Aislamiento de microorganismos degradadores de 2,4,6-trinitrotolueno (TNT) a partir de ambientes contaminados con explosivos

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE 2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES

CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C.

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE 2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES

CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

TRABAJO DE GRADO

PRESENTADO COMO REQUISITO PARCIAL

PARA OPTAR AL TÍTULO DE MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

DIRECTOR: FABIO ROLDÁN, Ph.D.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C.

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NOTA DE ADVERTENCIA

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE 2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES

CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

APROBADO

__________________________ Fabio Roldán, Ph.D.

Microbiólogo Director

__________________________ Ziv Arbeli, Ph.D.

Microbiólogo Codirector

__________________________ Aura Marina Pedroza, Ph.D. Bacterióloga

Jurado

__________________________ Gloria Acosta, M.Sc

Microbióloga Jurado

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C.

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE 2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES

CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

_________________________ Ingrid Schuler García, Ph.D Decana Académica

Facultad de Ciencias

_________________________ Janeth Arias Palacios, M.Sc Directora

Carreras Microbiología

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C.

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AGRADECIMIENTOS

A Fabio Roldán, Erika García, Ziv Arbeli y Joaquín Benavidez por permitirme participar en un proyecto de aspiraciones grandes, imponentes e importantes. A Fabio por ser el ejemplo de una carrera exitosa y a Erika por enseñarme a dar pasos grandes. A Carlos por ser un compañero incondicional dentro y fuera del laboratorio, porque gracias a su humor, serenidad y responsabilidad, este proceso estuvo cobijado por una gran amistad. A todas las manos amigas que en momentos de desesperación nos brindaron su ayuda, Johan, Juan Pablo, Angela y Angélica, espero que sigan haciendo parte de este proyecto y que sus logros se queden en casa.

A INDUMIL por creer en el proyecto y motivar la respuesta de sus participantes dándonos un ejemplo de palabra y eficiencia. A la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) por el espacio de trabajo y la formación académica.

A Fabio Roldán y Erika García por la dirección de este proyecto, los aportes académicos, la confianza, la comprensión y el apoyo en momentos difíciles.

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TABLA DE CONTENIDO

AGRADECIMIENTOS ……… VI TABLA DE CONTENIDO ………. VII ÍNDICE DE FIGURAS ……… IX ÍNDICE DE TABLAS ……….. X RESUMEN ………... XI

1. INTRODUCCIÓN ……….…… 1

2. MARCO TEÓRICO ………..……… 2

2.1 DEGRADACIÓN MICROBIOLÓGICA DE TNT ……… 5

2.2 RUTAS METABÓLICAS ……….……….. 7

2.2.1 VÍA I ……….. 8

2.2.2 VÍA II ………. 9

2.2.3 VÍA III ………...………... 11

2.3 MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE TNT ……….... 13

2.3.1 AISLAMIENTO ………. 13

2.3.1.2 MEDIOS DE CULTIVO ……….… 14

2.3.2 EVALUACIÓN DEL POTENCIAL DEGRADADOR ……….…... 15

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN ……….….... 16

4. OBJETIVOS ……….…... 17

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5.1 ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO ……… 18

5.2 AISLAMIENTO ………....………...…. 19

5.2.1 ETAPA I: PREENRIQUECIMIENTO ……….……… 20

5.2.2 ETAPA II: AISLAMIENTO EN MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO …………...….. 21

5.2.3 ETAPA III: SEGUNDO CULTIVO Y SELECCIÓN MACROSCÓPICA DE COLONIAS……….……. 21

5.2.4 ETAPA IV: MÉTODOS ANALÍTICOS: HPLC ………...…… 22

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ……….………... 23

6.1 ETAPA I: PRE-ENRIQUECIMIENTO ………... 24

6.2 ETAPA II: AISLAMIENTO EN MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO ………….……... 27

6.3 ETAPA III: SUBCULTIVO Y SELECCIÓN DE COLONIAS ……….……. 33

6.4 ETAPA IV: MÉTODOS ANALÍTICOS: HPLC ………..………… 35

7. CONCLUSIONES ……….. 43

8. RECOMENDACIONES ………... 44

9. REFERENCIAS ……….. 45

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ÍNDICE DE FIGURAS

1. Estructura química del TNT …………..……… 3

2. Reducción de TNT mediante enzimas Nitroreductasas ………..… 10

3. Formación del complejo Meisenheimer ………. 12

4. Transformación del complejo Meisenheimer ……….… 12

5. Diversidad de colonias obtenidas en T2 de la muestra No. 6 ……… 32

6. Subcultivo en medio líquido correspondiente a T2 ……….. 33

7. Coloraciones de Gram de las colonias T1, T100, T54 y T 137 ………….. 34

8. Cromatograma Estándar 100ppm TNT ……….. 36

9. Cromatograma Control No 1 ……….... 38

10. Cromatograma Control No 2 ….………. 39

11. Cromatograma Cepa T1 ……….... 41

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ÍNDICE DE TABLAS

1. Propiedades físico químicas del TNT ………..… 3

2. Estudios que reportan microorganismos como potenciales degradadores de TNT ………..…. 6

3. Medios de cultivo más reportados para el aislamiento de microorganismos degradadores de TNT ……… 14

4. Puntos de Muestreo seleccionados ………..…. 18

5. Tratamientos utilizados en el aislamiento de microorganismos degradadores de TNT ………..…. 19

6. Caracterización físico química de las muestras ……….. 23

7. Morfología microscópica de los microorganismos desarrollados en los pre-enriquecimientos ……….... 26

8. Número de colonias seleccionadas a partir de cada muestra ……… 30

9. Cromatografía curva de calibración de TNT ……… 37

10. Cromatografía Control No 1 ………..… 38

11. Cromatografía Control No 2 ……….…. 39

12. Cromatografía Cepa T1 ……….. 41

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RESUMEN

El 2,4,6-Trinitrotolueno (TNT) es un compuesto nitroaromático con propiedades explosivas y gran estabilidad química. Su producción incrementó desde la primera guerra mundial y actualmente supera los dos millones de toneladas anuales. De la mano con su uso ha incrementado la contaminación generada por este compuesto, el cual tiene efectos mutagénicos y carcinogénicos. Estas características han generado la necesidad de buscar estrategias para eliminarlo del ambiente; la biorremediación se ha perfilado como una de las más efectivas debido a que además de ser ambientalmente amigable, logra la mineralización completa del contaminante. Para llevar a cabo este método es necesario conocer microorganismos con capacidad metabólica para degradarlo. Los sitios que presentan contaminación histórica con explosivos, son una excelente fuente de aislamiento de microorganismos con potencial degradador, ya que están adaptados a su presencia y han adquirido la capacidad de incorporarlo a su metabolismo y transformarlo. El aislamiento se realizó a partir de zonas aledañas a una de las plantas de producción y ensamblaje de explosivos más importante de Colombia, donde se presumía había contaminación histórica de TNT. Se utilizaron tres medios de cultivo, diferenciados básicamente por la presencia o ausencia de fuentes adicionales de carbono (glucosa, citrato, glicerol y acetato) y nitrógeno (NH4). El aislamiento se

