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CERTIFICACIÓN
Ingeniero
Juan Carlos Romero Benavides
DIRECTOR DEL TRABAJO DE FIN DE TITULACIÓN
De mi consideración:
El presente trabajo de fin de titulación: “Obtención de extractos, aislamiento y caracterización de metabolitos secundarios de Passiflora cumbalensis, P. manicata y P. indecora con actividad citotóxica”, realizado por Karina Noemí Torres García, ha sido
orientado y revisado durante su ejecución, por cuanto se aprueba la presentación del mismo.
Loja, agosto de 2013
DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS
Yo, Karina Noemí Torres García, declaro ser autor del presente trabajo de fin de titulación: “Obtención de extractos, aislamiento y caracterización de metabolitos secundarios de
Passiflora cumbalensis, P. manicata y P. indecora con actividad citotóxica”, de la titulación
de Bioquímica y Farmacia, siendo el Ing. Juan Carlos Romero Benavides, director del presente trabajo; y eximo expresamente a la Universidad Técnica Particular de Loja y a sus representantes legales de posibles reclamos o acciones legales. Además certifico que las ideas, conceptos, procedimientos y resultados vertidos en el presente trabajo investigativo son de mi exclusiva responsabilidad.
Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposición del Art. 67 del Estatuto Orgánico de la Universidad Técnica Particular de Loja que en su parte pertinente textualmente dice: “Forman parte del patrimonio de la Universidad la propiedad intelectual de investigaciones, trabajos científicos o técnicos, o tesis de grado que se realicen a través, o con el apoyo financiero, académico e institucional (operativo) de la Universidad.
DEDICATORIA
El presente trabajo va dedicado a mi madre Lcda. Noemí García Álvarez, por ser mi ejemplo, mi compañera, mi amiga y apoyo incondicional; a mi niño Ian Yariel Pullaguari Torres el motivo de culminar mi carrera profesional; a mi padre Lcdo. Julio Torres Jiménez (+) y mi hermana Cristina (+), por las bendiciones recibidas día a día; a Santiago Pullaguari y su familia por todo el apoyo brindado; a toda mi familia y compañeros por compartir estos años de valiosos recuerdos.
AGRADECIMIENTO
Le agradezco a Dios por haberme acompañado y guiado a lo largo de estos cinco años, por ser mi fortaleza en los momentos de debilidad y por brindarme una vida llena de aprendizajes y experiencia, a mi madre por apoyarme en todo momento, por los valores que me han inculcado, y por haberme dado la oportunidad de tener una excelente educación en el transcurso de mi vida y por ser mi ejemplo de vida a seguir; a mi hijo Ian Yariel por llenar mi vida de alegría y amor, y ser el motivo para seguir adelante; a mi familia y compañeros por compartir grandiosos momentos.
Le agradezco la confianza, apoyo y dedicación de tiempo al Ing. Juan Carlos Romero Benavides, por haber compartido conmigo sus conocimientos y amistad; a la vez al departamento de Química Aplicada de la Universidad Técnica Particular de Loja y todos sus integrantes por el apoyo y facilidades otorgadas para el desarrollo del presente trabajo investigativo.
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Página
CARATULA i
CERTIFICACION ii
DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS
iii
DEDICATORIA iv
AGRADECIMIENTO v
ÍNDICE DE CONTENIDOS vi
LISTADO DE TABLAS, GRÁFICAS Y FIGURAS viii
ABREVIATURAS xi
RESUMEN Y PALABRAS CLAVE 1
ABSTACT AND KEY WORDS 2
INTRODUCCIÓN 3
CAPITULO I
1. Fin, propósito y componentes del proyecto 5
CAPITULO II
2. Aspectos generales 7
2.1. Medicina Tradicional. 7
2.2. Productos Naturales, fitoquímica y cáncer. 7
2.3.Fitoesteroles y Aldehídos. 9
2.3.1.Fitoesteroles. 9
2.3.2. Aldehídos. 11
2.4. Antecedentes. 11
2.4.1. Género Passiflora y cáncer. 11
2.5.Características botánicas y taxonómicas de
las especies a estudiar.
14
2.5.1.Passiflora cumbalensis. 14
2.5.2.Passiflora manicata. 15
2.5.3.Passiflora indecora. 16
CAPITULO III
3.1. Recolección de material vegetal. 19
3.2. Evaluación de la actividad inhibitoria del crecimiento celular de los extractos y
compuestos identificados mediante MTT.
20
3.3. Cromatografía en columna. 20
3.4.Cromatografía en capa fina. 22
3.5.Recristalización. 22
3.6. Caracterización de los MS. 22
CAPITULO IV
4. Resultados y análisis 24
4.1. Rendimiento del material utilizado. 24
4.2. Inhibición de crecimiento de tres líneas celulares de cáncer humano.
24
4.3. Fraccionamiento mediante cromatografía en columna.
27
4.4. Identificación y caracterización de metabolitos secundarios.
27
4.5. Porcentaje de inhibición de crecimiento celular de los compuestos identificados.
33
4.6. Extracto de P. cumbalensis en acetato de
etilo, se aisló e identifico 1 compuesto
35
4.7.Extracto metanólico de P. cumbalensis, se
obtuvo 2 compuestos.
36
4.8. Extracto hexánico de P. manicata se
obtuvo dos mezclas de compuestos.
36
CONCLUSIONES 39
RECOMENDACIONES 40
BIBLIOGRAFIA 41
LISTA DE TABLAS
Página
Tabla 1. Taxonomía de P. cumbalensis. 14
Tabla 2. Taxonomía de P. manicata. 15
Tabla 3. Taxonomía de P. indecora. 16
Tabla 4. Proporción y peso de cada uno de los
extractos de las especies P. cumbalensis, P. manicata y silica gel, utilizados en cromatografía en
columna abierta.
20
Tabla 5.Peso de extractos obtenidos, rendimiento de
las especies P. cumbalensis, P. manicata y P. indecora
23
Tabla 6.Número de fracciones obtenidas en el
fraccionamiento por cromatografía en columna de los extractos P. cumbalensis y P. manicata.
27
LISTA DE GRAFICAS
Gráfica 1. Porcentaje de inhibición del crecimiento
celular en la línea de cáncer de colon RKO; de los extractos de P. cumbalensis, P. manicata y P.
indecora.
24
Gráfica 2. Porcentaje de inhibición del crecimiento
celular en la línea de cáncer de mama MCF7; de los extractos de P. cumbalensis, P. manicata y P.
indecora.
24
Gráfica 3.Porcentaje de inhibición del crecimiento
celular en la línea de astrocitoma cerebral D384; de los extractos de P. cumbalensis, P. manicata y P.
indecora
25
Gráfica 4. Porcentaje de inhibición del crecimiento
celular en la línea RKO de los fitoesteroles identificados.
33
celular en la línea D384 de los fitoesteroles identificados.
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. Mecanismo anti - cancerígeno de los
fitoesteroles
10
Figura 2. Resumen de la metodología utilizada en el
estudio de las tres especies del género Passiflora.
18
Figura 3. Mapa del cantón Loja, ubicando los sitios
de recolección de las especies (San Cayetano Alto y Uritusinga).
19
Figura 4. Compuesto 1. Estructura molecular de
dodecanal.
28
Figura 5. Compuesto 2. Estructura molecular de
hexacosanal.
29
Figura 6. Compuesto 3. Estructura molecular de 5,
22 dien – 3 estigmasterol.
30
Figura 7. Compuesto 4. Estructura molecular de
gamma sitosterol.
31
Figura 8. Compuesto 5. Estructura molecular de
beta sitosterol.
32
Figura 9. Compuesto 6. Estructura molecular de
ergosterol.
33
Figura 10. Compuesto 7. Estructura molecular de
nonadecanal.
