Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de

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(1)

Cuaabicrlaalliempe

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

SECRETARIA ACADEMICA

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio de l a presente se hace constar que el (la):

M. EN B. KElKO SHlRAl MATSUMOTO.

del Departamento de BIOTECNOLOG1A.

de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesor6 el siguiente Servicio Social:

TITULO

ALUMNO Luis Domlnguez Varela.

MATRICULA

9 1 33269 1

LICENCIATURA Ingeniería de los Alimentos. PERIODO

Se extiende la presente para los fines que a l interesado convengan, en la Ciudad de México, D.F. a veintiuno de Julio de mil novecientos noventa y ocho,

A T E N T A M E N T E "Casa Abierta al Tiempo"

Aislamiento y caracterización de proteasas de camarón.

Noviembre 14, 1997 a Mayo 27, 1998.

SECRETARIO ACADÉMICO

(2)

Nombre: Luis Doinínguez Varela Matricula: 91332691

Licenciatura: ingenieria de los Alimentos Unidad: hapalapa

División: Ciencias Biológicas y de la Salud Teléfono: 567-41-87

Trimestre lectivo: 97

-

O Horns a la semana: 20 horas Titulo del Servicio Social:

Asesores:

Aislamiento y Caracterización de Proteasas de Camarón

*Dra. Gabriela Mariana Rodriguez Serrano Profesor Titular “A”

Tiempo Completo.

Departamento de Biotecnologia

*M. en

B.

Concepción Keiko Shirai Matsumoto

Profesor Titular “A” Tiempo Completo.

Departamento de Biotecnología

Lugar donde se realiza el Servicio: Universidad Autónoma Metropolitana, Área -de

Bioquimica de Macromoléculas, laboratorio

S-146

y Planta Piloto de Carnes PP2.

Clave:

Fecha de Inicio:

Fecha de Terminacion: 14 de Mayo de 1998

Nombre del Proyecto: “Purificación y Caracterización de Proteasas a Partir de Cabeza de Camarón ( Penaeus Sp. )”

Firmas:

14 de Noviembre de 1997

-

Alumno

Luis Dominguez Vkela. Dra. Gabriela Mariana Rodriguez

Serrano.

L

M. en

B.

ConceDción Keiko

(3)

Aishmiento y Carnctenznción de Proteasas de Camarón __I_

I N T R O D U C C I ~ N

I

Los

o&anos ofrecen una gran diversidad biológica que puede ser proveedora de enzimas

con

características únicas. El estudio de organismos marinos con potencial de explotación y el estudio de las propiedades de las enzimas de éstos, redundará en el control de la actividad enzimática para aplicación comercial. Se estima que el 48% de las ventas totales

a

nivel mundial involucra

a

proteasas, pues es considerable su demanda para aplicaciones específicas en la industria

México se encuentra dentro de los principales productores de

camarón a

nivel mundial. S e d cifnis de la

Secretaría

de

Pesca, en

los

últimos diez años se

capturaron

alrededor de

70,000

a

80,000 toneladas

de camarón por ailo;

en

1995

se

tuvo un

volumen de producción en peso vivo de .

85,901

Ton de producción pesquera

nacional y

15,867

Ton en acuicultura y

para junio de

1997

se tenía una producción total de camarón de 78,879 Ton, de las que frecuentemente sólo se

aprovecha el cuerpo del camarón, y la cabeza es desechada

(SEMARNAP,

1995).

Sin embargo, la cabeza de este

cnist8ceo

es

una

fuente de productos de cierto valor agregado,

como

proteasas provenientes

del

hepatopáncreas y colorantes ligados al exoesqueleto.

El término proteasas se refiere

a

las enzimas hidoliticas que catalizan la degradación de enlaces peptidicos de moléculas de proteinas, con diferentes grados de intensidad y selectividad (Haard y col.;

1994).

Las

proteasas pueden ser clasificadas usando

algún criterio utilizado para proteasas de origen animal, vegetal o microbiano y, en otros

casos, pueden ser clasificadas en base a Io siguiente:

1.

Su

similitud a proteasas bien caracterizadas, como tripsina, quimotripsina,

quimosina, cFtepsina, etc.

2.

Su

perfil de actividad a pH ácido, neutro o alcalino.