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ABSTRACT

2,4,6–Trinitrotoluene (TNT) is a nitroaromatic compound that has stand out due to its explosive properties and its great chemical stability. Its production has been increased since the World War II and now days it is over 2 million tons per year. As well as the use of this product has been increase, the contamination that it generates, which has mutagenic and carcinogenic effects has also raised. These features have generated the need of strategies that allow the elimination of this compound from the environment. The bioremediation seems to be one of the most effective alternatives since it is environmentally friendly and also it gets the whole mineralization of the contaminant. In order to accomplish this method it is required to know microorganisms metabolically capable to degrade this compound. Places that present historic contamination with explosives or with some compounds of similar chemical nature are an excellent isolation source of microorganisms with degradation potential for these compounds. It occurs not only because the microorganisms have adapted to the compound presence but also because they have acquired the capability of incorporate it to its metabolism, transforming it in simpler and less toxic compounds. The isolation was made from zones near by the colombian more important explosive production and assembly plant. Those places where presume to be contaminated with nitroaromatics like TNT. Three different culture media were used, basically differenced by the presence or absence of additional carbon sources (glucose, citrate, glycerol and acetate) and nitrogen (NH4). The isolation was

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1. INTRODUCCIÓN

El TNT es uno de los explosivos más importantes dentro de la industria militar debido a que detona con gran potencia y por su estabilidad es fácil de manipular. En Colombia, se viene utilizando en diversas actividades como la minería, las excavaciones y las demoliciones, y esto ha provocado el incremento de su producción.

Este compuesto es uno de los nitroaromáticos más conocidos y hace parte de un grupo de xenobióticos recalcitrantes que generan efectos nocivos sobre el medio ambiente. Dichas estructuras aromáticas nitrogenadas, se caracterizan por ser compuestos persistentes y altamente tóxicos, son químicos mutagénicos y carcinógenicos, que están clasificados por la USEPA (del inglés United States Environmental Protection Agency) como uno de los contaminantes de mayor prioridad, debido a su toxicidad con el ambiente y el peligro que representan para la salud humana.

Estas características, han generado la necesidad de encontrar métodos efectivos y ambientalmente amigables que permitan tratar diversos ambientes contaminados con TNT. Aunque la incineración es el método más utilizado a nivel mundial para tratar este tipo de contaminantes, en las últimas décadas la biorremediación se ha convertido en una de las mejores alternativas para la eliminación de contaminantes xenobióticos, debido a que representa ventajas en cuanto a costos, seguridad, mineralización completa y efectividad, frente a los otros métodos.

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Experiencias en biorremediación basadas en la degradación de compuestos persistentes como explosivos, fenoles e hidrocarburos, reportan que los microorganismos nativos presentes en estos ambientes contaminados son los degradadores más efectivos, pues están adaptados a las condiciones del ambiente y la presencia del contaminante. Esto lleva a pensar que los sitios con presencia histórica de contaminación por TNT son unas de las mejores fuentes para buscar degradadores nativos con capacidad para utilizar este compuesto en su crecimiento como fuente de carbono y/o nitrógeno

2. MARCO TEÓRICO

A partir de 1830, con el desarrollo de la química orgánica, se empezaron a sintetizar gran diversidad de compuestos, dentro de los que destacaron gracias a su propiedad explosiva, los productos resultantes del proceso de nitrificación (Lewis et al., 2003). La Primera Guerra Mundial, trajo consigo un gran avance en la producción de estos compuestos, que logró consolidar la industria militar como una de las industrias más importantes durante el siglo XX. El 2,4,6-trinitrotolueno, más conocido como dinamita o TNT, ha sido uno de los productos dominantes dentro de esta industria, siendo también uno de los más utilizados en el desarrollo de bombas, granadas, propulsores y dispositivos detonantes empleados en demoliciones (Nyanhongo et al.,

2008), gracias a que por su estabilidad es fácilmente manipulable.

El TNT es el producto de la nitración del tolueno (Figura 1), que se genera mediante una reacción llamada sustitución electrofílica, la cual requiere la presencia de una mezcla de ácidos nítricos y sulfúricos altamente concentrados (McMurry, 2004). Este compuesto posee una gran estabilidad química, y esto permite que en la producción de dispositivos detonantes pueda utilizarse de forma pura, sin la presencia de ninguno de sus isómeros

(Unión Española de Explosivos, 1994). Sin embargo, en algunas ocasiones,

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como el pentaeritritol, con el objetivo de aumentar el potencial detonante de los productos (Ballesteros 2006).

Figura 1: Estructura química del 2,4,6-Trinitrotolueno. Tomada de: Lewis et al., 2003

Tabla No 1: Propiedades físico químicas del TNT

Propiedad Magnitud Punto de solidificación 80,6ºC

Punto de Degradación 300ºC Temperatura de Explosión 400ºC

Solubilidad Agua 20oC 120mg/L Coeficiente Henry 0,0018

Presión de Vapor 20oC 150Pa

Densidad 1,65g/cm3

Velocidad de Detonación 6900m/s

Peso Molecular 227,1 gmol

Tomada de: Unión Española de Explosivos, 1994

Byung-Hoon et al., 2008

Además de ser un compuesto químicamente estable, el TNT se caracteriza por ser insoluble en agua, neutro y no corrosivo (Unión Española de

Explosivos, 1994). Forma cristales color amarillo pálido y bajo la luz solar se

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(Unión Española de Explosivos, 1994). Es importante tener en cuenta que para mantener estables sus características a temperatura ambiente y trabajarla sin peligro de explosión, la muestra debe estar disuelta en compuestos como etanol y acetona (Ballesteros, 2006).

EL TNT es uno de los explosivos más utilizados, su producción supera los dos millones de toneladas anuales (Byung-Hoon In et al., 2008), y esta es una de las razones por las cuales se ha convertido en un contaminante de gran prioridad dentro de la lista especial que maneja la EPA acerca de los químicos contaminantes tóxicos más peligrosos. Adicionalmente, el TNT hace parte de un grupo de xenobióticos recalcitrantes nocivos para el ambiente (Bradley et al., 1994); razón que cual ha motivado diversas investigaciones dirigidas hacia la búsqueda de tratamientos que permitan recuperar las zonas afectadas con estos compuestos, las cuales generalmente están ubicadas alrededor de las plantas de producción, y ensamble de armamento (misiles) o de lugares de alta actividad militar. Estas zonas se han caracterizado por presentar concentraciones superiores a los 200g TNT/Kg de Suelo (Zoe & Neil, 2006).

Muchos de los compuestos nitroaromáticos, como los explosivos, fertilizantes, insecticidas y solventes, han sido clasificados como compuestos citotóxicos y carcinogénicos (Park et al., 2003). Por parte del TNT, se ha reportado que tiene la capacidad de causar anomalías en los eritrocitos, destrucción del hígado y diferentes tipos de cáncer (Zoe & Neil, 2006), y es esta otra de las razones por las cuales se clasifica como un contaminante prioritario.

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química artificial, limita el proceso de degradación por microorganismos nativos presentes en los suelos contaminados (Zoe & Neil, 2006). Estas características y su persistencia en el ambiente afecta la integridad del ecosistema provocando efectos mutagénicos en los humanos, peces, algas y microorganismos (Park et al., 2003).

Actualmente, se conocen diferentes tratamientos, físicos, químicos y biológicos para tratar ambientes contaminados con explosivos, entre los que destacan la incineración de suelos, el compostaje y la biorremediación. Sin embargo, algunos estudios demuestran que la degradación biológica de compuestos nitroaromáticos representa ventajas frente a las otras soluciones, debido a que es un tratamiento ambientalmente amigable, económico, seguro para el personal que lo efectúa y efectivo debido a que no traslada el contaminante de un ambiente a otro, sino que realmente lo trasforma en metabolitos simples e inocuos (Zoe & Neil, 2006).