36
LISTA DE FOTOGRAFIAS
Fotografía 1. Fotografía de Cromatografía en
columna: a cromatografía en columna del extracto hexánico de P. cumbalensis; b: cromatografía en
columna del extracto de acetato de etilo de P.
cumbalensis, c: cromatografía en columna del
extracto de metanol de P. cumbalensis; d:
cromatografía en columna del extracto hexánico de
P. manicata.
LISTA DE FORMULAS
Fórmula 1. Rendimiento del extracto obtenido y
peso de la materia vegetal seca.
ABREVIATURAS MS AcOEt Hex MeOH DCM CC TLC UV Pf RMN RMN 1H
RMN 13C
EM CDCl3 CMI P RKO MFC7 D384 MTT Metabolito secundario Acetato de Etilo Hexano
Metanol Diclorometano
Cromatografía en Columna Cromatografía en capa fina Ultravioleta
Punto de fusión
Resonancia Nuclear Magnética
Resonancia Nuclear Magnética de Hidrogeno Resonancia Nuclear Magnética de Carbono Espectrometría de masas
Cloroformo deuterado
Concentración mínima inhibitoria Passiflora
RESUMEN
P. cumbalensis, P. manicata y P. indecora se recolectaron en Uritusinga y San Cayetano Alto (Loja); de las partes aéreas se obtuvieron extractos en Hex, AcOEt y MeOH, se realizó un estudio de inhibición de crecimiento celular en tres líneas de cáncer humano RKO, MCF7 y C384 mediante MTT; los más activos se los fraccionó por CC, los extractos con mayor actividad fueron hexánico de hojas de P. manicata (60%), hexánico de P. cumbalensis
(50%); de éste se aislaron seis MS: cuatro fitoesteroles (estigmasterol; gamma-sitosterol; beta-sitosterol y ergosterol) cuya actividad fue 50-60% en D384 y 15-20% en RKO y dos aldehídos (dodecanal y hexacosanal); todos identificados por primera vez en esta especie; del extracto AcOEt de P. cumbalensis se aisló e identificó un aldehído (nonadecanal); todos los compuestos se identificaron utilizando: RMN: 1H, 13C; y EM, la caracterización de los MS se efectuó por medio de comparación con datos espectroscópicos previamente informados; del extracto metanólico de P. cumbalensis se obtuvo dos compuestos que no se lograron caracterizar, y del extracto hexánico de P. manicata se obtuvo dos mezclas de compuestos.
ABSTACT
P. cumbalensis, P. manicata and P. indecora were collected in Uritusinga and San Cayetano Alto (Loja),the aerial parts extracts were obtained in Hex, EtOAc and MeOH, a study of inhibition of cell growth of three human cancer cell lines: RKO, MCF7 and C384 by MTT; the more active they are fractionated by CC, the most active extracts were hexane from leaves of P. manicata (60%), hexane from P. cumbalensis (50%) of it is isolated six MS: four phytosterols (stigmasterol, gamma-sitosterol, beta-sitosterol and ergosterol) whose activity was 50-60% in D384 and 15-20% in RKO and two aldehydes (dodecanal and hexacosanal), all identified for the first time in this species, the AcOEt extract of P. cumbalensis was isolated and identified an aldehyde (nonadecanal); all compounds were identified using: NMR: 1H, 13C, and MS, the MS characterization was effected by means of spectroscopic data compared to previously reported, the methanol extract of P. cumbalensis was obtained two compounds which characterize not achieved, and the hexane extract of P. manicata was obtained two mixtures of compounds.
INTRODUCCION
El desarrollo alcanzado en las técnicas de aislamiento e identificación de productos y el nivel de las investigaciones mundiales hacen que el área de los productos naturales es la de mayor crecimiento dentro del campo de la química orgánica, en la actualidad se reportan cerca de un millón de productos naturales aislados a partir de diferentes especies. Han surgido novedosos y sofisticados métodos y técnicas de aislamiento, dependientes del creciente desarrollo de la biotecnología y la bioingeniería y la aparición de nuevas demandas en la terapia humana (Krishnaswamy, 2000). Aproximadamente el 53% de los fármacos de uso clínico actual proceden de una fuente natural o sus derivados sean sintéticos o semisintéticos (Chamba, 2012); la zona sur del Ecuador es considerada uno de los 10 lugares sobresalientes de diversidad biológica a nivel global, y de gran valor ancestral debido a la presencia de dos grupos étnicos: Saraguro y Shuar, en donde la medicina tradicional sobresale destacando algunas especies de gran interés (Pineda et al., 2010).
1. Fin, propósito, y componentes del proyecto.
1.1. Fin del proyecto.
Contribuir con el estudio de metabolitos secundarios de Passiflora cumbalensis, P. manicata y P. indecora, y su acción inhibitoria en el crecimiento de líneas celulares de cáncer humano.
1.2. Propósito del proyecto.
Obtener extractos, purificar y caracterizar metabolitos secundarios de Passiflora cumbalensis, P. manicata y P. indecora con actividad inhibitoria en el crecimiento de líneas de cáncer humano.
1.3. Componentes del proyecto.
Seleccionar y recolectar las especies vegetales.
Obtener extractos de acuerdo a la polaridad con diversos disolventes: hexano (Hex), acetato de etilo (AcOEt) y metanol (MeOH).
Determinar la actividad inhibitoria del crecimiento celular mediante MTT de los extractos obtenidos, en líneas de cáncer humano.
Realizar el fraccionamiento de los extractos por cromatografía en columna.
2. Aspectos generales.
2.1. Medicina tradicional.
La organización mundial de la salud (OMS) define a la Medicina Tradicional como un conjunto de prácticas, enfoques, conocimientos y creencias diversas que incorporan medicina de origen animal, mineral y vegetal; también incluye terapias espirituales, técnicas manuales o ejercicios practicados de forma individual o grupal con la finalidad de mantener el bienestar del individuo y en algunos casos para tratar, diagnosticar y prevenir enfermedades (OMS, 2010).
2.2. Productos naturales, fitoquímica y cáncer.
Los productos naturales hacen referencia a los extractos o sustancias obtenidas de materia vegetal, en especial de las que se conoce un uso medicinal o nutricional, en la década de los cincuenta México fue pionero en el desarrollo de productos naturales con la producción de esteroides a partir de la “cabeza de negro” y el “barbaso” (Lara et al,. 1996).
Desde tiempos ancestrales, el hombre utilizó diversas plantas para satisfacer sus más urgentes necesidades como la alimentación y la medicina, originando de esta manera el interés de algunos por el estudio químico de las plantas, permitiendo la formación de la fitoquímica, una disciplina científica que emplea diversas técnicas que le permiten aislar extractos y fraccionarlos sucesivamente hasta obtener metabolitos secundarios (Badawy et al., 1999), que son sustancias ecológicamente eficaces, frente a los metabolitos primarios que son biológicamente efectivos, estos son el resultado de la biosíntesis, transformación y degradación de compuestos endógenos mediante proteínas de especialización, las cuales se han formado como resultado de los procesos de diferenciación y se los puede clasificar según su significación biológica y función en la célula protectora (Valdés y Valbín, 2000); en los organismos vivos se conocen tres rutas biosintéticas por la que se los puede producir: ruta del sikimato, ruta del acetato-malonato y la ruta acetato-mevalonato; los metabolitos secundarios se encuentran presentes en pequeñas cantidades, sin embargo, en base a las técnicas espectroscópicas es posible reconocer su estructura molecular (Olmedo et al 2009).