3. Su sustrato especifico.

4.

Su mecanismo de catálisis.

Estas enziinas al ser proteinas que catalizan reacciones esenciales para los

organismos vivos, se sintetizan frecuentemente en forma inactiva: y as¡ piiedcn ser almacenadas o transportadas del sitio de sintesis al lugar de actividad. como es cl caso de la

pepsina. tripsina y quiinotripsina. Las enzimas proteoliticac se eiitucntraii distribuidas en

todos los tejidos y fluidos biológicos; las proteasas cstr:icdiilarcs coino Ins pancr&iciis y ghstricas, las proteasas de plasma de marniferos y las protensas bactcrinnas han sido las inis estudiadas y se tiene mas información; en caiiihio se ticnc inucho nicnos iiili)riii;iciOii de las proteasas intracelulares.

(4)

Airlamicato y Caractuhción de Probuas de Cnmirúóo

. . , . . , . ~ , , , ., ,. .. :,,... .,..I .,,,. ,,.., ,_;...,Lr..._ ,,.. , . ,

Por otra parte,

la

activación de

estas

enzimas puede ocurrir por dos medios:

a)

autocatalítica; la enzima inactiva precursora es un sustrato de la forma activa b) el segundo grupo de enzimas (mdoproteasas). requiere de uno o diversos iones

metálicos específicos para su activación.

Las

proteasas desempeñan

un

papel vital

en

biotecnologfa y son utilizadas en

detergcntes, limpiado

en

seco, curtido

de

pieles; en

la

industria alimentaria ayudando

en

aigunos productos,

como

producios hormados,

cerveza

y vino, cereales, leche y quesos,

ctiocoiate,

huevo

y

productos

de

huevo,

carne (ablandador) y pescado, legumbres y para la producción de hidmlizsdos

de

protelna, que se

usan

como saborbntes en la elaboración

de

diversos alimentos y son el resuitado

de

una

hidróiisis controlada de algunas

proteínas

(Haard

y

col.; 1994).

Normalmente, para aislar

una

enzima

es

necesario desarrollar un proceso de

purificación

específico; no

obstante,

mediante el

uso

secuencia1 de un número de técnicas

conocidas es posible aislar un número elevado de enzimas en estado puro o prácticamente

puro (Gacesa y Hubble; 1990).

O B J E T I V O S

Objetivo general.

Aislamiento y caracterización de enzimas proteolíticas endógenas a

partir

de cabeza

de

camarón

fermentado.

Objetivos particulares.

'%

Obtención del extracto enzirnático.

'b

Establecer el porcentaje de saturación en el extracto enzimático con sulfato de amonio.

% Purificación parcial del extracto enzimático por filtración en gel.

., - ,

(5)

___- Aislamiento y Caracterización de Proteasas de Camarón

___

M E

T O D O L O G i A

1. Características del camarón empleado

Nombre Común: Camar6n Café

Especie: Penaeus aztecus

Chif-ión: artrópodo

(c-)

Hábbtrt: estuarios,

mar

abierto, costa del

Atlántica y Golfo de México

Alimentación: algas y microorganismos

Infonnación nutricional: alto en proteína, vitamina C, hierro, calcio; moderado contenido de sodio; bajo en calorías

(Ocean

Planet,

1998)

2. Cuantificaeión de Proteína

Se cuantificó concentración de proteha

por

el

metodo de Lowry y

col.,

(1959) en

cada paso de purificación del licor, empleando seroaibiunina bovina como estándar

(SIGMA,

E.U.A.).

Reactivos.

\ Nazcol al 2% en NaOH O.

1

N. i CuSOj al 1%.

M¿todo.

i Tartrato de

sodio

y potasio

al

2%.

I3 Reactivo de Fohn en una dilución 1 : I

Se mezcló j0ml de la solucion A con Iml. de la solución B más Iml. de la solución

C. En un tubo dc ensaye se adicionó Iml de la-muestra problema y se agregó 5ml de la solución anterior. Despues de agitar se dejó reposando por 10 minutos en obscuridad.

I'osterionnente se agregó 0.5nil de la solución D y se agitó: se dejó reposar en obscuridad por 30 minutos. Por iiltiino, sc Icy6 absorbancia a 590 nm et1 un espectrolotómetro

r3eckitt;in

uv

o m

(6)

.