Es así, como conocer el metabolismo de los microorganismos capaces de degradar los explosivos en compuestos más simples y menos tóxicos para el entorno, ha tomado gran importancia, abriendo las puertas al desarrollo de métodos de remediación biológica.

2.1 Degradación Microbiológica de TNT

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Numerosos estudios han reportado el aislamiento de microorganismos con potencial degradador de TNT (Tabla 2), capaces incluso de mineralizar este compuesto, a partir de ambientes contaminados con explosivos.

Tabla No 2: Estudios que reportan algunos microorganismos como potenciales degradadores de TNT.

FUENTE AÑO INVESTIGACIÓN

Boopathy R., et al. 1993 Desulfovibrio sp: Transformación de TNT en compuestos como 2,4-diamino-6-nitrotolueno.

Vanderberg L., et al. 1995

Mycobacterium vaccae: Degradación de TNT produciendo un compuesto marrón identificado como 4-amino-2,6-dinitroácido benzóico.

Pasti-Grigsby M., et al. 1996 Actinomyces sp: Degradación aeróbica y anaeróbica de TNT con producción de intermediarios hidroxilaminotoluenos.

Tope A., et al. 1999 Estudio sobre la transformación de TNT en aminonitrotoluenos por parte de una cepa de Arthrobacter sp.

Pavlostathis S., et al. 2002 Anabaena sp: Transformación de TNT en productos solubles y metabolitos polares.

Kim H., et al. 2002 Evaluación de la capacidad de Klebsiella sp. Para degradar TNT en compuestos menos tóxicos como amino-nitrotolueno.

Park C., et al. 2002 Estimación de la cinética de degradación de TNT por parte de una cepa de Pseudomonas putida.

Yin H., et al. 2004

Evaluación de la capacidad metabólica de Escherichia coli para convertir TNT en compuestos como Hidroxilamino-dinitrotolueno.

Kutty R., et al. 2005 Clostridium acetobutylicum: Degradación de TNT mediante enzimas nitroreductasas.

Claus H., et al. 2007 Raoutella terrígena degradación de TNT en metabolitos más sencillos

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2.2 Rutas Metabólicas de Degradación de TNT:

Se conocen principalmente tres vías metabólicas por las cuales algunos microorganismos degradan el TNT, convirtiéndolo en compuestos intermediarios menos tóxicos. La primera (Vía I), se da en condiciones de anaerobiosis y consiste en una transformación secuencial de los grupos nitro unidos al anillo aromático hacia la correspondiente amina (Yin et al., 2004). Esta vía de transformación, es generalmente realizada por microorganismos anaeróbicos, donde Clostridium sp es uno de los más reportados, junto con algunas bacterias sulfatoreductoras como Desulfovibrio sp (Zoe & Neil,

2006).

Así mismo, se han descrito otras dos vías alternativas, que ocurren en presencia de oxígeno, aún cuando una de ellas no lo utiliza como aceptor final de electrones. Precisamente, la segunda vía (Vía II), es aquella en la que el TNT actúa como un aceptor de electrones, debido a la gran facilidad que existe para reducir los nitro-grupos formados por los enlaces nitrógeno-oxígeno altamente electrofílicos (Yin et al., 2004), con este metabolismo se han reportado bacterias como Enterobacter cloacae, Escherichia coli y

Pseudomonas putida (Zoe & Neil, 2006).

La tercera vía (Vía III) es una de las rutas metabólicas más complejas, que se caracteriza por la formación de un complejo llamado Meisenheimer, que se genera cuando el microorganismo es capaz de atacar directamente los enlaces que conforman el anillo aromático. Esta es una de las vías más difícil y menos común dentro de los microorganismos reportados (Zoe & Neil,

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2.2.1 Vía I

La descripción de esta ruta metabólica es dada con claridad en el estudio realizado por Preuss y col. (1992), donde utilizaron bacterias sulfatoreductoras crecidas en un medio con sulfato y piruvato como fuente de energía y TNT como única fuente de nitrógeno.

Esta degradación consiste, básicamente, en una reducción secuencial de los grupos nitro del TNT hasta sus respectivas aminas (Yin et al., 2004). Algunos autores reportan que la reducción del primer nitro-sustituto del TNT, puede darse bajo condiciones tanto de aerobiosis como anaerobiosis (Zoe & Neil,

2006). Cuando se lleva a cabo este paso se obtiene uno de los primeros

subproductos, denominado: 4-amino-2,6-dinitrotolueno (4-ADNT), y su isómero: 2-amino-4,6-dinitrotolueno (2-ADNT) (Preuss et al., 1992). Una de las características de esta secuencia de reacciones, es que el segundo grupo nitrogenado no se reduce hasta que finaliza la reacción anterior, por lo cual el segundo paso está definido por la transformación de 4-ADNT y 2-ADNT a 2,4-diamino-6-nitrotolueno (DANT) (Preuss et al., 1992).

La siguiente etapa es la reducción total del TNT, produciendo finalmente triaminotolueno (TAT). Esta reacción requiere un donador de electrones como el piruvato o el monóxido de carbono y un conjunto de enzimas encargadas de catalizar la reacción, llamadas hidrogenasa, Piruvato: ferredoxin oxidoreductasa y monóxido de carbono dihidrogenasa (Preuss et

al., 1992).

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(DAHAT) (Preuss et al., 1992). Los resultados obtenidos en este experimento sugirieron que bajo estas condiciones, el monóxido de carbono juega un papel bifuncional dentro de la reacción, donde además de ser el donador de electrones puede ser inhibidor de la reducción de DAHAT a TAT (Preuss et

al., 1992).

2.2.2 Vía II

Esta es una de las rutas metabólicas que aunque no es estrictamente aeróbica, por lo general ocurre en presencia de oxígeno (Kim et al., 2002). El proceso, consiste en una reacción reductiva (Figura 2), a partir de la cual, uno o máximo dos de los grupos nitro que componen el TNT son convertidos en radicales nitroso e hidroxilamina, por acción de enzimas nitroreductasas

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Figura 2: Reducción de TNT mediante enzimas Nitroreductasas (Tomada de: Zoe & Neil, 2006)

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2.2.3 Vía III

Esta ruta metabólica corresponde a la degradación aeróbica del TNT. La formación del complejo Meisenheimer y la dependencia de oxígeno, son sus principales características (Zoe & Neil, 2006). Actualmente no se reportan muchos microorganismos capaces de llevar a cabo este mecanismo, sin embargo se conoce con certeza que Pseudomonas fluorescens, Enterobacter cloacae y Rhodococcus erythropolis son capaces de degradar compuestos nitroaromáticos mediante esta vía (Núñes et al., 2001).

Este tipo de metabolismo, al ser uno de los más complejos, es también el menos conocido, aunque no se han determinado con seguridad todos los metabolitos producidos, se cree que la etapa final de esta ruta es la mineralización total del TNT (Vorbeck et al., 1994; Núñes et al., 2001; Zoe &

Neil, 2006).

