina, mucho más altas (100000 LD50), sin muertes de ningún animal o de síntomas de envenenamiento, las dos dosis con el toxoide tetánico proveen protección parcial en comparación con la subunidad THc. En el suero obtenido del ELISA usado para el ensayo in vivo, los títulos de anticuerpos neutralizadores aumentaron con el número y dosis de vacunaciones, obteniendo títulos ≥0.β5UI/ml, indicando que
una cantidad mol equivalente de la proteína THc, induce una respuesta humoral fuerte en comparación con el toxoide tetánico, al ofrecer una potente protección contra altas dosis de la toxina tetánica; posteriormente al llevar a cabo el ensayo en fase sólida, el suero anti THc inhibió la unión del THc al gangliósido GT1b, provocando una respuesta inmunológica contra la toxina tetánica, la proteína THc expresada y purificada mantiene su conformación funcional activa siendo capaz de ser desarrollada como vacuna candidata para la prevención del tétanos (18).
La vacuna elaborada redujo el tiempo de fabricación en comparación con la vacuna convencional y simplificó el proceso técnico asociado, ya que una subunidad recombinante elimina la necesidad del cultivo de Clostridium tetani o la purificación de la toxina tetánica, y mantiene la unión al gangliósido, e indujo respuestas inmunes protectivas contra la toxina tetánica, seguida de inmunización parenteral en ratones, lo cual constituye una opción de uso en humanos con menores dosis de refuerzo asociadas
6.2Alternativas en formulación
administraciónoral del toxoide tetánico, aprovechando el mecanismo de administración de la cobalamina y/o sus derivados (adenosilcobalamina, cianocobalamina, aquocobalamina, glutationilcobalamina, hidroxicobalamina, cianocobalamina carbanálido, 5-ο-metilbencilcobalamina, desdimetilmonoetilamida y análogos metilamida de todos los compuestos anteriormente nombrados), esta ingresa por via oral, llega al estómago donde el factor intrínseco (una proteína necesaria para la absorción de la cobalamina), transporta junto con la cubilinala cobalamina, al ileón proximal del intestino y posteriormente; el factor intrínseco, transporta la cobalamina al torrente sanguíneo.Los receptores celulares mediadores de la endocitosis internalizan la cobalamina procedente del torrente sanguíneo, donde se convierte en cobalamina biodisponible. La vacuna conjugadabuscasuperar losdos obstáculosde la entregaentérica del medicamento: protegerlasustancia biológicamente activade la proteólisisgastrointestinal y evitar tanto la absorción comolatoma celular de la cobalamina por los enterocitos en el lumen del intestino(19).
Doyle et al. (2010) evaluaron la estabilidad de las cadenas liviana y pesada del toxoide tetánico por modelado molecular, en el cual la respuesta inmune no se vio afectada indicando la estabilidad de la proteína, por la conservación de la geometría y plegamiento nativo, específico para las cadenas laterales de lisina, en la formación del bioconjugado con cobalamina y garantiza su estabilidad condiciones extremas, concluyendo que estructura α/ de la cadena liviana se
mantiene estable, y considerando por medio de la determinación cristalográfica, los residuos de lisina superficie accesibles, como el único grupo significativo de residuos de lisina en el diseño del bioconjugado (19).
Como modeloin vitrose utilizó la línea celular BeWo coriocarcinoma humana, en la cual, la concentración del conjugado se determinó por Bradford, desarrollando posteriormente experimentos de microscopía confocal y un ELISA, para determinar la actividad biológica del bioconjugado usando diferentes concentraciones de suero monoclonal de ratón anti toxoide tetánico obteniendo una curva de calibración lineal hasta una concentración de 10L/ml del toxoide tetánico. El ELISA control y el ELISA del bioconjugado,se compararon mediante un ensayo con Bradford para cada concentración de la proteína, este número se comparó con el Bradford elaborado para el toxoide tetánico de partida, donde el proporción de floculación Lf en µg dio 0.32, siendo más baja la proporción para los bioconjugados que el material de inicio del toxoide tetánico; ambos se expusieron a la unión con el factor intrínseco por espectroscopía de absorción electrónica, indicando un incremento en la absorción (19).
Los estudios realizados para evaluar la actividad in vitro de la cobalamina concluyeron que el bioconjugado no interrumpe el reconocimiento de la cobalamina, por otra parte, el factor intrínseco es crucial para que el toxoide tetánico efectivamente llegue al torrente sanguíneo. Las células humanas con receptores de cubilina son las encargadas de internalizar el conjugado cobalamina
– toxoide tetánico, expresado en el tracto gastrointestinal, tomado por las células epiteliales del ileón (19)
Esta alternativa ofrece numerosas formas de administración de la vacuna antitetánica, de una manera segura, confiriendo inmunogenicidad, al aprovechar el mecanismo de administración de cobalamina, por lo que la hace una alternativa paraserempleada en países en desarrollo y en especial en poblaciones como niños, bajo formas como chicles, jarabes, entre otras.
6.2.3Tecnología de encapsulación para la elaborar una vacuna
antitetánica de una sola dosis
Las sales de aluminioson uno de los pocos adyuvantes usados en vacunas capaces de generar una respuesta inmune fuerte, pero con limitada antígeno - compatibilidad e incapaz de generar la inducción de respuestas inmunológicas en las células T citotóxicas en infecciones de origen viral y de origen parasitario (4).