originaron, sino de viajar por la sangre y el líquido linfático hasta otros órganos y desarrollarse, se calcula que sería el causante de la muerte de 84 millones de personas entre 2005 y 2015 (Laza et al., 2006), entre los principales fármacos utilizados en la quimioterapia del cáncer está la doxorrubicina, que es un antibiótico que actúa en la intercalación del ADN inhibiendo algunos ácidos nucleicos dificultando el avance de algunas enzimas, su administración por lo general es intravenosa, o el placlitaxel que es una droga citoesquelética, las células tratadas con ésta sufren disfunción en el ensamblamiento de los microtúbulos alterando su mitosis, al ser fármacos muy agresivos causan elevados efectos secundarios por lo que se pretende encontrar anticancerígenos naturales y con menores repercusiones al paciente (Callacondo, et al 2008) ante esto en los últimos años se han investigado diversas especies vegetales y sus componentes para combatirla: reportes en mangos donde se aisló el lupeol y la mangiferina que contienen importante actividad anti cáncer (Croweel 1997), los isotiocianatos presentes en el Brassica oleracea italica son capaces de eliminar la proteína del gen p53 defectuoso y dejar libres las proteínas sanas para suprimir el desarrollo de tumores; el licopeno presente en el Solanum lycopersicum es capaz de inhibir la proliferación celular, al tiempo que posee un efecto anti-carcinogénico y anti-aterogénico; el resveratrol presente en las uvas para la fabricación de vino reduce un 50% el riesgo de cáncer de próstata, y los fitoesteroles presentes en las nueces son capaces de desacelerar el crecimiento del cáncer, en especial el de mama (Sanz 2011). A todo el grupo de Symphytum spp, se le otorgan características cicatrizantes, antiinflamatorias y para aliviar el cáncer, mientras que la Beta vulgaris (remolacha) se la utiliza para ayudar en las lesiones provocadas por las radioterapias aplicadas en pacientes con presencia de tumores, que los efectos sean mejor tolerados (Navarro, et al 2011).Una de las especies que ha revolucionado el mundo de la fitoterapia contra el cáncer es la fruta de Annona muricata considerada 10.000 veces más potente que la quimioterapia: sus extractos revelaron que destruye las células malignas en 12 tipos de cáncer, entre ellos: colon, pecho, próstata, pulmón y de páncreas, los compuestos de este árbol demostraron una mejor inhibición en el crecimiento de las células de cáncer que la adriamiacina, una droga quimioterapéutica, normalmente usada en el mundo y lo más destacado es que solo destruye las células malignas del cáncer y no afecta las células sanas (Street, 2006).
estudios científicos de las plantas medicinales, todavía no se conoce a fondo muchos de los principios activos a los que deben las plantas sus extraordinarias cualidades (Hua K, 2002). Existen gran cantidad de tipos de metabolitos secundarios en plantas una de las clasificaciones se basa en la presencia o no de nitrógeno en su composición, no obstante, los tres grupos de metabolitos secundarios más importantes en plantas son los terpenoides (o isoprenoides), fenil propanoides (o compuestos fenólicos) y los alcaloides (este último grupo lleva nitrógeno en su estructura) (Olmedo, 2009), sin embargo en el presente trabajo se logró aislar los fitoesteroles y aldehídos.
2.3. Fitoesteroles y aldehídos.
2.3.1. Fitoesteroles.
El grupo de los fitoesteroles comprende esteroles y estanoles de origen vegetal, que cuentan con una estructura casi idéntica a la del colesterol, difieren únicamente en la presencia de grupos metilo o etilo en la cadena lateral de la molécula (Higdon, at al 2008). Están considerados como compuestos antiinflamatorios, antitumorales, bactericidas y fungicidas, aunque su propiedad más estudiada es su efecto hipocolesterolémico, el cual se ha observado tanto en el colesterol total, como en el colesterol-LDL (Rodríguez, et al 2008). Los fitoesteroles se encuentran disponibles en todas las plantas, por lo que los vegetarianos son los que cuentan con un mayor consumo de estos compuestos, sin embargo, pueden encontrarse en mayor concentración en aceites vegetales no refinados, nueces, semillas, granos enteros, legumbres y germen de trigo (Ostlund, 2002).
Dentro de las principales funciones que se atribuyen a los fitoesteroles está la de ser antiinflamatorio aunque limitada, hay un poco de información acerca de cómo los fitoesteroles podrían atenuar las reacciones inflamatorias del sistema inmunológico, en algunos estudios se observó que el tratamiento de células con fitoesteroles reducía la producción de prostaglandinas, compuestos involucrados en la respuesta inflamatoria (Woyengo, et al 2009); también juegan papeles importantes en enfermedades cardiovasculares gracias a su influencia en el nivel de colesterol en la sangre, los fitoesteroles pueden jugar un papel importante en la prevención de arterioesclerosis y enfermedades coronarias (Jenkins, et al 2005). Y actúan en hiperplasia prostática benigna, que se refiere a un crecimiento no canceroso de la próstata, y se ha encontrado que la administración de fitoesteroles ayuda al tratamiento de síntomas de presión en la uretra (Bergues, et al 1995).
[image:21.595.87.542.248.594.2]
la apoptosis, los fitoesteroles también pueden interferir en el crecimiento y la multiplicación celular aunque se desconoce la forma en que se lleva acabo. En las etapas de angiogénesis y metástasis, estos compuestos parecen reducir la capacidad de las células cancerígenas, finalmente, el sitosterol participa en la activación de enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa y la glutatión peroxidasa, con esto se reducen los agentes oxidantes y potenciales carcinogénicos (Honey, 2012) en la Figura 1, se puede observar las actividades inhibitorias y activación en la carcinogénesis.
Figura 1. Diversos mecanismos anti-cancerígenos de los fitoesteroles.
Fuente: Modificado de Honey, 2012
En algunos estudios en ratones y conejos se ha observado que en grandes cantidades los fitoesteroles pueden alterar las propiedades de la membrana y el metabolismo de la testosterona (Jones, et al 2005); además son fácilmente tolerados, sólo en algunas ocasiones se han asociado a casos de nausea, indigestión, diarrea y constipación (Bergues, et al 1995).
Aunque no se trate directamente de un efecto negativo sobre la salud, cabe mencionar que se ha visto una correlación entre el consumo de alimentos enriquecidos con fitoesteroles y una reducción de la concentración plasmática de α-caroteno, β-caroteno y licopeno (Ntanios, et al 2002). En cuanto a su interacción con otros compuestos, además de lo ya mencionado sobre los carotenoides, no se han encontrado reducciones importante en la absorción de otros compuestos liposolubles como son las vitaminas A, D, E y K (Katan, et al 2006).
2.3.2. Aldehídos.
Los aldehídos son compuestos orgánicos caracterizados por poseer el grupo funcional – CHO; se utilizan principalmente para la fabricación de resinas, plásticos, disolventes, pinturas, perfumes y esencias (Olmedo, et al 2009).
Los aldehídos están presentes en numerosos productos naturales y grandes variedades de ellos son de la propia vida cotidiana, como la glucosa que existe en una forma abierta que presenta un grupo aldehído, o el acetaldehído formado como intermedio en la metabolización se cree responsable en gran medida de los síntomas de la resaca tras la ingesta de bebidas alcohólicas y causante del 15.6% cáncer de esófago, sin embargo existe la aldehído deshidrogenasa 2 (ALDH2), que es responsable de descomponer el acetaldehído en una sustancia no tóxica, por lo tanto de disminuir la incidencia de cáncer; sin embrago los no bebedores carecen de la ALDH2, por lo que su estudio es controversial (Espinoza et al., 2005), se los ha identificado y caracterizado en diversas especies entre las principales tenemos Eucaliptus citriodora, Lippis citriador y Melissa officinalis, en donde se les otorgan funciones como antiinflamatorio, antiinfeccioso, ansiolíticohipotérmicos, inmunoestimulantes y antialérgico (Garbarino, et al 2003); el principal uso que se les otorga a los aldehídos aislados de especies vegetales es la hidrogenación selectiva de estos, utilizando catalizadores metálicos, con el propósito de satisfacer el mercado de saborizantes, de fragancias químicas y de productos farmacéuticos (Espinoza, et al 2005).
2.4. Antecedentes.
El género Passiflora (P.) conocida comúnmente como Pasiflora, pertenecen a la familia de Passifloraceae, cuenta con 18 géneros y alrededor de 630 especies distribuidas en zonas tropicales y subtropicales de todo el mundo, en América la mayoría de las especies se hallan en Centro y Sudamérica (Labardén 2005). Extractos de pasiflora se han clasificado en varias categorías de la actividad química: ansiolíticos, espasmolítico, hipnóticos, sedantes, narcóticos (Ozarko 2001) estos extractos son parte de un tratamiento que ha tratado con éxito a pacientes ambulatorios con trastorno de adaptación y estado de ansiedad (Bourin 1997).
