Determinación de los compuestos volátiles en pentacalia vaccinioides, su estudio antioxidante y antimicrobiano

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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE QUIMICA

DETERMINACIÓN DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES EN Pentacalia

vaccinioides, SU ESTUDIO ANTIOXIDANTE Y ANTIMICROBIANO

MARIA ANGELICA CASTELLANOS GÓMEZ

TESIS

Presentado como requisito parcial Para optar al título en

MAESTRIA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

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NOTA DE ADVENTENCIA

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DETERMINACIÓN DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES EN LA ESPECIE

Pentacalia vaccinioides, SU ESTUDIO ANTIOXIDANTE Y ANTIMICROBIANO

MARIA ANGELICA CASTELLANOS

--- --- Concepción Puerta Bulla PhD Manuel Antonio Franco MD PhD

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AGRADECIMIENTOS

A la Pontificia Universidad Javeriana, sus directivos y profesores de quienes siempre tuve apoyo para culminar este trabajo.

Al profesor Luis Enrique Cuca por sus valiosos comentarios y sugerencias

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1 RESUMEN

TITULO: “DETERMINACIÓN DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES EN

Pentacalia vaccinioides, SU ESTUDIO ANTIOXIDANTE Y ANTIMICROBIANO”*

Autor: María Angélica Castellanos**

El trabajo realizado con la Pentacalia vaccinioides fue complemento al “Estudio Químico y Antimicrobiano de Plantas Autóctonas de Páramos Colombianos”, realizado por investigadores de la Universidad Javeriana. Este trabajo contribuyó al conocimiento de los compuestos volátiles de la Pentacalia así como también al fortalecimiento de la línea de aceites esenciales (AEs) de la maestría en Ciencias Biológicas. En el desarrollo se emplearon diferentes técnicas de extracción para aislar los metabolitos secundarios volátiles de las hojas y flores de la Pentacalia vaccinioides: Destilación y extracción simultanea (DES), hidrodestilación HD, Arrastre con vapor (AV) y microextracción en fase sólida (MEFS). El material vegetal se recolectó en el Parque Natural Matarredonda ubicado en el Páramo del Verjón, Departamento de Cundinamarca, se trabajó con material fresco y seco. La determinación (Índice de Kováts, Librerías NIST y Wiley) y cuantificación (Tetradecano) de las sustancias se realizó en un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas; en este proceso se determinaron más de 104 compuestos, que para efectos de comparación entre metodologías solo se tomaron los compuestos con áreas superiores al 1%. Los principales metabolitos secundarios volátiles determinados en los aceites esenciales (AEs) de la P. vaccinioides, empleando diferentes sistemas de extracción fueron el 1S-α-pineno 11.40%, β-felandreno 7.73%, β-pineno 7.63%, fenol 7,51%, 4-terpineol 4.33%, γ -terpineno 3.83%, β-tujeno 3.79%, α-nerolidol 3.78%, limoneno 3.24%. Se determinó que el mejor método para la extracción de los hidrocarburos monoterpénicos fue la microextracción en fase sólida seguida del sistema de extracción DES. La mayor cantidad de terpenoides se obtuvo empleando el sistema de arrastre con vapor en material seco, así como también se puede concluir que el sistema de extracción MEFS empleado no extrae monoterpenos oxigenados, sesquiterpenos oxigenados ni compuestos tipo fenólicos. Finalmente el método que representó la mayor parte de los compuestos y el de mayor extracción fue el método de arrastre con vapor (AV) con material vegetal húmedo. Por el método ABTS los AEs no presentaron actividad antioxidante similar al trolox, comparativamente se requerirían 462 kg de AE x cada mg de trolox.

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2

PALABRAS CLAVES: Pentacalia vaccinioides, compuestos volátiles, destilación-extracción simultánea, hidrodestilación, aceite esencial (AE), terpenos.

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TABLA DE CONTENIDO

Pág.

Resumen 1

Lista de Figuras 6

Lista de Tablas 8

Lista de abreviaturas y acrónimos 10

Introducción 11

1. ESTADO ACTUAL DEL TEMA Y MARCO CONCENTUAL 14 1.1. Generalidades de la familia de las pentacalias 14

1.1.1. Pentacalias en Colombia 15

1.1.2. Importancia y usos de las pentacalias 15 1.1.3. Estudios químicos realizados en el género pentacalia 16 1.2. Descripción de la especie Pentacalia vacciniodes 16 1.2.1. Clasificación, taxonomía y localización 17

1.3. Análisis cienciométrico 18

1.3.1. Pentacalias y P. vaccinioides 18

1.3.2. Aceites esenciales 19

1.4. Compuestos volátiles de los metabolitos secundarios de

las plantas 21

1.4.1. Rutas biosintéticas de los compuestos volátiles 22

1.5. Aceites esenciales 25

1.5.1. Importancia en las plantas 25

1.5.2. Fuente y ubicación 26

1.5.3. Clasificación y composición 27

1.5.4. Terpenos 27

1.6. Métodos de extracción 29

1.6.1 Métodos directos 30

1.6.2 Métodos indirectos tradicionales 31

1.6.2.1 Destilación 31

1.6.2.1.1. Destilación por arrastre con vapor 31

1.6.2.1.2. Hidrodestilación 32

1.6.1.1.3. Hidroextracción 32

1.6.1.1.4. Fermentación y subsecuente

destilación con vapor 32

1.6.2.2 Extracción con solventes 32

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4

1.6.2.6 Extracción asistida por microondas 36 1.6.2.7 Extracción asistida por ultrasonido 36 1.6.2.8 Extracción con fluidos en condiciones

subcríticas y supercríticas 36

1.6.2.9 Microextracción en fase sólida (MEFS) 37 1.6.2.9.1 Tipos de fibras en MEFS 39 1.6.2.9.2 Variables que afectan el proceso MEFS 39 1.7. Análisis realizados a los aceites esenciales 39 1.7.1. Características Organolépticas 40

1.7.1.1. Color 40

1.7.1.2. Olor 40

1.7.2. Características Fisicoquímicas 40

1.7.2.1. Solubilidad 40

1.7.2.2. Densidad 41

1.7.2.3. Rotación óptica 41

1.7.2.4. Índice de refracción 41

1.7.2.5. Punto de ebullición 42

1.7.3. Técnicas Instrumentales 42

1.7.3.1. Cromatografía en capa fina (CCF) 42 1.7.3.2. Cromatografía de columna abierta (CC) 43 1.7.3.3. Cromatografía de gases (CG) 43 1.7.3.4. Cromatografía de gases acoplada a

espectrometría de masas (CG-EM) 44

1.8. Propiedades biológicas de los aceites esenciales 44

1.8.1. Propiedades antioxidantes 44

1.8.1.1. Métodos para evaluar la capacidad

antioxidante 47

1.8.2. Propiedades antimicrobianas 49

2. OBJETIVOS 52

2.1. Objetivo general 52

2.2. Objetivos específicos 52

3. DISEÑO METODOLOGÍCO 53

3.1. Material vegetal 53

3.2. Materiales, reactivos y equipos 53

3.3. Métodos de obtención del AE y sus compuestos volátiles 54

3.3.1. Parámetros experimentales 54

3.3.2. Equipos 55

3.4. Caracterización química del aceite esencial 56

(11)

5

3.4.2. Análisis instrumental 57

3.4.2.1. Identificación de los aceites esenciales 57 3.4.2.2. Cuantificación de los compuestos

mayoritarios 58

3.5. Determinación de la actividad antioxidante 58 3.6. Determinación de la actividad antimicrobiana 60

3.6.1.Concentración crítica (CC) 60

4. RESULTADOS Y ANÁLISIS 62

4.1. Pruebas organolépticas 62

4.2. Pruebas fisicoquímicas 62

4.3. Rendimientos de los AE 63

4.4. Determinación de los aceites esenciales 64

4.4.1 Análisis estadístico 66

4.5. Interpretación de los espectros de masas obtenidos de

los AEs P. vaccinioides por CG-EM 68

4.6. Actividad antioxidante 74

4.6.1. Análisis estadístico 78

4.7. Actividad antimicrobiana 80

4.7.1. Análisis estadístico 87

5. CONCLUSIONES 89

6. RECOMENDACIONES 91

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6

LISTA DE FIGURAS

Pág. Figura No. 1. Detalle de la inflorescencia de las Asteráceas 14 Figura No. 2. Pentacalia vaccinioides Parque Ecológico Matarredonda 16 Figura No. 3. Pentacalia vaccinioides. Taxonomía 17 Figura No. 4. Países con mayor productividad científica en estudios

sobre Aceites Esenciales 19

Figura No. 5. Países Latinoamericanos con mayor productividad científica en estudios sobre Aceites Esenciales 20 Figura No. 6. Ruta biosintética de los ácidos grasos/lipoxigenasa 23 Figura No. 7. Ruta biosintética del mevalonato/no mevalonato 24 Figura No. 8. Ruta biosintética del ácido shikímico 25 Figura No. 9. Tricomas de la superficie abaxial de una hoja de Menta 26 Figura No. 10. Estructuras Químicas de algunos compuestos presentes

en los AE 29

Figura No. 11. Varias Modificaciones del aparato DES 35 Figura No. 12. Diagrama de fase del dióxido de carbono 37

