Efecto in vitro del aceite esencial de Syzygium aromaticum y amikacina sobre pseoudomonas aeruginosa ATCC 27853

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE MEDICINA. ici. na. “EFECTO IN VITRO DEL ACEITE ESENCIAL DE Syzygium aromaticum Y AMIKACINA SOBRE Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853”.. M. ed. INFORME DE TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE:. ca. AUTORA:. de. BACHILLER EN MEDICINA. lio te. APOLITANO CÁRDENAS, CLAUDIA ISIS.. Bi b. ASESORA:. Dra. MEJÍA DELGADO, ELVA MANUELA.. CO-ASESORA: Dra. AYALA RAVELO, MARÍA SOLEDAD. TRUJILLO - PERÚ 2017. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. ed A mis abuelitos: Margarita y Napoleón, aunque ya no están a mi lado, siempre confiaron en mí y me apoyaron en cada decisión tomada.. lio te. ca. de. M. A mis padres: Jorge y Martha, y a mi hermana Cynthia, por su apoyo constante y por ser la motivación que me permite seguir adelante cada día.. ici. na. A Dios, por guiar mis pasos, iluminar mi mente y fortalecer mi cuerpo a lo largo de este camino.. Bi b. A Víctor David, por brindarme su cariño, compañía y ayuda, haciendo más hermosos mis días.. A mi familia, en especial a mis tías Consuelo y Alejandra, quienes me apoyaron a lo largo de toda mi vida.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTOS. M. ed. ici. na. A la Dra. Elva Manuela Mejía Delgado, por su tiempo, paciencia y conocimiento impartido durante la realización de este trabajo.. Bi b. lio te. ca. de. A la Dra. María Soledad Ayala Ravelo, por sus consejos, aportes, recomendaciones y tiempo invertido en la construcción del presente trabajo de investigación.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE. Pág.. na. RESUMEN……………………………………………………... ici. ABSTRACT……………………………………………………. i. ii. INTRODUCCIÓN…………………………………………….. II.. MATERIAL Y MÉTODO…………………………………….. III.. RESULTADOS………………………………………………... IV.. DISCUSIÓN…………………….…………………………….. 37. V.. CONCLUSIONES…………………………………………….. 43. VI.. RECOMENDACIONES………………………………………. 44. REFERENCIAS BILBIOGRÁFICAS……………………….... 45. M. de. ca. lio te. Bi b. VII.. ed. I.. VIII. ANEXOS………………………………………………………. 1. 7. 27. 50. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN Objetivo: Evaluar el efecto in vitro del aceite esencial de Syzygium aromaticum (AESA) y amikacina (AMK) sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Métodos: El diseño experimental incluyó 2 fases: la primera, determinó el efecto antibacteriano de AESA y AMK y la segunda, la interacción de ambos; mediante. na. los métodos de disco difusión, macrodilución en caldo y “tablero de damas”. ici. (checkerboard). Resultados: En la fase 1, se observaron halos de inhibición con. ed. AESA al 50%, 75% y 100%, que aumentaron proporcionalmente a las concentraciones ensayadas. La concentración inhibitoria mínima de AESA fue 50%. M. y de AMK se halló entre 4 y 8 μg/mL. En la fase 2, los halos de inhibición de AESA y AMK aumentaron. Con el método de “tablero de damas” la sumatoria de los. de. índices de concentración inhibitoria fraccional de AMK y AESA fue 0.625 indicando una relación de aditividad (0,5 < ∑CIF ≤ 1). Conclusiones: El AESA. ca. tiene efecto antibacteriano in vitro y la interacción de AESA y AMK posee efecto. lio te. aditivo sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.. Palabras clave: Efecto antibacteriano, aceite esencial de Syzygium aromaticum,. Bi b. amikacina, interacción, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT Objective: To evaluate the in vitro effect of the Essential Oil of Syzygium aromaticum (EOSA) and amikacin (AMK) on Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Methods: The experimental design included 2 phases: the first, determinate the antibacterial effect of EOSA and AMK and the second, the interaction of both;. na. through the disk diffusion, broth macrodilution and checkerboard methods.. ici. Results: In the phase 1, inhibition halos were observed with 50%, 75% and 100%. ed. EOSA, which increased proportionally to the concentrations tested. The minimum inhibitory concentration of EOSA was 50% and of AMK was between 4 and 8. M. μg/mL. In the phase 2, the diameters of the EOSA and AMK inhibition halos increased. With the checkerboard method, the summation of the fractional. de. inhibitory concentration indexes of AMK and EOSA was 0.625 indicating an additivity ratio (0.5 <ΣCIF ≤ 1). Conclusions: EOSA possesses antibacterial effect. ca. in vitro and the interaction of EOSA and AMK has an additive effect on. lio te. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.. Key words: Antibacterial effect, essential oil of Syzygium aromaticum, amikacin,. Bi b. interaction, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I.. INTRODUCCIÓN. El descubrimiento de los antibióticos se ha visto ensombrecido por la temprana aparición de cepas bacterianas resistentes. Actualmente, debido al uso injustificado de estos fármacos, las bacterias clínicamente importantes se caracterizan por. na. presentar resistencia a múltiples antibióticos.1. ici. Una de las bacterias más conocidas por su elevada resistencia antibiótica es Pseudomonas aeruginosa. Esta bacteria Gram negativa y aeróbica estricta es un. ed. patógeno oportunista que infecta a seres humanos con defensas naturales. M. comprometidas; además, es considerada un agente biológico nosocomial importante. Las infecciones producidas por P. aeruginosa son difíciles de tratar. de. debido a la resistencia natural de la especie, así como a su notable capacidad de adquirir nuevos mecanismos de resistencia; ya que prácticamente posee todos los. ca. mecanismos conocidos hasta la actualidad.2. lio te. Los mecanismos de resistencia de P. aeruginosa pueden ser específicos, para una clase en particular o generales, afectando a diferentes grupos de antibióticos. Los mecanismos específicos incluyen la alteración de dianas o target (topoisomerasa. Bi b. IV y girasa en el caso de las fluoroquinolonas, o los lipopolisacáridos, en el caso de la colistina), canales de captación o uptake channels (OprD, que media la entrada de carbapenems) o sistemas reguladores (AmpD, que reprime indirectamente el gen que codifica la β-lactamasa AmpC). Los mecanismos generales incluyen las bombas de eflujo, las cuales están conformadas por proteínas formadoras de canales de membrana externa (OMFs), un antiporter asociado a la membrana citoplasmática (RND) y una proteína de fusión de membrana periplásmica (MFP);. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. y son las encargadas de eliminar ciertos antibióticos del interior bacteriano. Los plásmidos, transposones e integrones pueden codificar factores adicionales de resistencia, incluyendo las metalo-β-lactamasas, que son activas contra casi todos los β-lactámicos; y enzimas inactivadoras de aminoglucósidos.3 Los aminoglucósidos es uno de los grupos de antibióticos más utilizados en el. na. tratamiento de infecciones por P. aeruginosa. Estos fármacos atraviesan la. ici. membrana externa de dicha bacteria mediante mecanismos pasivos, accediendo al espacio periplásmico, para luego traspasar la membrana interna mediante. ed. mecanismos de transporte activo que no se producen en condiciones anaerobias. 