Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Minthostachys mollis “muña” sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. IA S. BI. O. LO. G. IC AS. ESCUELA PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. EN C. Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de. DE. CI. Minthostachys mollis “muña” sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus. TESIS. CA. PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE:. TE. BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO. BI B. LI O. AUTOR: Br. SUSANA FIORELLA MANTILLA GERMAN Br. EVELYN KARYN YUPANQUI ROJAS ASESOR: Dr. PEDRO MERCADO MARTÍNEZ CO-ASESOR: MsC. EDGAR DAVID ZAVALETA VERDE TRUJILLO – PERÚ 2018. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC AS. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. LO. G. Dr. Orlando Gonzáles Nieves. EN C. IA S. BI. O. RECTOR. Dr. Rubén Vera Véliz. Dr. Steban Alejandro Ilich Zerpa SECRETARIO GENERAL. BI B. LI O. TE. CA. DE. CI. VICERRECTOR. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC AS. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. Dr. Freddy Mejia Coico. IA S. BI. O. LO. G. DECANO DE LA FACULTAD CIENCIAS BIOLOGICAS. Dr. William Elmer Zelada Estraver. CA. DE. CI. EN C. SECRETARIO DE LA FACULTAD CIENCIAS BIOLOGICAS. Dra. Bertha Soriano Bernilla. TE. DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO. BI B. LI O. PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEL ASESOR. El que suscribe: Dr. Pedro Estuardo Mercado Martínez, asesor de la presente tesis titulada:. IC AS. “Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Minthostachys mollis “muña” sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus.”. LO. G. CERTIFICA:. O. Que ésta ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la Facultad. BI. de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en conformidad. IA S. con su correspondiente proyecto, y que el informe ha sido redactado acogiendo las. EN C. observaciones y sugerencias alcanzadas.. CI. Por lo tanto, autorizo a Yupanqui Rojas Evelyn Karyn y Mantilla German Susana. DE. Fiorella, continuar con el trámite del reglamento correspondiente.. BI B. LI O. TE. CA. Trujillo, Mayo del 2018. Dr. Pedro Estuardo Mercado Martínez. ASESOR. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. IC AS. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:. En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados y. G. Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración y criterio,. LO. el informe de tesis titulado: “Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Minthostachys mollis “muña” sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes y. BI. O. Staphylococcus aureus.”, con el propósito de obtener el Título Profesional de Biólogo –. DE. CI. EN C. IA S. Microbiólogo.. LI O. TE. CA. Trujillo, Mayo del 2018. Br. Yupanqui Rojas Evelyn Karyn. BI B. Br. Mantilla German Susana Fiorella. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. G. ---------------------------------------------------. IC AS. MIEMBROS DEL JURADO. LO. Ms. C. Pedro Alvarado Salinas. EN C. IA S. BI. O. PRESIDENTE. --------------------------------------------------. CI. Dr. Pedro Estuardo Mercado Martínez. BI B. LI O. TE. CA. DE. SECRETARIO. ----------------------------------------------Ms. C. David Zavaleta Verde VOCAL. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN. Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran que el presente informe de tesis ha cumplido con los requisitos formales y. O. LO. G. IC. AS. fundamentales, siendo aprobado por unanimidad.. BI. --------------------------------------------------Ms. C. Pedro Alvarado Salinas. CI EN. CI. AS. PRESIDENTE. DE. -----------------------------------------------Dr. Pedro Estuardo Mercado Martínez. BI. BL. IO. TE. CA. SECRETARIO. -----------------------------------------------Ms. C. David Zavaleta Verde VOCAL. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA. G. IC. pesar de los obstáculos y permitirme culminar este trabajo.. AS. A Dios, mi Padre Celestial, por darme la vida, salud y la fortaleza de seguir adelante a. LO. A mis padres, Luis y Olga, por sus consejos, su apoyo incondicional y la motivación. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. diaria que me dan para seguir adelante en mi vida profesional.. MANTILLA GERMAN, SUSANA FIORELLA. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA. A Dios todopoderoso, por haberme dado la vida y permitirme llegar a este momento tan. G. IC. fuerzas para superar obstáculos y seguir adelante día a día.. AS. importante en mi formación profesional. Por guiarme por el buen camino y darme. LO. A mis padres, Facundo y Ana María, por su amor, confianza y apoyo incondicional en. O. cada paso que he dado en la vida, siendo los pilares fundamentales que me impulsa a. AS. BI. seguir adelante, alcanzando cada una de mis metas.. CI. A mis abuelitas, Eulalia (mi Lala) y Amalia, por todo su cariño, su alegría, sus. CI EN. inmensas enseñanzas, sus consejos y valores que me han inculcado y que siempre los. DE. mantendré conmigo el resto de mi vida.. CA. A mi abuelito Manuel, mi ángel, quien desde el cielo me cuida y aunque ya no esté acá. de mis metas propuestas.. BI. BL. IO. TE. para verme crecer como profesional, sé que está feliz, porque estoy logrando cada una. YUPANQUI ROJAS, EVELYN KARYN. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTOS. Un especial agradecimiento al Dr. Pedro Mercado Martínez, nuestro asesor de tesis, por. IC. AS. su orientación y conocimientos brindados durante la realización de este trabajo de tesis.. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. por su apoyo brindado en la realización de esta investigación.. G. Así mismo agradecemos al MsC. Edgar David Zavaleta Verde, nuestro co-asesor de tesis,. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN. El control del crecimiento microbiano es un factor importante en la conservación de. AS. alimentos, para lo cual comúnmente se usan productos químicos; sin embargo estos están. IC. siendo sustituidos por sustancias naturales como los aceites esenciales. La presente. G. investigación tuvo como objetivo determinar la concentración mínima inhibitoria del. LO. aceite esencial de Minthostachys mollis “muña” sobre el crecimiento de Listeria. O. monocytogenes y Staphylococcus aureus. Para ello se extrajo el aceite esencial de toda la. BI. planta de muña mediante la técnica de destilación por arrastre de vapor, y se preparó una. AS. solución stock. Se realizó la curva de crecimiento de L. monocytogenes y S. aureus, determinando que el tiempo de generación fue de 55 y 42 minutos respectivamente; y la. CI EN. CI. fase logarítmica media 7 y 8 horas respectivamente. Se preparó el inóculo de cada bacteria, en su fase logarítmica media y con la solución stock se realizó la determinación de la concentración mínima inhibitoria, utilizando pocillos de microcultivo con. DE. concentraciones finales de 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5 y 2.5 µg/mL del aceite esencial. Los sistemas se incubaron a 37°C por 24 horas, todo se realizó por triplicado. El resultado. CA. de la concentración mínima inhibitoria de Minthostachys mollis “muña” sobre el. TE. crecimiento de L. monocytogenes y S. aureus fue de 40 µg/mL y 80 µg/mL. BI. BL. IO. respectivamente.. Palabras claves: Concentración mínima inhibitoria. Aceite esencial. Minthostachys. mollis “muña”. L. monocytogenes. S. aureus.. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT. The control of microbial growth is an important factor in food preservation, for which. AS. chemicals are commonly used; however, these are being replaced by natural substances such as essential oils. The objective of the present investigation was to determine the. G. IC. minimum inhibitory concentration of the essential oil of Minthostachys mollis "muña" on. LO. the growth of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus. To do this, the. O. essential oil was extracted from the entire muña plant using the steam distillation. BI. technique, and a stock solution was prepared. The growth curve of L. monocytogenes and. AS. S. aureus was determined, determining that the generation time was 55 and 42 minutes respectively; and the logarithmic phase averages 11 and 8 hours respectively. The. CI. inoculum of each bacterium was prepared, in its average logarithmic phase and with the. CI EN. stock solution the determination of the minimum inhibitory concentration was made, using microculture wells with final concentrations of 320; 160; 80; 40; twenty; 10; 5 and. DE. 2.5 μg/mL of the essential oil. The systems were incubated at 37°C for 24 hours, everything was done in triplicate. The result of the minimum inhibitory concentration of. CA. Minthostachys mollis "muña" on the growth of L. monocytogenes and S. aureus was 40. BL. IO. TE. μg/mL and 80 μg/mL respectively.. BI. Key words: Minimum inhibitory concentration. Essential oil. Minthostachys mollis "muña". L. monocytogenes. S. aureus.. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ÍNDICE. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ............ ……ii. AS. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ....................... iii DEL ASESOR ..................................................................................................................iv. G. IC. PRESENTACIÓN ............................................................................................................. v. LO. MIEMBROS DEL JURADO ...........................................................................................vi. O. APROBACIÓN .............................................................................................................. vii. BI. DEDICATORIA ............................................................................................................ viii. AS. AGRADECIMIENTOS ..................................................................................................... x RESUMEN .......................................................................................................................xi. CI. ABSTRACT ................................................................................................................... xii. CI EN. ÍNDICE .......................................................................................................................... xiii I. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 01. DE. II. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................... 11 III. RESULTADOS .................................................................................................. 16. CA. IV. DISCUSIÓN ....................................................................................................... 17. TE. V. ENUNCIADO RESUMEN ................................................................................ 23. IO. VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÀFICAS .............................................................. 24. BI. BL. ANEXOS……...……………………………………………………………………… 35. xiii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. I. INTRODUCCIÓN. Las bacterias del género Listeria comprenden un grupo de bacterias Gram positivas, anaerobios facultativos, bacilos no esporulados que están ampliamente distribuidos en el. AS. medio ambiente (Hain et al., 2007). Debido a su naturaleza ubicua, estas bacterias pueden. IC. persistir en las instalaciones de procesamiento de alimentos y, por lo tanto, pueden. LO. G. contaminar los productos alimenticios (Carpentier y Cerf, 2011).. De las siete especies reconocidas de Listeria (L. monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua, seeligeri,. L.. welshimeri,. L.. grayii. y. O. L.. L.. murrayi),. BI. solo L. monocytogenes y L. ivanovii actualmente se consideran como patógenos e. AS. infecciosos, provocando enfermedades en animales y seres humanos, ya que son. CI EN. CI. conocidos por ser β-hemolíticos (Brugere-Picoux, 2008; Schuchat et al., 1991).. Listeria monocytogenes se diferencia de la mayoría de los patógenos bacterianos encontrados en alimentos debido a su capacidad para sobrevivir con condiciones. DE. ambientales duras, creciendo sobre un amplio rango de temperaturas (1 a 45 °C), amplio rango de pH (4.5 a 9.6), alta concentración de sal (10 a 15 % de NaCl), y actividad de. CA. agua muy baja (0.94). Por lo tanto, puede crecer en diferentes tipos de productos. TE. alimenticios (Farber y Peterkin, 1991). Es un microorganismo ambiental que tiene la. IO. facultad de adherirse a las superficies, formando biopelículas (Kim et al., 2008; Pan et. BL. al., 2009; Gilmour et al., 2010; Wong, 1998) para protegerse de la acción de los. BI. tratamientos antimicrobianos (Kim et al., 2008; Pan et al., 2009; Wong, 1998). En el ambiente de fábrica de producción de alimentos, tiene la oportunidad de contaminar en sus diferentes etapas, siendo esta vía la más frecuente para llegar al ser humano (Muñoz y Díaz, 1998; Oteo y Alós, 2009; Pan et al., 2009).. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. L. monocytogenes ingresa en las plantas industriales por medio de la tierra existente en los zapatos y en la vestimenta de los obreros, en el equipo de transporte de los alimentos crudos de origen animal y posiblemente por medio de portadores humanos sanos. Una. AS. vez instalada allí es capaz de adherirse a varios tipos de superficie (que incluyen el acero inoxidable, el vidrio, el caucho) y han sido encontradas biopelículas en la carne y en los. G. IC. ambientes de tratamiento de los distintos productos alimenticios. Sobrevive en los dedos. LO. de los operarios después del lavado de las manos y en los aerosoles y es capaz de crecer. O. adecuadamente a las temperaturas de refrigeración durante largos períodos de tiempo aún. BI. bajo condiciones muy adversas (Cox et al., 1989; Jeong y Frank, 1994).. AS. La listeriosis humana es causada por Listeria monocytogenes y el consumo de alimentos. CI. contaminados es su origen fundamental. Es un microorganismo saprofito y ubicuo en el. CI EN. ambiente, y está presente en bajo número en muchos alimentos, incluidos algunos que no necesitan ser cocinados antes de su consumo (Marzocca et al., 2004; McLauchlin et al., 2004; Ryser y Marth, 1999; Sauders et al., 2006). Este microorganismo supone un. DE. problema grave para las empresas alimentarias debido a la dificultad que presenta su. CA. control en las plantas de procesado. Por todo ello, desde el punto de vista de la higiene y la salud alimentaria y pública, L. monocytogenes es un organismo prioritario en los planes. TE. de análisis de peligros y puntos de control críticos (APPCC) llevados a cabo en las. IO. industrias alimentarias, así como en los planes de prevención de enfermedades de las. BI. BL. instituciones sanitarias (J Food Prot, 2005; Mengoni y Apraiz, 2003).. Los datos obtenidos en los últimos 10 años, con respecto a los orígenes de los brotes de listeriosis, indican que algunos alimentos son más peligrosos que otros, considerándose de alto riesgo a los alimentos listos para consumir y conservados por un período de tiempo prolongado a temperaturas de refrigeración y a los que poseen una población elevada. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. de L. monocytogenes (mayor a 100 UFC/g o ml). Dicho microorganismo se encuentra en una gran variedad de alimentos tanto frescos como procesados, de origen vegetal o animal como hortalizas, leche, quesos, carne de vaca, cerdo, aves, embutidos ahumados y. AS. fermentados, mariscos crudos, pescado ahumado. (Doyle et al., 2001).. IC. El género Staphylococcus está formado por cocos Gram positivos, con un diámetro entre. G. 0.5 a 1.5 μm, agrupados como células únicas, en pares, tétradas, cadenas cortas o. LO. formando racimos de uvas (Kloss et al., 1992). Ogston introdujo el nombre de. O. Staphylococcus, del griego staphyle que significa racimo de uvas, para describir a los. BI. cocos responsables de inflamación y supuración. Son bacterias no móviles, no. AS. esporuladas, no poseen cápsula, aunque existen algunas cepas que desarrollan una cápsula. CI. de limo, son anaerobias facultativas. La mayoría de los estafilococos producen β-. CI EN. hemólisis o hemólisis total y catalasa; característica que se utiliza para diferenciar el género Staphylococcus de los géneros Streptococcus y Enterococcus que son catalasa. DE. negativos (Kloss et al., 1992; Kuroda et al., 2001).. Las principales fuentes de contaminación por S. aureus en los alimentos son: el humano. CA. y los animales. El humano al estar infectado o ser portador lo trasmite a los alimentos. TE. durante la elaboración, en el caso de la contaminación por los animales la situación más. IO. frecuente es la mastitis crónica o aguda del ganado lechero, la contaminación es a través. BL. de las maquinas ordeñadoras o de las manos de los ordeñadores del ganado. Otros factores. BI. que contribuyen a la contaminación son el manejo inapropiado y la conservación en condiciones inadecuadas de los alimentos favoreciendo el desarrollo de los microorganismos. El crecimiento de S. aureus en alimentos tiene gran importancia por tratarse de un microorganismo capaz de producir toxinas que al ingerirse causa intoxicaciones alimentarias (Fernández, 2008).. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. S. aureus es importante no solo porque ocasiona infecciones en diversas partes del organismo humano, sino porque es una de las principales bacterias implicadas en enfermedades transmitidas por alimentos (ETA). Tales enfermedades son causadas por. AS. diversas acciones, incluyendo la capacidad del patógeno de producir toxinas, siendo esto relativamente común en determinados sectores de la población y en algunas regiones. G. IC. geográficas desfavorecidas por la falta de sistemas de salud. Las infecciones son causadas. LO. por la ingesta de alimentos contaminados con toxinas que se encuentran presentes en el. O. aire, la leche, el agua potable, las aguas residuales y, desde luego, la comida o en el equipo. BI. donde los alimentos han sido elaborados (Tibavizco et al., 2007).. AS. Staphylococcus aureus es el patógeno aislado con mayor frecuencia en casos de toxi-. CI. infecciones alimentarias (Bean et al., 1996), siendo un microorganismo que coloniza. CI EN. preferentemente la nasofaringe, piel y mucosas de hombres y animales (ICMSF, 1996). Su presencia en los alimentos se asocia directamente a una inadecuada manipulación o al empleo de materias primas contaminadas (Bean et al., 1996). Este agente produce. DE. diversas enterotoxinas (A, B, C1, C2, C3, D, E, G, H e I) causantes de toxi-infecciones. CA. alimentarias (Halpín-Dohnalek y Marh, 1989) que son fácilmente identificables con antisueros específicos (Dinges et al., 1989). La producción de estas toxinas depende. TE. principalmente de la naturaleza del alimento, de los procesos a los cuales fue sometido. IO. (crudo, cocido, fermentado, etc.) y de su potencial exposición a temperaturas de abuso. BI. BL. (Halpín-Dohnalek y Marh, 1989; Bennett, 1992; Qi y Miller, 2000).. Existe una amplia variedad de alimentos capaces de albergar al estafilococo, pero cabe destacar que los más susceptibles son aquellos que tienen contacto con la piel del animal, tal es el caso de la leche, el huevo, los productos cárnicos como el jamón e, incluso, la carne de pollo; este último es muy susceptible a la contaminación bacteriana, porque tiene. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. características fisicoquímicas que permiten que su superficie se contamine fácilmente, especialmente en la etapa de evisceración (Mercado et al., 2012). Aun así, no solo la carne de pollo es ideal para la proliferación de Staphylococcus aureus sino también el chorizo,. AS. ya que las materias primas con que se elabora, de las que destacan la carne y la tripa, tienen excesiva manipulación del productor (Ruíz-Quezada et al., 2010). También es. G. IC. importante considerar la influencia de la temperatura inadecuada a la que se expenden los. LO. productos o se almacenan las materias de elaboración (Borbolla et al., 2004).. O. El hombre a través del tiempo ha encontrado en los recursos naturales la solución a. BI. diferentes problemáticas, empleando las plantas a nivel alimenticio, industrial y. AS. medicinal, convirtiéndose de esta manera, en materias primas de vital importancia para el. CI. avance de la humanidad (Ben-Hsouna et al., 2013).. CI EN. Los productos naturales que se utilizan en nuevas tecnologías de conservación de alimentos son agentes antimicrobianos que existen en animales, plantas y microorganismos, en los que frecuentemente están implicados en mecanismos de defensa.. DE. En la actualidad se investigan sistemas enzimáticos, moléculas y polímeros como:. CA. lactoperoxidasa (leche), lisozima (clara de huevo), saponinas, flavonoides (hierbas y especias), aceites esenciales (carvacrol, timol, etc.), bacteriocinas (bacterias lácticas) y. IO. TE. quitosan (exoesqueleto de crustáceos) (Devlieghere et al., 2004).. BL. Los aceites esenciales son las fracciones liquidas volátiles generalmente destilables por. BI. arrastre con vapor de agua, que contienen las sustancias responsables del aroma de las plantas y que son importantes en la industria cosmética (perfumes y aromatizantes), de alimentos (condimentos y saborizantes) y farmacéuticas (saborizantes) (Reichling et al., 2009). Los aceites esenciales lo constituyen una diversa familia de compuestos orgánicos de bajo peso molecular con grandes diferencias en la actividad antimicrobiana. Los. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. componentes activos de los aceites esenciales pueden dividirse en cuatro grupos según su estructura química: terpenos, terpenoides, fenilpropenos, y fenilpropanoides (BerkaZougali et al., 2012).. AS. Los aceites esenciales de plantas aromáticas y medicinales contienen principios activos. IC. que exhiben bioactividades como: antioxidante, antifúngica, antimicrobiana, entre otras. G. (Matiz et al., 2012). Los aceites esenciales y sus principales constituyentes inhiben a los. LO. microorganismos por una variedad de mecanismos tales como: destrucción de la. O. membrana citoplasmática, fuga de constituyentes intracelulares tales como metabolitos e. BI. iones, coagulación de contenido celular, inhibición de la síntesis de proteínas, enzimas. AS. asociadas con la síntesis de la pared celular, síntesis DNA/RNA, destrucción de la. CI. integridad osmótica de la membrana celular (Kuorwel-Kuorwel et al., 2011).. CI EN. La biodiversidad vegetal ofrece alternativas antibacterianas; algunas especies con excelentes resultados, debido a sus constituyentes químicos. Entre las cuales tenemos al. DE. género Minthostachys que es utilizado por el campesino de los Andes peruanos para preservar la papa y otros tubérculos menores contra el ataque de insectos en condiciones. CA. de almacenamiento, ya que se trata de una planta con singulares propiedades. Se considera. TE. que está planta permitió en épocas prehispánicas conservar en perfectas condiciones los. IO. alimentos de origen vegetal (Schmidt-Lebuhn, 2008). Minthostachys mollis, nombre. BL. científico de la muña, planta nativa que crece en diversas zonas de la serranía peruana.. BI. La muña habita en los diferentes pisos ecológicos de nuestra serranía, crece entre 2500 y. 3500 m.s.n.m, donde existe en abundancia (Salaverry, 2005; Roersch, 1999; Rojas et al., 2003). El clima más apropiado es aquel con abundante lluvias y elevada luminosidad (Salaverry, 2005).. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Minthostachys mollis es una planta de 0.9 a 1.5 m de altura, frondosa en la parte superior, de aspecto bien tupido en hojas, las mismas que son opuestas y aserradas presentando pelos en los peciolos y en la cara inferior de las hojas, en las cuales se deposita la mayor. AS. cantidad de aceite esencial. El tallo es ramificado desde la base, que también presenta pelos, tiene forma prismático cuadrilátero y propenso a la lignificación. Las flores se. G. IC. encuentran en la parte superior de las ramas reunidas en verticilos. Las flores son. LO. pequeñas y blancas; irregulares o zigomorfas. Se encuentran reunidas en seudo verticilos. O. axilares, formados por cuatro pequeñas cimas, brevemente pedunculadas, dos en cada. BI. axila y situadas en la parte superior de las ramas (Salaverry, 2005).. AS. La muña, según el sistema de Engler & Prantil, modificado por Melchor en 1964, recibe. CI EN. REINO: Vegetal. CI. la siguiente clasificación (Dabbah et al., 1970):. DE. DIVISIÓN: Angiospermae. CA. CLASE: Dicotyledoneae. TE. SUB CLASE: Simpetaleae. IO. ORDEN: Tubiflorales. BI. BL. FAMILIA: Lamiaceae. GÉNERO: Minthostachys. ESPECIE: Minthostachys mollis (Kunt/Griseb) NOMBRE COMUN: “MUÑA”. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La composición de la muña es: aceite esencial, glicósidos, mucílagos, saponinas, taninos, alcaloides, esteroles, éteres y terpenos en mayor porcentaje. Además, contiene carbohidratos, calcio, fósforo, fierro, trazas de vitamina B1, esencias, mentol y mentona. AS. (Alaba y Jiménez, 2014). Gibaja (1960) realizó la desterpenación del aceite esencial de Minthontanchy mollis. IC. (muña) determinando el 10.20% para la parte desterpenada (compuestos oxigenados) y. G. 89.80 % para la fracción terpénica. Cano (2007) determinó la presencia de carvacril. LO. acetato, carvacrol, pulegona y mentona.. BI. O. Inga y Guerra (2000) demostraron mediante un estudio las propiedades bactericidas / bacteriostáticas del aceite esencial de Minthostachys mollis frente a Staphylococus aureus. AS. ATCC 25923, B. cereus MC, Salmonella typhi, S. sonnei MC, Escherichia coli. CI. ATCC.25922 y K. pneumoniae ATCC 10031. Además de la acción fungistático /. CI EN. funguicida para Fusarium moniliforme y Aspergillus Níger. Primo et al. (2001) estudiaron a Minthostachys verticillata “peperina”, observaron buena. DE. actividad contra Staphylococcus aureus, B. cereus, E. coli, P. mirabillis y antiviral contra el virus Herpes Simplex tipo 1 y el virus de la Pseudorrabia, aunque con escasa actividad. CA. contra P. aeruginosa.. TE. Díaz K. (2005), obtuvieron el aceite esencial de muña mediante la técnica arrastre de. IO. componentes pulegona y transmenton. Concluyó que el aceite esencial de muña presenta. BL. actividad antibacteriana en Streptococcus mutans, Lactobacillus sp., Fusobacterium. BI. nucleatum, Actinobacillus actinomycetemcomitans y Actinomyces