Dentro de las investigaciones en especies de este género sobresalen:
P. quadrangularris es utilizada tradicionalmente por los curanderos para mordeduras de serpientes, ya que esta especie causa la coagulación sanguínea evitando la hemorragia (Worldnet, et al 2001). Cuando un extracto de las hojas y ramas de P. quadrangularis se administra por vía oral, ya sea antes o después de una inyección de veneno, la neutralización de la hemorragia se reduce por debajo de 25% en ratones (Otero, et al 2000)
(Lee, et al 2000). Harman actúa como un vasodilatador (reduce la inflamación o edema), funciona mediante la liberación de GABA, serotonina y noradrenalina (Dolzhenko 1997). Harman y compuestos relacionados son mutagénicos y se vuelven más mutagénicos en condiciones ácidas del estómago (Lin, et al 1986). El Maltol es un compuesto aromático que tiene propiedades antioxidantes en la inhibición de la oxidación del hexanal en un 84% (Lee 2000). Además es responsable del desarrollo de enfermedades relacionadas con la disfunción renal y el desarrollo de ciertos trastornos neurodegenerativos (Ginkel, et al 1993). Shatfocide es un glucósido de apigenina, se aisló de P. incamata L. (Li 1991); experimentos realizados con brotes de trigo sugieren que es responsable de propiedades antimutagénicas (Peyrt, et al1992). Extractos de P. morifolia contienen el glucósido cianhidrina, y la linamarina (Jaroszewski 1996). La linamarina provoca un aumento de ácido láctico y el colesterol total en el hígado y cerebro además del agotamiento de los fosfolípidos cerebrales en conejos (Padmaja 1989).Varios compuestos monoterpenoides (compuestos con 10 carbonos) se han aislado de P. quadrangularis (Osorio 2001); algunos monoterpenos dietéticos han demostrado actividad quimioprotectora contra el cáncer mamario de rata (Crowell 1997).4-Hidroxi-2-ciclopentenona es responsable de la actividad anti-bacteriana de un extracto de hojas de P. tetrandra contra las bacterias: Escherichia coli, Bacillus subtilis, y Pseudomonas aeruginosa, también encontró que la 4-hidroxi-2-ciclopentenona fue citotóxica para las células de leucemia (Perry 1991) P. mollissima se caracteriza por poseer un alto contenido de compuestos polifenólicos hidrofílicos y lipofílicos con propiedades antioxidantes determinados por métodos fluorescentes ORAC (oxygen radical absorbance capacity), determinando que en su extracto acuoso tiene un alto potencial nutracéutico, debido al contenido de polifenoles, que inciden directamente en su capacidad para atrapar radicales y especies reactivas de oxígeno (Rojano et al,. 2012). En P. edulis se aisló e identificó cianidina-3-O-β-D-glucopiranosido como antocianina mayoritaria, a la que se atribuyen funciones como antioxidante, actividad contra alergias, inflamación, diferentes virus, hipertensión, artritis, diabetes y cáncer (Jiménez, 2010).
Junto con todos estos usos terapéuticos de los extractos de Passiflora vienen algunos efectos secundarios negativos y propiedades recientemente reportadas P. alata puede inducir enfermedades alérgicas ocupacionales en los seres humanos (Giavina-Bianchi 1997).
La mayoría de estudios sobre el género Passiflora se enfoca a buenos resultados sobre inflamaciones por ende al cáncer, debido a que en los seres humanos en diversas partes del organismo con inflamación crónico es más frecuente la aparición de tumores, hecho que indica que el proceso irritativo favorece a la carcinogénesis; la inflamación actúa como un agente genotóxico e indirectamente favorece la aparición de tumores y rompe el control celular, permitiendo la división celular con el ADN dañado y al mismo tiempo frena la apoptosis (Espinosa, 2009).
2.5. Características botánicas y taxonómicas de las especies a estudiar.
2.5.1. Passiflora cumbalensis.
[image:25.595.78.515.417.693.2]Comúnmente conocida como coruba roja, son plantas trepadoras con zarcillos filamentosos enrollados, sus hojas son alternas, miden hasta 14 cm de largo, tienen tres lóbulos más o menos triangulares; los bordes son aserrados, sus flores son solitarias y colgantes se encuentran distribuidas desde el Sur Colombia al Centro de Perú, y en Ecuador localizada en Tungurahua y Ambato(Torsten et al., 2004)..
Tabla 1. Taxonomía de P. cumbalensis
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Dilleniidae
Superorden: Violanae
Orden: Violales
Familia: Passifloraceae
Subfamilia: Passifloroideae
Tribu: Passifloreae
Género: Passiflora
Subgenero: Passiflora
Sección: Tacsonia
Especie: Cumbalensis
2.5.2. Passiflora manicata.
[image:26.595.80.513.417.701.2]Planta trepadora con los tallos más o menos pubescentes, redondeados, estriados sus estípulas son reniformes, de 0,5-2,5 cm de longitud, glandular-aserradas, sus hojas trilobadas, de 4-11 x 4,5-14 cm, glabras en el haz y algo pubescentes en el envés, de margen aserrado. Pecíolo de 1-3 cm de longitud, con 4-9 glándulas, poseeflores solitarias, sobre pedúnculos robustos de 5-10 cm de largo, con brácteas ovadas, de 2-4 cm de largo, libres o unidas en la base, son de color rojo, de 6-9 cm de diámetro, con los sépalos rojos en la cara superior y verdosos en la inferior, sus pétalos rojos, oblongos, de 2,5-4 cm de longitud con una corona con 3-4 series de filamentos, los de las dos series externas de 0,2-0,4 cm de largo, de color púrpura oscuro, su fruto de ovoide a ovoide-oblongo, de 3,5-5,5 x 2-3,7 cm, verdoso, con semillas ovoides, reticuladas, negruzcas, de unos 4-5 mm de largo, se cultiva entre los 1.800 y 3.500msnm, su floración se caracteriza por ser en verano y otoño y puede soportar hasta temperaturas de 5ºC; su fruto es muy apreciado en la alimentación por su sabor y aroma, por el contenido de vitaminas A, B y C, calcio, fósforo y hierro, tiene un amplio mercado, especialmente en Colombia, Perú, Venezuela y al Sur del Ecuador, (Torsten et al., 2004).
Tabla 2. Taxonomía de P. manicata
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Dilleniidae
Superorden: Violanae
Orden: Violales
Familia: Passifloraceae
Subfamilia: Passifloroideae
Tribu: Passifloreae
Género: Passiflora
Especie: manicata
1.5.3. Passiflora indecora.
[image:27.595.81.515.209.494.2]Es endémica se puede encontrar en el sureste de Ecuador, especialmente en las provincias de Loja y El Oro, esta especie prospera en los bosques remanentes pequeños (Torsten et al., 2004).
Tabla 3. Taxonomía de P. indecora
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Dilleniidae
Superorden: Violanae
Orden: Violales
Familia: Passifloraceae
Subfamilia: Passifloroideae
Tribu: Passifloreae
Género: Passiflora
Especie: indecora .
3. Metodología.
[image:29.595.106.520.204.680.2]En la figura 2. se indica la metodología utilizada en el presente estudio.
Figura2. Resumen de la metodología utilizada en el aislamiento y caracterización de metabolitos secundarios de P. cumbalensis, P. manicata y P. indecora con actividad inhibitoria de líneas de
cáncer humano.