Aislamiento y CamtenzPción de Plotearns de Camarón

3. Caracterización de la Actividad Enzimitica

La

actividad proteolítica fue determinada en cada paso de purificación

por

el método de Kunitz (Jiang y

col.;

1991), usando como sustratos caseína al 1%

(MERCK,

E.U.A.) y hemoglobina bovina desnaturalizada al 2%

(SIGMA,

E.U.A.).

Para la reacción enzitnática:

En

un

tubo de ensaye se mezcló lml del sustrato (caseins o hemoglobina) y se le se adicionó 150 pl del extracto enzimático; para el

caso

del blanco se

adicionó

150 pl del

buffer donde se encontrabaa

La

reacción e m á t i c a se hizo

a

30 "C por 10 min,

a

pH 6.0.

Posteriormente, se detuvo la reacción agregando 2 ml de ácido tricloroacético al 5% (TCA); para el testigo,

se

agregó al sustrato 2

ml

de TCA cuando transcUmó el tiempo de

reacción y enseguida se adicionaron 150 pl del extracto e d t i c o . Por iiltimc, x

:gi:--...

los tubos

y

se centrifugaron durante 15 min a 12000 r.p.m. en

una

centrífuga

Sorvall

M C

12C y se leyó el sobrenadante

a

280 nm en

un

espectrofotómetro Beckman

UV

650.

Preparación de íos susiratos:

caseína: Se pesó 1 g de ceseha y se le adicionaron 50 ml desolución reguladora con

el pH deseado.

Se

calentó la caseína

a

"

baiio

Maria con agiiación por

20

min y se dejó enfiar en probeta y

se

llevó el volumen a 95 ml con el M e r .

Es

&o ajustar el

pH.

Hemonlobina: Se disolvieron 2 g de hemoglobina en 100 ml de buffer universal (ácido acético, ácido bórico

y

ácido fosfórico) con el pH deseado; se calentó

a

50 OC

con

agitación

manual (varilla de vidrio) y se mantuvo esta

temperatura

hasta que se disuelva. Después de enfriar, se ajustó el pH y se afotd a 100 ml y se le adicionó 0.02% de mida de sodio como

conservador. Para el caso de la hemoglobina desnaturalizada,

una

vez que se disolvió se

elevó la temperatura a 60 OC y se mantuvo la temperatura durante 20 min con agitación manual. Transcurrido el tiempo se enfrió, se ajustó el pH y se aforo a 100 ml y se adicionó azida de sodio 0.02% para conservar.

4. Obtención del extracto enzimático

4.1. Inóculo

El inóculomipleado es de Irictohcrcrllirs .vp Cepa BZ; para conservación de la cepa

(7)

Airlamiento y Caracterización de Proteams de Camarón

4.2. Fermentación

A partir de un lote de desperdicio de cabezas de camarón de diferentes tamaños, se

machacó y homogeneid

para

almacenarlo en congelación. Se

ocuparon

porciones del lote

de

1

Kg,

ai cual

se

le agregaba

10%

de glucosa y 5% de inóculo (Luctobucillus sp.). Se

llevó

a cabo una fermentación a 30 O C durante

48 hr.

Se tuvo control de la fermentación

midiendo al final el pH del medio y comparándolo

con

un control al que

no

se le inoculó.

Una

vez transcurrido el tiempo de fermentación,

se

centtifugó a

5000

r.p.m. durante

20

min

a 4

"C en

una

centdfuga

refngerada

Beckman J2Mí y, de esta

manera

es

como se

obtuvo el licor (sobrenadante). inmediatamente después de que se obtuvo el extracto

enzimático se mantuvo a

una

temperatura de 4 "C y se determinó actividad enzimática

(Kunitz,

1947) y concentración de proteína (Lowry y col.;

1959);

el

resto

que no se ocupaba

se almacenó en ultracongelación (Bio Freezer, E.U.A.) a -70 "C.

5. Purificación

5.1. Precipitación con sulfato de amonio [("&S041

El sobrenadante (licor) obtenido se precipitó

con

sulfato de amonio a diferentes

concentraciones de

saturación

(30%,-50??, 70% y

80%)

determinando para cada porcentaje

de saturación tanto

para

el precipitado como

para

el sobrenadante actividad proteolítica

(Kunitz,

1947)

y concentración de proteína (Lowry y

col.;

1959).