Figura No. 13. Sistema de Extracción MEFS 38

Figura No. 14. Mecanismo de captura de radicales libres por parte de estructuras fenólicas. R* es un radical libre orgánico tipo peróxido ROO*

46

Figura No. 15. Equipo DES Likens-Nickerson 55

Figura No. 16. Equipo AV tipo Clevenger 55

Figura No. 17. Equipo HD tipo Clevenger 56

Figura No. 18. Esquema de los halos de inhibición formados por el

zzzzzzzzzzzzzzzzzmétodo de difusión en gel 61

Figura No. 19. Gráfica Log concentración vs longitud de la corona (X2) 62 Figura No. 20. Cromatograma AE, DESH de las hojas P. vaccinioides 64 Figura No. 21. Distribución de las principales familias de los compuestos

en los AEs de la P. vaccinioides, obtenidos por diferentes métodos de extracción

66

Figura No. 22. Espectro de masas del α-Pineno 69 Figura No. 23. Posibles rutas de fragmentación del α-Pineno 70 Figura No. 24. Espectro de masas del β-Felandreno 71 Figura No. 25. Posibles rutas de fragmentación del β-Felandreno 72 Figura No. 26. Espectro de masas del β-Pineno 73 Figura No. 27. Posibles rutas de fragmentación del β-Pineno 74

Figura No. 28. Curva de Calibración Trolox 75

Figura No. 29. Curva de calibración AE AVV 76

Figura No. 30. Curva de calibración AE DESV 76

Figura No. 31. Actividad antiradical IC50 (mg Trolox/Kg AE) frente al

trolox 77

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7 frente a E. coli

Figura No. 33. Halos de inhibición (mm) concentración vs diámetros, AE

DESS B. subtilis 81

Figura No. 34. Diámetros halos de inhibición AE frente a B. subtilis 82 Figura No. 35. Diámetros halos de inhibición AE frente a S. aureus 83 Figura No. 36. Log. Concentración vs longitud de la corona (X2) para el

método DESS frente a B. subtilis 84

Figura No. 37. Log. Concentración vs longitud de la corona (X2) para el

método HDS frente a B. subtilis 84

Figura No. 38. Log. Concentración vs longitud de la corona (X2) para el

método DESS frente a S. aureus 85

Figura No. 39. Log. Concentración vs longitud de la corona (X2) para el

método HDS frente a S. aureus 85

Figura No. 40. Log. Concentración vs longitud de la corona (X2) para el

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8

LISTA DE TABLAS

Pág. Tabla No. 1. Países relacionados con estudios en pentacalias 19 Tabla No. 2. Números de artículos por áreas de investigación 20 Tabla No. 3. Principales instituciones y organizaciones

colombianas relacionadas con la Investigación en AE

21

Tabla No. 4. Clasificación de algunos AE de Acuerdo a con su

Composición 28

Tabla No. 5. Nomenclatura de los procesos realizados para la

extracción del AE. 54

Tabla No. 6. Parámetros experimentales empleados en los diferentes procesos de extracción 54

Tabla No. 7. Condiciones cromatográficas 57

Tabla No. 8. Rendimientos de los aceites obtenidos en los

diferentes métodos 63

Tabla No. 9. Cantidad relativa (%) e identificación de los principales componentes (>1%) del AE de P. vaccinioides obtenido por diferentes extracciones

64

Tabla No. 10. Proporción estimada por método 66 Tabla No. 11. Intervalo de confianza vs método 67 Tabla No. 12. Porcentaje Inhibición para el Trolox 75 Tabla No. 13. Actividad Antioxidante del AE determinado por

ABTS 77

Tabla No. 14. Análisis ANOVA para la medición de CAET 79 Tabla No. 15. Actividad antimicrobiana de los aceites esenciales,

presencia-ausencia 80

Tabla No. 16. Diámetros halos de inhibición (mm), AE DESS

Bacillus subtilis 81

Tabla No. 17. Diámetros halos de inhibición (mm), AE HDS

Bacillus subtilis 82

Tabla No. 18. Diámetros halos de inhibición (mm), de los aceites obtenidos por DESS P. vaccionioides Bacteria S. aureus

82

Tabla No. 19. Diámetros halos de inhibición (mm), de los aceites obtenidos por HDS P. vaccionioides Bacteria S. aureus

83

Tabla No. 20. Diámetros halos de inhibición (mm), de los aceites obtenidos por AVS P. vaccionioides Bacteria S. aureus

83

Tabla No. 21. Concentración Crítica del AE por composición de la

P. vaccinioides 86

(15)

9 B. subtilis

Tabla No. 23. Prueba comparaciones múltiples de Tukey 88 Tabla No. 24. ANOVA para la actividad antimicrobiana probada en

S. aureus 89

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LISTA DE ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS

AE Aceite (s) esencial (es)

DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhidrazyl (2,2-Difecil-1-1picrilhidracilo) CG Cromatografía de gases

CG-EM Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas CLAE Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia

MEFS-EC Microextracción en fase sólida en el espacio de cabeza MEFS Microextracción en fase sólida

MEFSH Microextracción en fase sólida hoja húmeda MEFSS Microextracción en fase sólida hoja seca MEFSF Microextracción en fase sólida flores

INVIMA Instituto de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos

P. Pentacalia

CIT Corriente Iónica Total tR Tiempo de retención

UV-VIS Ultra Violeta Visible

DESH Destilación extracción simultánea hoja húmeda DESS Destilación extracción simultánea hoja seca DESF Destilación extracción simultánea flores AVH Arrastre con vapor hoja húmeda

AVS Arrastre con vapor hoja seca HDH Hidrodestilación hoja húmeda HDV Hidrodestilación hoja seca IC50 Concentración inhibitoria media

CAET Capacidad antioxidante equivalente a Trolox FDA Food and Drug Administration

GRAS Generalmente reconocidos como seguros UNNE Universidad Nacional del Nordeste

PDMS Polidimetilsiloxano PA Poliacrilato

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INTRODUCCION

La importancia de los compuestos volátiles en las plantas se ve reflejado en diferentes áreas como son la industria farmacéutica, de sabores y fragancias, cosmética, y alimenticia. En la actualidad son varias las publicaciones que relacionan las diferentes actividades biológicas de estos compuestos tales como insecticidas (Karpouhtsis, 1998), antioxidante (Demo, 1998; Lagouri 1993) y antibacterianas (Vokou, 1993), y sus propiedades como carminativas, antiinflamatorias, antiespasmódicas, antieméticas, analgésicas, emenagogo, y estimulante anticatarral. Estas propiedades no son debidas a un solo compuesto sino a una mezcla de compuestos que son finalmente los que hacen el sinergismo para llegar a la actividad (Berger, 2007).

El uso de sustancias naturales, extraídas de especies o plantas, como oleoresinas o aceites esenciales buscan sustituir a los conservantes sintéticos, proporcionando un valor agregado debido a sus propiedades multifuncionales, mejorando algún proceso biológico específico o evitando el riesgo de ciertas enfermedades (Ibañez, 2003).

Las plantas requieren una elevada concentración de antioxidantes ya que se encuentran expuestas por la acción de la fotosíntesis a una gran cantidad de radicales libres. Estos compuestos antioxidantes (compuestos fenólicos, flavonoides y carotenoides) las protegen del daño celular y se ha demostrado que estos compuestos al ser ingeridos por los seres humanos, generan una protección similar. Los compuestos bioactivos de origen natural han demostrado ser sumamente efectivos al proporcionar bienestar y salud, por lo que se ha incrementado el interés en ellos como previsores de enfermedades. Algunos padecimientos crónicos y degenerativos como el cáncer o enfermedades cardiovasculares y neuronales, han sido vinculados con la presencia de radicales libres en el organismo. Se ha podido demostrar que al incrementar el consumo de antioxidantes en la dieta es posible lograr un equilibrio entre estos y los agentes oxidantes. Algunos estudios afirman que existe una estrecha relación entre la actividad antioxidante y la reducción de riesgos de padecer cáncer y algunas enfermedades cardiovasculares, además de éstas, a los flavonoides y otros compuestos fenólicos, se les atribuyen capacidades antimicrobiales y antiinflamatorias (Gonzalez et al, 2007).

