U I I V W I D X D AUTOlOñA HETROPOLITANA-IZTAPALAPA

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(1)

U I I V W I D X D AUTOlOñA

HETROPOLITANA-IZTAPALAPA

/DESARROLLO

Y EYTABLECIñItblTO DE CULTIVOS

PR1)UHIOS

DE

CELULAS

DE

SBdTOLI.

IiiFORHE FIñAL

DEL

SERVICIO

SOCIAL.

Clave: 23. 12. 26. 87

(2)

ESTE S E A V I C I O SOCIAL

SE

LLEVO A CABO

M J O

LA

DIiiECCION DEL PROP. ENHIQUE W D I E T A

-

UARQUEZ Eli LOS LABOMTORIOY DE W C A U I S U O S DE ACCION HORMOUAL

Y

P I S I O L O C I A CCLbLAH

-

DEJ, DEPARTAIIEYTO Dk CJOlDCIAS DE L A $ALUD, D I V I S I O N C I E N C I A S BIOLOGICAY Y

U

LA SALUD

UKIVEABIDAD AUTOKOWA ClETROPOLITAblA-IZTAPA- LAPA.

(3)

1.-

11.-

111.-

1v.-

V.-

v1.-

VI1.-

VII1.-

1x.-

I Y D I C E

IYTHOUU CCI ON.

a) Anteoedentea

OBJETIVO.

MTMIALES Y IIBTODOS.

a)

Separaohín

celular.

b)

Cultivo celular.

RESULTADOS.

a) Caracterfsticas iorfoi4gicaa

d e loa cuitlvoa.

DISCUSION.

e)

Puntoe críticos de procedimiento.

CUY

CLU

3 IOü

ES.

RESUI1Eli.

APEliDICE.

(4)

....

D E b U O L L O Y

EYTABWCIñirJlTO DE CULTIVOS

PRINAii103

DS

CgtULAS DE

SERTOLI

I

.-

-

E l te8tfCUlO 08 üiia glándula tUbUlOü8 O O B ~ @ a t 8 ,

redeada de UM Cáp8t~i. f i b r o u ,

la

tdnica albuginea. En l a

cara

-

posterior dol

brgano,

un

engrosamiento del tejido conjuntiva de

-

l a cápoula ae proyecta hacia e l interior de l a g l b d u l a : e1

me---

día8tino terticular, desde e1 que se extienae radialmente hacia

-

l a tdnlaa albugfne8 un08 delgados tabique fibrosoe, llamados amp-

tula t e a t i s , que dividen a l órgano en unos 250 compartimiento pi-

ramidales

,

l o a l o b u l i l l o s testiculares, estos tabiques suelen

-

quedar incompletos hacia l a p e r i f e r i a , d e modo que l o a l o b u l i l l o s

se comuniquen entre

s f ,

pero l a convergencia de sus vértices en

-

e l rnediastino,los l o b u l i l l o a quedan más completamente separados.

Cada l o b u l i l l o

se

compone be uno a cuatro tdbulos

seminfferos contorneados, de 150 a 250

am

de diámetro,

3Q

a 70 cm

de longitud que adoptan un trayecto muy tortuoso.

Loa tdbuloa seminfferos constituyen l a parte ex&-

crin. del te8tfcul0, que es e8encialmente una glkidula citbgena,

cuyo producto de secrecidn holócrina está formado por cólulas

en-

teras: l o 8 espmriatoxoides.

Los

tdbulo8 suelen mstar formando

-

888s muy contornmada8

,

pero también pueden ramifiaarse

o teni--

(5)

-.,_* ... ... . “ . _ . . I ,... .,.,

.

.. . , _ . . . . ~... . . ...,,, ~ ..,_

.

., ... ~d .I< ... . .,.. <^..,*,---

-1

. . . ~

-

I .

11.1

on

e1 fondo del 8 8 ~ 0 . On e1 v6rtioo de cada l o b u l i l l o ru8 t i

bu108 Oeiinffer08 contornerdor se convierten bruaoamente en tdbs

108 r e a i a f f e r o s

reotoa,

que conrtituym e l primer slatem8 da OOIJ

duotoe

exoretorer,

108 crrillor 8

sa

vex oonfiuym

on

el rete

t e e

t i e , e i r t e u , p l e x i f o r m de erp8cios revertidor de e p i t e l i o

en

e1

t e j i d o COnjuntiVO 601 medí8rtino.

Ln

l a cara interna de

l a

túnica albuginea, e l denso t e j i d o conjuntivo ee continda con un8

mas8

más h x a , provista de abundante8 vasos eaagufneoa: l a tdnica vaaculoea del testfculo.

A p a r t i r de eat8 tdnica

un

t e j i d o conjuntivo laxo, de caracterfq ticas sirnilarea,

se

extiende hacia e1 i n t e r i o r , para rellenar

-

todos l o a i n t e r s t i c i o s entre l o a túbuloa seniniferos: este t e j i -

do contiene fibroblastoa, macr6fagoa, c6lulas oebad.8 y iesenquL

natoeas perirascularea. AdePiia hay a111 grupoa de c6lulaa interq

t i c i a l e s epiteloides, denominadas también células de Leydig (en-

docrinocitoe intereticialea) que constituyen e1 tejido endocrino

del teatfculo. todos estos conponentea integran e l conpartimien-

to i n t e r s t i c i a l .

o1 conp8rtimiento tubul8r de l o s adultos,

loa túbu--

l o s seminfieros estan rovestidor de

un

complejo e p i t e l i o e s t r a t j fio8do ooipuesto de doe catogorfas principales de 041~188: c6lu-

la8 de soit6n J c6lul.s 88p.nirtOg6niCa8. l o s olemento8 do SOB--

t l n son do una 8018 claro de c6lul8s J ne denbinan c&lulas do

-

(6)

. .