La formación del complejo Meisenheimer (Figura 3), implica la pérdida de las propiedades aromáticas del benceno. Aunque este compuesto es uno de los mejores donadores de electrones, cuando se encuentra nitrogenado (como lo es el TNT), pierde propiedades oxidativas, debido a la presencia de los grupos nitro unidos a sus carbonos 2,4 y 6 (Zoe & Neil, 2006). En consecuencia, el potencial redox del TNT disminuye, llevándose a cabo un ataque reductivo que trae consigo la formación NO2 y el complejo

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Figura 3: Formación del Complejo Meisenheimer (Tomada de: Vorbeck et al., 1994)

Figura 4: Transformación del complejo Meisenheimer (Tomada de: Zoe & Neil, 2006)

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Aunque los últimos productos de esta ruta metabólica no se han podido identificar, se ha confirmado que la transformación del complejo dihíbrido-Meisenheimer ocurre mediante varias reacciones de reducción que genera la producción de diversos metabolitos y NO2 (Zoe & Neil, 2006).

2.3 Microorganismos Degradadores de TNT

2.3.1 Aislamiento

Numerosos estudios reportan que los microorganismos nativos de ambientes contaminados con explosivos, son los microorganismos que presentan mejor potencial degradador de compuestos nitrogenados como el TNT.

Debido a la complejidad química que caracteriza a todos los compuestos xenobióticos, la búsqueda de estos microorganismos implica la localización de áreas de contaminación histórica, que son aquellos lugares en los que el compuesto ha permanecido presente durante largos periodos de tiempo; con el objetivo de encontrar microorganismos que han conseguido adaptarse a su presencia, desarrollando potencial degradador, que les permite aprovecharlo en su metabolismo como única fuente de carbono o nitrógeno

(Zaripov et al., 2004; Oh et al., 1998).

Varias investigaciones reportan que el TNT es tomado por los microorganismos como fuente única de nitrógeno (Zaripov et al., 2004; Oh et

al., 1998). Por ese motivo, necesitan la presencia adicional de compuestos

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2.3.1.2 Medios de Cultivo

El aislamiento de microorganismos con este potencial degradador, requiere de un medio de cultivo que le brinde las condiciones nutricionales para efectuar este metabolismo. En la Tabla No 3, se muestra el contenido de cinco medios de cultivo diferentes, utilizados en estudios realizados con microorganismos degradadores de compuestos nitroaromáticos. En términos generales, además del explosivo, los microorganismos deben contar con una fuente de carbono, una solución mínima de sales, fósforo, vitaminas y elementos traza.

Tabla No 3: Medios de cultivo más reportados para el aislamiento de microorganismos degradadores de TNT.

FUENTE AÑO MEDIO DE CULTIVO

Spanggord R., et al. 1991

FC: -

FN: 100ppm DNT

Medio Base: K2HPO4, 0.7g/L; KH2PO4,0.3 g/L;(NH4)2S04, 0.5 g/L; NaCl, 0.5 g/L; MgSO4 - 7H20, 0.05 g/L; CaCl2.2H20, 0.1 g/L; FeSO4 7H20, 0.003 g/L.

Elementos Traza: H3BO3, 0.1g/L; CaSO4 5H20, 0.05 g/L; ZnSO4. 7H20, 0.05 g/L; Na2MoO2 6H20, 0.05 g/L.

Boopathy R., et al. 1993

FC: Lactato o Piruvato 30mM FN: TNT 100ppm

Medio Base: KH2PO4, 2.94 mM; K2HPO4, 1.15 mM; NH4Cl, 9.35 mM; NaCl, 10.27 mM; MgCl2, 0.5 mM; CaCl2, 0.34 mM; Na2SO4, 20.0 mM; Na2S, 0.5 mM; Resarsurina 0,003 mM.

Kim H., et al. 2002

FC: 2,5g/L Glucosa

FN: 300ppm TNT; 1g/L Sulfato de Amonio Medio Base: 0,1g/L MgSO4; 3,5g/L K2HPO4; 1,5g/L KH2PO4; 1g/L Extracto Levadura

Zaripov S., et al. 2003

FC: Glucosa 5g/L FN: TNT 12-200 g/L

Medio Base: 0,25g/L MgSO4; 4,5 g/L Na2HPO4; 3 g/L KH2PO4; 1 g/L (NH4)SO4; 0,05 g/L Extracto de Levadura

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Como se muestra en la tabla anterior (Tabla No 3), la concentración de TNT óptima para estimular la degradación del compuesto por parte de los microorganismos, varía en las investigaciones en un rango muy amplio, pues abarca concentraciones que van desde 50ppm, hasta 200g/L (200.000ppm). Sin embargo algunos estudios reportan que concentraciones por encima de los 100ppm ejercen un efecto inhibidor sobre el crecimiento de los microorganismos con potencial degradador (Gonnison et al., 1993).

2.3.2 Evaluación del Potencial Degradador

La evaluación del potencial degradador de los microorganismos crecidos en un medio, se da generalmente mediante el control de consumo del sustrato, en este caso TNT. Los métodos más utilizados para esto son la cromatografía de gases y la cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC)

(Núñes et al., 2001), el objetivo es determinar la disminución de la concentración inicial de TNT presente en el medio en un determinado intervalo de tiempo.

En el análisis por HPLC, un gran número de estudios reportan el etanol

(Lachance et al., 2004; Collie et al., 1995; Park et al., 2003) como la fase

líquida más utilizada, sin embargo también se usan compuestos como metanol y acetona. Aunque esta técnica es la más reportada para el estudio de la degradación de compuestos nitroaromáticos, Bruns-Nagel y col (1996) reportan que la cromatografía de gases fue el método más rápido y eficiente para la detección de compuestos como TNT, 4-ADNT y 2-ADNT en muestras provenientes de suelos contaminados.

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microorganismo que lleva a cabo el metabolismo aeróbico en el que se produce el complejo de Meisenheimer (Vorbeck et al., 1994).

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

El uso de TNT ha incrementado con el desarrollo de la industria militar que inició su progreso en la Primera Guerra Mundial. En Colombia, este compuesto se utiliza en diversas actividades que incluyen la excavación, la minería y la milicia. De la mano de su utilización, ha incrementado la contaminación producida por la acumulación de este compuesto en diversos ambientes. La toxicidad de su composición química y las propiedades mutagénicas y carcinogénicas que le son atribuidas, ha incentivado la búsqueda de soluciones efectivas y económicas, capaces de disminuir la concentración de este compuesto sin trasladarlo de un ambiente a otro.

Actualmente, la biorremediación se perfila como una de las mejores alternativas para remediar regiones contaminadas con compuestos explosivos como TNT, debido a que es una solución ambientalmente amigable que requiere una baja inversión económica. Sin embargo, en Colombia no se reporta ninguna investigación orientada a la biorremediación de explosivos y esto ha impedido el aprovechamiento de sus ventajas en nuestro país.

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4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL:

Aislar microorganismos degradadores de TNT, a partir de ambientes contaminados con explosivos.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

• Identificar sitios contaminados en los que posiblemente se encuentren microorganismos con potencial degradador de TNT.

• Evaluar si el TNT es utilizado por los microorganismos degradadores como fuente de carbono y/o nitrógeno, utilizando otras fuentes adicionales fácilmente asimilables.

• Realizar una caracterización macro y microscópica de los microorganismos degradadores de TNT aislados.