sp. frente a Amoxicilina como control positivo y agua destilada como control negativo. En las pruebas de susceptibilidad concluyó que la bacteria más sensible al aceite esencial de muña era Fusobacterium nucleatum seguido de Actinobacillus actinomycetemcomitans, Streptococcus mutans, Lactobacillus sp. y Actinomyces sp. con una media de halos de 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. inhibición 20.13 mm, 18.42 mm, 16.50 mm, 14.38 mm, 11 mm respectivamente. La propiedad antimicrobiana se debería a las sustancias terpenoides presentes en el aceite esencial del Minthostachys mollis.. AS. Paredes N. (2009), determinaron la efectividad antibacteriana salival mixta de las. IC. infusiones a base de té verde, y té verde y muña, no encontró efectividad en la infusión a. G. base de muña, y que existían diferencias significativas entre las medias de las muestras.. LO. Así mismo, la infusión a base de té verde resultó ser similar en cuanto a su efectividad. O. antibacteriana con respecto a la Clorhexidina. De los resultados obtenidos se concluye. BI. que se ha evidenciado la efectividad antibacteriana de una infusión a base de té verde y. AS. muña sobre la flora salival mixta, sin embargo, se observó una efectividad antibacteriana. CI. menor con respecto a la infusión a base de té verde y la Clorhexidina.. CI EN. La cuantificación de la actividad in vitro de los antimicrobianos se evalúa habitualmente mediante algunas de las variantes de los métodos de dilución. La Concentración Mínima. DE. Inhibitoria (CMI) se define como la mínima concentración de antimicrobiano (en μg/mL) que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo después de 24 horas de. CA. incubación a 37°C. La CMI se ha establecido como "gold Standard" frente a otros. TE. métodos que evalúan susceptibilidad antimicrobiana; además de confirmar resistencias. IO. inusuales, da respuestas definitivas cuando el resultado obtenido por otros métodos es. BL. indeterminado (Andrews, 2001).. BI. Conociendo que el control de crecimiento microbiano es un factor importante en la conservación de alimentos, en el cual se utilizan agentes químicos comunes. Es por ello que se busca una alternativa diferente como el empleo de plantas medicinales para la conservación de alimentos, reduciendo la carga microbiana y extendiendo su vida útil. Además se han encontrado estudios ya realizados con Minthostachys mollis “muña”, que 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. inhibe a otros géneros bacterianos, es por ello que se espera saber cuál es la concentración mínima del aceite esencial de M. mollis que inhibe el crecimiento de L. monocytogenes y S. aureus.. AS. Este trabajo forma parte del programa sobre acción bacteriana de plantas medicinales que. LO. G. Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.. IC. está ejecutando el laboratorio de Fisiología y Genética Bacteriana en el Departamento de. BI. Determinar la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de. AS. •. O. OBJETIVO GENERAL. CI EN. Staphylococcus aureus.. CI. Minthostachys mollis “muña” sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes y. DE. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.  Determinar la fase logarítmica media y el tiempo de generación de L.. TE. CA. monocytogenes ATCC® 19115™ y S. aureus subsp. aureus ATCC® 12600™..  Conocer la concentración mínima de Minthostachys mollis “muña” que inhibe el. IO. crecimiento de L. monocytogenes ATCC® 19115™y S. aureus subsp. aureus. BL. ATCC® 12600™, mediante la técnica de dilución en caldo en pocillos de. BI. microcultivo.. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. II. MATERIALES Y MÉTODOS. 1.. MATERIAL BIOLÓGICO  Cepa de Listeria monocytogenes ATCC® 19115™.. PROCEDIMIENTO. BI. O. 2.. LO. G. IC.  Minthostachys mollis “muña”. AS.  Cepa de Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 12600™.. AS. 2.1 Procesamiento de Minthostachys mollis “muña”. La planta Minthostachys mollis “muña”, se obtuvo en el Mercado “La. CI EN. de La Libertad.. CI. Hermelinda”, distrito de Trujillo, provincia de Trujillo, departamento. DE. 2.1.1. Identificación Taxonómica de Minthostachys mollis “muña” La planta obtenida en el Mercado “La Hermelinda”, fue identificada en. CA. el Herbario Antenor Orrego (HAO) de la Universidad Privada Antenor. IO. TE. Orrego (Anexo 01 y 02).. BI. BL. 2.1.2. Obtención del aceite esencial de Minthostachys mollis “muña” El aceite esencial se obtuvo a partir de toda la planta de M. mollis “muña” por el método de destilación por arrastre de vapor (Berka-Zougali y col., 2012), para ello se usó 2 Kg de la planta (Anexo 03).. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.1.3. Preparación de solución Stock del aceite esencial El aceite esencial de M. mollis “muña” se disolvió inicialmente en una mezcla solubilizante (Tween 80) a una concentración de 40 mg/mL.. AS. Después, se tomó una alícuota de 1 mL de esta solución y se diluyó en 9. G. IC. mL de Caldo de Enriquecimiento BHI (Anexo 04).. LO. 2.2. Reactivación de las cepas Listeria monocytogenes ATCC® 19115™ y. BI. O. Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 12600™. AS. 2.2.1. Reactivación de la cepa Listeria monocytogenes ATCC® 19115™. CI. L. monocytogenes ATCC® 19115™ en presentación KWIK STIK. CI EN. contenía un microorganismo liofilizado, con una ampolla de fluido de rehidratación en la parte superior y una torunda para su adecuada inoculación (Anexo 5).. DE. Con un hisopo estéril embebido con el microorganismo liofilizado se. CA. reactivó en caldo BHI y se incubó a 37°C durante 24 horas; pasado el tiempo de incubación se extrajo una alícuota del medio y se sembró en. TE. agar BHI por la técnica de siembra en estrías por agotamiento, luego fue. aisladas.. BI. BL. IO. incubado a 37°C durante 24 horas, con la finalidad de obtener colonias. 2.2.2. Reactivación de la cepa Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 12600™ Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 12600™ en presentación KWIK STIK contenía un microorganismo liofilizado, con una ampolla. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. de fluido de rehidratación en la parte superior y una torunda para su adecuada inoculación (Anexo 9).. Se sembró en el medio Agar manitol salado utilizando la técnica de. IC. AS. siembra en estrías por agotamiento y se incubó a 37°C durante 24 horas.. LO. G. 2.3. Obtención de la curva de crecimiento de L. monocytogenes y S. aureus. BI. O. 2.3.1. Curva de crecimiento de Listeria monocytogenes. Se sembró 1 mL de suspensión de L. monocytogenes equivalente al tubo. AS. N° 0.5 del Nefelómetro de MacFarland (1.5x108 UFC/mL) en 99 mL de. CI. caldo de enriquecimiento BHI a 37 °C durante 12 horas en agitación. CI EN. constante y se determinó la concentración de la población microbiana cada 2 horas por el método de recuento en placa. Con estos recuentos se. DE. obtuvo la curva de crecimiento, la fase logarítmica media y por. CA. consiguiente el tiempo de generación.. BI. BL. IO. TE. 2.3.2. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus. Se sembró 1 mL de suspensión de S. aureus equivalente al tubo N° 0.5 del Nefelómetro MacFarland (1.5x108 UFC/mL) en 99 mL de caldo. nutritivo a 37 °C durante 12 horas en agitación constante y se determinó la concentración de la población microbiana cada 2 horas por el método de recuento en placa. Con estos recuentos se obtuvo la curva de crecimiento, la fase logarítmica media y por consiguiente el tiempo de generación. 13. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.4. Preparación de inóculos. 2.4.1. Preparación de inóculo de L. monocytogenes Se sembró L. monocytogenes en una placa conteniendo Agar BHI y se. AS. incubó a 37 °C por 7 horas obteniendo un cultivo en fase logarítmica. IC. media. Se preparó una suspensión bacteriana de 1 mL equivalente al tubo. LO. G. N° 0.5 del Nefelómetro de MacFarland (1.5x108 UFC/mL).. O. 2.4.2. Preparación de inóculo de S. aureus. BI. Se sembró S. aureus en una placa conteniendo Agar nutritivo y se incubo. AS. a 37 °C por 8 horas obteniendo un cultivo en fase logarítmica media. Se. CI. preparó una suspensión bacteriana de 1 mL equivalente al tubo N° 0.5. CI EN. del Nefelómetro de MacFarland (1.5x108 UFC/mL).. 2.5. Determinación de la concentración mínima inhibitoria. DE. Se realizó por la técnica de dilución en caldo en pocillos de microcultivo. CA. (Negroni, 1991; Brooks et al., 1996) de 2 mL de volumen. Se adicionó 800 µL de Caldo de Enriquecimiento BHI en 8 pocillos y para el primer pocillo se. TE. adicionó 800 µL de solución Stock del aceite esencial de M. mollis. Del primer. IO. pocillo se tomó 800 µL y se realizó diluciones hasta el octavo pocillo para. BL. obtener las concentraciones 400; 200; 100; 50; 25; 12.5; 6.25; 3.125 µg/mL.. BI. Luego se completó el mililitro con 200 µL de inóculo (3x105 células) para tener. las concentraciones finales de: 320, 160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5 µg/mL. Se adicionó en un noveno pocillo 800 µL de Tween 80 que sirvió de control del medio (Cueva-Yesquen, 2016).. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Se incubó los 9 sistemas a 37 °C por 24 horas y se verificó el crecimiento con la aparición de turbidez (Anexo 17 y 18).. PROCESAMIENTO DE DATOS. IC. AS. 3.. LO. G. 3.1. Determinación de la CMI. Al realizar la lectura, se observó el crecimiento o inhibición del. BI. O. microorganismo en todos los pocillos, adecuados a diferentes concentraciones del aceite esencial, y en donde no hubo crecimiento visible correspondió a la. AS. CMI.. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. Los resultados se validaron realizando tres repeticiones.. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. III.. RESULTADOS. A partir de la planta muña, se obtuvo el aceite esencial, con el cual se determinó la. AS. concentración mínima inhibitoria sobre el crecimiento de L. monocytogenes. IC. ATCC® 19115™ y S.aureus subsp. aureus ATCC® 12600™.. G. En la siguiente tabla se muestra que la concentración mínima inhibitoria del aceite. LO. esencial de Minthostachys mollis sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes que. O. fue de 40 µg/mL y sobre el crecimiento de Staphylococcus aureus que fue de 80. CI. AS. BI. µg/mL.. CI EN. Tabla 01. Concentración mínima inhibitoria (CMI) del aceite esencial de Minthostachys. CA. DE. mollis sobre el crecimiento de L. monocytogenes y S. aureus.. Bacterias. CMI 40 µg/mL. S. aureus subsp. aureus ATCC® 12600™. 80 µg/mL. BI. BL. IO. TE. L. monocytogenes ATCC® 19115™. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IV.. DISCUSIÓN. El efecto antimicrobiano de los aceites esenciales se determina evaluando mediante la concentración mínima inhibitoria (CMI), que se define como la concentración en la que. AS. se evita el crecimiento visible de bacterias bajo las condiciones de crecimiento definidas.. IC. Las técnicas más comúnmente utilizadas son: la dilución en agar y dilución en caldo. La. G. técnica de dilución en caldo utiliza un medio líquido que contiene concentraciones. LO. crecientes geométricamente (típicamente una serie de diluciones dobles) del agente. O. antimicrobiano, que es inoculado con un numero definido de células bacterianas. BI. (Wiegand et al., 2008). Además la técnica de dilución en agar o difusión en disco puede. AS. reducir la eficiencia del aceite esencial por la precipitación de este en los pocillos o en los. CI. discos (Sánchez y Kouznetsov, 2010).. CI EN. La demanda del consumidor por alimentos naturales, con ausencia o reducida cantidad de productos químicos ha ido incrementando notoriamente, lo que hace indispensable la. DE. búsqueda de compuestos alternativos y nuevas tecnologías no contaminantes. El control del crecimiento microbiano es uno de los factores más importantes a considerar en la. CA. conservación de alimentos, por lo que la sustitución de los productos antimicrobianos. TE. químicos por sustancias naturales, como los aceites esenciales, que no alteran las. IO. características sensoriales ni nutricionales de los alimentos ha sido revisada por diversos. BL. autores desde hace varios años (Velázquez, 2010).. BI. Los aceites esenciales son compuestos extraídos de varios tipos de plantas y usados para preservar alimentos y bebidas, tienen un efecto inhibitorio sobre el desarrollo de microorganismos (Azaña, 2010). Los componentes activos de los aceites esenciales pueden dividirse en cuatro grupos según su estructura química: terpenos, terpenoides, fenilpropenos, y fenilpropanoides (Berka-Zougali et al., 2012). Los terpenoides pueden 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. servir como un ejemplo de agentes liposolubles, los cuales afectan la actividad de las enzimas catalizadoras a nivel de membrana, por ejemplo: ciertos componentes del AE pueden actuar como desacopladores, los cuales interfieren en la translocación de protones. AS. sobre la membrana y subsecuentemente interrumpir por la fosforilación del ADP (Cano. IC. et al., 2008).. G. Estudios in vitro han mostrado que los aceites esenciales inhiben el crecimiento. LO. bacteriano pero varían en su eficacia debido a que los componentes químicos que actúan. O. como agentes antimicrobianos varían en tipo y concentración (Hyldgaard