Los antioxidantes son utilizados para impedir o retardar oxidaciones catalíticas y enranciamientos naturales, o bien, aquellos que son provocados por la luz, altas temperaturas, aire y/o residuos metálicos (Ibañez, 2003).

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12

Sintéticos: Presentan elevada actividad química, gran eficacia a dosis bajas, alta estabilidad y bajo costo. Sin embargo pueden formarse productos secundarios en el proceso de fabricación del alimento o bien, al ingerirlos.

Naturales: Tienen menor actividad química y se necesitan dosis más elevadas, además debido a la dificultad en su extracción presentan un costo mayor y menor estabilidad. Pese a lo anterior existen numerosas investigaciones que demuestran que no solo no generan efectos en la salud, sino que tienen considerables efectos benéficos (Costa-Batllori, 2003).

Los antioxidantes en la salud juegan un papel decisivo en el estrés oxidativo del organismo. Además tienen propiedades antimutagénicas y antiinflamatorias, previenen la destrucción oxidativa del DNA, las enfermedades cardiovasculares y degenerativas, los procesos cancerígenos y tumorales. Igualmente mejoran los procesos inmunitarios (antivirales), y retardan el proceso de envejecimiento y demencia senil. Actualmente la industria alimentaria utiliza diversas técnicas para evitar o retardar la oxidación, entre las que se destacan el empaque al vacío o en recipientes opacos, así como la utilización de antioxidantes (Costa-Batllori, 2003). Hoy en día, existe una marcada tendencia en la industria alimentaria con respecto a la utilización de antioxidantes, siendo los de origen natural los que van ganando terreno sobre los sintéticos. Lo anterior no solo por los beneficios a la salud que se les atribuyen, sino también porque las presiones sociales y ecologistas han tenido un papel protagónico en la migración de lo sintético a lo natural, algunas veces por el solo hecho de su origen.

Una alternativa para evitar el uso y consumo de agentes químicos sintéticos como preservantes, es acudir al uso de sustancias que se encuentran de manera natural en algunas plantas y que simultáneamente presentan esta actividad. Dentro de dichas sustancias se destacan los fenoles presentes en algunas hierbas aromáticas y condimentarias, en las oleorresinas y extractos de las mismas; y también en algunos frutos, semillas y aceites vegetales. Entre los fenoles de origen vegetal reconocidos por proporcionar actividad preservante se encuentran el ácido carnósico, el carnosol y el ácido rosmarínico presentes principalmente en el Romero (Rosmarinus Officinalis L.) y la Salvia (Salvia Officinalis L.). Estos compuestos también proveen actividad antiséptica, antibacterial y antifúngica (Jeffries, 2005). De acuerdo a la normatividad de la FDA (Food and Drug Administration, USA) estos antioxidantes naturales son clasificados como GRAS (Generally Recognized As Safe), es decir, seguros para su utilización como preservantes en alimentos, cosméticos y productos farmacéuticos.

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13

En varios trabajos se han demostrado las propiedades antibacterianas, antimicóticas, antiparasitarias e insecticidas de los aceites esenciales.

La actividad antimicrobiana de los aceites esenciales en las plantas se debe principalmente a los compuestos denominados “terpenoides” en especial a los que contienen grupos OH, seguidos de los aldehídos y los grupos cetónicos. Un ejemplo de estos es el aceite esencial de Limonaria o limoncillo (Lemon grass), el cual tiene como principios activos al α-citral, β-citral, citronelol, citronelal, linalool y geraniol los cuales han demostrado poseer actividad antimicrobiana ante E. coli, Bacillis subtilis y Staphylococcus aureus (Griffin, 1979).

En estudios realizados con terpenoides se evidencia su actividad antimicrobiana principalmente inhibiendo el crecimiento de la bacteria E. coli.

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1. ESTADO ACTUAL DEL TEMA - MARCO CONCENTUAL

1.1.

Generalidades de la familia de las

pentacalias

Pentacalia es un género de plantas con flores pertenecientes a la familia Asteraceae

Reino: Plantae

División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Orden: Asterales Familia: Asteraceae Género: Pentacalia

Las Asteráceas o también denominadas Compuestas reúnen más de 23.000 especies por lo que son la familia de Angiospermas con mayor riqueza y diversidad biológica. La familia está caracterizada por presentar las flores dispuestas en una inflorescencia compuesta denominada capítulo la cual se halla rodeada de una o más filas de brácteas.

Figura No. 1 Detalle de la inflorescencia de las Asteráceas

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15

Hieracium (1000 especies) y Helichrysum (600 especies). A pesar de la distribución mundial de Asteraceae y su potencial fuente de agentes antimicrobianos y antioxidantes, las actividades biológicas de una serie de especies de Asteraceae aún no han sido investigados (Kenny et al., 2014)

Las compuestas almacenan carbohidratos como oligosacaridos, incluyendo a la inulina. Usualmente en las especies de la familia están presentes los poliacetilenos y los aceites aromáticos terpenoides.

1.1.1 Pentacalias en Colombia

El género incluye aprox. 217 especies. En Colombia se han reportado un total de 94 especies de las cuales 51 pertenecen al subgénero Pentacalia (Díaz – Piedrahita, S. & S. Obando. 2003) y 44 al subgénero Microchaete. De acuerdo a la bibliografía se encuentran 32 en Venezuela, 42 en Ecuador, 60 en Perú y 15 en Bolivia (Pedrozo, 2001).

En el páramo de Cruz Verde, lugar donde se recogió el material de estudio, se han reconocido hasta el momento las siguientes especies de Pentacalia: P. pulchella, P. corymbosa, P. ledifolia, P. nitida, P. astuans, P. andicola, P. tolimensis, P.vaccinioides y P. guadalupe. (Díaz, S. y Cuatrecasas, J. 1999)

1.1.2. Importancia y usos de las Pentacalias

Las Compuestas comprenden más de 40 especies de importancia económica, las cuales incluyen plantas alimenticias (lechuga, topinambur), oleaginosas (girasol, cártamo), medicinales (manzanilla) y ornamentales (dalia, zinia, crisantemo). También otras especies de Helianthus, Cichorium, Cynara, Taraxacum, Artemisia que se usan como especias.

Las diversas especies de la familia son una rica fuente de insecticidas y otras sustancias químicas de uso industrial, tales como el piretro (Tanacetum, o en Crisantemum), la Pulicaria, la goma (en el guayule). Muchas otras compuestas se cultivan como plantas medicinales o como hierbas aromáticas. Se encuentran algunas ornamentales como la Caléndula, Dendranthema, Argyranthemum, Leucanthemum (el crisantemo), Dahlia, Tagetes, Senecio, Spaghenticola, Gaillardia, Helianthus, Zinnia, y muchas otras.

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“la enfermedad de la montaña” y contra ciertos tumores (Schoental, 1959; Garcia-Barriga, 1975).

1.1.3. Estudios químicos realizados en el género pentacalia

Existen pocos estudios fitoquímicos del genero pentacalia reportados en la literatura. A continuación se mencionan algunos resultados de estas investigaciones: De las especies P. ephiphytica, P. andicola, P. firmipes y P. archieri, se aislaron los compuestos nerolidol, humuleno, farneseno, curcumeno, santaleno, germacreno D, varios cadinenos, cicloartenol, friedelina y 5-metoxieugenol (Bohlmann y Ziesche, 1979; Bohlmann et al., 1984). En la P. corymbosa se obtuvieron sitosterol, eicosanol, friedelina, dos cumarinas (escopoletina y 7-geraniloxilescopletina) y dos flavonoides (quercetina y rutina) (Torrenegra et al., 2000).

En las investigaciones de Pentacalias ubicadas en paramos en Colombia para la P. Crymbosa y P. Ledifolia se comprobó su actividad biológica antifúngica (contra hongos filamentosos) y antibacteriana (Pedrozo, 2001).

