3 tie noviemhra do I993 y c:ii!nUnO

Texto completo

(1)

AA

_ _ ~

Casa abietta al tiempo

UNIVERSIDAD

AUTONOMA METROPOLITANA

DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y

DE LA

SALUD SERVICIO SOCIAL ss.cbs. 512.95

A QUIEN CORRESPONDA

Por medio de la presente se hace constar que el (la):

M. EN C. MA. DE LOURDES ESCAMILLA HURTADO

del Departamento de: BIOTECNOLOGIA

de la Divisi6n de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesor6 el siguiente Sewicky Social:

TITULo: CARACTERIZACION TAXONOMICA Y FISIOLCGICA DE TRES CEPAS DE

BACTERIAS LACTICAS

ALUMNO: SEGURA VELAZQUEZ MONICA

MATRICULA: 90336877

LICENCIATURA: INGENIERIA DE LOS ALIMENTOS

PERIODO: NOVIEMBRE 3, 1993-ABRIL 20, 1995

Se extiende la presenta para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de MBxico, D.F. a hy13~

de mil novecientos noventa y cinco. dias de Diciembre

Atentamente.

“Casa Abierta al Tiempo”

A. CBS

UNIDAD IZTAPALAPA

Av. Michoacin y La Puriaima lztapalapa 09340 Mexico. D.F. A.P. 55-535 Fax: (6) 612-8043 Tela. 724-46-81 y 85

(2)

caiiabswdlenp>

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

‘Y:.UtACTERIWCION TkYONOMICA Y FIL-IOLOGICA DE

TRES

CEPAS DE B.4CTERMS LACT I CAS”.

Ci

xr;icii- ni< iniciado 21 3 tie noviemhra do I993 y c:ii!nUnO el 20 de abril de 1995. U! repite t7wi ya ha sidi, icviscido y estoy de acuerdo uin su wnt&nido.

.A T

E

4 1‘ .\ .>I E N T E.

UNIDAD IZTAPAIAPA

(3)

México D.F.

a

20 de abril de 1995.

M en C. Rosaura Grether G o d l e z . Directora de la Div. C.B.S., UAM-I.

P r e

s e

n t e.

3

-Por medio de la presente me dirijo a usted, la alumna de la carrera de Ingeniería de los Alimentos, M6nica Segura Velázquez, con matrícula 90336877, para solicitar el registro del reporte final del Servicio Social con clave l.A.60.93, denominado:

" CARACTERIZACION TAXONOMICA FISIOLOGICA

DE

TRES CEPAS

DE

BACTERIAS LACTICAS"

El servicio social fue asesorado por la M. en C. Ma. de Lourdes Aurora Escamilla Hurtado, profesora titular C, tiempo completo, adscrita al grupo de trabajo:

Estudio

y Desarrollo de Alimentos Fermentados

y Enologia, Area de Alimentos, Departamento de Biotecnología, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa.

El

proyecto se llev6

a

cabo en el Laboratorio S-152 de la Unidad Iztapalapa teniendo como fecha de inicio el 3 de noveimbre de 1993 y fue finalizado el 20 de abril de 1995.

Por la atencidn prestada, quedo de usted agradecida

A T E N T A M E N T E .

(4)

7 % México

D.F.

a 20 de abril de 1995. .A.

'

I:

M

en C. Rosaura Grether González.

17

P r e s e n t e .

I

La

presente es con motivo de exponerle las razones por las cuales la entrega del informe final de servicio social denominado " CARACTERIZACIÓN TAXONÓMICA

Y

FISIOLÓGICA DÉ

TRES

CEPAS DE BACTERIA LACTICAS '' se efectua 11 meses posteriores a la fecha señalada para su finalización ( 3 de

'

'

Mayo de 1994. ).

I

[

En primer termino, el periodo de realización de este Servicio Social coincidió con el paro de labores por motivo del estallido de huelga efectuado

a

cargo de los trabajadores y personal académico de la UAM-I

haciendo imposible el acceso a sus instalaciones y laboratorios.

Dicho evento provocó practicamente la pérdida del trimestre. Este atraso de casi tres meses a su vez

I

r

modifico la planeación de mis actividades académicas. Como recordara, el acomodo de

las

semanas him

" a ducho trimestre más intenso. Presisamente yo me encontraba en el onceavo trimestre que es cuando se

Directora de la Div. C.B.S., UAM-I.

d-

inicia el llamado " Paquete terminal I ' .

La

carga de trabajo fue mucho mayor ante tales cambios por lo que el tiempo dedicado al Servicio Social

tuve que reducirlo, aunque no solo durante dicho trimestre si no tambien en el siguiente ( doceavo) pues

este último resulta ser mucho más activo.

Esto provocó finalmente el retardo del cual hago de su conocimiento.