. .

divereos tipos morfol6,giccuente diferentee: esperutogbniie, es-

p e r u t o c i t o s primarios, espermatocitor secundarios, e s p e r d t i d a s

y espermatoroides. Estas c6lulas germinslea no constituyen tipos

aelulares onto64miouente diferentes, eino que son producto do

-

un

procam0 contfouo de diferenoiaclón de l a s c6lul8s germinales

( 1 , 2 ) .

Las cdlulas de 8ertoli eon l a s únicas que existen

-

asade l a lámina basal haeta l a l u z del tdbulo, es

por

e l l o que

-

mantienen una orguiiraci6n tubular: eon célulae que preeentan

n i

cleos ovaladom, prominentes nocleolos y abundante gluc6geno en

-

e1 citoplasma, por l o que ee l e e atribuye l a funcibn de propor-

donar

nutrientes a l e p i t e l i o germinal adheridas a e l l a s (3),

--

pues ea ha encontrado que e l lactacto, producto metabólico de l a

glucosa en l a s c6lulae de Sertoli, es aprovechado por l a s célu--

l a s germinales ( 4 , 5 ) . Las célulae de Sertoli recubren l a membra-

na baa81 y l a interacclón ente l a s c6lulas a través de uniones

-

estrechas evita que toda macromolécula difunda de eapacio inters

t i c i a l a l tubular ( 6 ) , estas unionee eetrechae constituyen l a ba

-

r r e r a henatotesticular, de tal manera que l o s marcadores Mcromq

lecularee como l a ferritin., peroxidaeae y otras euetanciae admA

nistradas a l a circuiaci6n general no l a atraviesan.

L. aaci6n testicular dopende de elementos dlversos

(7).

Las hormonas gonadotr6ficas hormona f o l f c u l o estimulante

-

(=E)

y hormona luteinizuite

(HL)

60 secretan en e l 16bulo ante-

(7)

CERPBBO

HIPOTALAIY)

BIPOFISIC

TEST1

T e j i d o

interaticial

(8)

rior

de l a

hipófisie

y actdan respectivamente sobre receptores de cólulae de S e r t o l i 8) y sobre receptores de c6lulas de Ley-

d i g para inducir ru actividad eeteroidogénica ( 9 , l O ) . La

tertoi

terona ( T ) junto

con

l a

RL

=tienen un r i s t e u de retroaliien-

tacibn neaativa, ya que cuando se

eleva

en

l a sangre 01 nivel

-

de HLprcduce l a inhibicidn del factor liberador de

HL

en e1 h i

p o t 6 1 ~ 0 , l o que induce a reducir l a liberacibn de

erta

hormona,

provoccmdo que e l nivel de aecrecibn de

T

en l n e c6lulas de

Lez

d i g disminuya (11).

Por o t r a parte, l a

HFE

al interaccionar

aon

l o a

r.

ceptor.8 e x t r a m e m b r ~ a i e r de l a s c6lulae de S e r t o l i (12) promy

ve l a s f n t e s i s de una proteina unidora de andr6genos (ABP), que

se une principalmente a T y 5 d d i h i d r o testoeterona (DHT) con

-

una a l t a afinidad y rápida dieociación (13,14); La iunción prio

cipal del complejo AMP-andrbgeno ea que l a protefna transporte

y mantenga a l o 8 mdrógenoe dentro del compartimiento tubular,

de manera que al l i b e r a r e l andrógeno (T) induzcu junto

con

l a

WE y

HL

l a diferenciacibn y maduracibn de l o a espermatozoide8

115)

An teceden tee.

En e l testfculo, l a e célula8 de Sertoli s u f r m di-

visiones ccnatantes cuando e l animal es inmaduro, que terminan

cuando l l e b a a l a pubertad y ccmimnsa una r i p i d a p d i f e r a c i b n

-

(9)

..

" , . . . , I . . ... ,

.<.,

, , .

....

.

.. I . , , ~.~

, , , . .. . ~ ,,... < ..

1

~ ~~

y diferanciací6n. Por l o t a t o en e l 8nimal aduito, un8

gran

-

parta de l a masa teoticular son 06luiar de l a l i n e a geriín8l:

-

tambidn

sa

h.

ancontrrdo qua 18 sacreci6n da ABP, truraferrina ( p r o t e h a qua t r m q o r k hierro,

TP)

(16) y 18 raopuaot8 hono-

n8l da l a s c6lulae da S e r t o l i

vitrQ

a m b i 8 de 18

-

inmadurez 8 l a madurar (17).

lluohoe estudios con objeto de comprander

la

fiaio- l o g f a tarticul8r hrri sido iiev8dos 8 cabo en 8nimalae inmaduroo,

donde se puede obtener una produccidn

más

a l t a de cólulae de SeE t o l i con poca contrminací6n de 18 l i n e a g a r i i n a l . 3in embargo,-

l a funcidn de Óatas no as un

sietam8

adecuado para eatudfar 18 f i e i o l o g f i como en c6lul8a de animalas adultos (18).

También

ae han realizado cultivos enriquecidos en c6lulas de S e r t o l i

(19,20)

provenientes de ratas inmadur80, con e l f i n de detectar sus mecanismos de regulación f i e i o l ó g f c a .

-

EU otros estudios se han empleado ratas adultas para conooar fun

duentalmente e l aspecto morfol6gico de l a s c6lulaa de S e r t o l i

( 21,221

.