El estudio de los terpenos y diterpenos ha permitido reconocerlos como compuestos fitoalexinos, antimicrobianos (nomilactonas y oryzalexinas) y antimicóticos. (Pedrozo, 2001)

1.2. Descripción de la especie

Pentacalia vaccinioides

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17

Figura No.3.Pentacalia vaccinioides. Taxonomía

La Pentacalia vaccinioides pertenece a la familia de las compuestas, es un arbusto de paramo que crece alrededor de los 2600 y 3700 msnm (Kunth 2003); su altura oscila entre 0.5 m y 5m, son ramificados; con ramas fasciculadas, cilíndricas, totalmente glabras; inflorescencias dispuestas en corimbos terminales simples, de 24-56 flores por capítulo, hermafroditas, amarilla.

1.2.1. Clasificación, taxonomía y localización

De acuerdo a la división establecida en 1981 por Jose Cuatrecasas, el género Pentacalia se divide en dos subgéneros: Pentacalia y Microchaeta. Estos

subgéneros se pueden diferenciar fácilmente por el hábito: los primeros son frutales con tallo aéreo y ramas semiapoyantes y escandentes, generalmente con hojas más grandes y, los segundos son frútices o frutículos erectos, a veces postrados, generalmente con hojas más pequeñas.

Inicialmente la P. vaccinioides perteneció al género Senecio y cambio de género después de la revisión que hizo José Cuatrecasas en 1981 por Pentacalia.

De acuerdo a la información consignada en el Herbario Nacional Colombiano la P. vaccinioides se clasifica de la siguiente manera:

División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida

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18 Orden: Asterales

Familia: Asteraceae Género: Pentacalia Especie: P. vaccinioides

Actualmente hay un ejemplar en el Herbario Nacional de Colombia, radicado con el número de colección COL-570482, recolectado en Agosto 2013.

Esta especie se localiza en el Valle del Cauca (Alto de los Farallones), Cauca (Municipio de Puracé), Monserrate (El Granizo), Páramo de Cruz Verde (Matarredonda) y Chingaza (Bosque al costado suroriental).

En algunas regiones de Colombia se le conoce como “Chilquilla menuda” (Cauca), “Tangue” (Santander), “Hierba de Páramo” (Pancitara Cauca), “Romerillo Rusio” (Díaz; Cuatrecasas, 1999), “Panque” (Nevado del Cocuy – En esta región se usa popularmente en la curación de heridas de difícil cicatrización, “Nabo” (Páramo de Cruz Verde, Cund. – Allí se emplea en caso de dolores estomacales y como leña por algunos nativos)

1.3. Análisis cienciométrico

1.3.1. Pentacalias y P. vacciniodes

Se realizó el estudio cienciométrico sobre el género Pentacalia y la especie P. vaccinioides empleando la base de datos Web of Science - Thomson Reuters, con la siguiente ecuación de búsqueda: Topic=(Pentacalia). Timespan=All years. Databases=SCI-EXPANDED, SSCI, A&HCI, BKCI-S, BKCI-SSH.

La búsqueda se realizó en el mes de Agosto del 2013 las categorías evaluadas fueron número de publicaciones (países, año) y revistas científicas.

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19

Tabla No.1. Países relacionados con estudios en Pentacalias PAISES No. Publicaciones

Estados Unidos 3

Brasil 2

Colombia 1

Venezuela 1

Corea del Sur 1

Suiza 1

1.3.2. Aceites esenciales

Una forma de identificar que tan importante a nivel internacional son los productos naturales y en particular de los AE es valorando su productividad científica. Por esta razón se consultó en la base de datos Web Science la cual permitió consolidar y presentar la siguiente información (Topic=(Essential Oil). Timespan=All years. Databases=SCI-EXPANDED, SSCI, A&HCI, S, BKCI-SSH):

En la búsqueda se encontraron 30.258 publicaciones relacionadas con aceites esenciales de las cuales 1.206 están enfocadas sobre actividades biológicas. De este análisis se observa que Estados Unidos aporta un 11.76% de estas publicaciones siendo el de mayor productividad científica, seguido de Brasil con un 8.14%. Los resultados se presentan en los siguientes gráficos:

Figura No. 4. Países con mayor productividad científica en estudios sobre Aceites Esenciales Fuente: Web of Science, Ec: TS “Essencial oils” Agosto 2013. Período: Período 2003-2013

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

4000 3556

2464

2124 1933

1668 1564 1555

1423 1263 1232 Países con mayor Productividad Científica en AE

(26)

20

Figura No. 5. Países latinoamericanos con mayor productividad científica en estudios sobre Aceites Esenciales

Fuente: Web of Science, Ec: TS “Essencial oils” Agosto 2013. Período 2003-2013

Dentro de los sectores con mayor número de publicaciones encontramos al área Química

Tabla No. 2 Números de artículos por áreas de investigación AREA DE INVESTIGACIÓN No. Artículos

Química 9.497

Ciencia y tecnología de los alimentos 7.897

Farmacología y farmacia 5.506

Ciencias de las plantas 4.060

Agricultura 3.276

Bioquímica y Biología Molecular 2.722

Ingeniería 1.488

Biotecnología y microbiología aplicada 1.377

Nutrición y dietética 1.262

Ciencias ambientales y ecología 1.011

Microbiología 823

0 500 1000 1500 2000 2500

2464

461 285

136 100 123 126 59 33 38 18 23

(27)

21

En Colombia la institución que más publicaciones ha realizado de los AE es la Universidad Industrial de Santander con 51 publicaciones de las 136 publicadas en la base de datos Web Science.

Tabla No. 3 Principales instituciones y organizaciones colombianas relacionadas con la investigación en AE

ENTIDAD No.

Publicaciones

Universidad Industrial de Santander 51

Universidad Nacional 42

Universidad de los Andes 24

Universidad de Cartagena 13

Universidad de Antioquia 11

Instituto de Investigación en la Industria Alimenticia 10

Corpoica 9

IICA 8

Jardín Botánico 7

Universidad de la Salle 6

Las propiedades y actividades biológicas que tienen los AE son muy diversas y su aplicación se da en diferentes campos. En el estudio cienciométrico realizado se puede apreciar que de los 30.258 artículos, 1026 refieren alguna actividad biológica y 362 alguna actividad farmacológica, donde la actividad antimicrobiana, es la más estudiada seguida de la propiedad antioxidante.

1.4. Metabolitos secundarios volátiles de las plantas

Los compuestos volátiles de las plantas son producidos principalmente en las flores, pero también se encuentran en los frutos, tallos, hojas y raíces (Chen, 2004; Steeghs, 2004). Los compuestos volátiles en las esencias florales varían ampliamente entre especies, en el número, su identidad, y las cantidades relativas de sus constituyentes (Dudareva y Pichersky, 2000).

(28)

22

compuestos volátiles y sin embargo se reproducen y se defienden exitosamente. Por esta razón se considera que las plantas generan compuestos volátiles per se, y quedan como remanentes de diversos procesos metabólicos.

La utilidad de estas sustancias surge entonces a través de la selección natural. Estas han sido adaptadas por las plantas de diferentes maneras para obtener un beneficio de ellas (Owen y Peñuelas, 2005).

1.4.1. Rutas biosintéticas de los compuestos volátiles

Los compuestos volátiles de origen vegetal son producidos principalmente por tres rutas biosintéticas: la ruta de los ácidos grasos/lipoxigenasa, la ruta del mevalonato/no mevalonato, y la ruta del ácido shikímico/triptófano.

La ruta biosintética de los ácidos grasos/lipoxigenasa es la responsable de la producción de los volátiles de hojas verdes (o también conocidos como compuestos volátiles C6 debido a que contienen seis carbonos) y la cetona (Z)-jasmona. Estos compuestos son sintetizados a partir del ácido linoleico, α-linoléico y sus respectivos hidroperóxidos que son fragmentados para formar dos compuestos: uno de 12 carbonos (ácido 12-oxo—Z-9-dodecenoico) y otro de seis (Z-Hexenal), que mediante reordenamientos, reducciones o esterificaciones producen una variedad de compuestos orgánicos. Entre estos se incluyen alcoholes como el Z-3-hexenol, aldehídos como el Z-3-hexenal y esteres como el acetato de Z-3-hexenilo, todos con 6 átomos de carbono (Paré, 1996; Rodriguez, 2012).