4. M. En el citoplasma bacteriano, los aminoglucósidos se unen al ARNr 16S componente de la subunidad 30S de los ribosomas e interfieren en la síntesis proteica bacteriana. de. al alterar la lectura del ARNm.5 El resultado final puede ser el bloqueo del inicio de la síntesis proteica, la terminación prematura de la lectura del ARN y/o la lectura. ca. errónea del ARNm con la incorporación de aminoácidos incorrectos a la proteína. lio te. sintetizada. Estas proteínas alteradas pueden incorporarse a la membrana interna y modificar su permeabilidad, provocando la pérdida de sustancias hacia el exterior y facilitando el ingreso de mayores concentraciones de aminoglucósidos.4 La. Bi b. amikacina, perteneciente a este grupo, es un derivado semisintético de la kanamicina, aminoglucósido natural derivado de Streptomyces griseus. El espectro de actividad antibacteriana de la amikacina es el más amplio del grupo y debido a que es la menos vulnerable a la inactivación enzimática es el fármaco de elección para el tratamiento inicial de infecciones intrahospitalarias graves por bacilos gramnegativos, en nosocomios con alta tasa de resistencia a antibióticos del mismo grupo, como gentamicina y tobramicina.4,6 Debido a esto, las infecciones graves e. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. intrahospitalarias por P. aeruginosa requieren generalmente un tratamiento con fármacos combinados pertenecientes a distintos grupos de antibióticos, con el objetivo de lograr un efecto sinérgico lo que se evidencia en un mayor efecto bactericida.7 La resistencia bacteriana y los efectos secundarios causados por los antibióticos. na. existentes, ha originado que se considere el uso de sustancias antimicrobianas. ici. naturales. En experimentos in vitro, se ha demostrado que las plantas producen un gran número de metabolitos secundarios que tienen actividad antimicrobiana. Estos. ed. se suelen clasificar en tres grandes familias de moléculas: fenoles, terpenos y. M. alcaloides. Estas moléculas antibacterianas formadas en las plantas han sido clasificados como “fitoanticipinas”, las cuales son compuestos inhibidores. de. preformados; y “fitoalexinas”, que se derivan a partir de precursores a través de la síntesis de novo en respuesta a un ataque microbiano.8. ca. Existen una gran variedad de plantas conocidas por sus propiedades medicinales,. lio te. entre ellas tenemos a Syzygium aromaticum, comúnmente denominado “clavo” o “clavo de olor”. Esta especia, perteneciente a la familia Myrtaceae, ha sido utilizada en la medicina tradicional como carminativo, estimulante y antihelmíntico natural.. Bi b. La extracción del aceite esencial a partir de sus hojas, tallos y yemas, es una de principales formas de su uso tradicional y medicinal. El principal componente del aceite esencial de S. aromaticum es un compuesto fenólico, llamado eugenol. 9 El alto nivel de eugenol imparte una fuerte actividad biológica y antimicrobiana. En el estudio de Raghavenra et al, este derivado fenólico ha mostrado inhibir la actividad de la 5-lipoxigenasa y del leucotrieno-C4 en leucocitos polimorfonucleares humanos.10 Los resultados de la investigación de Guénette et al, quienes utilizaron. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. un modelo experimental animal, apoyan la hipótesis que el eugenol puede aliviar el dolor neuropático.11 Ali et al, mediante un modelo animal de cirrosis hepática inducida por tioacetamida, demostraron que la fracción rica en eugenol de S. aromaticum inhibe la proliferación de células hepáticas y disminuye el estrés oxidativo, posible mecanismo de protección contra la cirrosis.12. na. Con respecto a la actividad antibacteriana, los aceites esenciales o sus compuestos. ici. activos que contienen el grupo hidroxilo (-OH) poseen alta actividad antimicrobiana. Además, la presencia de un núcleo aromático con un grupo. ed. funcional polar determina sus propiedades inhibidoras. El grupo hidroxilo es mucho. M. más eficaz en comparación con el grupo carbonilo (-CHO), ya que el primero puede unirse fácilmente al sitio activo de las enzimas y alterar su metabolismo.13 Este sería. de. el mecanismo de acción del eugenol, principal componente del aceite esencial de S. aromaticum. De acuerdo a investigaciones recientes, este aceite esencial muestra. ca. efecto antibacteriano considerable frente a varios géneros de bacterias; incluyendo. lio te. a patógenos de animales y plantas, a causantes de intoxicación alimentaria y a bacterias de descomposición.14, 15 Además, ha mostrado actividad antimicrobiana contra bacterias patógenas humanas resistentes a antibióticos.16, 17. Bi b. Debido a los estudios realizados acerca de la actividad antibacteriana de S. aromaticum, y conociendo que P. aeruginosa es un agente etiológico importante por el elevado número de infecciones y la alta resistencia antibiótica, se realizó el presente trabajo de investigación con el objetivo de determinar el efecto in vitro del aceite esencial de Syzygium aromaticum y amikacina sobre P. aeruginosa.. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PROBLEMA ¿Cuál es el efecto in vitro del aceite esencial de Syzygium aromaticum y de la interacción con amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853?. HIPÓTESIS. na. El aceite esencial de Syzygium aromaticum posee efecto antibacteriano y la. ici. interacción con amikacina efecto sinérgico in vitro sobre Pseudomonas aeruginosa. ed. ATCC 27853.. M. OBJETIVOS Objetivo general. Evaluar el efecto in vitro del aceite esencial de Syzygium aromaticum y de la. de. -. ca. interacción con amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.. -. lio te. Objetivos específicos. Determinar el efecto antibacteriano in vitro del aceite esencial de Syzygium aromaticum y de amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Bi b. mediante el método de disco difusión. -. Determinar la concentración inhibitoria mínima del aceite esencial de Syzygium aromaticum y de amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, mediante el método de macrodilución en caldo.. -. Determinar el efecto de la interacción del aceite esencial de Syzygium aromaticum y amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, mediante el método de disco difusión.. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. -. Determinar el efecto de la interacción del aceite esencial de Syzygium aromaticum y amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,. Bi b. lio te. ca. de. M. ed. ici. na. mediante el método “tablero de damas”.