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5. MATERIALES Y MÉTODOS

Las muestras de suelo, agua y lodos contaminados con residuos explosivos, entre los que se encontraban grandes cantidades de TNT, fueron recogidas en sitios aledaños a una de las principales plantas colombianas fabricadoras de productos explosivos comerciales. Alrededor de sus instalaciones, se definieron doce puntos de muestreo, que fueron elegidos por su proximidad con las áreas de manipulación del compuesto de interés y las áreas de desechos y manejo de residuos resultantes de los procesos de producción físicos y químicos (Tabla 4). Las muestras se almacenaron en bolsas estériles que se mantuvieron en refrigeración hasta su análisis en el laboratorio de USBA (Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental).

Tabla No 4: Puntos de muestreo seleccionados

No Área Muestreada 1 Exterior

2 Canal Exterior 3 Trampa Taller Multiplicador 4 Canal de la Trampa

5 Caneca 6 Tanque de Transporte 7 Ex Caja de Captación

8 Concentración Tensoactivos 9 Campo de Prueba

10 Lodos de Planta Tratamiento de Aguas Residuales (PTAR) 11 Fitorremediación

12 Caño PTAR

5.1 Análisis Físico-Químico

(31)

preparación del medio de cultivo. A la muestra número 6, correspondiente a los trozos de producto comercial tomados del tanque transportador de la planta no se le midieron estas variables, debido a que por su composición se recomendó evitar al máximo su manipulación.

Incluir cálculos sobre la concentración inicial de explosivo y la presencia de fuentes de carbono y nitrógeno, habría permitido realizar una caracterización completa de las muestras, arrojando datos importantes para definir cuál de los sitios funcionaría mejor como fuente de aislamiento de microorganismos degradadores, sin embargo estos ensayos no se incluyeron en este proyecto por limitantes de tiempo y presupuesto.

5.2 Aislamiento

La preparación de los medios de cultivo que se utilizaron fueron tomadas de estudios que reportaron aislamientos exitosos de microorganismos degradadores de TNT (Zaripov et al., 2004; Kim et al., 2002). Para realizar el aislamiento a partir de las muestras tomadas, se evaluó el crecimiento de microorganismos en tres tratamientos diferentes. La diferencia entre estos tratamientos, fue básicamente la presencia de carbono y nitrógeno, con el fin de determinar si el TNT era metabolizado por los degradadores como una fuente de carbono o nitrógeno. El medio de cultivo base para los tres, contenía una solución mínima de sales, buffer fosfato, trazas, vitaminas y TNT.

Tabla No 5: Tratamientos Utilizados en el aislamiento de microorganismos degradadores de TNT

Tratamiento Características

Fuente Carbono Fuente Nitrógeno

T1 - -

T2 + -

(32)

Como fuente de carbono se utilizó una mezcla de glucosa, glicerol, citrato y acetato a una concentración final de 25 ppm, y como fuente de nitrógeno 10 ppm de nitrato de amonio (NH4NO3). El explosivo se adicionó a los tres

tratamientos en solución con acetona a una concentración final de 50 ppm, concentración que fue seleccionada por ser la más reportada en diversas investigaciones, como una concentración óptima para evaluar la biodegradación de este compuesto.

El proceso que se llevó a cabo para el aislamiento de microorganismos degradadores, se dividió en tres etapas, cada una con una duración aproximada de diez días.

5.2.1 Etapa I: Preenriquecimiento:

Se montaron en total 36 preenriquecimientos, tres tratamientos por cada una de las 12 muestras, utilizando frascos de vidrio estériles (100 mL).

El montaje se realizó colocando inicialmente 1 g o mL de muestra y 125 µL de solución de explosivo en acetona, solvente que se dejó evaporar en la cabina de flujo laminar durante dos horas, con el objetivo de volatilizar la acetona y disminuir los residuos que pudieran interferir en los ensayos y evitar que fuera utilizado como una fuente de carbono adicional para los microorganismos, o ejerciera un efecto tóxico sobre los mismos. Posteriormente, se agregaron 4 g o mL de muestra y 45 mL del medio de cultivo correspondiente a cada tratamiento.

Los preenriquecimientos se mantuvieron a temperatura ambiente (21,0 ± 0,9

oC) y agitación constante de 115 rpm durante 10 días. Los frascos utilizados

(33)

5.2.2 Etapa II: Aislamiento en Medio de Cultivo Sólido

A partir de los preenriquecimientos, se realizaron diluciones seriadas (10-2, a

10-5)en solución salina al 0,85% p/v, utilizando la metodología estandarizada

por Latorre (2007) en el laboratorio de USBA. Todos los preenriquecimientos, fueron sembrados en superficie por duplicado en tres medios de cultivo sólidos, correspondientes a T1, T2 y T3 (Tabla 5).

Adicionalmente se realizó un ensayo en una de las réplicas del Tratamiento1 (T1) que consistía en adicionar el explosivo en la superficie del medio ya solidificado, mientras que en los otros tratamientos se manejó disolviendo la solución de explosivo y acetona en el medio líquido estéril justo antes de servir las cajas.

Todos los cultivos fueron incubados a temperatura ambiente (21,0 ± 0,9 oC) en condiciones aeróbicas, durante aproximadamente dos semanas.

5.2.3 Etapa III: Segundo cultivo y selección macroscópica de colonias. La etapa III inició con la selección de todas las colonias que crecieron en los tratamientos y presentaron diferencias macroscópicas, esperando tomar el mayor número de posibles degradadores. El segundo cultivo se realizó en medio sólido de cada uno de los tratamientos con concentración doble de TNT (100ppm) para generar mayor presión selectiva sobre los microorganismos. Para llevar a cabo el aislamiento de estas colonias se utilizaron cajas de petri marcadas con una cuadrícula de 22 espacios (uno para cada colonia).

(34)

análisis mediante HPLC, debido a que es reportado como el medio más favorable para la degradación del compuesto evaluado.

Estos cultivos fueron incubados a temperatura ambiente (21,0 ± 0,9 oC)

durante 10 días. Finalizado este periodo, se evaluaron las características macroscópicas y microscópicas de todas las colonias. Se definió como primer criterio de selección el crecimiento positivo en T1, debido a que por sus condiciones nutricionales este medio podría ser el más selectivo.

Posteriormente se evaluaron las colonias crecidas en T2 y se seleccionaron aquellas que presentaran morfologías macro y microscópicas diferentes.

5.2.4 Etapa IV: Métodos Analíticos: HPLC

El TNT residual de los tubos sembrados en la etapa anterior, fue evaluado mediante cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC), basándose principalmente en el método 8330 descrito por la EPA (EPA, 1994). Para su desarrollo se tomaron 1.2 ml de cada cultivo y se centrifugaron a 1200 rpm durante 10 min; el sobrenadante obtenido se pasó a través de un filtro de membrana 0.2 µm (Advantec) de nitrato de celulosa. Posteriormente se inyectaron 100 µL de cada muestra al equipo de HPLC marca Shimatzu prominence, que consta de un detector de diodos y una columna Restek C-18. Se utilizó una solución Metanol:Agua (50:50 v/v) como fase móvil con un flujo de 1 ml/minuto y una temperatura de 35ºC. La longitud de onda empleada para la detección de los picos de TNT fue 254 nm.

(35)

Para poder cuantificar la concentración de TNT presente en los cultivos, se elaboró una curva patrón, utilizando soluciones estándar preparadas con concentraciones conocidas de TNT (12,5 ppm, 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm).