La segunda ruta biosintética para la síntesis de los volátiles es la que da origen a los terpenos y se lleva a cabo a través de dos vías, la del mevalonato y la del no mevalonato (DXP). La mayoría de los terpenos conocidos se deriva de estas vías; ambas vías tienen como compuesto intermedio al isopentenil pirofosfato (IPP), y según el sitio de síntesis dan origen a monoterpenos o a sesquiterpenos. Así, si el IPP proviene del ácido mevalónico, su síntesis ocurre principalmente en el citosol, para que luego dos moléculas de IPP se condensen con una de dimetil-alil-pirofosfato (FPP), el cual es precursor de todos los sesquiterpenos. Caso diferente ocurre con los monoterpenos, en el cual el IPP es sintetizado a través de la desoxi-xilulosa-fosfato (DOXP) en los compartimientos plasmáticos, donde se transforma en su isómero dimetilalil difosfato (DMAPP), y por la condensación de una molécula de IPP con una de DMAPP se genera el geranil pirofosfato (GPP), precursor universal de los monoterpenos (Croteau 1987; McGarvey y Croteau, 1995).

(29)

23

fenilalanina, la cual es convertida al ácido cinámico por la enzima fenil-alanina-amino liasa. Esta ruta da origen también al salicilato de metilo, el cual es producido vía síntesis del ácido salicílico. El indol, un compuesto volátil que contiene nitrógeno, es producido por la ruta del triptofano y es un intermediario en la síntesis de triptófano. (Rodriguez, 2012).

(30)

24

CoAS

Acetil CoA (C2)

Ácido mevalónico

Isopentenil difosfato (IPP)(C5)

Ácido pirúvico (C3)

ISOPRENO Gliceraldehído 3-fosfato (C3)

1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato

Dimetilalil difosfato (C5)

Geranil difosfato MONOTERPENO SESQUITERPENO TRITERPENO Farnesil difosfato Geranilgenaril difosfato 2x TETRATERPENO (DOXP) (DMAPP)

(GPP) (C10)

(C15)

(C30)

(FPP)

(GGPP)

DITERPENO

(C5)

(C5)

(C10)

(C15)

(C20) 2x (C20)

(C40)

HO2C O

C H3

O H C H3

CO2H

O H

C H3

C H3 C H3 C H3 C H3

P P

O C H3

C H3

C H3 C H3

P P

O C H3

C H3

C H3

P P

O C

H3 C H3

P P O O H O C H3 O H O P O H C H O O P P P O C H3

C H2 C H3

O

(31)

25 Glicólisis Fotosíntesis D-Glucosa Ácido 3-fosfoglicérico Gliceraldehído 3-fosfato Ácido shikímico Ar

Ar Ar = R

R = OH, OMe, etc

Fosfoenolpiruvato

Fenilpropanoides

Ácido cinámico

Glucosa 6-fosfato Eritrosa 4-fosfato

O

O H

CO2H

O H O H O H O P O H O O H O H O H O H O O H O H O H O H

C H2

C H3

OP

HO2C

C H2

O P C H O O H O P

HO2C O H

O

P

O H O O H

Figura No. 8. Ruta biosintética del ácido shikímico

1.5

Aceites esenciales

Los aceites esenciales son mezclas de terpenos, pertenecientes a diferentes clases de compuestos como son: hidrocarburos, ésteres, alcoholes, aldehídos, algunos ácidos, fenoles y sus derivados, lactonas, etc.; todos, son productos de largas cadenas de biosíntesis vegetal (Ríos, 2010).

1.5.1. Importancia en las plantas

(32)

26

producción y emisión de estos. Lo anterior ha ayudado parcialmente a reconocer la razón del porque se producen este tipo de sustancias, el papel que desempeñan en la interacción con otros organismos y con el medio (Harbone 1988, Jolivet 1998, Rosenthal y Berenbaum 1992, Mori 1999).

1.5.2. Fuente y ubicación

Las plantas aromáticas son la principal fuente de AE, estas pertenecen generalmente a las familias Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Chenopodiaceae, Cupressaceae, Gentianaceae, Lamiaceae, Lauráceas, Myrtaceae, Pinaceae, Piperaceae, Poaceae, Rutaceae, Verbenaceae y Zingiberaceae (Lahlou, 2004).

Los aceites esenciales se biosintetizan en tricomas glandulares o glándulas como lo muestra la siguiente fotografía tomada con un microscopio.

Figura No. 9. Tricomas de la superficie abaxial de una hoja de Menta pulegium. Microscopio electrónico de barrido Jeol JSM-5220 (Rodrígues, 2013). 1. Tricoma corto multicelular. 2. Tricoma no glandular con distribución regular. 3. Tricoma del tipo Peltate y capitate. 4. Tricoma

glandular hundido en depresión epidérmica

Se pueden localizar en:

• Pelos glandulares como los que se encuentran en la Labiatae (AE de menta y lavanda)

• Células modificadas del parenquima: Ej. Piperaceae (pimienta)

• Tubos oleíferos o vitas: Ej. Lauraceae (canela)

• Tubos esquizógenos: Ej. Umbelliferae (anís, hinojo)

• Canales lisigenos: Ej. Pinaceae (pinos)

• Canales esquizógenos: Ej. Rutaceae (Ruda) y/o en órganos vegetales como:

• Flores: como en la lavanda, jazmín, rosa.

(33)

27

• Leños: (alcanfor)

• Raíces: (lirio, vetiver)

• Cortezas: (Canela)

• Frutos (anís, cítricos)

• Semillas (almendra)

• Madera (sándalo)

• Resina (incienso, mirra, benjuí)

• Cáscara de los frutos (limón, naranja y bergamota)

1.5.3. Clasificación y composición

1.5.4. Terpenos

La mayor parte de los aceites esenciales lo forman los monoterpenos, C10H16, y sesquiterpenos, C15H24, así como sus terpenoides, alcoholes, aldehídos, ácidos, y ésteres terpénicos, que se denominan, respectivamente, monoterpenoides y sesquiterpenoides.

Los aceites esenciales se clasifican teniendo en cuenta varios criterios: consistencia (esencias fluidas, bálsamos y resinas), origen (naturales, artificiales y sintéticos) y naturaleza química de los compuestos mayoritarios (Martínez, 2003). La composición de los aceites esenciales depende de varios factores:

• Ciclo circadiano: La composición y proporción de los compuestos volátiles en las plantas depende de la intensidad solar, así como por ejemplo el jazmín a las 7 am tiene un 0.6% de indol y 6% de linalol, a la 1 pm 0.3% y 25% respectivamente, y a las 7 pm los compuestos tienen porcentajes del 0.4 y 13% (Peyron, col 1981).

(34)

28

Tabla No. 4. Clasificación de algunos AE de acuerdo a con su composición Monoterpenoides Aceite de pino, cítricos, bergamota, enebro, aceite de

limonaria, etc.

Sesquiterpenoides Bálsamo de Copaiba, aceites de cedro, jengibre, etc. Compuestos

Oxigenados Monoterpenoles: Aceite de albahaca, citronela, geranio, lavandina, mejorana, palmarrosa, menta, rosa, árbol de té, etc.

Monoterpenonas: Lippia sp., Satureja sp. Menta spicata, Carum carvi, ruda, salvia, etc.

Fenoles: Canela, clavo, tomillo, orégano.

Éteres y Esteres: Lavanda, jazmín, ylang-ylang, narciso

α-Pineno Limoneno

β-Pineno β-Mirceno

OH

Fenol

HO

(35)

29 3-Carene

trans-Nerolidol

Figura No. 10. Estructuras químicas de algunos compuestos presentes en los AE

1.6. Métodos de extracción

Los métodos de extracción deben ser reproducibles, fáciles de implementar, que requieran un mínimo equipamiento y que produzcan resultados significativos. Existen varios factores que influyen en la extracción, entre ellos se encuentran:

• El tiempo de secado del material, este varía mucho dependiendo de la especie

• El tiempo de extracción

• La presión del vapor, si esta es muy elevada se presenta arrastre excesivo con agua disminuyendo su calidad y rendimiento

• La condensación interior, esta suele evitarse realizando una purga previa a los 30 minutos de haberse iniciado el proceso, además de mantener bien aislado el tanque

• La distribución interior del vapor, esta se logra colocando una flauta de distribución en el fondo del tanque (Sánchez, 2006)

• Tamaño del material, cuando se logra moler la planta antes del proceso se obtienen mayores rendimientos ya que hay mayor área superficial que va a entrar en contacto con el vapor.

• Polaridad de los solventes y su costo

• Concentración de los solventes y sistemas de reflujo

• Temperatura usada en la extracción

(36)

30

• Nivel de concentración: Los niveles de concentración de los compuestos aromáticos son generalmente bajos, típicamente en rangos de ppm, ppb o ppt. No solamente se busca aislar los compuestos de interés sino también la mayor concentración posible de estos.