et al., 2012).. BI. La actividad antimicrobiana de los diferentes aceites esenciales es muy difícil de. AS. comparar teniendo en cuenta la variación de la composición del aceite esencial. CI. (compuestos orgánicos de bajo peso molecular) entre especies de plantas, diferencias en. CI EN. el origen geográfico, estación del año, métodos de extracción y parte de la planta que es usada (Kuorwell-Kuorwell et al., 2011).. DE. En recientes estudios se ha demostrado la actividad antibacteriana de diversos aceites esenciales, los cuales pueden contener más de 150 componentes (Brack y Heinz, 2002).. CA. El análisis del aceite esencial de M. mollis recogidos de Mollis Tuñame Paramo, estado. TE. Trujillo, Venezuela mediante la técnica de cromatografía de gases mostrando la presencia. IO. de trece compuestos, siendo pulegona (55.2%) y mentona (36%) los componentes. BL. principales además de linalol (0.5%), minomeno(0.1%), isopulegona (1.5%), piperitona. BI. (1.5%), piperitenone (1.7%), entre otros (Mora et al., 2009), y en una menor proporción se encuentra el carvacrol así como en varias hierbas conocidos como el orégano (Origanum vulgare), la ajedrea de verano (Satureja hortensis) o tomillo (Thymus serpyllum) (Baca, 2014).. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Los aceites esenciales que tienen mayor capacidad inhibitoria presentan como mayores componentes del mismo, compuestos tales como el timol, el carvacrol, el linalol, el aldehído cinámico, la alicina y el eugenol (Winward et al., 2008; Delaquis et al.; 2002;. AS. Benkeblia, 2004); dichos aceites por su acción lipofílica tienen la capacidad de pasar las membranas celulares, romper polisacáridos, ácidos grasos y lípidos, permeabilizando la. G. IC. membrana celular; conduciendo a la pérdida de iones, al colapso de la bomba de protones. LO. y a la disminución del ATP lo cual conduce a la muerte celular; a nivel citoplasmático. O. puede actuar sobre lípidos y proteínas coagulando dichas moléculas (Bakkali et al.,2008).. BI. Con respecto a la composición química del aceite esencial de Minthostachys mollis. AS. (muña) presenta una estructura aldehídica, cetónica, alcohólica (mentol y mentona),. CI. ésteres, éteres y terpenos en mayor porcentaje (Azaña, 2010). Además se determinó la. CI EN. presencia de carvacril acetato, carvacrol, pulegona y mentona (Cano, 2007). Entre los compuestos fitoquímicos responsables de la actividad antibacteriana destacan los derivados fenólicos timol y carvacrol (Domingo y López-Brea, 2010), los cuales. DE. pueden penetrar la membrana del citoplasma, causando una desestabilización de esta;. CA. igualmente podría actuar como intercambiador de protones, reduciendo el gradiente de pH a lo largo de la membrana (Xu et al., 2008), y con algo menos de actividad se presentan. TE. los derivados alcohólicos y cetónicos (Domingo y López-Brea, 2010). Los compuestos. IO. fenólicos destacan la capacidad de actuar como conservantes de alimentos (Pinelo et al.,. BI. BL. 2006).. Investigaciones recientes reportan que el carvacrol aumenta la fluidez de la membrana y causa fuga de protones e iones de potasio lo que resulta en un colapso del potencial de membrana y la inhibición de la síntesis de ATP; del mismo modo refieren que el mentol tiene un efecto “antiplasmid” (secuencia extracromosómica de ADN que no puede ser. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. compartida entre los patógenos) lo que hace interrumpir la eficiencia de la célula (Fisher y Phillips, 2008). La actividad antibacteriana del timol y otros monoterpenos está relacionada a daños. AS. estructurales y funcionales que provocan en la fracción lipídica de la membrana plasmática; estos interactúan con proteínas de membranas y dianas intracelulares, inducen. G. IC. alteraciones en la permeabilidad de la membrana, despolarización y liberación de material. LO. intracelular de las bacterias (Hyldgaard et al., 2012).. O. Cabe resaltar que los aceites esenciales mostraron un mayor efecto inhibitorio frente a. BI. cepas Gram-negativas. Este comportamiento particular frente a un grupo de cepas,. AS. probablemente se debe a que la pared celular de las bacterias Gram-positivas estudiadas. CI. está compuesta básicamente por peptidoglicano que representa hasta el 90% de la pared,. CI EN. ácidos teicoicos que también suelen estar presentes en pequeñas cantidades y polisacáridos; mientras que la pared celular de las Gram-negativas está constituida solo por el 10% del peptidoglicano, además posee tres polímeros que se encuentran fuera de. DE. su envoltura: lipoproteína, membrana externa y lipopolisacáridos, este último con un. CA. contenido de lípido A que pudiera favorecer la entrada, por disolución de los aceites esenciales debido a su carácter hidrofóbico y provocar la muerte celular por. TE. desestabilización de la membrana externa y la membrana plasmática. Este lípido A no. IO. está presente en las bacterias Gram-positivas y esta sería una causa probable del efecto. BL. del aceite en los diferentes grupos bacterianos, donde las bacterias Gram-negativas son. BI. relativamente más sensibles (Guerra et al., 2014).. Briceño, (2016) utilizó la técnica de microdilución en caldo para medir la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial obtenido de la cáscara de Citrus limetta “lima” sobre el crecimiento de L. monocytogenes, la cual presentó una concentración mínima. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. inhibitoria de 10 µg/mL; mientras que en nuestra investigación al trabajar con la misma bacteria sin modificar la técnica, pero empleando el aceite esencial de Minthostachys mollis (muña), se obtuvo para dicho microorganismo una CMI de 40 µg/mL, por lo cual. AS. Listeria monocytogenes es más resistente al aceite esencial de la muña y más sensible al. IC. aceite esencial de la lima.. G. Los aceites esenciales de las especies del género Origanum presentan actividad contra. LO. bacterias Gram negativo: Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Klebsiella. O. pneumoniae, Yersinia enterocolitica y Enterobacter cloacae; y las gram positivas como. BI. Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Listeria monocytogenes y Bacillus. AS. subtilis (Aligiannis et al., 2001). Dicha acción antimicrobiana posiblemente se debe al. CI. efecto sobre los fosfolípidos de la capa externa de la membrana celular bacteriana,. CI EN. provocando cambios en la composición de los ácidos grasos. Se ha informado que las células que crecen en concentraciones sub-letales de carvacrol, sintetizan los fosfolípidos adicionales y omiten uno de los fosfolípidos originales (Reinders y Burt, 2003). Este. DE. componente está presente en la muña, la cual se le atribuye el mecanismo de acción sobre. CA. las bacterias trabajadas.. TE. Sanla-Ead et al. (2011) reportaron un diámetro de inhibición promedio de 30.1 milímetros. IO. para L. monocytogenes, 28.9 mm para S. aureus y 22 mm para Salmonella enteritidis. Los. BL. resultados de este estudio confirman los reportes de que las bacterias Gram negativas,. BI. como Salmonella, son más resistentes a la acción de los aceites esenciales que las Gram positivas (Sanla-Ead et al., 2011, Panahi et al., 2011, Al-Bayati y Muthanna, 2009). A diferencia de nuestro trabajo se empleó la técnica de microdilución en caldo y se obtuvo que la CMI de L. monocytogenes fue de 40 µg/mL, y de S. aureus fue de 80 µg/mL, esto demuestra la siguiente relación : L. monocytogenes por ser más sensible su crecimiento. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. será inhibido con una concentración menor del aceite esencial trabajado, y su halo de inhibición será mayor; a comparación de S. aureus por ser resistente su inhibición se dará a una concentración mayor y su halo de inhibición será menor.. AS. Según los resultados obtenidos la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de. IC. Minthostachys mollis “muña” sobre el crecimiento de L. monocytogenes fue de 40 µg/mL. G. y de S. aureus fue de 80 µg/mL, con esto se muestra un mayor efecto inhibitorio en L.. LO. monocytogenes, siendo esta bacteria más susceptible al aceite esencial debido a que su. O. tiempo de generación es mayor (55 minutos), por lo tanto la velocidad de crecimiento es. BI. menor (0.752), esto conlleva a que haya una menor población microbiana que al ser. AS. expuesta ante el aceite esencial de Minthostachys mollis “muña” sea más sensible que S.. CI. aureus; el cual presento un tiempo de generación menor (42 minutos) y una velocidad de. CI EN. crecimiento mayor (0.9792), lo que genera una mayor población microbiana, por lo tanto es más resistente al aceite esencial evaluado.. DE. En esta investigación se expuso a L. monocytogenes y S. aureus a las mismas condiciones y concentraciones del aceite esencial de Minthostachys Mollis (Muña), por lo cual se. CA. asume que la actividad antimicrobiana de éste depende principalmente de tres. TE. características: su carácter hidrófilo o hidrófobo, sus componentes químicos y el tipo de. IO. microorganismo que debe atacar (Fisher y Phillips, 2008; Solórzano Santos y Miranda-. BL. Novales, 2011). Es por ello que se concluye que la concentración mínima inhibitoria de. BI. L. monocytogenes es 40 µg/mL y S. aureus es 80 µg/mL.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. V.. ENUNCIADO RESUMEN. En esta investigación se determinó el tiempo de generación y fase logarítmica media para Listeria monocytogenes que fue de 55 minutos y 7 horas respectivamente; así como de. AS. Staphylococcus aureus que fue de 42 minutos y 8 horas respectivamente. También se. IC. evaluó la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Minthostachys mollis. G. “muña” sobre el crecimiento de dichas bacterias, el cual presento un mayor efecto. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. diferencia de S. aureus que obtuvo una CMI de 80 µg/mL.. LO. inhibitorio para L. monocytogenes siendo más susceptible con una CMI de 40 µg/mL a. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. Alaba W, Jiménez C. (2014). Efecto inhibitorio in vitro del aceite esencial de las hojas de. AS. Minthostachys mollis (muña) sobre colonias de Enterococcus faecalis ATCC. IC. 29212. (1):15-22.. G. Al-Bayati, F. y Muthanna M. (2009). Isolation, identification, and purification of. LO. cinnamaldehyde from Cinnamomum zeylanicum bark oil. An antibacterial study.. BI. O. Pharmaceutical Biology, 47(1) 61-66.. Aligiannis N, Kalpoutzakis E, Mitaku SC. (2001). Composition and antimicrobial activity. CI. CI EN. Chemistry, 49(9), 4168 - 4170.. AS. of the essential oils of two Origanum species. Journal of Agricultural and Food. Andrews MJ. (2001). Determination of Minimum Inhibitory Concentration. J Antimicrob. DE. Chemother. 48 (31): 5-16.. Azaña I. (2010). Efectividad Antibacteriana in vitro del aceite esencial de Minthostachys. CA. mollis griseb (muña) sobre bacterias prevalentes en patologías periapicales. TE. crónicas de origen endodóntico. (Tesis para obtener el título de Cirujano Dentista).. IO. Lima: Universidad Nacional Mayor de San Marcos.. BL. Baca C. (2014). Efecto inhibitorio del aceite esencial de Minthostachys Mollis (Muña). BI. sobre el género Proteus causantes de infecciones del tracto urinario. Tesis para optar el título profesional de licenciado en Biología. UNA-Puno. Perú.. Bakkali, F; Averbeck, S; Averbeck, D; Idaomar, M. (2008). Biological effects of essential oils. Food and chemical toxicology. 46:446-475.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Briceño M, JI. (2016). Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Citrus limetta sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes. (Tesis para optar el título de Biólogo Microbiólogo) Trujillo: Universidad Nacional de Trujillo.. AS. Brooks G, Butel J, Ornston N. (1996). Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y. G. IC. Adelberg. 15º edición. México: Editorial Manual Moderno.. LO. Brugere-Picoux O. (2008). Ovine listeriosis. Small Rumiant Res. 76 (1): 12-20. doi:.. O. 10.1016 / j.smallrumres.2007.12.022.. BI. Carpentier B, Cerf O. (2011). Review- Persistence of Listeria monocytogenes in food. AS. industry equipment and premises. Int J Food Microbiology. 145(1): 1-. CI. 8. doi: 10.1016 / j.ijfoodmicro.2011.01.005.. CI EN. Cano C. (2007). Actividad antimicótica in vitro y elucidación estructural del aceite de las hojas de Minthostachys mollis (muña). Tesis de Maestría para Magister en. DE. recursos vegetales y terapéuticos, Lima- UNMSM.. CA. Cano C, Bonilla P, Roque M, Ruiz J. (2008). Actividad antimicótica in vitro y metabolitos del aceite esencial de las hojas de Minthostachys mollis (muña): Rev Peru Med. IO. TE. Exp Salud Pública. 25(3):298-301.. BL. Cox LJ, Kleiss J, Cordier JL, Cordellana C, Konkel P, Pedrazzini C, Benmer R, Siebegna. BI. A (1989). Listeria spp. in food processing, non food and domestic environments. Food Microbiol. 6: 49-61.. Cueva-Yesquén L G. (2016). Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Citrus limón sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes. (Tesis para optar el título de Biólogo Microbiólogo) Trujillo: Universidad Nacional de Trujillo. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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