Posteriormente

se

centrifugó nuevamente a 4 OC por

20

min a

18000

rpm

en

una

centrífuga

refrigerada

Beckman J2MI

con

la finalidad de eliminar grasa y pimentos del camarón.

La

fraccionación se realizó a 4 OC para evitar la desnaturalización de las enzimas.

5.2. Diálisis del precipitado

Después de determinar el porcentaje de saturación óptimo se dialid contra buffer

de acetatos O.O5M, pH

4

y. contra agua desionizada; a

una

temperatura de

4

"C

por

48

hr.

Se llevó a cabo a una temperatura de 4 O C por

48

hr,

ademas se hicieron cambios del buffer

y del agua cada 12 hr y se procuraba que hubiera agitación.

Las

bolsas de diálisis

empleadas

(SIGMA,

E.U.A.) presentan una capacidad de 100 ml/ft.

5.3. Cromatografia de baja presión

El licor dializado se filtró a través de Fractogel TSK HW-SOC. (MERCK, E.U.A.);

en una columna de 3 8 x 2 3 cm. Utilizando como eluyente regulador de fosfatos 0.05 M a

pH 7.5 con azida de sodio al 0.02 %, con un flujo de 30 rnlhr. A Ius fracciones colectadas

(8)

A C T I V I D A D E S R E A

L I Z A

D A S

El servicio social tuvo un tiempo de duración total de seis meses, constando de tres etapas donde se obtuvo el extracto enzimático y se realizó una purificación y

caracterización parcial de

las

enzimas presentes.

r"D

- 6 -

. . ..

(9)

I - . , a z- - - ,

'

Aislamiento y CarnetCr¡zareión de Protuur de Camarón

-

L

@

O B J E T I V O S

Y

M E T A S

A L C A N Z A D O S

Se cumplió

con

los

objetivos establecidos al inicio del desarrollo del trabajo, ya

D

tb

Se obtuvo el exiracto enzimático

4%

w

tb

Se determinó el porcentaje de saturación

del

extracto enzimático con sulfato de amonio

B

Se d i z 6 la purificación parcial

de

las

enzimas

por

filtración en gel

%

Se determinó la inhibición de

la

actividad pmteoiítica

las

enzimas con EDTA

%

Se determinó

la

afinidad de la enzima

por

dos sustratos

D

@?

0

I

3 0

(10)

1,

-__

Aislamiento y Caracterización de Proteasas de Camarón

PROTEfNA (mg/mi) ACTLVIDAD (üími)

Con EDTA 0.36 0.0

Sin EDTA 0.36

7 X

10"

R E S U L T A D O S Y D I S C U S I ~ N

Como se expuso en la metodología, se cuantifico concentración de proteína por el metodo de Lowry y coi.

(1959)

en cada paso de purificación del licor, se empleó

seroaibúmina bovina como estándar (SIGMA, E.U.A.); así como actividad enzimática en

cada

paso

de purificación, utilizando como sustrato caseina (M.ERCK, E.U.A.) y

hemoglobina (SIGMA, E.U.A.). Una unidad de actividad enzimática (U) está definida como la cantidad a la cual 0.001 unidades de absorbancia cambian por minuto bajo

las

condiciones de ensayo (Kunitz,

1947).

Se ley6 la actividad proteolítica

a

280

nm,

las

proteínas exhiben un máximo a esta longitud

de

onda, que se atribuye al gnipo fenólico

de

la tirosina y el grupo ind6lico del

triptófano (Hams y Angal,

1992;

Scopes,

1994).

Debido

a

la gran cantidad de pimentos

presentes

en

las

muestras se tuvo que

hacer

diluciones para

las

determinaciones tanto de

actividad como de proteína, respetando las CO----~- I.* ...."PC-."l.*J Illl~.ulLiJ.

1. Producción del extracto enzimático

Se determinó en el extracto crudo enzimático que la actividad del licor hecha en presencia de EDTA

0.5

mM (tabla

1),

se

inhibía al 100%.

La

inhibición de la actividad proteolitica del licor presente en este trabajo

es

típica de enzimas que requieren metales

iónicos para funcionar (Vega-Villasante y

col.,

1995).