• Matriz: Los volátiles son frecuentemente intracelulares y deben ser liberados por rompimientos celulares. La muestra frecuentemente contiene compuestos no volátiles como lípidos, proteínas o carbohidratos, los cuales dificultan los procesos de extracción; así como también pueden ocasionar problemas de emulsificación y espuma durante estos procesos.

• Complejidad de las aromas: La composición de un aceite esencial con frecuencia es muy complejo. Por ejemplo, el café cuenta con más de 800 compuestos identificados, es por esto que estas sustancias presentan un rango de polaridades, solubilidades, densidades y pHs.

• Variación de la volatilidad: Los componentes poseen rangos de ebullición que van desde temperaturas por debajo del medio ambiente (sólidos) hasta los 300°C.

• Inestabilidad: Muchos de los componentes de un aceite esencial son inestables y pueden oxidarse al contacto con el aire o degradación por cambios de pH y/o temperatura.

Schreier enfatiza que la preparación de la muestra es el paso más crítico de todo el proceso de investigación de los volátiles (1984).

Para obtener un extracto, es importante identificar taxonómicamente la planta a estudiar y la (s) parte (s) que contienen los constituyentes útiles. Adicionalmente, la determinación de una técnica precisa de recolección y métodos de preservación de la planta es de crucial importancia. El mecanismo de extracción involucra dos fenómenos físicos: difusión a través de la pared celular y el lavado de los contenidos celulares, una vez que las paredes se han dividido (Vinatoru, 2001).

1.6.1. Métodos directos:

Comúnmente se emplean dos métodos directos:

• Expresión: compresión de cáscaras

(37)

31 1.6.2. Métodos indirectos tradicionales:

Los métodos indirectos son los más empleados para la extracción de los AEs ya que estos permiten trabajar la planta en grandes cantidades y proporcionan buenos rendimientos; de estos métodos los más empleados son la extracción con arrastre con vapor y la hidrodestilación. La extracción con solventes, la extracción DES (emplea solventes e hidrodestilación simultáneamente), la extracción supercrítica, el enfleurage o la extracción con aceites grasos, entre otros, son menos utilizados por sus altos costos de operación. Estos métodos menos convencionales se usan de acuerdo con las propiedades del producto, su concentración, y su uso posterior. Sin embargo estos métodos de extracción requieren altos tiempos de residencia y grandes cantidades de solvente.

El soxhlet es una técnica estándar y la principal referencia para evaluar el rendimiento de los métodos de extracción sólido – líquido (Luque de Castro; García-Ayuso, 1998).

1.6.2.1. Destilación

La destilación es uno de los métodos más empleados para la obtención de los aceites esenciales, principalmente por su bajo costo y relativa simplicidad del equipo. La destilación se realiza en varias formas: destilación con vapor, destilación con agua o hidrodestilación, destilación con vapor y agua, destilación con solvente y agua.

1.6.2.1.1. Destilación por arrastre con vapor:

(38)

32

aceite esencial acumulado en el florentino no varía con el tiempo; a continuación, el aceite es retirado del florentino y almacenado en un recipiente y lugar apropiado. (Parry, 1921; Güenther, 1948; Al Di Cara, 1983; Heath, 1986).

1.6.2.1.2. Hidrodestilación:

En este proceso el material se encuentra en contacto directo con el agua de la cual se va a generar el vapor saturado (Güenther, 1948). Este proceso consiste en llevar a estado de ebullición el agua, la cual va a penetrar los tejidos de la planta disolviendo una parte del aceite esencial presente en las estructuras contenedoras. La solución acuosa se difunde a través de las membranas de las células y el aceite se vaporiza inmediatamente desde la superficie. Este proceso continua hasta que se remueve todo el aceite contenido en las glándulas de la planta.

Una ventaja de la etapa inicial de este proceso es la liberación de los compuestos oxigenados con agua hirviendo (unas 100 veces más que los compuestos análogos) esto ocurre gracias a su grado de solubilidad más que por sus puntos de ebullición. Luego a medida que avanza la destilación, los compuestos se liberan en función de su temperatura de ebullición, siendo la última fracción rica en sesquiterpenos y sus análogos oxigenados (Güenther, 1948; Koedam, 1982; Galleti, 1988; Duran, 2005).

1.6.1.1.3. Hidroextracción

Cuando se usa vapor saturado, pero la materia no está en contacto con el agua generadora, sino con un reflujo del condensado formado en el interior del destilador(Palomino y Cerpa, 1999).

1.6.1.1.4. Fermentación y subsecuente destilación con vapor:

Se usa para aquellos aceites esenciales que se forman por hidrólisis (generalmente enzimática) de heterósidos. Tal es el caso de las esencias de Wintergreen, de almendras amargas, mostaza, etc. (Calderón, 1963).

1.6.2.2. Extracción con solventes:

(39)

33

precipitar las ceras se deja enfriar la solución y después se destila a presión reducida el alcohol para recuperar el aceite.

La extracción por solventes o extracción líquido-líquido, se basa principalmente en la selección del solvente(s), temperatura o agitación, con el fin de incrementar la solubilidad de los materiales y la tasa de transferencia de masa (Gao y Liu, 2005). En este proceso se separan los compuestos con base en sus solubilidades por dos líquidos inmiscibles, usualmente agua y un solvente orgánico. En la industria, este proceso se realiza continuamente bombeando una corriente orgánica y otra acuosa dentro de una mezcladora, donde ambos componentes se mezclan y se permite la transferencia de masa hasta que se logra el equilibrio. En el laboratorio este proceso se realiza comúnmente en sistema soxhlet.

Para la extracción con soxhlet se deben tener en cuenta: la selección del solvente, la matriz sólida y las condiciones de operación. El factor preponderante es la selección del solvente, el cual debe ofrecer el mejor balance de varias características deseables: alto límite de saturación y selectividad respecto al soluto por extraer, capacidad para producir el material extraído con una calidad no alterada por el disolvente, estabilidad química en las condiciones del proceso, baja viscosidad, baja presión de vapor, baja toxicidad e inflamabilidad, baja densidad, baja tensión superficial, facilidad y economía de recuperación de la corriente de extracto y bajo costo (Dahlstrom et al., 1999). Cada solvente diferente produce extractos y composiciones específicos (Zarnowski y Suzuki, 2004).

Los solventes más empleados hoy en día son el éter etílico, mezclas de pentano/éter etílico, hidrocarburos.

El uso de solventes alternativos tales como: isopropanol, etanol, hidrocarburos, e incluso el agua, se ha incrementado debido a sus menores efectos sobre el medioambiente, la salud, y mayor seguridad. Sin embargo, los solventes alternativos producen a menudo menos recuperación debido a una afinidad molecular disminuida entre el solvente y el soluto. Los costos de los solventes alternativos pueden ser superiores. A veces se agrega un co-solvente para aumentar la polaridad de la fase líquida. Además, se han reportado extracciones de mezclas de isopropanol y el hexano para aumentar el rendimiento y la cinética de extracción (Li et al., 2004).

(40)

34 1.6.2.3. Destilación Extracción Simultánea

El denominado DES es un procedimiento de destilación y extracción simultánea en el cual sustancias volátiles se transfieren desde un medio acuoso hacia un medio solvente orgánico no miscible al agua. Este proceso no requiere contacto entre el solvente orgánico y la muestra tratada, evitándose la extracción de sustancias indeseables del medio tratado. Este tipo de equipos no permite trabajar a escala preparativa, ni la alternancia de operación bajo presión reducida y condiciones atmosféricas, o en continuo. El equipo no es versátil para procesos que requieren condiciones variables.

El solvente empleado puede ser más o menos denso que el agua, y se prefieren los hidrocarburos alifáticos, alifáticos halogenados, alicíclicos, aromáticos, entre los que se destacan: diclorometano, pentano, iso-octano, tolueno, tricloroetano y dietiléter.

Cuando la sustancia a extraer va a ser consumida se puede usar el limoneno, o el alfa y beta-pineno como solvente.

Aplicaciones particulares de este sistema son el aislamiento de mezclas aromáticas de extractos de café o la extracción de benzaldehído a partir del agua tratada con almendras, por ejemplo el albaricoque.

Ventajas del sistema:

• Una sola operación extrae y concentra los AE.