Lo8 estudios hasta 8quf

menoionados,

a l igual que

algunoa otros ( 2 3 , 2 4 ) , se han llevado a cabo en ouspenaiones ce-

l u l a r e s , o bien

en

citosolee o fracciones subcelulares obtenida8

8 p8rtír de ?raooionao rnriquacidaa, y 8unque eon da gran valor,

(10)

de reguiacibn ante diverso8 cambios de l a s condicione8 u b i o n t g

l o a a l o s que .e encuontran sujetas.

Lo8 cultivos primario8 Juog.n un papo1 fnnduiskl

en 01 e8tUdiO de 1 i mOrfOlOgf8 J fisiOlO&fa C S l U l U (25). COn

-

e1 establecimiento de l i n e r s celulares que mantengan l a 8 propia

dedes de funcionalidad de1 tipo celular deseado, me pueden iavo)

t i e r sus mecanismos de regulación f i s i o l b g i c a en cultivo. Lar

c l l u l a e en cultivo primario al menos inicialmente, expresan mu-

chas de l a e funciono8 y propiedades de l a s misma8

&

-

,

--

esto puede

aer

e l r e f l e j o de cómo operan

en

e l animal

la

m.

Sin

embargo, puede ser que v a r i o 8 aspectos de su comportamionto

cambien inmediatamente a l someterlas a cultivo, esto debe ser

-

tomado en cuenta en e l diseño de un sistema de cultivo primario

(26)

La funcidn del suero en e l desarrollo de cultivos

-

celulares, es l a de proporcionar hormonas y factore8 de croci-

miento, por l o que ea utilizado como

un

complemento del medio

-

de cultivo; se.ha demostrado que trabajando con órganos, e l

su2

r o , suprime l a expresión de muchas funciones diferentes de lar

c6lulas en cultivo primario (27). Por o t r o lado, l a eliminación

del suoro permite desarrollar un medio completamente definido

-

que f a c i l i t e l a detection de l o s efectos provocados por l a va--

ri8cibn de las concontraciones de proteína8 u

horwnra

o r p c f f l

cas on l a s c6lulaa estudiada. (28,29).

(11)

Por l o anteriormente

mencionado,

marfa deeoable

ea

t u a i u

lor

m e o 8 n l a i o ~ do r e g i i l a c f b endoorina tertioolar e8pl.-

ando oultivor primarios de eetlrpea de tertfoolo,

l o

que eblfc.

U e r t a b l e o i i i r t o provio de l o r p u k t r o r que

pniitr e1

irg

t r l i i e a t o de

aiohor

tipoi, celularer

en

condicione.

funoiouier

.doaord.i a l o l a r g o de

lor

bileranter período. do

inoob.siám,-

que requierui, de aoierdo

a

lor

protoooloa e x p e r i H a W l e r 00-

pondientes.

I1

.-

OBJLTIVO,

Establecer cultívoe p r i u r í o s en medio l i b r e de

---

mero de c6lulaa de S e r t o l i , obtenida8

a

p a r t i r de

ntar

a d u l t ~

(12)

.,.".> .~ ...., .. ._...,. ^ 1 ~ ...,

...

., .. ,,* .. . . .~ <..

,, , . . ".. . -,,,"

..-.

.r-r-...*-.-*-r-.-cl--w

I

_. .~ .

I _

111.- IUTBRIALES Y METODOY

Todoa l o a r..otivoa u t i l i r a d o a aon de grado analíti-

00: C o l y e n r i ~ tipo I A , Pico11 da

PH

400.000, PuiCre8tftU y

-

Albúmina de suero

bovino

( M A ) me obtuvieron de

Si-

Chmmic8i

Corp. ( S t . Louie, USA.). Los d a d s reaotiros

non

de

J.T.

m e r

(Mxioo,

D.P.).

Loa

iedioa de cultivo a l Igual que l a L-(luta-

mina me obtuvieron de In V l t r o (itóxlco,

U.P.).

Loa .ntibl6tl-- cos añadidos

non

preparaciones específicas para aedioa de oul-

tivo de In

Vitro

o

preparaciones comercialer (Scherinq A.C.).

A

todaa l a s aoluclonea empleada8 ae l e s adioion6 1

-

m1. de una mezcla de

penicilina-estreptomiclna

(10,000 U1

-

1,000

U/ml.)

por

cada

m1,

o gentamicin. a una concentraci6n

-

f i n a l de 2 0 ~ 3 / m l . y eo f i l t r a r o n con e l aisteaa n i l l i p o r e a

-

trave6 de meibranaa tipo GS con tamaño de poro de 0.22

o

0.45

s a .

Se utilizaron rata8 macho adultae de l a cepa

Wiatar

de aproximadamente

90

días de edad; se eacrificaron por medio

da dialocaci6n cervical en grupos de 2 a 4 l a l i a l e s .

Ye procedib a extraer l o a teetfculoa para au d e a c a p

aulaci6n. Yreviaiante ae l e a lar6 con agua, jabbn y etanol

al

7Op an l a zona eacrotal. La elagre residual de l o r teatfculoa

se elimia6 medianta varios lavadoa con una aolucibn u o r t i g u a - dora

K

W

(ver Ooipoahdda

en

a1 ap4ndice) pri

7.4,

adicionada

-

(13)

con e l antibibtico correspondiente.

Los testfculos fueron deacapsulados J ae le8 elimi-

n6

al J x i i o l o s vasos sangufneoa clrcundmtes con e1

uso

da

-

material de c i r u g í a e s t & r i l ; terminado este proceso, 8e depo8i

taron

por

pares

en

matraces Hrlenmyer de 25 al. para ser tra-

tados con 7 m l . de KRBC-colagenaea (1 mg/ml.), se taparon l o s

matraces y se procedib a incubar en baño Warfa a 3 T C durante

18 minutos con rgitacibn periódica. Terminado esto lap80, se

-

wregaron

a

cada matraz 15 i1. de Hac1

(0.9s)

y se l e s invirti6

en 10 ocasiones: deapubs ne dejaron reposar a temperatura am--

biente 10 minutos. Concluido este tiempo l a suspenri6n se fil-

tr6 R travbs de una malla e s t é r i l de poro aproximado de entre

50-100 L1..