Se

utilizaron concentraciones de

EDTA desde

0.1

mM hasta

10

mM. Fik

(1984)

reporta

la utilización de EDTA

como

inhibidor.

Ae (U/mg)

0.0

0.019

promedio de tres observaciones.

Las metaloproteasas son inhibidas por un agente quelante como el EDTA y este efecto es reversible (Harris

y

Angal,

1992).

Dicha inhibición de estas metaloproteasas es

lograda cuando se trabaja con concentraciones alrededor de 5 mM. (Janson y Rydén,

1989);

aunque Harris y Angal reportan que I

m M

de EDTA es una concentración efectiva.

El

EDTA actúa como agente quelante'en el sitio activo del ion zinc en

las

inetaloproteasas pero también puede inhibir otras metaloproteasas que dependen de otros iones coino el calcio (Harris y Angal, 1997).

Tainbiin se pudo determinar actividad proteolitica contra dos sustratos diferentes (tabla 7 ) . con In tinatidad de observar por cual sustr;it« sc' tenia mis alíiiidnd, ericontrindose que fue por la Iienioglobina dcsniitiiralizada.

(11)

i .

.

1

Admiento y Caracterización de Protcisir de Camarón

/

+

2. Purificación

2.1. Precipitación con sulfato de amonio [(NE4)$3Ch]

Ai

efeciuar

una

precipitación

fraccionada

con

sulfato

de

amonio,

se

encontró que ai 70%

de

saturación se precipitaba gran

cantidad

de

enzima y se detectaba

poca

actividad

en

el

sobrenadante.

Ai

igual que Fik (1984),

en

una

purificación parcial

de

proteasas

de

Krill

antartico, encuentra que

se

requiere de

una

cantidad de sulfato de amonio

para

obtener el

70% de saturación.

En l a tabla 3 se muestran

los

valores de las determinaciones para cada una de los porcentajes de saturación donde claramente se observa que a un 80% de saturación con sulfato de amonio no se pudo determinar actividad enzimática, por io que se decidió

trabzjar con un

70%

de saturación en el

licor.

Con mayor claridad, en la figura 2 se muestra una comparación en actividad específica para el precipitado y el sobrenadante en cada

porcentaje de saturación, donde la mayor cantidad de las proteasas fue precipitada al 50% de saturación con sulfato de amonio.

(12)

Aislamiento y Cmrmeterización de Pmtemams de Cmmmrón

__.

_____-

Figura 2. Actividad específica del extracto enzimáiico bajo distintas concentraciones de sulfato de amonio.

% de Saturación A e (ülmg)

80

(-rite

UPrecipitado

1

Se empleó sulfato ?te amonio como agente precipitante por ser una sal fácilmente soluble y estable. (Janson y Rydén, 1989; Scopes, 1994).

2.2. Diálisis del precipitado

Se encontró que se obtenían mejores

resultados

contra agua desionizada porque se

efectuaba más rápido la diálisis y se obtenían vaiorcs más altos de concentración de proteína y de actividad enzimátka. Este paso de purificación

es

conveniente después de la fraccionación y fue empleado

por

Fik (1984) para remover las sales o

para

cambiar la solución amortiguadora. En esta etapa la proteína es introducida en una

bolsa

de membrana

semi-permeable (acetato de celulosa) y

las

moléculas de la sal pasan libremente a través de la membrana mientras que

las

moléculas grandes como

las.

proteínas son retenidas (Hams y

Angal, 1992).

2.3. Cromatografia de baja presión

Figura 3. Fracciones de la iiltración en gel que tuvieron actividad con

heinoglobina desnaturalizada a pH 6.

-

in-

(13)

Aislnmiento y Cnrncterizaci6n de Protemas de Cnmnrón

Una vez que se dializó la muestra, se centrifugó y se hizo pasar por una columna de cromatografía de baja presión.

Las

fracciones que fueron colectadas se les determinó

concentración de proteína y actividad proteolítica, obteniendo los resultados de las figuras 3 y 4. Estas determinaciones se realizaron

a

pH 6 con sustratos diferentes (caseina y hemoglobina)

L-

GB

-

Figura 4. Fracciones de la filtración en gel que tuvieron actividad con

caseins a pH 6.