Agradezco de antemano la atención prestada y me es grato enviarle un cordial saludo.

I

I

Ir"

L. A T E N T A

M

E N T E

I f -

'

I.

(5)

INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIAL

“CARACTERIZACION TAXONOMICA Y FISIOLOGICA DE

TRES

CEPAS

DE

BACTERIAS LACTICAS”

I. INTRODUCCION

1.1 GENERALIDADES.

1.1.1 Características de Bacterias Lacticas.

Las BACTERIAS LACTICAS están caracterizadas como microorganismos gram positivo, de forma esférica (coco), en bastón (bacilo) u ovoides (cocobacilo), dividiéndose en un solo plano con excepción del género

Pediococcus,

el cual se divide en dos planos (Sharpe, 1979).

Las

células son inmóviles y no forman esporas; la enzima catalasa está ausente en ellas aunque algunas cepas, ai crecer en

un

medio conteniendo una baja conceiitración de azúcares, pueden producir una “pseudocatalasa” que descompone el &Oz, pero que difiere de la primera por carecer del grupo prostético hemo (Sharpe, 1979). Su nombre se ha derivado precisamente por su capacidad para

formar

ácido láctico como producto principal del metabolismo ferrnentativo (Brock, 1987).

Todas las bacterias Iácticas crecen de manera anaerobia, y la mayor parte de ellas son insensibles al oxígeno; por lo tanto, pueden desarrollarse en presencia

o

ausencia de este elemento. Además,

no

son

capaces de sintetizar el ATP por medio de la respiración pues carecen de citocromos y compuestos porfirínicos (Sharpe, 1979).

Por

lo general tienen una capacidad biosintética limitada, y sus requerimientos numcionales complejos incluyen necesidades de aminoácidos, vitaminas y pirimidinas (Brock, 1987).

A los miembros de este grupo se les puede encontrar principalmente

en

alimentos fermentados, productos lácteos, en el aparato digestivo del hombre y animales, en cavidades naturales como la boca y la vagina y en otros materiales vegetales (Alais, 1991).

A nivel metabólico, una diferencia importante entre los subppos de bacterias Iácticas se basa en la

naturaleza de los productos que forman en la fermentación de los azúcares; un grupo denominado homofermentativo forma cuantitativamente casi un solo producto de la fennentación:.el ácido láctico (vía Embden-Meyerho@, mientras que el grupo llamado heterofermentativo produce además de este ácido, cantidades importantes de otros compuestos ccmo etanol, ácido acético y COZ, principalmente por la vía

del 6-fosfogluconato (Brock, 1987).

(6)

Lrrctohaciilus

rpp.

Pediococcus spp. ieuconostoc spp.

Streprococcus

.yip. Luctococcus

spp.

~~i el Cuadro No. 1 se muestran algunas de las diferencias más importantes que los distinguen.

~a denominación Luctococcics es reciente. e incluye a los microorganismos conocidos anteriormente

c«mo estreptococos del grupo seroldgico N

o

estreptococos lácticos; los cuales, son de gran importancia para 13 industria alimentaria, principalmente como iniciadores de fermentaciones. Las especies que

integran este grupo son (Marshall, 1987):

Lactococcus r@nolactis.

Lactococcus l a d subsp. lactis, incluyendo la biovariedad diacelylactis. Lacroroccus

lactis

subsp

cremoris.

La

capacidad de formar acetoína

o

diacetilo a

partir

del citrato, distingue

a

la especie Lact. lactis biovar. uiaceiylactis de Lact. lacris subsp. lactis. la cual está ligada a un plásmido que puede llegar a perderse

fácilmente y hacerlos indistinguibles.

En

tanto, la especie Lact. lactis subsp. cremoris se diferencía de la

siibsp. lactis

por

la habilidad de este último para liberar

NH,

a partir de la arginina (Marshall, 1987).

Lacr. raflnolactis se diferencía de Lact. lactis por el patrón de fermentación de carbohidratos, pues el

primero puede formar ácido láctico a partir de la fermentación del glicerol, rafuiosa, ramnosa y sorbitol. Tampoco es capaz de liberar NH, de la arginina, ni de formar acetoína (Krieg y Holt, 1984).

Del género Sfreprococcuí, la especie de importancia en las fermentaciones de alimentos es Streptococcus salivaris subsp. thermophilus. Anteriormente fue conocida como Streptococcus thermophilus pero tuvo

que ser reclasificada debido a la cercana homologfa

de

los ácidos nuclefcos y a la similitud del perfil de ácido grasos de cadena larga, con respecto a la especie Str. salivaris (Marshall, 1987).