Se definieron dos controles diferentes. El control No 1 correspondió al medio de cultivo del Tratamiento 2 sin ser inoculado, el cual permitió cuantificar la concentración inicial de TNT presente en el medio. El segundo control fue tomado del medio de cultivo T2 contenido por un palillo de madera estéril, igual a los que se utilizaron para inocular las cepas. Esto con el objetivo de visualizar su efecto en el medio.

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se realizó una caracterización preliminar físico-química de las muestras y se obtuvieron los siguientes valores de pH y conductividad.

Tabla 6: Caracterización físico-química de las muestras

Muestra No pH (deciSiemens/metro) Dilución Conductividad

1 7,11 0,34 1:1

2 7,34 0,22 1:1

3 6,58 0,17 -

4 7,14 1,15 -

5 2,11 1,47 -

7 7,54 0,44 -

8 7,20 14,96 -

9 7,88 0,63 -

10 8,73 1,57 1:1

11 7,42 0,47 1:1

12 8,95 0,44 1:1

(36)

consideran ambientes normales de baja salinidad. Sin embargo, la muestra No. 8, procedente del tanque de concentración de tensoactivos, obtuvo una conductividad superior de 14,96 dS/m indicando características de fuerte salinidad (Tabla No. 6). Este fenómeno, puede deberse a la presencia de compuestos como carbonatos, cloruros y sulfatos, que junto con los tensoactivos, pueden ser compuestos residuos de la producción de los explosivos comerciales.

Como se puede visualizar en la Tabla No 6, la mayoría de las muestras presentaron un pH cercano a la neutralidad, sin embargo algunas de ellas arrojaron valores extremos de acidez y alcalinidad. Aunque es difícil pensar que a partir de muestras con un pH de 2,11 se logren obtener microorganismos nativos que puedan desarrollarse en un medio de cultivo con pH neutro, no se considera una variable que pueda influir en el aislamiento de microorganismos degradadores de TNT, ya que como lo reportan Zaripov (2004) y Kim (2002) en sus estudios, la degradación biológica de compuestos nitroaromáticos ha sido posible en amplios rangos de pH.

6.1 Etapa I: Pre-enriquecimiento

(37)

eficientes. Sin embargo, en la evaluación microscópica que se hizo de los pre-enriquecimientos, fue más común la presencia de bacterias GP que GN (Tabla 7), lo que puede deberse a la ventaja que representa para estas bacterias (GP) la esporulación.

A pesar de que los pre-enriquecimientos preparados presentaban una concentración considerable de TNT (50 ppm), la presión selectiva que este ejerció sobre los microorganismos no fue tan alta, debido a la posibilidad de que las muestras (suelos, lagos y aguas) contuvieran algunas trazas de carbono y nitrógeno fácilmente asimilables. Aunque habría sido bastante útil determinar la presencia de estas trazas y la concentración inicial de TNT en cada una de las muestras para conocer con certeza las condiciones nutricionales bajo las cuales se desarrollaban los microorganismos nativos, esta determinación no se realizó por limitantes de tiempo y presupuesto.

En algunas muestras se observó la presencia de bacilos Gram negativos curvos y en forma de “S”, muy similares a las bacterias características del ciclo del azufre (Tabla 7). En un estudio realizado por Kulkarni y Chaudhari (2007) se presentó una revisión general de los microorganismos capaces de degradar compuestos nitroaromáticos, donde encontraron que Desulfovibrio sp y en general bacterias sulfato reductoras, presentan la capacidad de degradar TNT. La morfología característica de estas bacterias se encontró en los Tratamientos 1 y 2 (Tabla 7), los cuales tienen en común la ausencia de una fuente adicional de nitrógeno. El estudio mencionado, reporta que estas bacterias utilizan el TNT como única fuente de nitrógeno, convirtiéndolo en triaminotolueno (TAT) y algunos otros compuestos no identificados.

(38)

Aunque inicialmente las condiciones de los microcosmos fueron aeróbicas, es probable que al finalizar el periodo de incubación, la disponibilidad de oxígeno haya disminuido y las condiciones finales fueran favorables para el crecimiento de microorganismos anaerobios. La degradación de TNT se puede llevar a cabo en cualquiera de estas condiciones, de hecho microorganismos estrictamente anaeróbicos como Clostridium sp.y Acetobacterium sp han sido reportados como potenciales degradadores de compuestos nitroaromáticos como TNT (Neal & Arnett, 2004; Kutty &

Bennett, 2005).

Tabla 7: Morfología microscópica de los microorganismos desarrollados en los pre-enriquecimientos.

Mtra. Tto Bacilos Gram Positivos

Bacilos Gram Negativos

Cocos Gram Positivos

Otra Morfología

1

T1 x - x -

T2 x - x forma de S BGN en

T3 x - - -

2

T1 x - x -

T2 x - x BGN curvo

T3 x x - -

3

T1 x x x -

T2 x - x -

T3 x - x -

4

T1 x - x forma de S BGN en

T2 x - x forma de SBGN en

T3 x - x -

5

T1 x x - -

T2 x - - -

T3 - - x -

6

T1 x - x -

T2 x - x -

(39)

Mtra. Tto. Bacilos Gram Positivos

Bacilos Gram Negativos

Cocos Gram Positivos

Otra Morfología

7

T1 x - x -

T2 x x x forma de S BGN en

T3 x - - -

8

T1 x - - -

T2 x - - BGN curvo

T3 x - - -

9

T1 x x - -

T2 x - - -

T3 x - - -

10

T1 - - - -

T2 x - - -

T3 - - - -

11

T1 x x - -

T2 x x - -

T3 - x - -

12

T1 x - - forma de S BGN en

T2 x x x -

T3 x - - -

6.2 Etapa II: Aislamiento en medio de cultivo sólido

El crecimiento de colonias en los medios de cultivo correspondientes a los tres tratamientos fue muy diverso, sin embargo no se observó ninguna característica particular de las colonias conocidas de los microorganismos degradadores de TNT que son descritas en estudios anteriores.

(40)

Con el objetivo de evidenciar un efecto parecido, se realizaron dos ensayos sobre la forma de adicionar el explosivo al medio de cultivo, en superficie y en solución. Aunque se encontraron diferencias importantes en el crecimiento de microorganismos adicionando la solución de TNT en la superficie del medio, es necesario estandarizar la concentración de TNT bajo la cual se logra opacidad en el medio de cultivo, de tal forma que se puedan observar los halos de degradación, o se logre visualizar el cambio de color provocado por la producción de metabolitos como 2-aminodinitrotolueno y sus isómeros.

En este ensayo, en el que el TNT fue adicionado en la superficie del medio una vez solidificado, el número de colonias obtenidas fue mucho más pequeño y la diversidad morfológica que se apreció en estas cajas fue menor, probablemente debido a que la concentración final de TNT que se consiguió sobre la superficie del medio fue mayor que la que resultó con la disolución del explosivo en el medio líquido, ensayos en los que el número de colonias fue mucho mayor y con una distribución en el medio mucho más homogénea.

(41)

medio de cultivo óptimo para el crecimiento de los microorganismos con potencial degradador de TNT.