La fracción i n t e r s t i c i a l cruda, puede ser separada

y purificada meaiante centrifugacidn a traves de un gradiente

de KHBC-Pico11 (13$)-WA

(O.%),

obteniendo una fracción enrl- quecida de cólulas do Leydig que puede ser u t i l i z a d a para cul-

tivo de tejidos o para medir l a actividad esteroidogbnico (30).

La fracci6n tubular cruda retenida en l a malla, se

colocó en a j a s do petri para una frylientación con b i s t u r í ,

(14)

"

..

.. .

,

2 O 4

r8-

DUertM

por

dialooacibn Oe?ViC81

I

1

Teatfculoa deacmpwldor

U ~ 8 r

Oon

KRBG

p8r8

retir8r rangre

7

i1

.d nm-c01.(I !a8 8.

(1

W/Bl), 18:

37%

c/.gitaci6n peri6dice

15

i1

de IiGL

0.9s.

1

nvirtiendc varia8 reces,

repour

10' a

temperatura aibiente

1

Filtrar

a

trade

de una

&la

de

poro

50-100 pm

Fracción intereticial

cruda

P8mibn

tubular cruda

pryaentacián de tdbulos

1

1

I

x )

i1

KilBC-Pancreatina,(0.2

W/mi)

2 0 1 ,

28.c.

c/agitacián

peri6dica

Sedimeatar 18,

C C ,

io*

Pmg~entar

a

trade de una aguja

y

por

agitacibn n d n i c a

1

centriftyar

i,üüo6

5 ' .

5-lbc

(15)

.. .

,

....

aoioapendor

l a

p a i t i i i a en

KRBG

1

Sodiicmtu

18

a tr8v6s a.

un

gr8diente

aiscoitfaoo

ao K B B ~ - ~ ~ O H (2-6$),

C c ,

Hecupwar fra&ionea

4

y

5

$ del gradient.

F i l t r a r a trav6s 60 una a a i l a de poro 50

-

100 p i

1

contrirugar

i,ooo

5 9 ,

5.c

1

.

Resuapmde-r en DWn

Sembrar en botella de 25 nl, 10 n l

de

medio

e

1

Cambio de medio 48 y 72

incubar a

37%

(16)

20 a l . de i(nBC-purcreatina (0.2 mg/ml.), incubando en b a o Ma-

ria durante 20 minuto8 a 28.C con agitaci6n peribdica. Tr8n8ag

rrido erte tieipo, 8e pa8aron

a

baño de hielo

o

a

refriger8Oi6n

10 minutos, para deipuó8 decantar e l sobrenadmte b e t a dejar

aproximabuente 10 a l . . Con UM jeringa de v i d r i o de 2ü m l . de

capacidad J aguja del ndmero 20, se disgregb l a fracci6a tubu-

lar fragmentada, haciendola

pasar

en

3

o

4

ocasiones a trav6o

de l a aguja, y posteriormente con agitaci6n mecánica durante

-

15

segundos para romper los fragmentos tubulares peque508 obto niendo grupos de c6luias aisladao.

L a fraccí6n de cada matraz totalmente disgregada,

-

fue colocada por separado

en

un gradiente discontfnuo de

KRBG-

sacarosa del 2 a l 6s

( 5

a i l . para cada escai6n) contenido en prq

betas de 50 n l . , dejándolos 30 minutos

en

refrigeracibn para

-

que ocurra l a separacidn celular de acuerdo a l a densidad pro-

p i a de c a d c d l u l a . Se separaron l a s fracciones correspondien-

tes a l 4 y

59

de

KHBG-

sacarosa y se f i l t r a r o n a través de una malla depositando l a s fracciones sobre tubos de centrífuga; 8e

centrifugd h 500 x g durante 2 aínutos, se desechó e1 sobrena-

dante y se y r e g d a cada tubo suficiente medio de cultivo para

resuspender e l b o t h celular.

Culti vo celu&

La c6lulas obtenida8 mediante e l procedimiento ante-

(17)

__I_ ,X,...._..,._,, . .__._/..,..,..,_.

.

.

, . , , .~ ~. ....

, , ~. . .. . . .,.. . . ...,. ~ .,.".,---. ....* * ,. ...* - -.-..- -.-c.

1

~ -

r i o r fueron reiuspendidas en medio eaencial afnimo do Eagle

-

iodIfic8do por Dulbocco

(DmW)

y sembradai en b o t e l l a i Falcon

con un v01ui.n t o t a l de

medio

de cultivo do 10 ml a una donai-

dad c e l u i a r 89rox1iPd. do

3

x 10

5

C6lulam/ml. 6 en o a j u multi

pozoa de

4

68vidulea ( m c ) caioapacidad

aproximada

ae 1.2-1.5

81. por podo.

L8a

c6luiaa a. inoubaron a 37.C oon r x c l a de C02-- a i r e (5:95$ v/v), irnteniéndoae en cultivo durante periodos de

24-72 hrs., con cambio de medio a h e 48 y '72 hrs. de cultivo.