3.1. Materia vegetal.
[image:30.595.86.541.281.627.2]De la especie P. cumbalensis se recolectó 5.56 Kg en Uritusinga ubicada a 17 kilómetros al suroeste de la Provincia de Loja, entre las parroquias de El Tambo, Malacatos y San Sebastián coordenadas: 04o02´21” -04º 08´09” Latitud Sur; 79º12´21” -79º14´47” Longitud Oeste.; de P. manicata se recolectó 7.023 Kg y de P. indecora se recolectó 1.789 Kg, ambas especies fueron recolectada en el barrio San Cayetano Alto – UTPL coordenadas 3º49´53” Latitud Sur; 79o14´58” a 79º04´38” Longitud Oeste. Una vez identificadas las especies se depositó una muestra de cada una en el herbario de la UTPL.
Figura 3. Mapa del cantón Loja, priorizando la ubicación de San Cayetano Alto y Uritusinga.
(Formula 1)
A los extractos obtenidos se les hicieron pruebas de inhibición de crecimiento mediante MTT en tres líneas RKO, MCF7 y D384; los extractos que presentaron la mayor actividad fueron analizados mediante cromatografía en columna.
3.2. Evaluación de la actividad inhibitoria del crecimiento celular de los extractos y compuestos aislados mediante MTT.
Se utilizaron 3 líneas celulares de cáncer humano: RKO (cáncer de colon), MCF-7 (cáncer de mama) y D384 (SNC), para el estudio de los extractos, y 2 líneas celulares de cáncer humano: RKO y D384 para los compuestos; cada línea celular se cultivó en medio RPMI (GIBCO) a 37°C, humedad del 95%, en una atmósfera con un 5% de CO2. Todas las líneas
celulares fueron expuestas por 48 horas a todos los extractos y compuestos a dosis de 50μg/mL y compuestos a 50 uM respectivamente, determinándose el efecto inhibitorio empleando el método de MTT, siguiendo el siguiente protocolo: en un caja multidish de 96 pocillos se sembró 3000 células con 100uL de medio de cultivo por pocillo, se incubó por 24 horas; se aplicó tratamiento con cada uno de los derivados disueltos en DMSO (0,5%) y medio de cultivo , también se aplicó DMSO 0,5% como control negativo y Doxorrubicina 2μM como control positivo; en todos los casos se llegó a un volumen final de 200μL en cada posillo; cada dosis se aplicó por triplicado en tres experimentos diferentes, se incubó por 48 horas y se añadió 20μL de reactivo de MTT Gibco (Kit cell titer 96º, Aqueous one solution reagent), se incubó por 2 horas y se realizó la lectura en el espectrofotómetro (Sunrise) a una absorbancia de 490nM; los datos obtenidos fueron analizados por medio del programa Prisma. Los extractos más activos en la inhibición de crecimiento en las líneas celulares se los fracciono en cromatografía en columna, y la evaluación de la actividad inhibitoria celular de metabolitos secundarios se realizó en los que se obtuvo en mayor cantidad y sin problemas de solubilidad.
3.3. Cromatografía en columna.
Tabla 4. Proporción y peso de cada uno de los extractos de las especies P. cumbalensis y P. manicata y silica gel utilizados en cromatografía en columna abierta.
Especie vegetal Disolvente utilizado en el extracto
Proporción extracto : sílica gel
Peso del extracto (g)
P. cumbalensis
tallos y hojas Hexano 1:15 18.3
P. cumbalensis
Tallos y hojas Acetato de etilo 1:17 19
P. cumbalensis
tallos y hojas Metanol 1:18 34.5
P. manicata
tallos y hojas Hexano 1:13 13
Fuente: Autor
La elución de las columnas se hizo utilizando mezclas de hexano, acetato de etilo y metanol, recolectando fracciones (eluatos) de 100 mL, se evaporó el disolvente por medio de un rotaevaporador, y se realizó cromatografía en capa fina a cada una de las fracciones.
Fotografía 1. Fotografía de Cromatografía en columna: a) cromatografía en columna del extracto hexánico de P. cumbalensis; b) cromatografía en columna del extracto de acetato de etilo de P.
cumbalensis, c) cromatografía en columna del extracto de metanol de P. cumbalensis; d)
cromatografía en columna del extracto hexánico de P. manicata.
a) b) c) d)
3.4. Cromatografía de capa fina.
Los análisis cromatográficos en capa fina (CCF) se realizaron siguiendo técnicas convencionales empleando placas de aluminio recubiertas con gel de sílice F254, se observó
con luz ultravioleta de onda corta (254nm) y larga (350nm) y se reveló con una solución de sulfato cérico.
3.5. Re-cristalización.
En base a la similitud del perfil cromatográfico se unió diversas fracciones, se limpiaron utilizando disolventes adecuados y se purificaron por el método de par de disolventes (Sakura, 2011) hasta obtener fracciones puras.
3.6. Caracterización de los metabolitos secundarios.
4.
Resultados y discusión.
4.1. Rendimiento del material utilizado.
[image:35.595.70.523.235.613.2]El rendimiento se obtuvo en base a la fórmula 1: en relación al peso del extracto obtenido y el peso de la materia vegetal seca; en la tabla 5 se indica el peso de los extractos obtenidos de cada especie en los diferentes disolventes y el rendimiento de cada uno de ellos.
Tabla 5.Extractos obtenidos. Rendimiento de especies P. cumbalensis, P. manicata y P. indecora, y peso de cada uno de los extractos en los diversos solventes utilizados.
Especie vegetal Parte de la especie
Extracto
Disolvente utilizado: Hex
peso del extracto (g) y rendimiento (%)
Disolvente utilizado: AcOEt peso del extracto (g) y rendimiento
(%)
Disolvente utilizado: MeOH
peso del extracto (g) y rendimiento (%)
P. cumbalensis
Tallos 6.39 g 0.87%
5.16 g 0.70%
5.30 g 0.72%
Hojas 12.19 g 1.78% 13.81 g 2.01% 17.80 g 2.60% P. manicata
Tallos 10.23 g 1.03%
7.03 g 0.71%
9.36 g 0.95%
Hojas 14.00 g 2.62%
12.13 g 2.27%
10.36 g 1.94%
P. indecora Tallos y
Hojas 6.29 g 1.6% 2.10 g 0.56% 7.24 g 1.90% Fuente: Autor
4.2. Inhibición de crecimiento de tres líneas celulares de cáncer humano de los extractos.
Gráfica 1. Porcentaje de inhibición del crecimiento celular en la línea de cáncer de colon RKO, en extractos de P. cumbalensis, P. manicata y P. indecora. Los datos representan la media más el error
estándar de 3 experimentos con 3 repeticiones
Fuente: Autor
Gráfica 2. Porcentaje de inhibición del crecimiento celular en la línea de cáncer de mama MCF7, en extractos de P. cumbalensis, P. manicata y P. indecora. Los datos representan la media más el error
estándar de 3 experimentos con 3 repeticiones.
Gráfica 3. Porcentaje de inhibición del crecimiento celular en la línea astrocitoma cerebral D384, en extractos de P. cumbalensis, P. manicata y P. indecora. Los datos representan la media más el error
estándar de 3 experimentos con 3 repeticiones.
Fuente: Autor
Las tres especies de Passiflora presentaron baja actividad inhibitoria de crecimiento celular frente a las líneas celulares RKO, MCF7 y D384, excepto el extracto hexánico de P. manicata y el extracto hexánico de P. cumbalensis, cuya actividad fue moderada (60-70%); algunas especies pertenecientes del genero Passifloraceae como P. incarnata L. no presentaron actividad citotóxica (Visozo et al., 2010), a diferencia de otras especies vegetales caracterizadas por alto valores de citotoxicidad (Valdiviezo, 2010), como es el caso de P. manicata, cuyo extracto presento altos valores de citotoxicidad (60-70%) contra una línea de cáncer de próstata PC3 (Suffredini et al,. 2006).
demostrando su potencial anticancerígeno (Setzer et al., 2003) como el caso del ácido kaurenoico un diterpeno aislado de la oleoresina de Copaiferalangsdorffii, que demostró inhibir in vitro el crecimiento de células leucémicas, cáncer de mama y cáncer de colon (Costa et al,. 2002); las saponinas constituyen un amplio grupo de heterósidos muy frecuentes en los vegetales con propiedad antimicótica, antibacteriana, antiinflamatoria, antioxidante, anticancerígena (Liang et al,. 1995) y los fitoesteroles en la actualidad se los conoce por sus diversas funciones como disminución de colesterol, enfermedades coronarias y como antiinflamatorio, actualmente hay estudios que los reconocen capaces de retardar el crecimiento tumoral y cáncer hereditario en un modelo en ratas y conejos. (FABA, 2012).