Es por esto que el uso de micropartículas ha despertado un interés creciente, debido a su habilidad potencial de co-encapsular antígenos múltiples, inducir tanto respuestas imnunes contra antígenos inmunológicamente débiles,como en lascélulas T citotóxicas, respuestas lo suficientemente estables para ser administrada oral, nasal o parenteralmente. En la formulación de estas vacunas se utiliza el método de evaporación de múltiples solventesen emulsión, basado en ácido poliláctico (PLA) biodegradable,el cual ha sido usado extensamente en productos farmaceúticos comerciales de liberación atenuada (4).
solventes orgánicos y la presencia de interfases acuosas/orgánicas que pueden resultar en la degradación y perdida de la inmunogenicidad del toxoide tetánico (4)
Las micropartículas actúan como adyuvantes sintéticos, estimuladores de la inmunidad de células dendríticas y las células T, ademáspueden bioconjugarse con señales moleculares específicas de peligro.La formulación de sales minerales de aluminio en conjunto con polímeros absorben eltoxoide tetánico y lo liberan en forma de ráfaga (superior al 80% de la carga de la formulación), potenciando una respuesta inmune superor a bajas dosis (0.1 Lf) en comparación a la causada por el antígeno soluble (10Lf) (4).
La vacuna de una sola dosis antitetánica, fue manufacturada usando el proceso NanoMixTM,en el cual utiliza dióxido de carbono supercrítico (scCO2), para encapsular a alta potencia bajas dosis de medicamentos, en matrices de micropartículas producidas a temperatura ambiente y libre de solventes. Este proceso aprovecha el hecho que el scCO2 en polímeros como el PLA seincorpore a esteproduciendola liquefacción del PLA. Bajo estas condiciones el toxoide tetánico liofilizado se mezcla con el polímero en estado líquido y esta mezcla al pasar a través de un atomizador de baja presión, haceque el CO2 retorne a su estado gaseoso, solidificando el polímero en gotas que contienen el toxoide tetánico, las microparticulas injectables del polímero son producidas y pueden ser administradas por vía subcutánea o intra - muscular (4)
los 42 días para el tratamiento con el toxoide tetánico en micropartículas y con sales de aluminio, con un ligero decrecimiento a los 70 días y 112 días con títulos mejorados a los 154 días, los títulos inducidos para la anti toxina tetánica IgG se incrementaron sucesivamente y significativamente después de cada sangrado. La formulación de microparticulas del toxoide tetánico con la dosis mas alta del toxoide en la formulación, fue capaz de inducir titulos similares o mayores a los titulos anti toxoide tetánico IgG a los inducidos a la formulación del toxoide con sales de aluminio como adyuvante, de las cuales siguieron dos inyecciones de refuerzo a los días 28 y 56 (4).
De esta manera el proceso NanoMixTMes un proceso capaz de encapsular los antígenos de la vacuna en micropartículas de polímero a una dosis elevada, manteniendo la antigenicidad y bioactividad, la liberación prolongada del antígeno es mantenida y la vacuna puede ser liofilizada, lista para ser reconstituida antes de ser aplicada en programas de inmunizacion, mantiene un periodo de vida útil mayor a la vacuna convencional, por lo cual no es necesario mantener cadenas de frío desde que se adquiere la vacuna hasta su administración, abarantando costos en los programas nacionales de inmunización.
6.2.4 Administración oral del toxoide tetánico usando biliosomas que
inducen una inmunidad sistémica y de mucosas
Los antígenos proteicos administrados por vía oral son expuestos a un ambiente hostil en el tracto gastrointestinal por enzimas digestivas, y rangos de pH 1 - 7.5, son empaquetados en vesículas surfactantes no iónicas protectoras, formuladas con sales biliares (biliosomas), contra la degradación que permiten la administración del antígeno en las células responsables de generar respuestas inmunes locales y sistémicas (20).
L ácido láctico-co-glicólico (PLGA). Conformados por un sistema de vesículas bicapa lipídicas, incorpora sales biliares y atrapa un espacio acuoso donde candidatos a vacunas solubles pueden ser atrapados, e inducir una respuesta inmune significativa después de la administración oral. Los biliosomas tienen una alta resistencia a la disrupción de las sales biliares, por lo cual tienen propiedades adyuvantes inherentes, han demostrado inducir respuestas sistémicas y de mucosas caracterizadas por anticuerpos IgG e IgA respectivamente en las células del intestino (20).
Se usaron ratones inmunizados oralmente con el toxoide tetánico (40 o 200 µg dosis/ratón, 4 dosis en total). La dosis alta del toxoide tetánico encapsulado de 200 µg indujo en un estudio de tres semanas, los mismos niveles de IgG1 al observado con el toxoide tetánico subcutáneo sin encapsulación a una dosis <50 µg. Todas las dosis tanto las atrapadas en biliosomas como la no atrapadas comparadas, causaron un aumento en las células positivas para IgA en el intestino delgado, principalmente en los 15 cm iniciales (20).
la proteína contenida en ellos del ambiente hostil del estómago y ser capaces de producir la IgA (20).
Demostrando que el toxoide tetánico es capaz de inducir respuesta en los linfocitos Th2 por la producción de IgG1, inducidos únicamente con a 200µg/dosis y no a 40µg/dosis. El biliosoma no produjo anticuerpos IgG2a contra el toxoide tetánico, pero si induce la respuesta de linfocitos Th2, siguiendo dos diferentes vías para producir IgA, dependiente de interleucinas y factores como el TGF- ,
mediadas por la producción de IFN- en linfocitos Th1. Esta alternativa surge
como respuesta a la administración parenteral en la cual se remplace el uso de las agujas y pueda disminuir los casos de mortalidad asociados a tétanos neonatal y materno en países en desarrollo, siendo una forma de transmitir inmunidad pasiva de la madre al niño por nacer (20).
protección frente a la toxina tetánica para unos sea mejor que para otros, garantizando estándares máximos para todos los sujetos de vacunación y así puedan disminuirse la mortalidad y morbilidad asociadas al tétanos.
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