0.8 T T 0.04

3

:::

3

0.5

,s 0.4

j

::;

q 0.1

O

1 3 5 7 9 11 13 I5 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39

Frascwoes

/--Atnorbancia (280nm) -AcIividsd

I

Se

determinó la actividad de las distintas fracciones sobre hemoglobina

desnaturalizada

a

pH 6, y se d e p t ó en las fracciones 4-5, 12-17, 22, 33 y 38 (figura 3).

También se determinó actividad R pH 6 con caseína (figura 4), teniendo picos en 4-6, 11-

17, 20, 23 y 26. Se pudo observar que, para la actividad determinada por el método de Kunitz

en

hemoglobina, hubo más afinidad que en caseína (figuras 3 y 4), pero en la determinación de actividad por electroforésis sólo se pudo utilizar caseína, porque con hemoglobina se tiñeron demasiado los geles y no se observaron claramente las bandas de actividad.

La

diferencia de actividad en las fracciones se explica por la presencia de diferentes

enzimás proteoliticas en el sistema digestivo del camarón (Jiang y col.; 1991).

En

cuanto a

la diferencia de actividad en

los

sustratos se atribuye a los cambios conformacionales en la

hemoglobina desnaturalizada, dado que presenta una estructura extendida que es mas susceptible a la proteólisis enzimática.

C O N C L U S I O N E S

En +e trabajo fue posible obtener el extracto crudo enziinatico. establecer que a una concentración del 7096 de sulfato de alnonio se precipitan las enzimas del extracto y se

realizó una purificación parcial de las proteasas presentes por medio de una filtración cn gel. D e igual forma. se encontró que las proteasas tienen niayor atinidad por hemoglobina

desnaturalizada quc por ciiscina y que soti inhibidas en presencia de EDTA.

(14)

' Aislamiento y Caracterización de Proteasas de Camarón

R E C O M E N D A C I O N E S

Cuando

se

lleva a

cabo

la fermentaci6n

se

debe tener cuidado de no cerrar

herméticamente los frascos de fermentación, porque hay producción de gases y pueden reventarse.

c j Se sugiere ampliamente el trabajar a bajas temperaturas para evitar la

desnaturalizaci6n de las enzimas presentes, se puede trabajar a temperaturas de 4 OC.

Cuando se cenbifuga,

se

debe tener

la

precaución de no llenar mucho los frascos de

centrífuga porque puede

haber

pérdidas por

una

mala centnfugación o poque se derrame el

liquido.

4

deben tener el pH correcto y no haber caducado.

i; Cuando

se

está empacado la columna de filtración en gel, se aconseja verter el gel

de

tal

manera que no haya espacios y no quede desnivelado, porque esto trae consecuencias

en el mal desarrollo de la filtración de las moléculas a través del gel.

Y

Es

tal

la concentra~ión de proteína presente

en

el extracto enzimático que hubo la

necesidad de

hacer

diluciones para poderla cuantificar, aquí se advierte tener cuidado en

las diluciones realizadas y asegurarse de los cáiculos efectuados tanto para la

determinación de proteína como para la de

mividad.

Y Se debe tener cuidado en el llenado de las

bolsas

de diáiisis para que no se rompan,

porque al dejarlas muy llenas del precipitado a dializar

o

no.sacarIes totalmente el aire,

puede originar una ruptura y con esto generar

pérdidas.

Se debe asegurar que

los

buffers empleados durante la comda de electroforésis

(15)

Aislamiento y Caracterización de Protusas de Camarón

--

L I T E R A T U R A

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Figura  3. Fracciones de la iiltración en gel que tuvieron actividad  con  heinoglobina desnaturalizada a  pH  6

Figura 3.

Fracciones de la iiltración en gel que tuvieron actividad con heinoglobina desnaturalizada a pH 6 p.12
Figura  2.  Actividad específica  del extracto enzimáiico  bajo  distintas  concentraciones de  sulfato  de amonio

Figura 2.

Actividad específica del extracto enzimáiico bajo distintas concentraciones de sulfato de amonio p.12
Figura 4. Fracciones de la filtración  en  gel  que  tuvieron actividad  con  caseins  a pH  6

Figura 4.

Fracciones de la filtración en gel que tuvieron actividad con caseins a pH 6 p.13

Referencias

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