4.3. Fraccionamiento mediante cromatografía en columna.
[image:38.595.68.529.422.612.2]En la tabla 6, se indica el número total de fracciones obtenidas en las cuatro columnas fueron corridas en el presente trabajo.
Tabla 6. Número de fracciones obtenidas en el fraccionamiento por cromatografía en columna de los extractos de P. cumbalensis y P. manicata.
Especie vegetal
Disolvente utilizado
para la obtención del
extracto
Número de fracciones
obtenidas
P. cumbalensishojas y tallos Hexano 555
P. cumbalensishojas y tallos Acetato de Etilo 697
P. cumbalensishojas y tallos Metanol 672
P. manicata hojas y tallos Hexano 343
Fuente: Autor
4.4. Identificación de metabolitos secundarios.
Del extracto hexánico de P. cumbalensis se aisló e identifico seis compuestos:
De la fracción 98 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 95% Hex- 5%AcOEt, se obtuvo 8mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de fusión de 78-80ºC, soluble en diclorometano.
Cuyos datos espectroscópicos son: 1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.76 - 1.03 (m, 3 H) 1.14 - 1.34 (m, 19 H) 3.65 (t, J=6.65 Hz, 2 H). 13C NMR (100 MHz,
CHLOROFORM-d) ppm 14.4 (s, 1 C) 23.0 (s, 1 C) 26.0 (s, 1 C) 29.6 (s, 1 C) 29.7 (s, 1 C) 29.9 (s, 1 C) 29.9 (s, 1 C) 29.9 (s, 1 C) 30.0 (s, 1 C) 32.2 (s, 1 C) 33.1 (s, 1 C) 63.4 (s, 1 C).EM-IE: m/z % 184 M+ (8), 155 (38), 80 (24), 72 (100), 57 (70).Ver espectro Nº 1,2 y 3. La caracterización se efectuó por medio de la comparación de los datos espectroscópicos previamente informados en la base de datos Spectral Data base for Organic Compounds (SDBS).
Que se identifico como dodecanal, de formula molecular C12H24O; peso molecular: 184.3 g
mol−1, se ha identificado como componente principal del aceite esencial de Oriandrum sativum(cilantro) (Orendain, 2012);este compuesto no se ha identificado para ninguna de las especies estudiadas en este trabajo.
Figura 4. Estructura molecular de dodecanal
4.4.2. Compuesto 2.
De la fracción 309 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 60% AcOEt.- 40% MeOH, se obtuvo 12 mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de fusión de 79-81ºC, soluble en diclorometano.
Cuyos datos espectroscópicos son: 1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.85 - 0.92 (m, 3 H) 1.13 - 1.43 (m, 32 H) 1.65 (dt, J=14.11, 6.73 Hz, 14 H) 2.43 (td, J=7.41, 1.93 Hz, 2 H) 9.77 (t, J=1.93 Hz, 1 H). 13C NMR (101 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 14.27 (s, 1 C) 22.24 (s, 1 C) 22.85 (s, 1 C) 29.32 (s, 1 C) 29.51 (s, 1 C) 29.58 (s, 1 C) 29.73 (s, 1 C) 29.81 (s, 1 C) 29.85 (s, 15 C) 32.08 (s, 1 C) 44.08 (s, 1 C) 203.14 (s, 1 C).EM-IE: m/z % 380 M+ (8), 362 (30), 96 (75), 82 (100). Ver espectros Nº 4, 5 y 6. La caracterización se efectuó por medio de la comparación de los datos espectroscópicos previamente informados en la literatura (Fatland, et al 2005).
Que se identificó como hexacosanal; formula: C26H52O; peso molecular: 380.6 g mol−1,
Arabido psisthaliana (Fatland, et al 2005), este compuesto no se ha identificado para ninguna de la especies estudiadas en este trabajo.
Figura 5. Estructura molecular de hexacosanal
4.4.3. Compuesto 3.
De la fracción 133 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 90% Hex- 10%AcOEt, se obtuvo 9 mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de fusión de 130-132ºC, soluble en diclorometano.
Cuyos datos espectroscópicos son: 1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.71 (s, 3 H) 0.82-0.84 (m, 10 H) 0.92 (d, J=6.4 Hz, 3H) 1.18 (s, 7 H) 1.30 (m, 10H) 2.38 (m, 12H) 5.72 ( s, 4 H) . 13C NMR (101 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 11.8 (s, 1 C) 11.9 (s, 1 C) 18.9 (s, 1 C) 19.1 (s, 1 C) 20.6 (s, 1 C) 20.7 (s, 1 C) 21.0 (s, 1 C) 23.9 (s, 1 C) 24.7 (s, 1 C) 28.1 (s, 1 C) 31.2 (s, 1 C) 31.5 (s, 1 C) 31.6 (s, 1 C) 31.7 (s, 1 C) 36.2 (s, 1 C) 37.1 (s, 1 C) 39.3 (s, 1 C) 40.3 (s, 1 C) 42.0 (s, 1 C) 42.3 (s, 1 C) 50.1 (s, 1 C) 50.6 (s, 1 C) 55.8 (s, 1 C) 56.3 (s, 1 C) 70.2 (s, 1 C) 120.1 (s, 1 C) 129.2 (s, 1 C) 137.6 (s, 1 C) 141.6 (m, 1 C).EM-IE: m/z % 412 M+ (10), 394 (100), 255 (60), Ver espectros Nº 7, 8 y 9.La caracterización se efectuó por medio de la comparación de los datos espectroscópicos previamente informados en la literatura (Rojas, et al 2000) y (Pérez, et al 2009).
Se identificó como 5, 22 dien – 3 stigmasterol, formula: C29H48O; peso molecular: 412.69 g
Figura 6. Estructura molecular de 5,22 dien – 3 estigmasterol
4.4.4. Compuesto 4.
De la fracción 121 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 90% Hex- 10%AcOEt, se obtuvo 11 mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de fusión de 79-81ºC, soluble en diclorometano.
Cuyos datos espectroscópicos son:1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.64 - 0.74 (m, 4 H) 0.79 - 0.89 (m, 11 H) 0.91 - 0.98 (m, 5 H) 0.99 - 1.21 (m, 15 H) 1.23 (br. s., 1 H) 1.24 - 1.32 (m, 5 H) 1.37 (br. s., 1 H) 1.39 - 1.63 (m, 13 H) 1.65 - 1.70 (m, 1 H) 1.76 - 1.91 (m, 4 H) 1.92 - 2.13 (m, 5 H) 2.18 - 2.37 (m, 4 H) 3.46 - 3.67 (m, 3 H) 5.05 (s, 1 H) 5.14 (d,
J=8.34 Hz, 2 H) 5.30 - 5.42 (m, 2 H). 13C NMR (101 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 11.86 (s, 1 C) 11.98 (s, 1 C) 12.05 (s, 1 C) 12.25 (s, 1 C) 18.77 (s, 1 C) 18.98 (s, 1 C) 19.03 (s, 1 C) 19.39 (s, 1 C) 19.82 (s, 1 C) 21.08 (s, 1 C) 21.21 (s, 1 C) 23.06 (s, 1 C) 24.30 (s, 1 C) 24.36 (s, 1 C) 26.07 (s, 1 C) 28.24 (s, 1 C) 28.92 (s, 1 C) 29.14 (s, 1 C) 29.70 (s, 1 C) 31.67 (s, 1 C) 31.90 (s, 1 C) 33.94 (s, 1 C) 36.14 (s, 1 C) 36.50 (s, 1 C) 37.25 (s, 1 C) 39.68 (s, 1 C) 39.77 (s, 1 C) 40.49 (s, 1 C) 42.21 (s, 1 C) 42.30 (s, 1 C) 42.32 (s, 1 C) 45.83 (s, 1 C) 50.12 (s, 1 C) 50.15 (s, 1 C) 51.23 (s, 1 C) 55.95 (s, 1 C) 56.05 (s, 1 C) 56.76 (s, 1 C) 56.86 (s, 1 C) 62.74 - 64.09 (m, 1 C) 71.80 (s, 1 C) 121.71 (s, 1 C) 129.26 (s, 1 C) 138.31 (s, 1 C) 140.75(s, 1 C) 150.66 - 193.59 (m, 1 C). EM-IE: m/z % 414 M+ (6), 273 (10), 255 (10), 231 (8), 42 (100), Ver espectros Nº 10, 11 y 12. La caracterización se efectuó por medio de la comparación de los datos espectroscópicos previamente informados en la literatura (Gabirello, 2010).