Se eiple6 mioroacopio invertido Karl

Zeise

de con--

traete de :asea, con cámara y pelíoula de a l t o contraste *High

contrast copy

rilm*

en formato de 24 x

35

mm, asa 6; se eipleb

f i l t r o de interferencia de 560 nm. Las fotograffas s e impriaie

-

ron sobre papel fotográfico "poly contraat rapid", se us6 fil-

tro del No. 4 para incremento de contraete.

1v.-

RESULTADOS,

Lar célula8 do S e r t o l i obtenldaa de l a fraccibn enri

-

quecida cruda para cultivo, fueron Identificadas con base en su

(18)

Condicionoa i n i c i a l e a do l o s cultivos de células de S e r t o l i .

~

Vi8bilib.d.

90,3

P

Purosa.

7 2 3

%

Est irpa

con

taminan te. ESperE8tOCitOS p r i marioe, eapermáti- das, espermatozoi- des.

Densidad colular

i n i c i a l .

3-5

105

Factores niladidos al L-gl u t m i n a ,

medio de cultivo. gentasicina.

sin suero.

24

-

72

hrs.

--

Tiempo de cultivo

Para l a pureza, l a s células fueron teñidas con fuc eina Acida e identificadas por su morfologfa; l a coataminaci6n en l a fracci6n tubular no de Sertoli corresponde a l a s c6lul8s mencionadas en l a tabla I.

C a r w t e r f e t i c a s norfol6giqaa de los cultivos primarios

a l o a

36

Y 48 hrs.

En l a s eiguíentes figuras, 5e aprecia e l establecí--

miento de cultivos primarios de células de Sortoli. Las figuras

1

al

11 fueron tomadas a l a s 36 hra. de incubacidn sin cambio

-

de medio; l a 1 2 y

13

so obtuvieron

a

l a s 40 hrs. previo caibio

d e nedio.

-1%

(19)

La dascripcíbn colular se efectuo en a1 centro del

c u p o visual, ya qua debido a l a 8berraci6n esf6rica provomda

por 18 lente de 18 c k r a propicio di8torsi6n en l o 8 cupo. da

18 p a r i f a r i a .

Lor aspactor generales de l a s figar80 muestran en

-

todo. lo. c u o a

contuinwibn

de l a l í n e a germinal en mayor o

menor proporci6n. no aa detecta l a presencia de contamínaci6n

baCteriui8 (8610 an 108 caeoa qua ae indiquen),

ni

de c6lulae de Leydíg y l a presencia de eritrocito8 fue prActícamente nula.

no hay manireatacíonae de picnocis a eetos tiempos. La v i a b i l l

dad y adheeividad celular en l a s botellas Falcon (donde se ob-

tuvieron la8 fotograffas) fue adecuada.

(20)

Pig.

1.-

A8peCtO gmet81 de1 CU1ti.O de c6lü188 de Sertoli a 18s 36

hrs.

i i n oambio de medio a

l i s

24 hrs..

#a

r p m i a una densidad ce-

l u l a r muy elevada y diatorsibn en l a p e r i

f e r i a .

Fig.

2.-

En

e1 oontorno ruporior e izquierdo, se

-

observan cip.8 suporpuertas que inaic8n

-

mayor densidad celular y escasa f i j i c i b n ;

en e l campo claro se ertablecen l a s c6lu-

l a s de S e r t o l i con buena adhesividad.

Pig.

3.-

Se muestra una a b m d u c i a en células de S e r t o l i y l f n e a germinal; capas super--

puestas que ispiden l a adherenoia propia

(21)

.

I'

,

F i g .

2.-

a.-

CBlulas de Sertoli;

b.-

Espermato- goniaa; C.- hmperartocitos primarios;

d.-

E e p e r u t o c i t o s secundarios. Aumento 23 x 8.

Fig.3.

a.-

Células ae Sertoli;

b.-

Eapermato--

gonias; C.- Espermatoci tos priiarioe;d.-

(22)

i

P í y t ) . - a -

C6lula d e sertoii;b.- Espermatogonia;

C.-

Eepernatoci

to primario;d.- Espermato-

cito secundario;e.- EspermAtida;e!- i.lspex

Pig.

5.

a.-

Células

d e

3ertoii;b.- Eepermatog6nia

C.-

Eepermatocito priaario;d.- Esperiato-

cito

secundario. Aumento

23

x 8.

. .

. .

. .-

(23)

n . . " -. , -* "

-i

. . .. ,. . . . . ... . . . . . . ~ . ... - .. ... . .-

.. .

Pig.

4.-

Prerencia de v a r i a s cap.8 ceiuiarmo,

con e80888 8dberencia.

Fig.

5.-

Se

muertra una abundante porci6n de

-

células de d e r t o l i formando una mono-

capa en

e1

extremo i n f e r i o r ; en e l

--

contorno derecho de l a f i g u r a se pie1

(24)

. .

Pig.

6.-

So

maoatra una

buen8 distribución de

06lu-

l a s

do

Sertoli

aon

o e o u a 8dhosirid.d y

a-

bpndrrit08 f r q p e n t o s

do

l a l i n e a g o r ~ i n a l .

Fig.

7.-

&a todo

el

campo

visu81

80

observa una

--

buena díetribuci6n

uniforme de

c6lula8,

-

esca8a

prosencia d e espermltidas y

frag--

mento6 de

espermatozoídes.

-.-

.-

..

I-

..-

, .

.

."

. ..

.-

. -

(25)

~ i g . 6 .

a.-

C6luiae

de 3ertoii;b.- Espermatogonia;

C.- mpermatoci tos primarios;

d

.-

Esperma-

tocitoa 8ecundarioa;e.- Eapermátidae.

Aumento 23 x 8.

..

. <

Pig.7.

a.-

Célula de Serto1i;b.- Lapermatogonia;

C.- Eapermatoci to primario;d.- Capermato-

(26)

Pig.