• Se requieren pequeñas cantidades del solvente

• La recuperación de los componentes volátiles es generalmente alto

• El sistema se puede operar a presión reducida (dependiendo el diseño del equipo) evitando así la descomposición térmica de los compuestos

(41)

35

Figura No. 11. Varias Modificaciones del aparato DES (Schreier, 1984)

1.6.2.4. Extracción con materias grasas (Enfleurage):

(42)

36 1.6.2.5. Métodos indirectos recientes:

Según Gao y Liu (2005), los métodos de extracción más modernos se basan en la mejora de la eficiencia de los métodos tradicionales por acción física sobre el medio. Lo anterior con el objeto de acortar el tiempo de extracción, disminuir el consumo de solvente, aumentar el rendimiento de extracción y mejorar la calidad del extracto.

En los últimos años se han desarrollado nuevas técnicas para la extracción de solutos de matrices sólidas, entre ellas se tiene: la extracción asistida con ultrasonido, la extracción asistida con microondas, la extracción con solvente acelerado y la extracción con fluidos supercríticos.

1.6.2.6. Extracción asistida por microondas (EAM):

La irradiación de microondas causa movimiento en las moléculas por migración de iones y rotación de dipolos que contribuyen a una rápida transferencia de energía al solvente y al material vegetal.

1.6.2.7. Extracción asistida por ultrasonido (EAU)

La primera aplicación comercial del ultrasonido fue en 1917; desde entonces, el tema se ha desarrollado y expandido a un gran número de aplicaciones. Según el Centro de Sonoquímica de la Universidad de Coventry en el Reino Unido, el ultrasonido es utilizado por la posibilidad de realizar evaluaciones no invasivas ni destructivas, y por ser fuente de energía (2006).

1.6.2.8. Extracción con fluidos en condiciones subcríticas y supercríticas

(43)

37

Figura No. 12. Diagrama de fase del dióxido de carbono

Como se presenta en el diagrama de fase, el punto triple del CO2 en la cual coexisten las tres fases: sólida, liquida y gases se da a una presión de 5.2 atm y a una temperatura de -56.6°C. Para que pueda ser licuado es necesario que se encuentre a una temperatura de 31.1°C y a una presión mínima de 73.8 bares. El CO2 es el fluido supercrítico más utilizado debido a diversas propiedades: no es tóxico, no es inflamable, no es corrosivo, es incoloro, es de bajo costo, se elimina fácilmente, no deja residuos, sus condiciones críticas son relativamente fáciles de alcanzar, se consigue con diferentes grados de pureza, se puede trabajar a baja temperatura y por tanto, se pueden separar compuestos termolábiles, se puede obtener a partir de procesos de fermentación alcohólica, y ayuda a prevenir la degradación térmica de ciertos componentes químicos del alimento cuando son extraídos (Brunner, 2005; Hurtado, 2002; Rosa y Meireles, 2005).

1.6.2.9. Microextracción en Fase Sólida (MEFS)

La microextracción en fase sólida (MEFS) fue desarrollada a principios de los años 90 por el grupo de investigación de J. Pawliszyn. La MEFS se basa en la extracción de los analítos de la matriz de la muestra mediante una fibra de sílice fundida que está recubierta de un absorbente, en la mayoría de los casos polimérico, seguida de la desorción de los analítos mediante temperatura o un disolvente orgánico.

(44)

38

Figura No. 13. Sistema de Extracción MEFS

Ventajas:

• Técnica simple

• Fácil de manejar

• Bajo costo

• Se puede automatizar

• Requiere pequeños volúmenes de muestra

• No requiere solventes

• Fácilmente transportable

• Versátil: permite el análisis de diferentes tipos de muestras (gaseosas, líquidas o sólidas)

Es recomendable usar sistemas agitados ya que estos aumentan la velocidad de extracción, y facilita la difusión de los analítos hacia la superficie de la fibra.

Existen dos formas básicas de realizar la extracción en MEFS: extracción por inmersión directa o bien del espacio de cabeza.

La etapa de desorción se realiza térmicamente por CG o por adición de un solvente orgánico como es el caso de la cromatografía líquida.

(45)

39

cromatográfica. Además, el diámetro del inserto (liner) de dichos inyectores debe ser lo más similar posible al diámetro de la fibra para asegurar una transferencia rápida de los analítos desde el inyector a la columna (Harmon, 2002).

1.6.2.9.1. Tipos de fibras en MEFS

Actualmente hay fibras con diferentes recubrimientos de manera que la MEFS puede usarse para determinar un amplio grupo de compuestos. Los primeros recubrimientos comercializados fueron los de polidimetilsiloxano (PDMS) y poliacrilato (PA) pero los tipos de recubrimientos han ido aumentando progresivamente y actualmente cubren un amplio conjunto de aplicaciones.

1.6.2.9.2. Variables que afectan el proceso de MEFS

El proceso de MEFS se puede ver afectado por una serie de variables experimentales que pueden ser modificadas para incrementar la eficacia del proceso de extracción. Como se ha mencionado anteriormente, entre estas variables se encuentra la agitación de la muestra, que incrementa la difusión de los analítos desde la matriz de la muestra a la fibra o al espacio de cabeza por lo que se disminuye el tiempo requerido para llegar al equilibrio. Otros parámetros importantes son el tiempo y la temperatura de extracción, así como la modificación de las condiciones de la muestra, y los parámetros que afectan la etapa de desorción; estos últimos dependen de la técnica analítica que se utilice a continuación para llevar a cabo la separación y cuantificación de los analítos.

Los coeficientes de difusión de los analítos en la muestra aumentan al incrementar la temperatura, por lo que aumenta la cantidad de analito extraído. Por otro lado, un aumento de la temperatura disminuye los coeficientes de distribución del analito entre la muestra y la fibra por lo que la eficacia de la extracción se ve afectada negativamente. Para solucionar este problema, Zhang et al. (1995) diseñaron un dispositivo de MEFS que permite calentar la muestra y enfriar simultáneamente la fibra (Harmon, 2002).

1.7. Análisis realizados a los aceites esenciales

Algunas de las técnicas para el control de los aceites esenciales se relacionan a continuación:

• Evaluaciones sensoriales: olor, color, apariencia, textura, sabor

(46)

40

• Determinaciones químicas: acidez, esterificación, saponificación, compuestos fenólicos.

• Técnicas Instrumentales: perfil cromatográfico CG, cuantificación de componentes, índices de retención, identificación por CG-EM

El control analítico de los aceites esenciales permite determinar la calidad y su grado de pureza.

1.7.1 Características Organolépticas:

1.7.1.1. Color

El color que presentan los aceites esenciales es una propiedad inherente a la composición. En general son incoloros, sin embargo poseen un color en la gama del amarillo (Güenther, 1948; Teuscher et al, 2005; Parry 1921; Muñoz, 2002; Peter 2004). La exposición al ambiente hace cambiar su color ya que estos se oxidan fácilmente.

1.7.1.2. Olor

El olor de un único compuesto es difícil de describir y más aún los olores de una mezcla compleja a menos que uno de los componentes sea tan característico que determine en gran parte el olor o el sabor de la composición. Un olor puede clasificarse por adjetivos tales como floral, frutal, herbáceo, o los relacionados con fragancias naturales u otros conocidos con olores similares. (Dowthwaite, 2004). El olor en los aceites esenciales es su principal característica, cuando están expuestos al ambiente se volatilizan rápidamente los terpenos más livianos y se vuelven espesos o resinoides.

1.7.2 Características Fisicoquímicas:

1.7.2.1. Solubilidad

Los aceites esenciales son muy poco solubles en el agua, aunque esta adquiere el olor y el sabor de este. En cambio son solubles en los solventes orgánicos: alcohol, éter, cloroformo, ácido acético glacial, éter de petróleo, diclometano.

(47)

41

Es importante comprobar la solubilidad en alcohol, ya que cada AE presenta una solubilidad constante en los alcoholes diluidos (normalmente se emplea alcohol de 70%, 80% y 90%). Este ensayo muestra datos muy útiles en relación con la pureza, ya que los adulterantes comúnmente utilizados como la trementina, aceites grasos son prácticamente insolubles en alcohol de 70 y 80%.

1.7.2.2 Densidad

La densidad de los aceites volátiles, varía entre 0.84 y 1.2. Los que son más ligeros en agua (densidades menores a 0.9 g/cm3), son generalmente ricos en hidrocarburos, alcoholes, esteres y cetonas, tales como los de naranja, coriandro, limón, romero y trementina. Por otra parte aquellos que tienen densidades mayores de 1g/cm3, contienen principalmente fenoles, derivados fenólicos o ciertos esteres; por ejemplo el aceite de anís, canela, clavo y mostaza. (Domínguez, 1988; Güenther, 1948).