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II.. MATERIAL Y MÉTODO. 1. MATERIAL 1.1. Material botánico Para la elaboración del aceite esencial, se utilizaron los botones florales de. na. Syzygium aromaticum “clavo”, los cuales fueron obtenidos en el distrito de. ici. San Pedro de Lloc, provincia de Pacasmayo, región La Libertad. 1.2. Microorganismo utilizado. ed. Se trabajó con la cepa estándar Pseudomonas aeruginosa ATCC (American. M. Type Culture Collection) 27853, la cual fue adquirida del Laboratorio Referencial de Salud Pública de la región La Libertad, sede del Instituto. de. Nacional de Salud (Anexo N° 1). Las bacterias se conservaron en el cepario del Laboratorio de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Medicina. lio te. ca. de la Universidad Nacional de Trujillo. 2. MÉTODO. 2.1. Diseño:. Bi b. El diseño experimenta del presente trabajo se desarrolló en dos fases: Fase 1: Se evaluó el efecto del aceite esencial de Syzygium aromaticum (AESA) y de amikacina (AMK) sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. - Método de disco difusión: Se utilizaron discos embebidos con cada concentración de AESA (10%, 25%, 50%, 75% y 100%) y discos de AMK de 30 µg; hallándose la medida de los halos de inhibición. Se realizó 10. de. M. ed. ici. na. repeticiones por cada tratamiento.. Bi b. lio te. ca. IMAGEN Nº 1: Método de disco difusión en fase 1.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. - Método macrodilución en caldo: Para hallar la concentración inhibitoria mínima (CIM) de AESA y AMK. El Tween 80 y la bacteria sin tratamiento (control de crecimiento) formaron parte del grupo control. El experimento se repitió 5 veces.18 El Tween 80 o polisorbato 80 es una sustancia emulsionante que se utilizó en la preparación de las concentraciones de. na. AESA 10%, 25%, 50% y 75%. Se utilizó ampollas de amikacina 500 mg/. lio te. ca. de. M. ed. ici. 2mL (Medifarma®).. Bi b. IMAGEN Nº 2: Método de macrodilución en caldo en fase 1.. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Fase 2: Se evaluó el efecto de la interacción de AESA y AMK sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. - Método de disco difusión: En una misma placa se colocaron discos de AESA (50% ó 75% ó 100%) y AMK 30 µg. Se realizó 10 repeticiones por. ca. de. M. ed. ici. na. cada concentración.. Bi b. lio te. IMAGEN Nº 3: Método de disco difusión en fase 2.. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. -. Método “Tablero de damas” (Checkerboard) por macrodilución en caldo: Se utilizó la CIM de AESA y AMK obtenidos en la fase 1. Este experimento se realizó por triplicado.18 Se utilizó ampollas de amikacina. de. M. ed. ici. na. 500 mg/ 2mL (Medifarma®).. ca. IMAGEN Nº 4: Plantilla de trabajo del método “Tablero de damas”. Bi b. lio te. (Checkerboard) por macrodilución en caldo en fase 2.. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2. Procedimientos 2.2.1. Recolección e identificación taxonómica del material botánico Se recolectaron botones florales de Syzygium aromaticum “clavo”, antes de la floración, del distrito de San Pedro de Lloc (43 m.s.n.m.), latitud 7° 25' 11.52'' S, longitud: 79° 30' 13.75'' O, provincia de. na. Pacasmayo, región La Libertad, en el mes de octubre del año 2015.. ici. Un ejemplar completo de la planta se llevó al Herbarium Truxillense (HUT) de la Universidad Nacional de Trujillo para su identificación. ed. y posterior verificación taxonómica. El espécimen está registrado. M. bajo el código N° 58296 (Anexos N° 2 y 3).. 2.2.2. Obtención del aceite esencial de Syzygium aromaticum. de. El material recolectado fue transportado al laboratorio de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la. ca. Universidad Nacional de Trujillo, en donde se separó de las. lio te. sustancias extrañas presentes en la muestra y luego se secó a temperatura ambiente. La obtención de AESA se realizó por el método de destilación por. Bi b. arrastre de vapor de agua (convencional), el cual permitió un buen rendimiento. El AESA fue extraído a partir de los botones florales, previo tamizaje y pulverización, se colocó en un balón de fondo plano y se sometió a una corriente de vapor de agua sobrecalentada; de esta manera se arrastró la esencia que posteriormente por acción del refrigerante, fue condensada. El destilado se separó tomando en cuenta sus. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. propiedades de inmiscibilidad y diferencia de densidades entre el agua y AESA, utilizando una pera de separación de vidrio, se deshidrató las impurezas de agua con Na 2SO4 anhidro, se filtró y se guardó en un frasco de vidrio color ámbar (para evitar la descomposición por la luz) bajo refrigeración a una temperatura de. na. 4 °C19, 20 (Anexo N° 4).. ici. 2.2.3. Determinación del rendimiento de aceite esencial. La determinación del porcentaje de rendimiento de AESA se realizó. ed. a escala laboratorio por el método de arrastre por vapor de agua en. M. un equipo de destilación de vidrio. A partir de 150 g de botones florales de clavo, se obtuvo un volumen total de 18 mL de AESA, el. de. cual fue medido en una probeta. Por gravimetría y volumetría se determinó el rendimiento del aceite esencial (%RAE), aplicando la. ca. siguiente fórmula: 19, 20. lio te. %RAE = Vol. AE (mL)/ P. muestra (g) x 100. Bi b. Obteniendo: %RAE = 18 mL de AESA / 150 g de muestra x 100 %RAE = 12%. Donde: - Vol. AE: Volumen de AESA obtenido en mililitros (mL). - P. muestra: Peso de la muestra a destilar en gramos (g).. 2.2.4. Preparación de las diferentes concentraciones del aceite esencial Se midieron volúmenes de 0.6, 1.5, 3.0 y 4.5 mL de AESA puro (100%). Cada volumen se colocó en una probeta de 10 mL, y se. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. completó a un volumen de 6 mL con Tween 80, obteniendo las concentraciones de 10%, 25%, 50%, 75% respectivamente. Además, se midió 6 mL de AESA 100%. Cada concentración se colocó en frascos de color ámbar, para protegerlos de la luz, y se guardaron a 4 ºC para el estudio. na. microbiológico (Anexo N° 4).. ici. 2.2.5. Evaluación del efecto antimicrobiano del aceite esencial de Syzygium aromaticum. difusión. y macrodilución en caldo;. siguiendo las. M. disco. ed. El efecto antibacteriano de AESA se probó mediante los métodos de. recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards Institute. de. (CLSI).21. A. Método de disco difusión. ca. Método cualitativo basado en la capacidad de muchos agentes. lio te. antimicrobianos de difundir en el agar creando un gradiente continuo de concentración. Procedimiento:. Bi b. 1° Con el asa bacteriológica, se tomaron 3 a 5 colonias de bacterias morfológicamente idénticas, luego fueron transferidas a un tubo con 5 mL de caldo Mueller-Hinton (CMH) y se incubó a 37 °C durante 4 horas. La turbidez de la suspensión bacteriana en el CMH fue ajustada mediante su comparación con el estándar 0,5 de McFarland a 1,5 x 108 UFC/mL (UFC: unidades formadoras de colonias).. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2° La inoculación de la placa con agar Mueller-Hinton (AMH) se llevó a cabo como se describe por el CLSI.21 En esencia, se trata del hisopado de toda la superficie de la placa por tres veces, en tres direcciones diferentes, para asegurar el crecimiento uniforme de P. aeruginosa.. na. 3° Con una micropipeta, se colocó 50 µg de cada concentración de. ici. AESA (10%, 25%, 50%, 75% y 100%) sobre cada uno de los discos estériles (papel de filtro de 6 mm de diámetro), los cuales fueron. ed. embebidos y dejados en reposo durante 1 hora. Además, se realizó. M. el mismo procedimiento con Tween 80, el cual se utilizó como control. Asimismo, se tuvieron los discos de sensibilidad con AMK. de. 30 µg listos para su uso. 4° Con una pinza estéril se colocaron los discos sobre la superficie. ca. de la placa previamente preparada. En cada placa Petri de 85 mm de. lio te. diámetro se colocaron 2 discos de AMK de 30 µg ó 5 de AESA. Después de 15 minutos, las placas se invirtieron y se incubaron a 37 °C durante 18 horas.. Bi b. 5° Se realizó la lectura de las placas, y se registró la medición de los halos de inhibición en milímetros.22, 23 (Anexo N° 6 - Tabla N° 1) Interpretación de los resultados: De acuerdo a la medida del diámetro del halo de inhibición en milímetros, se tiene: Valores de sensibilidad de AMK21 -. Sensible (S): Diámetro superior o igual a 17 mm.. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. -. Intermedio (I): Diámetro entre 15 y 16 mm.. -. Resistente (R): Diámetro menor o igual a 14 mm.. Valores de sensibilidad de AESA según Duraffourd24 - Nula (-): Diámetro inferior o igual a 8 mm.. na. - Límite (+): Diámetro entre 9 y 14 mm. - Media (++): Diámetro entre 15 y 19 mm.. ici. - Sumamente sensible (+++): Diámetro superior o igual a 20 mm.. ed. B. Método de Macrodilución en Caldo. Método cuantitativo para determinar la concentración inhibitoria. M. mínima (CIM) de un agente antimicrobiano que inhibe el. de. crecimiento de microorganismos in vitro. Todos los pasos de este método se realizaron de acuerdo con las directrices publicadas por el. ca. CLSI.21. Procedimiento:. lio te. Para determinar la CIM de AESA 1° Se etiquetó los tubos estériles del 1 a 7 (Grupo experimental: 1 -. Bi b. 5 y grupo control: 6 - 7) 2° Se agregó 0.5 mL de cada concentración de AESA (10%, 25%, 50%, 75% y 100%) en los tubos del grupo experimental. 3° Se agregó 0.5 mL de CMH y 0.5 mL de Tween 80 a los tubos 6 y 7, respectivamente. 4° Se seleccionó 4-5 colonias aisladas de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y se diluyó en CMH hasta una turbidez comparable al estándar 0,5 de McFarland (aproximadamente 108 UFC/mL).. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 5° Después de 15 minutos de la preparación del inóculo se añadió 0.5 mL de esta suspensión a cada tubo 6° Se mezcló suavemente hasta uniformizar el contenido de los tubos, luego se sellaron con algodón y se incubaron a 37 °C durante 18 horas. 25, 26 Debido a la pobre miscibilidad del AESA, se mezcló. na. el contenido de los tubos con AESA cada 8 horas.. ici. 7° Después del periodo de incubación, previa agitación con una varilla de vidrio estéril, se tomó una muestra de 0,1 mL de cada tubo,. ed. luego se dispersó con el asa de Drigalski por toda la superficie de la. M. placa con AMH. Las placas sembradas se incubaron a 37 °C durante 18 horas. Este paso se realizó debido a la naturaleza del AESA.. de. 8° Transcurrido el periodo de incubación, se examinaron las placas, y se realizó el recuento de las UFC.25, 26. ca. Para determinar la CIM de AMK. lio te. 1° Se etiquetó los tubos estériles del 1 al 25 2° Se agregó 0.5 mL de CMH en los tubos 2-25. 3° Se agregó 0.5 mL de amikacina en los tubos 1 y 2.. Bi b. 4° Se transfirió 0.5 mL del tubo 2 al tubo 3 y se continuó hasta llegar al tubo 23. Se cambió las pipetas entre los tubos para evitar la acumulación de antibióticos. 5° Se desechó 0.5 mL del tubo 23. El tubo 24 (control de crecimiento) no recibió antibiótico.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 6° Se seleccionó 4-5 colonias aisladas de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y se diluyó en CMH hasta una turbidez comparable al estándar 0,5 de McFarland (aproximadamente 108 UFC/mL). 7° A los 15 minutos de la preparación de este inóculo se añadió 0.5 mL de esta suspensión a cada tubo, excepto al tubo 23 (control de. na. caldo).. tubos, y se sellaron con algodón.. ici. 8° Se mezcló suavemente hasta uniformizar el contenido de los. ed. 9° Se tomó 0.1 mL de suspensión del tubo 24 (control de. M. crecimiento) y con el asa de Drigalski se dispersó por toda la superficie de una placa con AMH. La placa y todos los tubos se. de. incubaron a 37 °C durante 18 horas. Interpretación de los resultados La CIM fue la concentración más baja de AESA y AMK en el que. ca. -. lio te. no hay crecimiento visible después del periodo de incubación (disminución o ausencia de turbidez en el tubo).. -. La concentración bactericida mínima (CBM), fue el subcultivo. Bi b. del tubo que contiene la concentración más baja de AESA y AMK que no muestra ningún crecimiento en la placa.. 2.2.6. Pruebas de interacción antibacteriana La interacción entre AMK y AESA se probó mediante los métodos de difusión en disco y “tablero de damas” por macrodilución en caldo, siguiendo las recomendaciones del CLSI.21. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A. Método de disco difusión25 Esta técnica cualitativa utiliza el mismo inóculo y agar (Mueller Hinton) que las pruebas de sensibilidad antimicrobiana. Procedimiento: 1. Preparación de los discos. na. a. Con una micropipeta, se colocó 50 µg de cada concentración. ici. de AESA (50%, 75% y 100%) sobre cada uno de los discos estériles (papel de filtro de 6 mm de diámetro), los cuales. ed. fueron embebidos y dejados en reposo durante 1 hora. Se. su uso.. M. tuvieron los discos de sensibilidad de AMK 30 µg listos para. de. b. Todos los discos se mantuvieron a temperatura ambiente. 2. Preparación del inóculo:. ca. a. Con una torunda, se transfirió 3 a 5 colonias de P. aeruginosa. lio te. a 5 mL de CMH estéril.. b. Se incubó a 35 °C hasta lograr una turbidez equivalente al estándar 0,5 de McFarland (1,5 × 108 UFC/mL).. Bi b. 3. Inoculación en las placas con agar: Transcurridos 15 minutos después de ajustar la turbidez de la suspensión del inóculo: a. Se introdujo un hisopo estéril en el inóculo y se giró varias veces. b. Se eliminó el exceso del inóculo presionando el hisopo contra la pared del tubo por encima del líquido.