1.1.2 Metabolismo del diacetilo

Algunas especies de bacterias lácticas son capaces de producir diacetilo y acetofna a partir de la fermentación de carbohidratos, siempre y cuando que exista una fuente adicional de piruvato. Esto es dehido a que los microorganismos del

grupo

homofermentativo tienen la necesidad de reducir todo el piruvato formado de la fermentación de los carbohidratos, para regenerar los nucledtidos de piridma que han oxidado (NAD), ya que estos son necesarios para continuar

con

la obtención de energfa. Las bacterias del grupo heterofermentativo presentan mayor versatilidad de vías, por lo que frecuentemente

están reprimidas las enzimas involucradas en la producción de diacetilo y acetofna. (Marshail, 1987).

El metabolismo del citrato provee una ruta para la producción de piruvato sin que se requiera el uso de NAD, según se muestra en la Fig. 1. A través de ella, Lact.

lanis

biovar diacetyiactis y Leuconostoc son capaces de

utilizar

el citrato para la produccidn de acetoína y diacetilo, sin embargo Leuconosroc lo

(7)

I . 1.3 Hidrólisis del almidón.

Existen actualmente p«cos estudios relacionados con la capacidad amilolít¡ca de las bacterias Iácticas, ~a

investigación realizada por Champ y colaboradores (1983), reporta el aislamiento a partir de piezas de pollo. de tres cepas del género Lactobacillus con capacidad amilolítica. Estas cepas pertenecían al subgénero Themiobacierium. siendo identificadas dos de ellas como Lactobacillus acidophilus y Lacrobacillus vitelinus.

La

producción de la amilasa fue

más

abundante cuando las bacterias crecieron en

un

medio conteniendo amiiopectina

o

almidón, en comparación con un medio conteniendo glUCOSd o maltosa. Cada una de las cepas presentó una actividad amilolítica diferente.

Otro estudio relacionado fue el que realizaron Sen y Chakrabarty (1984), en ,el

que

explican que la necesidad de encontrar fuentes alternativas de amilasas bacterianas,

a

las tradicionalmente utilizadas

(Bacillus

spp.), los llev6 a aislar una cepa con alta actividad amilolítica

a

partir de vegetales en

descomposición; esta cepa fue identificada como Lactobacillus cellobiosm

Esta capacidad

se

ha

observado también

en

las bacterias Iácticas de bebidas y alimentos indígenas como el pozol, tesgüino, atole de

maíz

agrio, chicha de maíz, tortilla agria, etc., en donde ocurre una

(8)

' I

i

FIGURA

1

RUTA METABOLICA PARA LA PRODUCCION DE DIACETILO

Y

ACETOINA DEL CITRATO POR INICIADORES LACTICOS

2 i 2 +

M g I Mn

CITRATO L OXALACETATO

+

ACETATO

P E S L W B D X I U S I C X I U C R P T O

PIRUVATO

i

ACETALDEHIDO-TPP

+

C02

DIACETILO

4

2,3 BUTI LENGLl CO L

(9)

CUADRO 1

PRINCIPALES CARACTERISTICAS DE DIFERENCIACION ENTRE BACTERIAS LACTICAS

-

GENERO

kctobacillus SPP-

klCtOCQCCUS Spp.

leuconostoc spp.

Pediococcus spp.

GRUPO FERMENTATIVO homofermentativo ieterofermentativo heterofermentativo homofermentativo

FORMA DE CELULAS

Células en forma de has-

tón corto

o

alargado, dis

puestas en pares

o

cadenas Frecuentemente se halla cocobacilos.

Células esféricas u ovoi-

des en pares o cadenas.

Células esféricas, frecuen- temente lenticulares, en

pares

o

cadenas.

Células esféricas, no elon- :adas formando tetradas o

mes.

Son raras las cade-

las o células aisladas.

-

OTRAS CARACTERISTICAS

Algunas cepas presentan in-

clusiones en forma de

gmu-

laciones internas

o

de apa- riencia de barril,

o

cuerpos hipolares visibles con la

tin-

ción de Gram

o

con azul de de metileno. Acidúncos con un pH óptimo entre 5 . 5 ~ 6.2. Crecimiento entre 2 o

C

y 53

'c,

con una temperatu- ra dptima de entre los 30'C

a ~ O ~ C .

-

Crecimiento entre IO'C y

40'C

con'

un óptimo de 30°C. Su crecimiento

en me-

dio líquido pruduce una caída rápida del pH. No

causan

algún cambio

en

agar sangre.

Temperatura óptima de 20°C a 30'C pero pueden crecer

en un rango de 5-C

a

30-C. Forman CO, y ácido D(-) láctico. No acidifican ni

coa-

gulan la leche.

Crecimiento entre 25OC y 40'C. Usualmente no acidifi-

can

la leche ni la coagulan. No forman gas.