8.-

Densidad celular ai1y a t a , 80

indiocrn

l a b cdlulas i i e roproaentativas de1 cultivo.

. -

Fiz.9.-

Esta figura ea una arpliricacibn del

mar

-

gen

punteado de l b figUr8

anterior.

Se

observa

gran drn~idad celular y

mayor

--

8preCi80ibn de l a morfología de cada c4-

l u l a .

(27)

a.

-

b.

-

C.

-

d.

-

e.

-

Aun

.8.

Células de Sertoli;

E8perma

togonia;

.

E8permtocito pri-

mario:

Espermatocito eecuz

dario;

Eepermdtida.

lento

23 x 8 .

Fig.9.

a.-

célula

ae

Sertoli.

b.

-

Eeperma

togonia

.

C.-

Bepermatocito pri-

d-

Espermatocito aecun

-

e.-

Espermltida.

mario.

(28)

.

..

Pig.

10.-

Ye observa una diatribuaíbn

poco homogóne8,

l a prerenaia de esper8átidas madur8s

es pr-

ticamente nula.

Pig.

11.-

ista figura

e a una

amplificacidn del margen

punteado de la figura anterior; el cual pe1

mite diforenciar claramente la morfología

-

de l a s

c6lulas presente8 en cultivo

d e

36

-

hre. ain caibio de medio.

*Aumento

10 X.

*

(29)

. .

. .

Pig.10.

a.-

célules

de S e r t o l i ;

b.

-

Espe rmatogonias ;

c.-

Espermatocito8 pri-

d.-

Espermatocito aecu5 marios.

dario;

0.-

Espermdtida. Aumento 23 x 8.

a.-

Células

de S e r t o l i ;

b.-

~epermatogon ian;

C.- Eeperrnatocios pri-

d.-

dspermatocito secun

a-

Ú s p e r d t i d a . marios;

(30)

Fit3.12FSo m u o ~ t r u i c6iuias de S e r t o l i bien d i s t r i baldas en una monocapa; 8. detect8 l a pre-

sencia de detritos de manera eacaaa. Tiem-

po d. cultivo 48 hra., después del

cambio

de medio de cultivo.

Fig.1a-Se obeervan células de S e r t o l i aisladas y con

buena adherencia. La presencia ae células de

(31)

._

..

..

Pig.12.

a.-

Célula de S e r t o l i ;

b.-

Detritos.

Aumento 23 x 8.

Pig.13.

a.-

Célula de S e r t o l i ;

b.-

Bacterias.

(32)

-' I--.--..--.--

---i . , ..~. ... . .

-

..

-.

.. . w-. r . c

1.-

4ixuuuL

Sa u t i l i s s r o n r a t u

mcho

8 d u l t u

nozm8las

para obto

aet

dimlu

4ptiiri.ite

8cti-s

aa e0 ragui8oibn

aa&oorim,

ya

-

que

ea

animalar

iarduros. r ~ n q u e pueda onoontrar un iayor

ng

maro da célula8 da Yartoli no remulta 8decudo para e1 estudio

-

da1 oorportuiento n a o r r l n

cam

ea

un

animal maduro por no eo--

tar plammente desarrollada l a funcidn gon8dal (17).. P o r

otro

-

lado, nuchos ostudios acerca de 18 f i s i o l o g f a testicular de 8ni-

i 8 1 0 S 8dultos, han eido l l e r a d a r

a

través de niinipul8ciones poco

coafiablee en base a l a eliminación o reduccidn de1 componente

-

garminal, mediante l a hipofisectamia ( 3 2 ) , criptorquidia (33),

-

irradiados prenatalmente o con interíerencia hormonal debido a l a

accidn de f6rmacoa.

Los

cuales son inadecuados para l a extrapola cidn del funcionamiento como en un animal adulto normal

(34).

L8 matodologfa de separación celular se basa en l a

descrita por Harrera, J. y cols. (%), l a cual no eetaba adapta-

da p8ri t r i b a j a r

con

e s t e r i l i d a d , de tal

forma

que se tuvieron

-

que hacer l a s modificaciones para l a obtención celular bajo estas

condicionee: en l a campana de f u j o lnminar, l a s soluciones de

--

KLRBC, KRBC

con

enzima8 ( c o l a g e n a u y pancreatina), sacarosa y a~

1in8 i m t ó n i c a fueron t i l t r a d a r con e l sistema Hillipore, puse

-

de l o contrario, l a posibilidad de adquirir contaminación b8cte-

rima

por oiisibn de este proceso as a l t a . Para un control efeg

tiro

de no contuin8ci6n microbian8 se hicieron pruebas de aste-

...

.,

(33)

r i l i d a d , que consirtieron en f i l t r a r todaa lam aolucioner con

-

penicilina -eatreptomicina

o

gentamioina

a trav6e del aisteaa

-

ubteriormsnte mencionado) ae tomaron alfCUOt88 y se l e a y r e g b

am cal&

nutritII.

(moto nutrient oroth dehydrated,

Difoo),

--

p r 8

fbCi1it.r e l OreCiiientO de iiOOb8Cteri8S

en

0.80 de que

-

existierub, resultando l a prueba n-tiva.

Sin

embargo, ae pudo

apreciar una mayor efectividad coa e1 uao de g e n t u i c i n a que

-

con

penicilina-estreptomicina,

favoreciendo l a obtención de cuL tivoe totalmente libre de bacterias.

E1 medio de cultivo

ae

u86 l i b r e de suero, ya que contiene entre otras auaLmciaa, hormonaa que pueden afectar

o

i n d i c i r l a activaci4n de l a regulacibn funcional de l a s células

de S e r t o l i (28).