Identificando como gamma-sitosterol, formula: C29H50O; peso molecular: 414.7 g mol−1, es
[image:41.595.208.388.133.309.2]de Pentacalia vaccinioides (Gabirello, 2010). También fue caracterizado en el extracto de diclorometano de Rhoeodiscolor, conocida como “maguey morado o barquilla”, en donde se le atribuyen funciones de antiinflamatorio y bactericida (Domínguez, et al 2002), este compuesto no se ha identificado para ninguna de las especies estudiadas en este trabajo.
Figura 7.Estructura molecular de gamma sitosterol
4.4.5. Compuesto 5.
De la fracción 132 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 90% Hex- 10%AcOEt, se obtuvo 13 mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de fusión de 79-81ºC, soluble en diclorometano.
Cuyos datos espectroscópicos son 1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.69-0.73 (m, 3H) 0.76-0.89 (m, 9 H) 0.91-1.05 (m, 5 H) 1.07-1.13 (m, 3H) 1.35-1.42 (m, 4 H) 1.65 – 1.70 (m, 9H) 1.8- 2.0 (m, 10H) 2.38 (m, 1H) 3.2 (m, 1H)3.63 (m, 1H) 4.68 (m, 1H) 5.19 (m,
J=8.34 Hz 1H) 5.26 (m 2H). 13C NMR (101 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 11.8 (s, 1 C) 17.7 (s, 1 C) 19.3 (s, 1 C) 21.6 (s, 1 C) 24.3 (s, 1 C) 26.1 (s, 1 C) 27.4 (s, 1 C) 28.1 (s, 1 C) 28.4 (s, 1 C) 29.8 (s, 1 C) 32.6 (s, 1 C) 34.3 (s, 1 C) 36.3 (s, 1 C) 37.1 (s, 1 C) 37.2 (s, 1 C) 38.6 (s, 1 C) 38.9 (s, 1 C) 39.2 (s, 1 C) 40.1 (s, 1 C) 40.8 (s, 1 C) 50.5 (s, 1 C) 55.1 (s, 1 C) 55.3 (s, 1 C) 79.0 (s, 1 C) 118.9 (s, 1 C) 121.7 (s, 1 C) 139.8 (s, 1 C) 145.2 (s, 1 C) 150.9 – 151.68 (m, 1 C).EM-IE: m/z % 414 M+ (25), 396 (100), 255 (60) Ver espectros Nº 13, 14 y 15.La caracterización se efectuó por medio de la comparación de los datos espectroscópicos previamente informados en la literatura (Gabirello, 2010).
Identificado como: beta-sitosterol, formula: C29H50O; peso molecular: 414.7 g mol−1;
(matico)en donde se le otorga características antiinflamatorias y cicatrizantes (Goity, 2007); este compuesto no se ha identificado para ninguna de la especies estudiadas en este trabajo.
Figura 8. Estructura molecular de beta sitosterol
4.4.6. Compuesto 6.
De la fracción 124-127 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 90% Hex-10%AcOEt, se obtuvo 15 mg de un compuestode color blanquecino,con un punto de fusión de 79-81ºC, soluble en diclorometano.
Cuyos datos espectroscópicos son: 1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.63 (s, 3H) 0.83 (d, J=6.7 Hz 3H) 0.84 (d, 9H) 0.92 (d, J=6.8 Hz 4H) 0.95 (s, 10 H) 1.04 (d, J=6.6 Hz 6H) 3.63 (m, 1H) 5.18 (dd 3H) 5.22 (dd, J=8.0 Hz 1H) 5.39 (m, 1H) 5.58 (m, 3H) . 13C NMR (101 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 12.0 (s, 1 C) 16.3 (s, 1 C) 17.6 (s, 1 C) 19.6 (s, 1 C) 21.1 (s, 2 C) 23.0 (s, 1 C) 28.3 (s, 1 C) 31.9 (s, 1 C) 33.1 (s, 1 C) 37.0 (s, 1 C) 38.4 (s, 1 C) 39.1 (s, 1 C) 40.4 (s, 1 C) 40.7 (s, 1 C) 42.8 (s, 2 C) 46.2 (s, 1 C) 54.5 (s, 1 C) 55.7 (s, 1 C) 70.4 (s, 1 C) 116.3 (s, 1 C) 119.6 (s, 1 C) 132.0 (s, 1 C) 135.6 (s, 1 C) 139.8 (s, 1 C) 141.3-141.9 (m, 1 C).EM-IE: m/z % 396M+ (64), 381 (3), 363 (100), 337 (35), 271 (5); 253 (20), 227 (4), 211 (15), 158 (5), 143 (17), Ver espectros Nº 16, 17 y 18.La caracterización se efectuó por medio de la comparación de los datos espectroscópicos previamente informados en la literatura (Chaparro, et al 2010).
Identificado como: ergosta-5,7,22-trien-3-ol, formula: C28H44O; peso molecular: 396.3 g
2012), este compuesto no se ha identificado para ninguna de la especies estudiadas en este trabajo.
Figura 9. Estructura molecular de ergosterol
4.5. Actividad inhibitoria de crecimiento celular de los fitoesteroles identificados, en dos líneas de cáncer humano RKO y D384.
El estudió se lo efectuó en dos líneas celulares RKO y D384, de los fitoesteroles porque había cantidades optimas y por los reportes anti-cancerígenos encontrados en la literatura; se obtuvo entre 15-20% de inhibición celular en la línea RKO de todos los fitoesteroles; y de 50-60% en la línea D384 de todos los fitoesteroles, excepto beta-sitosterol que obtuvo 15%, como se puede observar en las gráficas 4 y 5.
.
Fuente: Autor
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Se han encontrado algunas evidencias de que los fitoesteroles, particularmente el sitosterol, podrían inducir apoptosis en células de cáncer de próstata, de mama y de colon mediante un incremento en la actividad de la caspasa-3, enzima proteasa que participa en la cascada de la apoptosis (Choi, et al 2003) los fitoesteroles también pueden interferir en el crecimiento y la multiplicación celular aunque se desconoce la forma en que se lleva a cabo, en las etapas de angiogénesis y metástasis, estos compuestos parecen reducir la capacidad de las células, además el sitoesterol participa en la activación de enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa y la glutatión peroxidasa, con esto se reducen los agentes oxidantes y potenciales carcinogénicos (Woyengo, et al 2009), se conoce que los fitoesteroles inhiben el crecimiento tumoral y la oxidación de las lipoproteína al incorporarlos en la dieta, afirmando esta teoría con el estudio realizado en ratones en donde se confirma que los fitoesteroles en la dieta retardan el crecimiento y el esparcimiento de células de cáncer de mama, fue probado en la línea MDA-MB-231, xeno injertado en ratones SCID en donde los animales fueron alimentados con el suplemento AIN-93G que contiene mezcla de fitoesteroles, por 15 días antes de la inoculación del tumor, al final se observó que el tamaño del tumor
desarrollado en los ratones alimentados con fitoesteroles era 33% más pequeño y tenían 20% menos metástasis en nódulos linfáticos y pulmones (Honey, 2012).