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. c. Se frotó sobre toda la superficie del agar por tres veces, girando la placa aproximadamente 60° para asegurar una distribución uniforme del inóculo. d. Se dejó la placa inoculada en reposo durante 15 minutos, antes de la aplicación de los discos.. na. 4. Aplicación de los discos en las placas de agar inoculadas:. ici. a. Con una pinza estéril se colocaron los discos separados por una distancia mayor o igual a la suma de los radios de los halos de. ed. inhibición obtenidos con AMK y AESA 50, 75 y 100%. M. ensayados por separado.. b. Se presionó cada disco para asegurar el contacto completo con. de. la superficie del agar. c. No se movió un disco una vez que se ha puesto en contacto. ca. con la superficie del agar.. lio te. 5. Incubación:. a. Se colocaron las placas con tapas hacia abajo, y no se apilaron una sobre otra.. Bi b. b. Se incubaron las placas inoculadas a 37 °C durante 18 h.. 6. Lectura de las placas: a. Se examinaron y se procedió con la lectura de las placas con crecimiento uniforme. b. Se observó la interfaz de las zonas de inhibición.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Interpretación de los resultados26 Si el control de calidad se encontró dentro de los límites, se registró el patrón y los diámetros de las zonas de inhibición (Anexo N° 8 Tabla N° 3): - Indiferencia: Dos círculos independientes.. na. - Sinergismo: Aumento o zona de inhibición “puente” cerca de la. efectos combinados de ambos.. ici. unión de ambas zonas o inhibición del crecimiento debido a los. ed. - Antagonismo: Truncamiento de las zonas de inhibición cerca de. M. la unión de ambas zonas.. B. Método del “tablero de damas” por macrodilución en caldo26. de. El método “tablero de damas” se realizó mediante la técnica de macrodilución en caldo. Con este método se evaluó la interacción. ca. entre la AMK y AESA.. lio te. 1. Método macrodilución en caldo - Preparación 1. Se determinó la CIM de AMK y AESA individualmente, utilizando el método de macrodilución en caldo (CIM AESA=. Bi b. 50% y CIM AMK=8 µg/mL). 2. Se determinó las concentraciones y número de tubos necesarios (Anexos N° 8 - Tabla N° 4). 3. Se calculó los volúmenes totales de las concentraciones de AMK y AESA necesarios. Se requirió 0,5 mL de cada concentración de AMK y AESA por tubo.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 4. Se colocó 0,5 mL de cada dilución de AMK y de cada concentración de AESA 6.25, 12.5, 25, 50 y 100% en los tubos deseados, de acuerdo a la plantilla (Anexos N° 8 - Tabla N° 4). Asimismo, se colocó 1 mL de CMH en los tubos control de crecimiento y de esterilidad.. na. 2. Preparación y colocación del inóculo. ici. 1. Con un asa bacteriológica se transfirieron 3-5 colonias de P. aeruginosa a 4 tubos estériles conteniendo 5 mL de CMH.. ed. Luego, se incubaron a 37 °C hasta que se obtenga una turbidez. M. equivalente al estándar 0,5 de McFarland (1,5 × 108 UFC/mL). 2. Con una pipeta estéril, se añadió 1 mL de suspensión de P.. de. aeruginosa a cada uno de los tubos previamente preparados con las diferentes diluciones de AMK y concentraciones de. ca. AESA. La suspensión de P. aeruginosa se inoculó por debajo. lio te. del menisco sin tocar las paredes del tubo con la pipeta.. 3. Se preparó una placa de verificación de conteo del inóculo: a. Se añadió 0,1 mL de la dilución sobre una placa con AMH. Bi b. y con el asa de Drigalski se extendió en varias direcciones para difundir el inóculo de manera uniforme.. 4. Se incubaron los tubos, y las placas de esterilidad y de verificación del inóculo a 37 °C durante 18 h.. 3. Lectura y registro de los resultados 1. Se examinó el tubo control de crecimiento para la viabilidad de P. aeruginosa. Este tubo mostró una gran turbidez.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2. Se examinó la placa de esterilidad, y se verificó que el cultivo no se encuentre contaminado. 3. Se contó las UFC en las placas de verificación del inóculo. 4. Se registró el crecimiento o no crecimiento de todos los tubos en la hoja de trabajo (Anexo N° 8 - Tabla 4).. na. 5. Se registró los resultados de la CIM para AESA y AMK.. ici. 4. Cálculos. 1. Se calculó el índice de concentración inhibitoria fraccional. 𝐶𝐼𝑀 𝑑𝑒 𝐴𝑀𝐾 𝑒𝑛 𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛 1 = = 0.125 𝐶𝐼𝑀 𝑑𝑒 𝐴𝑀𝐾 8. M. 𝐶𝐼𝐹 𝑑𝑒 𝐴𝑀𝐾 =. ed. (CIF) para cada sustancia:. 𝐶𝐼𝑀 𝑑𝑒 𝐴𝐸𝑆𝐴 𝑒𝑛 𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛 25 = = 0.5 𝐶𝐼𝑀 𝑑𝑒 𝐴𝐸𝑆𝐴 50. de. 𝐶𝐼𝐹 𝑑𝑒 𝐴𝐸𝑆𝐴 =. ca. 2. Se calculó la suma de los índices (ΣCIF):. lio te. ∑ 𝐶𝐼𝐹 = 𝐶𝐼𝐹 𝑑𝑒 𝐴𝑀𝐾 + 𝐶𝐼𝐹 𝑑𝑒 𝐴𝐸𝑆𝐴 = 0.625. Interpretación de los resultados27. Bi b. - Sinergia: ΣFIC ≤ 0,5. - Aditividad: 0,5< ΣFIC ≤ 1. - Indiferencia: 1< ΣFIC ≤ 2. - Antagonismo: ΣFIC > 2.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.7. Variables y Escalas de Medición. VARIABLES. Tipo según su. Escala de. naturaleza. medición. Cuantitativa. De razón. Variable. CIM de Amikacina sobre. independiente. Pseudomonas aeruginosa. na. Diámetros de inhibición y. Diámetros de inhibición y CIM de AESA sobre. dependiente. Pseudomonas aeruginosa. De razón. de. M. ATCC 27853. Cuantitativa. ed. Variable. ici. ATCC 27853. 2.2.8. Definiciones operacionales. ca. A. Aceite esencial de Syzygium aromaticum “clavo”. lio te. Aceite esencial de Syzygium aromaticum obtenido mediante el método de destilación por arrastre de vapor de agua, con un rendimiento de 12%.. Bi b. B. Pseudomonas aeruginosa: Cepa estándar Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.. C. Halo de Inhibición: Zona alrededor del disco donde una sustancia antibacteriana es capaz de impedir el crecimiento de la bacteria al cabo de 18 horas de incubación.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. D. Sinergia: -. Según el método de disco difusión: Aumento de las zonas de inhibición o zona de inhibición “puente” cerca de la unión de ambas zonas.. -. Según el método del “tablero de damas” por macrodilución en. na. caldo: ΣFIC ≤ 0,5.. ici. E. Aditividad:. - Según el método de disco difusión: Zonas de inhibición circulares. ed. independientes.. M. - Según el método del “tablero de damas” por macrodilución en. 2.3. Aspectos éticos. de. caldo: 0,5< ΣFIC ≤ 1.. El proyecto de investigación fue presentado al Comité de Ética de la. ca. Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo, para. lio te. consideración, comentario y aprobación. Para la realización de la investigación se tuvo en cuenta los principios de bioseguridad, prestando atención adecuada a factores que puedan dañar el. Bi b. medio ambiente; asimismo, las normas establecidas en el Código de Ética y Deontología del Colegio Médico del Perú, sección segunda Art. 42°. 28. 2.4. Análisis e interpretación de la investigación Se utilizó el método estadístico análisis de varianza (ANOVA) para analizar el efecto de las diferentes concentraciones de AESA y AMK sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Se utilizó el estadístico de Levene, para determinar qué prueba (Games-Howell o Tukey) se debe utilizar para. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. realizar las comparaciones múltiples, determinando si el efecto producido por la interacción de AESA y AMK es estadísticamente diferente a los tratamientos administrados de manera independiente. Se utilizó el paquete estadístico IBM SPSS STATISTICS VERSIÓN 24. El nivel de significación p ≤ 0,05 fue considerado estadísticamente. na. significativo. Todos los datos se presentan como valores medios ±. Bi b. lio te. ca. de. M. ed. ici. desviación estándar.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III.. RESULTADOS. En el presente trabajo sobre la determinación del efecto in vitro del aceite esencial de Syzygium aromaticum y la interacción con amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, en cada fase se hallaron los siguientes resultados:. na. En la fase 1: La tabla N° 1 y el gráfico N° 1, muestran el efecto antibacteriano in. ici. vitro del aceite esencial de Syzygium aromaticum a las concentraciones de 10%, 25%, 50%, 75% y 100%, así como el de amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa. ed. ATCC 27853 mediante el método de disco difusión, observándose halos de. M. inhibición crecientes a partir de la concentración de AESA al 50%, 75% y 100%. El diámetro promedio de los halos de inhibición de AMK 30 µg fue 26.1 mm. El. de. Tween 80 no mostró actividad antibacteriana. En la tabla N° 2 se muestra la concentración inhibitoria mínima del aceite esencial. ca. de Syzygium aromaticum y amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC. lio te. 27853 mediante el método de macrodilución en caldo, encontrándose la CIM de AESA en 50% y AMK entre 4 y 8 µg/mL (media: 6.4 µg/mL).. Bi b. En la fase 2: La tabla N° 3 muestra el efecto de la interacción del aceite esencial Syzygium aromaticum (50%, 75%, 100%) y amikacina 30 µg sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 mediante el método de disco difusión, encontrándose diámetros de inhibición superiores a los obtenidos en la fase 1, no se observaron zonas de inhibición “puente” (Anexo N° 7: Imágenes N° 19 - 21 / Anexo N° 8: Tabla N° 6). En el gráfico N° 2 se observa la diferencia entre el efecto antibacteriano del aceite esencial de Syzygium aromaticum 50%, 75% y 100% sobre Pseudomonas. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. aeruginosa ATCC 27853 evaluados en la fase 1 y 2 mediante el método de disco difusión. En el gráfico N° 3 se observa el efecto antibacteriano de amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 evaluado en la fase 1 y 2 mediante el método de disco difusión, encontrándose aumento de los halos de inhibición de. na. AMK a medida que aumenta la concentración de AESA.. ici. En la tabla N° 4 se muestra el efecto de la interacción del aceite esencial de Syzygium aromaticum y amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 2785. ed. mediante el método “tablero de damas”, encontrándose la CIM de AESA en 25% y. M. de AMK en 1 µg/mL.. de. En el gráfico N° 4 se observa la diferencia de la concentración inhibitoria mínima del aceite esencial de Syzygium aromaticum de 50% a 25% y de amikacina de 8 a 1. Bi b. lio te. ca. µg/mL sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 obtenidas en las fases 1 y 2.. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TABLA N° 1: Efecto antibacteriano in vitro del aceite esencial de Syzygium aromaticum (10%, 25%, 50%, 75%, 100%) y amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 mediante el método de disco difusión.. FASE 1 Diámetros del halo de inhibición en mm. na. Media ± DE. Tratamiento. Máximo. AESA 10%. 6*. 6. AESA 25%. 6. AESA 50%. 6. AESA 75%. 7. AESA 100%. 8. ed. 6 ± 0.0 6 ± 0.0. 6.1 ± 0.3. 8. 7.5 ± 0.5. 10. 8.4 ± 0.7. 24. 28. 26.1 ± 1.6. 6. 6. 6 ± 0.0. M. 7. ca. Tween 80. 6. de. Amikacina 30 µg. ici. Mínimo. * Diámetro del disco de papel de filtro: 6 mm. Bi b. lio te. Fuente: Datos obtenidos por el grupo de investigación (2015-2016). 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. GRÁFICO N° 1: Efecto antibacteriano in vitro del aceite esencial de Syzygium aromaticum (10%, 25%, 50%, 75%, 100%) y amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 mediante el método de disco difusión expresado en diámetros promedio de los halos de inhibición.. na. 30 26.1. ici. 20. 10 5. 6. 6. 10%. 25%. 50%. de. 0. 6.1. ed. 15. 7.5. M. Diámetros (mm). 25. 75%. 8.4. 100%. 6. Amikacina Tween 80 30 µg. Concentración de AESA, amikacina y Tween 80. Bi b. lio te. ca. Fuente: Tabla N° 1. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TABLA N° 2: Concentración inhibitoria mínima del aceite esencial de Syzygium aromaticum y amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 mediante el método de macrodilución en caldo. FASE 1 CIM. na. Repeticiones AMK (µg/mL). 1. 50. 4. 2. 50. 3. 50. 4. 50. ici. AESA (%). M. ed. 8. 50. 4 8. de. 5. 8. Bi b. lio te. ca. Fuente: Datos obtenidos por el grupo de investigación (2015-2016).. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TABLA N° 3: Efecto de la interacción del aceite esencial Syzygium aromaticum (50%, 75%, 100%) y amikacina 30 µg sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 mediante el método de disco difusión. FASE 2 Diámetros del halo de inhibición en mm Mínimo. Máximo. Media ± DE. na. Tratamiento. AMK. AESA. AMK. AESA. AESA 50% + AMK 30 µg. 6. 26. 7. 28. 6.9 ± 0.32. 27.2 ± 0.79. AESA 75% + AMK 30 µg. 8. 27. 10. 29. 9.2 ± 0.79. 28.0 ± 0.82. AESA 100% + AMK 30 µg. 11. 28. 13. 30. 11.4 ± 0.70. 29.3 ± 0.82. AMK. M. ed. ici. AESA. * Diámetro del disco de papel de filtro: 6 mm.. Bi b. lio te. ca. de. Fuente: Datos obtenidos por el grupo de investigación (2015-2016). 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. GRÁFICO N° 2: Efecto antibacteriano del aceite esencial de Syzygium aromaticum 50%, 75% y 100% sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 evaluado en la fase 1 y 2 mediante el método de disco difusión en función de los diámetros promedio de los halos de inhibición.. 12.5. na. 11.4. 10.5. 7.5 6.9 6.1. 4.5. de. 2.5 0.5. FASE 1 Solo. ed. 6.5. ici. 8.40. FASE 2 Ambos. M. Diámetro (mm). 9.2. 8.5. 50%. 75%. 100%. Aceite esencial de Syzygium aromaticum. Bi b. lio te. ca. Fuente: Tabla N° 1 y Tabla N° 3. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. GRÁFICO N° 3: Efecto antibacteriano de amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 evaluado en la fase 1 y 2 mediante el método de disco difusión en función de los diámetros promedio de los halos de inhibición. 35.5 30.5 26.1. na. 20.5. ici. Diámetro (mm). 25.5. 29.3. 28.0. 27.2. 15.5. ed. 10.5 5.5. M. 0.5. FASE solo1. + AESA 50% 50%. + AESA 75% 75%. + AESA100% 100%. de. Amikacina 30 µg. Bi b. lio te. ca. Fuente: Tabla N° 1 y Tabla N° 3.. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TABLA N° 4: Efecto de la interacción del aceite esencial de Syzygium aromaticum y amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 2785 mediante el método “tablero de damas”.. FASE 2 CIM. na. CIM Repeticiones. AMK (µg/mL). ici. AESA (%) 25. 1. 2. 25. 1. 3. 25. 1. M. ed. 1. Bi b. lio te. ca. de. Fuente: Datos obtenidos por el grupo de investigación (2015-2016).. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. GRÁFICO N° 4: Concentración inhibitoria mínima del aceite esencial de Syzygium aromaticum y amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 obtenidas en las fases 1 y 2.. 40% 30%. 8 7 6 5 4. ed. 25%. 8. na. 50%. 9. ici. 50%. 20% 10% 0%. FASE 2. 2. 1. 1 0. CIM. de. CIM. FASE 1. 3. M. Concentración de AESA (%). 60%. Concentración de Amikacina (µg/mL). Concentración inhibitoria mínima de AESA y AMK sobre Pseudomonas CIM de aceite esencial aeruginosa de CIM de amikacina sobre ATCC 27853 Syzygium aromaticum sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC. Bi b. lio te. ca. Fuente: Tabla N° 2 y Tabla N° 4.. 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV.. DISCUSIÓN. El aumento de la resistencia bacteriana frente a antibióticos de amplio espectro, ha causado que la comunidad científica busque nuevos principios químicos capaces de contrarrestarla. Diversos trabajos de investigación han demostrado que las plantas. na. poseen sustancias activas con amplia actividad antibacteriana, comparable con la. ici. ejercida por los antibióticos. Por eso, debido al aumento de cepas bacterianas resistentes a múltiples fármacos y a la carencia de nuevos medicamentos. ed. disponibles en el mercado; se propone como alternativa, combinar los antibióticos. M. existentes con fitoquímicos para mejorar su eficacia.. El presente estudio evaluó el efecto in vitro del aceite esencial de Syzygium. de. aromaticum “clavo” y de la interacción con amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, empleando un diseño experimental dividido en 2 fases.. ca. En la fase 1, mediante el método de disco difusión, se determinó que. lio te. concentraciones iguales o superiores de AESA al 50% tienen efecto inhibitorio sobre el crecimiento de la cepa estudiada. Además, se observó que los diámetros promedio de los halos de inhibición fueron aumentando en relación directamente. Bi b. proporcional a la concentración utilizada; sin embargo, de acuerdo a la escala de Duraffourd19, la sensibilidad fue límite con las concentraciones 75% y 100%, y nula con las demás concentraciones (Tabla N° 1, Anexo N° 6: Tabla N° 1). La actividad antibacteriana mostrada por AESA puede explicarse a través del mecanismo de acción del eugenol, su componente principal. Los mecanismos probables de la toxicidad fenólica incluyen la inhibición enzimática por compuestos oxidados e interacciones más inespecíficas con proteínas bacterianas. 29 La AMK 30 µg mostró. 37 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(44) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. halos de inhibición superiores, cuyo diámetro promedio fue 26.1 mm; es decir, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 fue sensible de acuerdo al patrón de sensibilidad de la cepa estándar, se esperaba este resultado. Para realizar comparaciones múltiples entre los grupos estudiados (AESA 10%, 25%, 50%, 75%, 100% y AMK 30µg) se utilizó la prueba de Games-Howell. na. (Anexo N° 6: Tabla N° 2), ya que según el estadístico de Levene se encontró que la variabilidad de los diámetros entre los grupos de tratamiento (AESA 10%, 25%,. ici. 50%, 75%, 100% y AMK 30 µg) fue estadísticamente diferente (p ≤ 0.05) (Anexo. ed. N° 6: Tabla N° 4); hallándose que los diámetros obtenidos con el uso de. M. concentraciones de AESA 75 y 100% son estadísticamente significativos comparados con los obtenidos con concentraciones menores (p ≤ 0.05); además la. de. AMK 30µg al compararse con todas las concentraciones de AESA, mostró diferencia estadísticamente significativa (p≤ 0.05). Es decir, el efecto antibacteriano. ca. de AESA, incluso utilizando sus mayores concentraciones, no es comparable al. lio te. producido por la AMK. Por otro lado, el Tween 80 o polisorbato 80 no demostró actividad antibacteriana sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Este resultado coincide con los reportados en otras investigaciones.30, 31 (Tabla N° 1,. Bi b. Gráfico N° 1, Anexo N° 5: Imágenes N° 9-15 y Anexo N° 6: Tabla N° 1) Con el método macrodilución en caldo, la CIM de AESA fue 50%, y la de AMK se halló entre 4 a 8 µg/mL (media: 6.4 µg/mL). (Tabla N° 2, Anexo N° 5: Imagen N° 16 - 18). La CIM obtenida en el presente estudio coincide con los valores reportados en la literatura, ya que fue hallada sobre la cepa estándar Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.32, 33. 38 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(45) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los resultados obtenidos en esta fase concuerdan con los hallados en otros trabajos de investigación. Fu et al34 estudiaron la actividad antibacteriana de los aceites esenciales de clavo y romero, solos y en combinación sobre Pseudomonas aeruginosa; hallando que el diámetro de inhibición promedio de AESA fue 9.5 ± 0.5 mm; sin embargo, los investigadores no especifican la concentración de AESA. na. utilizado; además, hallaron que la CIM fue 50%, coincidiendo con lo hallado en el. ici. presente trabajo. Asimismo, Felső et al30, realizaron el perfil de proteínas de la membrana externa de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; en el cual se. ed. evidenció una proteína de peso molecular 79.4 kDa, que desapareció después de. M. administrar una doble concentración de la CIM de AESA (CIM = 1,6 mg/mL); este hallazgo se puede explicar mediante el efecto inhibidor de la síntesis proteica. de. producido por el AESA. En el estudio de Kavanaugh y Ribbeck31, se encontró que AESA al 5% no fue efectivo en la eliminación de biopelículas de Pseudomonas. ca. aeruginosa; sin embrago, el eugenol al 3,3% sí lo fue. En la presente investigación. lio te. y en las mencionadas anteriormente, se demuestra la actividad antibacteriana de AESA; sin embargo, las concentraciones inhibitorias mínimas halladas en los trabajos fueron diferentes. Esto se debe a factores intrínsecos y extrínsecos de. Bi b. AESA, como su método de preparación, su origen geográfico e incluso el momento de la cosecha.35. En la fase 2, se evaluó el efecto de la interacción entre AESA y AMK mediante los métodos de disco difusión y “tablero de damas”, hallando que la interacción de AESA y AMK posee efecto aditivo sobre a Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y no efecto sinérgico como se propuso en la hipótesis.. 