La densidad de un aceite esencial no es constante, ya que está influenciado por factores como la madurez de la planta de la cual se obtuvo, por el método de extracción y purificación, y la edad del aceite.

1.7.2.3. Rotación óptica

La rotación óptica de algunos de los aceites volátiles varía en límites relativamente amplios. Esta propiedad se determina en un polarímetro y consiste en determinar el valor de la desviación de la luz polarizada por un estereoisómero ópticamente activo. Para esto se emplea luz de sodio y tubos de 2.5, 5 o 10 cm el cual depende de la coloración del aceite.

Este ensayo sirve para determinar las adulteraciones con sustancias inactivas como el alcohol o sustancias de poder rotatorio diferente del aceite examinado; por ejemplo el aceite de limón tiene un poder rotatorio entre ≠57 a ≠64° y cuando esta adulterado con trementina este valor cambia entre ≠25 a ≠40° (Calderón, 1963)

1.7.2.4. Índice de Refracción

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Esta determinación debe hacerse a 20°C con excepción del aceite de rosas, que se hace a 30°C. (Domínguez, 1988)

1.7.2.5. Punto de Ebullición

El punto de ebullición de los aceites esenciales no es preciso ya que estos son mezclas de diversos compuestos. En general se determina el intervalo en el que la mayor parte del aceite es destilado, por ejemplo en la trementina se ha encontrado que un 90% destila entre 154 y 170°C. Para el estudio de los aceites esenciales es muy útil la destilación fraccionada cuando no se cuenta con técnicas de análisis como la espectrometría de masas. En este caso se recomienda que la destilación se haga a presión reducida, y así las fracciones recogidas se pueden someter a ensayos físicos y químicos. (Calderón, 1963)

1.7.3. Técnicas Instrumentales

1.7.3.1 Cromatografía en capa fina (CCF):

Se basa en colocar un adsorbente sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. La fase estacionaria por lo general es polar y el eluyente o fase móvil será menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares.

Aplicaciones:

- Identificación de metabolitos secundarios de un extracto

vegetal

- Comprobación de la pureza de una sustancia

- Evaluación y comprobación de actividades biológicas:

antimicótico, antibacteriano, moluscicida, piscicida, larvicida, espermicida, insecticida, antialimentario, antioxidantes y captadores de radicales libres, inhibición de la germinación, entre otros. (Hostettman, 2008).

- Comparaciones de diferentes muestras del material vegetal y

detectar adulteraciones

- Evaluación de la calidad e identidad de las plantas

Ventajas:

- Metodología económica y simple para la separación de

extractos y fracciones

- Reproducible

- Procesamiento de muestras en paralelo

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- Aislamiento especifico de sustancias

- Evaluación postcromatográfica sin presiones de tiempo

1.7.3.2 Cromatografía de columna abierta (CC):

Es el método más usado para la separación de productos naturales. Es fácil de efectuar, no requiere equipo especializado y es económica, sin embargo esta técnica tiene varias desventajas: separaciones lentas, mala resolución, adsorción irreversible de solutos, requiere grandes cantidades de disolventes, incompatibilidad con partículas de baja granulometría (Hostettman, 2008).

1.7.3.3 Cromatografía de Gases:

La cromatografía de gases (CG) se basa en la separación de analítos entre una fase móvil gaseosa (helio, argón, hidrógeno, nitrógeno) y una fase estacionaria. Esta última constituida por un sólido o líquido, soportado sobre las paredes de la columna. La columna se coloca en un horno, con temperatura regulable y programable, lo cual influye de forma decisiva en la separación de los componentes de la mezcla. Las columnas cromatográficas actualmente empleadas son de tipo capilar, las cuales están formadas por un tubo de cuarzo flexible (sílice fundida) de diámetro muy pequeño (estándar, 0.25 mm) y de longitud variable (de 25 a 60 m, hasta 100 m). Para el análisis de aceites esenciales suelen emplearse dos tipos de fases estacionarias, una polar, poli (etilenglicol) y otra apolar, poli(dimetilsiloxano) (Grob, 1985; Jennings, 1987; Poole, 1991; Rödel, 1987)

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embargo, es necesario realizar su identificación confirmatoria. Por ello, se emplean otras técnicas, entre las cuales se destaca la cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas (CG-EM).

1.7.3.4 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM): Esta técnica de análisis ha demostrado durante los últimos 25 años, que es uno de los métodos más eficaces para el estudio de la composición de los aceites esenciales (Stashenko, 1995, 1996, 2004). Es una técnica adecuada para la identificación debido a que los componentes del aceite son compuestos volátiles y de bajo peso molecular. La muestra se inyecta directamente al cromatógrafo sin ningún tratamiento previo, lo cual elimina posibles modificaciones en su composición o en la estructura de sus constituyentes. En el cromatógrafo, los componentes de la esencia se separan, entran al espectrómetro de masas, que permite registrar el espectro de cada una de las sustancias separadas. Los constituyentes del aceite se identifican con base en patrones de fragmentación, que se observan en sus espectros de masas (McLafferty, 1993; Skoog, 1994; Stashenko, 1999). La CG-EM permite realizar en una sola operación, para muestras del orden de 1 μL, un análisis cualitativo junto con una indicación de las proporciones en las que se encuentran los componentes. Cuando se disponen de sustancias patrón, la calibración del equipo permite un análisis cuantitativo exacto de la muestra (Message 1984, Staschenko 1999).

1.8. Propiedades biológicas de los aceites esenciales

1.8.1 Propiedades antioxidantes

Los antioxidantes son esenciales para contrarrestar los efectos perjudiciales de los pro-oxidantes o especies reactivas (O2. H2O2, ROO•, OH•).

Actualmente los antioxidantes de mayor uso para preservar alimentos son el hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), propil galato (PG) y la hidroquinona terbutilo (TBHQ), así como también los tocoferoles (δ>γ>β>α). (Moure, 2001), con reportes preocupantes para el BHT y el BHA los cuales causan daños al hígado y son carcinogénicos (El Abdouni, 2014); es por esto que la demanda de antioxidantes naturales, especialmente de origen vegetal se ha incrementado en los últimos años.

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seguridad porque ya se encuentran en los alimentos 4. Tienen propiedades funcionales y 5. Son aceptados sensorialmente (Olmedo, 2014)

Ensayos clínicos y estudios epidemiológicos han establecido una correlación inversa entre la ingesta de antioxidantes naturales y la presencia de enfermedades de estrés oxidativo, como la inflamación, problemas cardiovasculares, el cáncer y trastornos relacionados con el envejecimiento (Prieto, 2014).

Como fuente natural de antioxidantes los AEs han tomado reconocimiento como aditivos potencialmente seguros para conservar, prolongar la vida útil y mejorar la calidad de los productos alimenticios, hoy en día es posible encontrarlos comercialmente en la categoría DMC Base natural (mezcla de extractos ricos en polifenoles, flavonoides, ácidos orgánicos y otros productos naturales, con propiedades antioxidantes, por ejemplo: 50% AE de romero, salvia y cítricos y 50% glicerol) (Burt, 2004). Aunque ha aumentado su uso, se han visto limitados por alterar las propiedades organolépticas de los productos alimenticios; sin embargo recientemente se han encontrado técnicas de encapsulación donde utilizan diversos tensoactivos para superar tales problemas (Shukla, 2009), así como también el empleo de procesos de desodorización.

Algunos trabajos con aceites esenciales han permitido dilucidar la actividad de los diferentes componentes. Por ejemplo, el γ-terpineno retarda la peroxidación del ácido linoleico, el sabineno mostró una fuerte capacidad de remover radicales, el

α-pineno y el limoneno mostraron baja actividad antioxidante en la prueba del 2,2

difenil 1-picrylhydrazyl (DPPH). Por su parte el terpineno y terpinoleno presentaron alta capacidad de donación de hidrogeno contra el radical DPPH. El efecto de la remoción de radicales libre del citronelal evidenció una fuerte actividad protectora en procesos de peroxidación lipídica. También estos efectos antiradicales han sido descritos por el neral y geranial (Berger, 2007)

En muchos casos, la actividad antioxidante de los aceites esenciales puede no ser atribuida a los compuestos mayoritarios, ya que los compuestos minoritarios pueden jugar un papel significativo. Igualmente se han reportado efectos sinérgicos. Por ejemplo, en el AE de la especie Melaleuca, el cual contiene 1,8 cineol (34%) y terpinen-4ol (19%) estos últimos mostraron una mayor actividad antioxidante que aquellos con un alto contenido como metileugenol (97%) o 1,8 cineol (64.30%) (Berger, 2007).

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