Diversos estudios (Gonnison et al., 1993; Zaripov et al., 2003; Stenuit et al.,

2006; Kulkarni M. & Chaudhari A., 2007), han demostrado que dichos

microorganismos utilizan el explosivo como única fuente de nitrógeno, por lo cual recomiendan agregar al medio de cultivo una fuente adicional de carbono fácilmente asimilable como la glucosa o el acetato (Gonnison et al.,

1993), para generar un balance de nutrientes favorable para la degradación.

En este estudio, el tratamiento con estas características (T2) no solo presentó el mayor número de colonias, sino que fue donde mayor diversidad morfológica se observó.

Como parte de los resultados, se esperaba que el crecimiento en los otros tratamientos, en los que no se adicionaba ninguna fuente de carbono, fuera bajo; sin embargo en T3, por ejemplo, la mayoría de las muestras presentaron crecimiento masivo de una colonia puntiforme, trasparente y regular. Mientras que en T1, a pesar de ser el tratamiento con menor recuperación de biomasa, fue bastante diverso.

(42)

Tabla 8: Número de colonias seleccionadas a partir de cada muestra.

Muestra Origen No Colonias

1 Exterior 22

2 Canal Exterior 22

3 Trampa Taller Multiplicador 20 4 Canal de la Trampa 18

5 Caneca 16

6 Tanque de Transporte 14 7 Ex Caja de Captación 14 8 Concentración Tensoactivos 8

9 Campo de Prueba 15

10 Lodos de PTAR 6

11 Fitorremediación 4

12 Caño PTAR 5

El crecimiento de microorganismos fue muy diferente en todas las muestras. Aunque en términos generales, fue positivo para todas, se obtuvo un mayor número de colonias potencialmente degradadoras, a partir de los cultivos procedentes de las muestras 1, 2 y 3 (Tabla 8). Estas muestras se caracterizaron por estar constituidas de lodo y agua procedentes del pantano que rodeaba la planta de cristalización del explosivo (Muestra No 1) y los canales de desagüe ubicados alrededor de ella (Muestras No 2 y 3). La carga microbiana puede deberse a la alta disponibilidad de nutrientes de estos ambientes y la lejanía de los mismos con fuentes de contaminación por sustancias químicas que puedan ejercer algún efecto tóxico.

(43)

muestras a partir de las cuales se seleccionaron menos colonias aparentemente degradadoras de TNT. El impacto químico característico de estas zonas es la causa de la carga microbiana reducida presente en estos ambientes.

Contrario a esto, la Muestra No 5, que también se caracterizó por tener un pH extremo, pero en este caso ácido con un valor de 2,11, presentó en comparación con las muestras 10 y 12, un crecimiento abundante. Mientras en T2 se obtuvo gran diversidad morfológica (Figura 5), en T1 y T3, las colonias, aunque abundantes fueron todas muy similares: trasparentes, pequeñas, convexas y circulares. Debido a que el pH del medio utilizado se encontraba cercano a la neutralidad, no se esperaba crecimiento microbiano a partir de estas muestras, pues se dio un cambio drástico en las condiciones ambientales, y se esperaría que esto generara estrés en los microorganismos inhibiendo su crecimiento. Estos resultados abren dos nuevos interrogantes, el primero dirigido a la razón por la cual a partir de una muestra con un pH extremadamente ácido como lo es 2,11, lograron aislarse un gran número de microorganismos en un medio con condiciones nutricionales especiales y un pH cercano a la neutralidad. Y el segundo, dirigido hacia la evaluación de la eficiencia de microorganismos acidófilos para degradar compuestos nitroaromáticos como los explosivos.

(44)

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(46)

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et al., 2004

(47)

Finalmente tras diez días de incubación de los subcultivos, fueron seleccionadas 31 colonias, a las cuales les fue evaluada la capacidad degradadora de TNT, mediante la técnica de HPLC.

6.4 Etapa IV: Métodos Analíticos: HPLC

Para evaluar la degradación de TNT por parte de las cepas seleccionadas, se realizó una curva patrón preliminar con una solución estándar de TNT de concentración conocida, que permitiera trazar un punto de comparación para determinar si la concentración del explosivo en los diferentes cultivos había disminuido o no (Cromatograma, Figura 8). Como se muestra en la Tabla No 9, no fue posible realizar una relación del área bajo la curva, con la concentración de explosivo, debido a que la curva, además de contener muy pocos puntos, no fue del todo precisa. La zona sombreada en las tablas que acompañan todos los cromatogramas, representa los datos correspondientes a TNT. Como es posible verlo en la Tabla No 9, el tiempo de retención para el TNT fue de 5,9 minutos con un área correspondiente a 100ppm de aproximadamente 14678057,9 mm2.

(48)

explosivo, es diez veces más pequeña que la de los estándares, lo que sugiere que la concentración de TNT presente fue mucho menor a 100ppm.

Figura 8: Cromatograma Estándar 100ppm TNT

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min -50

0 50 100 150 200 250 300 350 400

mAU

210nm,4nm (1.00)

/0

.0

40

/0

.0

49 /1.6

19

/1

.6

61

RT2.

365/

0.

995

RT3.

320/

1.

925

/7

6.

301

/17.

(49)

Tabla 9: Cromatografía Curva de Calibración de TNT

ABS 254 nm

T. RETENCIÓN ÁREA ALTURA

12,5 ppm

1,307 33432,4 2159,3

1,631 133276,8 12081,8

1,755 225116,9 15220,5

2,358 438400,4 16521,1

3,371 65185,9 1824,7

5,954 1728559,7 21870,3

9,197 100731,7 1307

25 ppm

1,331 21065,7 1319,1

1,765 265919,5 16862,5

2,348 947950,5 32981,3

5,949 3421050,0 45787,6

50 ppm

0,162 14685,5 2534

0,523 1029,3 170

0,797 1809,8 141,7

2,138 2037,3 145,5

2,549 4070,1 270,6

3,406 64397,5 1899,4

100 ppm

1,463 21826,7 1962,3

1,765 62188,5 4901,7

2,318 4221569,5 207254

4,183 2284,6 133,3

(50)

Figura 9: Cromatograma Control No 1

Tabla 10: Cromatografía Control No 1

ABS 254 nm

T. RETENCIÓN ÁREA ALTURA

1,694 2839784,9 115919,4

2,426 3458913,2 318677,4

3,408 5395,8 403

4,075 20630,8 1239,7

4,382 34827,2 1504,8

6,227 7966096,8 207288,9

(51)

Figura 10: Cromatograma Control No 2

Tabla 11: Cromatografía Control No 2

ABS 254 nm

T. RETENCIÓN ÁREA ALTURA

1,818 11441883,7 1004096,7

2,417 6378743,2 363018,5

6,159 140842,1 4185,1

7,322 366834,7 9964,6

7,986 225687,2 5188,2

El resultado para todas las cepas analizadas fue muy similar a los cromatogramas que se muestran a continuación, correspondientes a las cepas T1 y T100. Las curvas de mayor altura que aparecen en el extremo izquierdo de las gráficas (Figuras 11 y 12), antes del tiempo de retención del explosivo, corresponde quizás a la presencia de azúcares simples como glucosa, acetato, glicerol y citrato, los cuales fueron la fuente de carbono

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 min -50

0 50 100 150 200 250 300 350

mAU

210nm,4nm (1.00)

/9

6.3

15

RT2.

365/

1.

968

/0

.0

68

/0

.1

79

/0

.9

78

/0

.4

(52)

adicionada al medio y se caracterizan por tener tiempos de retención pequeños.