Puntos c r f t i c o a de1 urocedlmiento.

se obaerv6 que un h V . d O incompleto con

KRBC

a

los

testfculoa deecapaulados, no elimina en gran medida a l o s peque

-

floe

va808 c8pilares que pueden l i b e r a r e r i t r o c i t o r , resultando

tbxicoa p8ra e1 cultivo provocando una dianinucibn en l a viabi-

l i d a d celular f i n a l .

I8 apliCaCi6n d. 18 @Ol.g.n8m8

(s),

produce #lila

-

aeparaoibn entre e1 compartimiento i n t e r s t i c i a l y e1 tubular, y

(34)

...-

I c-

..-

r. ..".

-..

I. .

c .

-.

.

C .

....

-.

con l a cantidad de tojido. Para d i g e r i r una mayor cantidad de

-

tojido, 80 nooeaita 860 colagonraa (una r e l a c i b 1:lO-20); una

aigemtibn muy prolongada tambión diOiinUY0 l a viabilidad.

Ea

lam fraccionoa

4

y

54

dol gr8dimte diacontfwo ae KíLBC-oacarou ae obtiono una mayor cantidad

b

célula8 do Sez

t o l i ,

y

on

..Dar proporci6n algaare

otraa

c6lular J

frag8ontoe

de 18 l f n o a germinal (o~porrirlocitos primarios, e a p e r d t i d a r

e

duras, colas de eaperiatoroidea, etc.), erto ae debe a que en

-

e l proooao de diferenciación de l a lfnoa germinal pasa por va--

r i o a e a t a d o r do deaarrollo, oncontrando eventualionto una donsA

dad a i i i l a r a 18s do S o r t o l i . . S i n eibargo, l a contriinación ae

l a l f n e a germinal no causa problema, y8 que desaparece en BU

mz

yorfa a l a s 48 hre. en e1 cultivo a l sor cambiado e l medio, por

no poder f i j a r s e OOM l a s c6lulae de Sortoli al fondo del pozo

o

do l a botella.

Para l a siombra ae u t i i i z d

como

punto de partida

-

una aenaidad c e l u l a r de 5 x 10 c6lulaa/il., observando que eat. valor era'muy a l t o , iiplicando escasa adhesividad; de

irnera

--

quo se biiiinUz6 l a donridad harta que ae enoontr6 quo l a c u i t i

dad d p t i u era aproximadamente de 2-3 x 10 células/al.

5

5

Se hioioron cultivos en caja8 multipozoa con capa-

cidad do 1.2 81. por pozo, a0 encontr6 quo en estar crjaa ofre-

cfan

a

la8 d l u l r a poca adho8ividad

por

tonor poca s u p r f i c i e

-

.

-25-

(35)

de contacto; l o ii8.o se apreció en cajas de petri ae roluien

-

a p r o x i i d o a 2 i1.

ae

a i i i e t r o de

35

x 10 mm. Los

wjoroa

rem&

tad08 se encontraron a1 8eihrar en botellas de

25

i1. de

vol&-

mon

total

y

4rea

de

9.5

cm (10 i1de medio de cultivo). Aquf

-

188 célula8 de S e r t o l i de88rrOlhrOn buena adhesiridad.

En

cul-

tiros

d a reciente8

ai

termino del Servicio 3ocial ( no io8tra-

do. en lam

fimrar

) , me encontr6 en todos l o 8

casos

la

premen-

2

cia de acúmulo8 OelUlare8 de i M O r a POCO s I ~ i f i c 8 t i V a . NO 80

-

apreci6 contaminación de otro tip0 celular como fibroblaator,

-

c61ulas de Leydig, etc. ( a ercepcibn de l a l i n e a germinal), l o

cual indica l a efectividad del procediilento y l a cantidad de

-

l a batorfa e n z i d t i c a , adecuada para l a separacibn celular en--

t r e u b o s compartimientos.

Loa tiempos 6ptiios de cultivo se encontnron entre

40 y 72 hrs. Después de eete tiempo se empezb a detectar picno-

81s celular. 3e observ6 que a l cambiar e l medio do cultivo

----

tranraurrido 24 hrs, se eliminaba gran cantidad de célular, ln-

cluyendo l a s de S e r t o l i , l o cual demueatra que a este tiempo

--

l a s c6lulas no 80 adhieren.

Las f i g u r a s 1

-

11 io8trlda.s en l o s rerultado8, fuz

ron

toasdas a l a s 36 hrs. después de haber sido seibrad88 l a 8

-

0 6 1 ~ 1 ~ . La8 figura. 12 y 13 representan tiempo. de 48 hrn.cu-

(36)

soncia b a c t o r i ~ a 8dvierte l a poca efectividad de 18 penicilina-

estroptomicirur, pero con g e n t u i c i n a

se

elimin6 totalmente este

probloi. en l o a cultivos colul8ros.

I Las 8aoreracionos

en

l a ida1tific8cibn iorfoi68ica

-

celul8r de l o s rosnlt8dos fueron argumontadaa con litorattar8 a--

p r o p i d a

(37.381.

I

Es importmte hacer notar quo l a actividad regulado-

ra de

las

células bajo estas condiciones de cultivo, no es

.vi--

d m t e 8610 deido e l punto de v i s t a morfol6gic0, de ahí l a necesl

dad de ímplomont8r una e v 8 l u a c i b funcional mediante e1 ostable-

cimiento de cultivos primario8 8 diferentes tiempos, que dotermA

no e l comportamiento "normal" de l a s cólulaa como e1 ciiste.8

&

-

vivo, para estudiar adecuadamente l o s mecanismos de regul8cibn

-

testicular (30).

VI.- C O N C L U ~ .