En los estudios in vitro, gamma sitosterol y ergosterol inhibieron el crecimiento de las células PC-3 un 70% y 14% respectivamente, los fitoesteroles también inhibieron la invasión de membranas de Matrigel, disminuyeron la migración de células tumorales, redujeron los enlaces de células PC3 con lalaminina y la fibronectina, se concluyó que los fitoesteroles inhiben el crecimiento de las células tumorales PC3 directamente en cultivo in vitro e indirectamente como suplemento en la dieta, y que el gamma-sitosterol es más efectivo (Honey, 2012).
β-sitosterol, es considerado como el principal fitoesterol diétetico que ha sido probado en el crecimiento delas células HT-29, una línea celular de cáncer de colon humano, cuyo estudio indico que de 8 y 16 mM fueron eficaces en el crecimiento celular en un 50%, esto se dio por la incorporación de este fitoesterol al grupo de fosfolípidos en la membrana, por lo que se produjo una disminución del 50% de las membranas esfingomieliticas de las células cultivadas, por lo que se considera posible quela inhibición del crecimiento observada por β -sitosterol puede ser mediada a través de la influencia de la vía de transducción de señal que implican fosfolípidos de la membrana (Awad, et al 1996).5, 22 dien stigmasterol 3 ol, es un fitoesterol que se lo ha estudiado en ratones como un posible antitumoral contra el
carcinoma EhrilchAscites (Ghosh et al., 2011). No existen estudios de la identificación o
caracterización de fitoesteroles en las especies estudiadas en el presente trabajo.
4.6. Del extracto de acetato de etilo de P. cumbalensis se aisló e identificó un
compuesto.
4.6.1. Compuesto 7.
De la fracción 309-311 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 20% Hex- 80% AcOEt, se obtuvo 8 mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de fusión de 135-1386ºC, soluble en cloroformo.
Cuyos datos espectroscópicos son: IR (ATR) νmax cm-1: 2916.5, 2848.9 (COH) 1725.4,
1472.8 1377.4.1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.78 - 0.85 (m, 3H) 1.18 (m, 30 H) 1.34 (m, 2 H) 2.35 (m, J=7.41, 1.93 Hz, 2 H) 9.70 (t, J=1.93 Hz, 1 H). 13C NMR (101 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 14.11 (s, 1 C) 22.09 (s, 1 C) 22.69 (s, 1 C) 29.16 (s, 1 C) 29.36 (s, 1 C) 29.43 (s, 1 C) 29.58 (s, 1 C) 29.66 (s, 1 C) 29.69 (s, 8 C) 31.92 (s, 1 C) 43.92 (s, 1 C) 202.98 (s, 1 C). EM-IE: m/z % 382 M+ (5), 82 (100). Ver espectros Nº 19, 20, 21 y 22.
Como se puede ver en el espectro N° 19, existen dos bandas de intensidad parecida 2916.5 y 2848.9 entre 2900 y 2700 que indica la vibración de la tensión de C-H, lo que generalmente sirve para identificar a los aldehídos. La caracterización se efectuó por medio de la comparación de los datos espectroscópicos previamente informados en la literatura (Tabrizi, et al 2010). Ha sido identificado como principal componente del aceite esencial de
T. transcaspicusen habitad natural (Tabrizi, et al 2010).
Figura 10. Estructura molecular de nonadecanal
4.7. Del extracto de metanol de P. cumbalensis se obtuvo dos compuestos.
4.7.1. Compuesto 8.
De la fracción 217 corrida en cromatografía en columna con una polaridad de 10% Hex- 90%AcOEt, se obtuvo 6 mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de fusión de 119-123ºC, soluble en DMSO.
El Espectro de CG/EM mostró tiempo de retención de 30.68, ver espectro Nº 23 y se determinó su peso molecular de 530g mol−1, ver espectro Nº 24, pero por problemas desolubilidad no seidentificó y al obtener cantidades pequeñas imposibilitó las repeticiones de RMN.
4.7.2. Compuesto 9.
De la fracción 401 corrida en cromatografía en columna con una polaridad de 60% MeOH- 40%AcOEt, se obtuvo 5 mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de fusión de 136-139ºC, soluble en DMSO.
El Espectro de CG/EM mostró un tiempo de retención de 7.99, ver espectro Nº 25 y se determinó su peso molecular de 561g mol−1, ver espectro Nº 26, pero por problemas de solubilidad no se identificó.
4.8 Del extracto hexánico de P. manicata se obtuvo dos mezclas de
4.8.1. Mezcla 1 (M1).
De la fracción 37 corrida en cromatografía en columna con una polaridad de 90% Hex - 10%AcOEt, se obtuvieron7 mg de color blanquecino.
El Espectro de CG/EM mostró: ver espectro Nº 27
4.8.1.1. Compuesto 1-M1.
Tiempo de retención de 10.45, peso molecular de 281 g mol−1. Ver espectro Nº 28 a.
4.8.1.2. Compuesto 2-M1.
Tiempo de retención de 11.02, peso molecular de 355 g mol−1. Ver espectro Nº 28 b.
4.8.1.3. Compuesto 3-M1.
Tiempo de retención de 12.14, peso molecular de 278 g mol−1. Ver espectro 28 c.
4.8.1.4. Compuesto 4-M1.
Tiempo de retención de 17.43, peso molecular de 336 g mol−1. Ver espectro Nº 28 d.
4.8.1.5. Compuesto 5-M1.
Tiempo de retención de 22.08, peso molecular de 364 g mol−1. Ver espectro Nº 28 e.
4.8.2. Mezcla 2:
Fue obtenido de la fracción 138 corrida en cromatografía en columna con una polaridad de 30% Hex - 70%AcOEt, se obtuvieron8 mg de color blanquecino.
El Espectro de CG/EM mostró cuatro compuestos: ver espectro Nº 29.
4.8.2.1. Compuesto 1-M2.
Tiempo de retención de 12.13, con un peso molecular de 278g mol−1. Ver espectro Nº 30 a.
4.8.2.2. Compuesto 2-M2.
Tiempo de retención de 17.39 con un peso molecular de 308g mol−1. Ver espectro Nº 30 b.
4.8.2.3. Compuesto 3-M2.
Tiempo de retención de 22.01 con un peso molecular de 364g mol−1. Ver espectro Nº 30 c.
Tiempo de retención de 28.8, con un peso molecular de 392g mol−1. Ver espectro Nº. 30 d.
CONCLUSIONES
Los extractos con mayor actividad inhibitoria de crecimiento celular fueron el extracto hexánico de hojas P. manicata, y el extracto hexánico tallos y hojas de P. cumbalensis frente a las tres líneas celulares de cáncer estudiadas RKO, MCF7 y D384 con un porcentaje entre el 50% y 60%, mientras que los demás extractos presentaron actividad inhibitoria entre 10y30%.
Del extracto hexánico de P. cumbalensis se identificaron seis metabolitos secundarios, de los cuales cuatro son fitoesteroles (5,22-dien-3 estigmasterol; gamma-sitosterol; beta sitosterol y ergosterol) y dos aldehídos (dodecanal y hexacosanal); todos aislados e identificados por primera vez en esta especie; de los cuales los fitoesteroles poseen importante actividad inhibitoria 50-60% en la línea celular de cáncer D384 y bajo entre el 15-20% en la línea celular RKO.
RECOMENDACIONES
• Continuar con el estudio del género Passiflora, realizando el aislamiento e identificación de metabolitos, con el fin de detectar cual son los componentes que le dan las propiedades curativas de la especie.
• Sería recomendable hacer ensayos de inhibición de crecimiento en líneas celulares normales para evaluar su efecto toxico en estas.
• Probar otras actividades de los extractos y compuestos identificados como: antibacteriana, anti fúngica, antioxidante.
• Finalmente continuar realizando estudios en especies vegetales con antecedentes
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