39 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(46) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El primer método, que consistió en colocar los discos de AESA (50%, 75% y 100%) y AMK 30 µg en una misma placa, permitió observar los patrones de inhibición. Se halló que los diámetros promedio de los halos de inhibición de AESA (50%, 75% y 100%) fueron superiores y significativamente diferentes a los obtenidos en la fase 1 (p ≤ 0.05); aumentando proporcionalmente con la concentración de AESA. na. ensayada (Tabla N° 3, Gráfico N° 2, Anexo N° 7: Imágenes N° 19 - 21, Anexo N° 8: Tabla N° 6); por lo que se concluye, que existe un efecto aditivo, ya que no se. ici. observaron zonas de inhibición “puente”, no se puede considerar sinergismo. Los. ed. diámetros promedio de los halos de inhibición de AMK evaluados al interaccionar. M. con cada concentración de AESA (50%, 75%, y 100%) fueron superiores a los obtenidos en la fase 1 (Tabla N° 3, Gráfico N° 3); a pesar de eso, sólo se encontró. de. diferencia significativa cuando interaccionó con AESA 100% (p≤0.05). Para realizar las comparaciones múltiples de los diámetros promedio de los halos. ca. de inhibición de AESA (50%, 75%, 100%) al interaccionar con AMK 30 µg, se. lio te. utilizó la prueba de Games-Howell (Anexo N° 8: Tabla N° 7), ya que según el estadístico de Levene se encontró que la variabilidad de los diámetros entre los grupos de AESA fue estadísticamente diferente (p ≤ 0.05) (Anexo N° 8: Tabla N°. Bi b. 10); hallándose que los diámetros promedio de AESA 50%, AESA 75% y AESA 100% son estadísticamente diferentes; es decir, no es lo mismo utilizar AESA 50% + AMK 30 µg, o AESA 75% + AMK 30 µg o AESA 100% + AMK 30 µg, ya que el efecto antibacteriano observado mediante los diámetros de los halos inhibición de AESA aumentan directamente proporcional a la concentración utilizada. Asimismo, para realizar las comparaciones múltiples de los diámetros promedio de los halos de inhibición de AMK 30 µg, se utilizó la prueba de Tukey (Anexo N° 8:. 40 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(47) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla N° 8), ya que según el estadístico de Levene, la variabilidad entre los diámetros de inhibición entre los grupos no fue estadísticamente diferente (Anexo N° 8: Tabla N° 10). Así, se comparó los diámetros de inhibición de los discos de AMK 30 µg entre los diferentes grupos (AMK + AESA 50%, AMK + AESA 75%, AMK + AESA 100%); observándose que el diámetro del halo de AMK del grupo. na. AMK + AESA 100%, es estadísticamente diferentes a los otros grupos; es decir, si. ici. se utiliza AMK + AESA 100% se obtiene resultados estadísticamente diferentes a los obtenidos en los otros grupos, lo que se evidencia mediante el mayor diámetro. ed. de los halos de inhibición. Por el contrario, si se utiliza las combinaciones AMK +. M. AESA 50% o AMK + AESA 75%, el promedio de los diámetros de inhibición de AMK no son estadísticamente diferentes.. de. Con el segundo método “tablero de damas”, la nueva CIM de AESA y AMK fue de 25% y 1 µg/mL, respectivamente; sin embargo, a pesar que las nuevas CIM son. ca. menores a las halladas en la fase 1 (Tabla N° 4, Gráfico N° 4 y 5), la suma de los. lio te. índices de concentración inhibitoria fraccional (CIF) fue 0.625 (0.5 < ∑CIF ≤ 1), lo que indica aditividad, pero no sinergismo (∑CIF ≤ 0.5). Entre los probables mecanismos de acción del eugenol, principal componente del. Bi b. AESA, tenemos: la inhibición de la actividad de la ATPasa, lo que conllevaría a la desorganización de la membrana; el bloqueo de la bomba de eflujo y la reducción de varios factores de virulencia a concentraciones sub-inhibitorias.36 La suma de estos mecanismos y la inhibición de la síntesis proteica bacteriana generada por la amikacina, se evidencian en los resultados encontrados en el presente trabajo. No se han encontrado otros estudios de investigación donde se evalúe la interacción de AESA y amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa.. 41 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(48) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Una de las posibles desventajas del uso de AESA es su toxicidad. El AESA se absorbe rápidamente a través de la piel y se utiliza en sistemas patentados en la administración dérmica de fármacos para aumentar la captación de estos a partir de sistemas de administración de parches cutáneos; sin embargo, la ingesta o inyección de este aceite en cantidad suficiente podría causar complicaciones como síndrome. na. de dificultad respiratoria aguda, insuficiencia hepática fulminante y depresión del. ici. sistema nervioso central. El eugenol, principal componente de AESA, es un irritante leve de la piel y los ojos (Categoría III); además, se ha determinado que su dosis. ed. letal (DL50) oral en ratas es 2 650 mg/kg. Hasta la fecha, no se han reportado. M. estudios epidemiológicos de los posibles efectos adversos para la salud humana relacionados con la exposición a AESA o a eugenol en los diferentes escenarios.37. de. De acuerdo a los resultados discutidos anteriormente, se concluye que el aceite esencial de Syzygium aromaticum “clavo” tiene efecto antibacteriano; y la. ca. interacción con amikacina posee un efecto aditivo frente a Pseudomonas. Bi b. lio te. aeruginosa ATCC 27853.. 42 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(49) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. V.. CONCLUSIONES. 1. El aceite esencial de Syzygium aromaticum “clavo” posee efecto antibacteriano sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, mediante el método de disco difusión a concentraciones superiores o iguales al 50%.. na. 2. La concentración inhibitoria minina de aceite esencial de Syzygium aromaticum. ici. fue 50% y la concentración inhibitoria minina de amikacina se halló entre 4 y 8 µg/mL (media: 6.4 µg/mL) mediante el método de macrodilución en caldo.. ed. 3. La interacción del aceite esencial de Syzygium aromaticum y amikacina. M. mediante los métodos de disco difusión y “tablero de damas” posee efecto. Bi b. lio te. ca. de. aditivo sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.. 43 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(50) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. VI.. -. RECOMENDACIONES. Realizar estudios para evaluar el efecto antibacteriano del eugenol, principal componente del aceite esencial de Syzygium aromaticum “clavo” sobre Pseudomonas aeruginosa. Realizar estudios para comparar el efecto antibacteriano del aceite esencial de. na. -. infecciones por Pseudomonas aeruginosa.. Incrementar investigaciones experimentales para demostrar. ed. -. ici. Syzygium aromaticum con otros antibióticos utilizados en el tratamiento de las. el efecto. M. antibacteriano del aceite esencial de Syzygium aromaticum “clavo” sobre otras bacterias.. Realizar estudios para evaluar el efecto antibacteriano de Syzygium aromaticum. de. -. Bi b. lio te. ca. en modelos animales mediante diferentes vías de administración (oral o tópica).. 44 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.