E l tejido teaticul.8r eat6 compuesto por varíos ti--

POR celularea en B U S compartirnientoa, por l o cual a0 roquiere do

su disporaibn i a h i c a y e n z i d t i c a .

La doneidad c e l u l a r 6ptima para l a siembra

es

4e

--

célul8s/ml.. E l uso de gentamicina permite obtener cui-

5

3 x 10

(37)

. .. ..

I.

..

I”

..‘.

c.

vos primarios l i b r e s de bactoriae.

E l tioipo donde re encuentra una ionocapa de c6lul.r

do

Yortoli

bien establecida y con buena adhesivid8d os

a

1.8 72

hrs.con e l cunbio do mod10 de cultivo on cajar quo ofrorom

m8--

yor euporficie do contacto, como l a s b o t e l l a s Falcon antea d e r -

c r i t a s .

L8

configuraci6n tridimencion81 de la8 nonocapas en

CUI

t i v o 00 diferente a l a s c6lulas

&

m.

La inter8ccibn c6lula-

c4lula o c4lula-tejido se pierden cuando

u?

e610 tipo de diu--- l a s R O cultiva.

En

l o s cultivos de

40

y 72 h r a , n o ee detect6 birr$ fringencia en inciuaionee citopiáeiicae y picnoria que son ma--

nifestaciones de daño celular.

La

vacuoiizaci6n muy marcada que nos indica probables cambios en l a presidn osm6tica de l a s c41g

l a s de S e r t o l i , fue también ausente.

La eliiin8ci6n de suero en 01 medio de cultivo,

si0

p l i f i c a 01 ortudio de l o 8 productos eecret8dos por l a s células,

ya quo l o r dnicos productos presentes en e l medio son l o s agrz

gad08 (L-glutanina, etc. v e r apéndice),

o

eecretadoa por lar

-

propias ~ 6 1 ~ 1 8 8 , por l o tanto, e1 ensayo y l a purifícaci6n de

(38)

,-”.

.. .

I

--

c

.<..

VI1.-

/iig&uw.

Ratu Mcho 8duit8a de l a cop8 Uistar de 90 dfas de edad

--

fueron sacrific8d8s por dialooación cervical y l o s teatfoulom son

extsmfdoa m conaicioaes de erterilidd, deacrpeul8dos y separutoa

om 2 fraocioner crudas: t u b u l u e i n t e r r t i c i a l , a p8rtir de l a s

--

aorlea

.e

obtienen fraocionea mriqUOCid88 de c4lulae de Sertoli y

Urdu

respectivamente. Las c4lulau de Sertoli se suspendieron en

Ilodío I.enc1.l Iltnim-Uulbeoco

( D U M )

adicionado con L-glutuina y

@ a t u í o i n a , da for88 tal que l a densidad celular fue de

3

x

10’

-

061U188/ml, a e i b r b d o s e on

boteilu

P8lcon con volumen tot81 de 25

m1. Las c4lulae se mantuvieron en cultivos durante periodos da

haz

ta

7 2 hie, a

57.

C con y

sin

cambio de i e d i o cada 24 hrs, pare dwbe

-

cs8r c(lUl88 no adberiaas. E1 est8bieciiiento de cultivos primarias

en ..tar

oondioionea

periice obtener c4lui.s de Sertoli con buena adherividad y l a s c6lulas

de

l a linea

germinal

me doapronden en au

u y o r f a a la8 48 hrs de cultivo, cumdo e l meaio es cambiado.Es ig portuite impleientar una ev8luaoi6n runcional mediante

el

establ$ oí8i.ato de CPitiv08

primrrlor

que oatexmine a1 eoiporlrrisnto

--

n o m 1 de la. c41ular como e l sistema

u

m.

(39)

,

..

"

, I.

v111.-

&#,&&&&.

Compoaici6n de l a eolucibn amortiguadora KrobcRiiyer de bl--

carbonatoa,

pH

7.4,

-aioioMda con glucoou a1 0.2 $

(m).

8.rotiro

dit.

c.

a.

n.ci

7.305 125

KC1

O.

373

5.0

T r í a 4.240 35.0

Glucosa 2.000 0.2%

Ajustar a

pH

7.4

U S O 4 7

H20

0.144 1.2

Wi$04

H20

0.120 1.00

Antibi6tico: Contamicina ( 20 & m l . ).

Solucionom o n r i m á t i c u on KRW: KHBC-colyl.naaa (

1

d a l . ).

KbW-panoreatina ( 0.2 mg/ml. ).

Gradient. discontinuo KRBC-sacarora: sacarosa a1 2,

3,

4,

5

y 6$

Composicibn a01 iodio do cultivo: nedio oaencial NInioo de Eagle modificado por Dulbecco

(Dun),

adicionado con L-glutaminn (200 in).

Sustuicia W/l-

CaC1 200

F O ( N O ~ ) ~

9H20

0.1

yigS04

7

H20 200

KC1 400

hac1 6,400

N.HC05 3,700 n,,n2p04

n20

125 Glucosa 4,500

Hojo

de

fono1

15 L-arg H C l 8 4 L-cy II t ina 48

Surtancia

w/l.

h g l n 548

310

L h i 8 HC1 H20 42

L-ile 105

L-1 eu 105 L-17s HC1

146

L-met 30

L-pha 66

t s a r

42

L-thr 95

L-trp 19

Sustancia

sell

b t y r 72

L-val Y4

D-pentotenate de Ca 4.0 C l O N r O de colina 4 4 Acldo f 6 i í c o 4.0 I n o i i to1 7.2

lticotinuida

4.0

P i r i d o u l HC1 4.0

Riboflarina

0.4

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