Para los dos casos, la curva que corresponde al TNT (probablemente situada entre los tiempo 6-6,1) es mucho más pequeña que la del control No 1, el cual puede considerarse la concentración inicial de TNT en el medio, antes de ser inoculado.

Las curvas que aparecen en el extremo derecho de los cromatogramas, mostrando tiempos de retención más altos, indican la presencia de compuestos menos polares que el TNT, pues la fase móvil utilizada fue metanol y éste al ser un compuesto polar, hace que los compuestos no polares, con los cuales no tiene afinidad, se demoren más en atravesarla y muestren un tiempo de retención más alto.

Diversos estudios en los que han caracterizado el metabolismo de los microorganismos degradadores de TNT, se ha encontrado la producción de metabolitos menos polares como el 4-Amino-2,6-Dinitrotolueno, su isómero 2-Amino-4,6-Dinitrotolueno (Stenuit et al., 2006) y el Triainotolueno (TAT), el cual es producido junto con otros subproductos desconocidos, pero se resumen como la ruta más eficiente en la degradación del TNT (Kulkarni et

al., 2007).

El área bajo la curva correspondiente a la concentración de TNT presente en el medio disminuyó en todas las cepas analizadas. Aunque aparentemente, todas tienen un potencial degradador de TNT, para poder concluir esto con certeza es necesario hacer un seguimiento en intervalos de tiempo más cortos, para evaluar la reducción del compuesto en el medio.

(53)

material diferente a la madera para inocular los medios de cultivo y así eliminar una posible fuente de contaminación.

Figura 11: Cromatograma Cepa T1

Tabla 12: Cromatografía Cepa T1

ABS 254 nm

T. RETENCIÓN ÁREA ALTURA

1,789 11971153,5 932139,5

2,427 5137177,1 318568

3,706 71319,2 4202,9

4,619 27899,9 1403,1

5,323 4478,1 205

6,133 2960,3 130,4

7,313 150230,8 4256,9

8,054 187625,3 3853,2

(54)

Figura 12: Cromatograma Cepa T100

Tabla 13: Cromatografía Cepa No 100

ABS 254 nm

T. RETENCIÓN ÁREA ALTURA

1,746 3479490 316794,9

2,003 357736 46789

2,418 3380758 194810,4

4,088 16003,7 1061,7

4,593 13040,4 686,2

6,077 167444,4 4817,9

7,28 196788 5403,3

(55)

7. CONCLUSIONES

‐ Los sitios ubicados alrededor de la planta de cristalización de TNT, a partir de los cuales se tomaron sedimentos, fueron los ambientes a partir de los cuales se logró aislar un mayor número de microorganismos (colonias) potencialmente degradadores de TNT.

‐ La mayor variabilidad de morfotipos se obtuvo a partir del tratamiento 2, indicando la importancia de adicionar al medio una fuente de carbono, para favorecer la degradación.

‐ La mayoría de las cepas que presentaron potencial degradador de TNT son bacilos Gram negativos.

(56)

8. RECOMENDACIONES

‐ Es necesario estandarizar la forma de adicionar el explosivo al medio de cultivo, de tal forma que resulte más fácil visualizar la degradación del compuesto y así realizar el seguimiento del metabolismo.

‐ Debido a que el control No 2 (Medio de cultivo + Palillo estéril) presentó contaminación, es importante probar materiales diferentes para realizar esta siembra, con el objetivo de eliminar una posible fuente de contaminación.

‐ Es necesario conseguir estándares de HPLC para diferentes subproductos del metabolismo de TNT como aminodinitrotolueno y triaminotolueno. Y evaluar cuál sería la mejor técnica para identificar estas sustancias.

‐ El aislamiento de microorganismos degradadores de TNT requiere la elaboración de pases sucesivos en medios de cultivo con explosivo, para eliminar trazas de compuestos orgánicos de fácil asimilación provenientes de la muestra, y ejercer una presión selectiva importante sobre los microorganismos no degradadores.

(57)

8. REFERENCIAS

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Figure

Tabla No 1: Propiedades físico químicas del TNT

Tabla No

1: Propiedades físico químicas del TNT p.15
Figura 1: Estructura química del 2,4,6-Trinitrotolueno. Tomada de: Lewis et al., 2003

Figura 1:

Estructura química del 2,4,6-Trinitrotolueno. Tomada de: Lewis et al., 2003 p.15
Tabla No 2: Estudios que reportan algunos microorganismos como potenciales degradadores de TNT

Tabla No

2: Estudios que reportan algunos microorganismos como potenciales degradadores de TNT p.18
Figura 2: Reducción de TNT mediante enzimas Nitroreductasas

Figura 2:

Reducción de TNT mediante enzimas Nitroreductasas p.22
Figura 3: Formación del Complejo Meisenheimer (Tomada de: Vorbeck et al., 1994)

Figura 3:

Formación del Complejo Meisenheimer (Tomada de: Vorbeck et al., 1994) p.24
Tabla No 3: Medios de cultivo más reportados para el aislamiento de microorganismos degradadores de TNT

Tabla No

3: Medios de cultivo más reportados para el aislamiento de microorganismos degradadores de TNT p.26
Tabla No 4: Puntos de muestreo seleccionados

Tabla No

4: Puntos de muestreo seleccionados p.30
Tabla No 5: Tratamientos Utilizados en el aislamiento  de microorganismos degradadores de TNT

Tabla No

5: Tratamientos Utilizados en el aislamiento de microorganismos degradadores de TNT p.31
Tabla 6: Caracterización físico-química de las muestras

Tabla 6:

Caracterización físico-química de las muestras p.35
Tabla 7: Morfología microscópica de los microorganismos desarrollados en los pre-enriquecimientos

Tabla 7:

Morfología microscópica de los microorganismos desarrollados en los pre-enriquecimientos p.38
Tabla 8: Número de colonias seleccionadas  a partir de cada muestra.

Tabla 8:

Número de colonias seleccionadas a partir de cada muestra. p.42
Figuura 6: Subccultivo en medio líquuido corresspondientee a T2.

Figuura 6:

Subccultivo en medio líquuido corresspondientee a T2. p.45
Figura 7: CF

Figura 7:

CF p.46
Figura 8: Cromatograma Estándar 100ppm TNT

Figura 8:

Cromatograma Estándar 100ppm TNT p.48
Tabla 9: Cromatografía Curva de Calibración de TNT

Tabla 9:

Cromatografía Curva de Calibración de TNT p.49
Figura 9: Cromatograma Control No 1

Figura 9:

Cromatograma Control No 1 p.50
Tabla 10: Cromatografía Control No 1

Tabla 10:

Cromatografía Control No 1 p.50
Tabla 11: Cromatografía Control No 2

Tabla 11:

Cromatografía Control No 2 p.51
Figura 10: Cromatograma Control No 2

Figura 10:

Cromatograma Control No 2 p.51
Figura 11: Cromatograma Cepa T1

Figura 11:

Cromatograma Cepa T1 p.53
Tabla 12: Cromatografía Cepa T1

Tabla 12:

Cromatografía Cepa T1 p.53
Figura 12: Cromatograma Cepa T100

Figura 12:

Cromatograma Cepa T100 p.54
Tabla 13: Cromatografía Cepa No 100

Tabla 13:

Cromatografía Cepa No 100 p.54

Referencias

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