(10)

PRINCIPALES CARACTERISTICAS DE DlFERENCIAClON ENTRE BACTERIAS LACTICAS

. _-__---

! GRUPO

I

FORMA

DE

CELULAS

I

GENERO ~ FERMENTATIVO I

homofermentativo Células esféricas u ovoides

Srreprococcus

spp.

I

I heterofermentativo en pares o cadenas.

I

-

OTRAS CARACTERISTICAS

Algunas especies son em- pleadas como iniciadores de fermentaciones para la producción de alimentos comoelyogurth. Su tem- peratura de crecimiento va-

ria entre los 10 a 40 OC aunque algunos pueden cre- cer mayores y enconcen-

traciones de 6.5 % de NaCl

y

pH= 9.6.

(Sharpe, 1979, Kneg y Holt, 1984)

E

1.2 ANTECEDENTES

1.2.1 Caracterización de bacterias Iácticas.

Las pruebas morfológicas

y

bioqufmicas empleadas para la caracterización de bacterias Iácticas incluyen

c

( S h q e ,

1979, Kneg y Holt, 1984):

K

Caracterización microscópica utilizando la tinción de Gram y otras tinciones especiales. Prueba de la catalasa.

Movilidad.

Patrón de fermentación de carbohidratos.

Tipo de fermentación (homo

o

heterofermentativo).

Determinación de isómeros de lactato formados

a

partir de la fermentación de

ia

glucosa. Formación de diacetilo.

Hidrólisjs de la arginina, esculina, hipurato y almidón. Pruebas serológicas.

Requerimientos nutrkionales.

(11)

i

c

E

E

K

in:

If

I

1

I

I C

I C

IC

IC'

Ir'

1'"

ir

17) producción de poiímeros extracelulares. 13) Coinpornmiento en leche de litmus.

14) Tolerancia a la bilis y altas concentraciones de NaCI 1 j) Configuración del ácido láctico.

16) Estudios whre homología genética, entre oíras.

~a mayoría de estas pruebas pueden ser realizadas convencionalmente en medio M.R.S. (Man et d., 1960) al que se le adicionan los aditivos convenientes de acuerdo a la naturaleza de la prueba; también pueden emplearse sistemas miniaturizados con ingredientes preparados en el laboratorio (Jayne- Williams, 1976)

o

en sistemas disponibles comercialmente como el SISTEMA API 20A (Sherwood

Medical, 1988).

.

El SISTEMA API 20 A está constituido por un kit de 21 pruebas bioquímicas rutinarias para la identificacih de microorganismos anaerobios de los géneros Actinomyces, Bacteroides, Closrridium, Eubucrenum.

iactobacilius,

Peptostreptococcus.

Polphyromonas,

Staphy Iococcus. Streptococcus,

Lclcrococcus,

etc. Junto con la investigación de otras características adicionales @or ejemplo tinción de Gram, morfologfa colonial y microsc6pica, etc.), puede obtenerse una identificaci6n rápida y confiable.

Para lograr esto, API 20-A está formado por 20 microtubos que contienen medio de cultivo con reactivos deshidratados, que son reconstituidos al adicionar una suspención bacteriana. Luego se incuban a 37 'C durante 24 horas en condiciones anaerobias, de modo que, los productos del metabolismo microbiano reaccionen con el contenido.

La

interpretación de los resultados se realiza después de que los sistemas

indicadores

han

sido afectados por los metabolitos producidos.

La

identificación de las bacterias puede entonces obtenerse al comparar todas las características halladas con la literatura,

o

bien, por el uso la

base de datos de API (Profile Index Analytical) (Shemood Medical,

1988).

1.2.2. Trabajos previos de identificación de bacterias lácticas.

Las especies de bacterias Iácticas seleccionadas en este trabajo para su caracterización ya habfan sido objeto de investigaciones previas en este laboratorio.

La

selecci6n de estas cepas estuvo basada en los resultados obtenidos

en

estudios previos efectuados por este grupo de trabajo. Fue enfocada hacia aquellas cepas de bacterias Iácticas que hubieran presentado una alta actividad amilolítica ylo la habilidad para formar compuestos aromáticos cuando se aislaron. Se seleccionaron tres cepas:

a)

La

cepa presumible del género Lanococcus sp. fue aislada en este laboratorio a partir del atole agio kul-chi, elaborado por el grupo étnico Tzotzil de San Cristobal de las Casas, Chiapas. A esta cepa se le

señal6 bajo la clave 27

B.

(12)

(7) Otra cepa fue aislada por e1 alumno de servicio social Amoldo Baca

y

el profesor René Velázquez del Departemenlo de Biotecnología de la UAM-I

a

partir del tesgüino. hehida fermentada de maíz gcrnii;iado, elahorado por el grupo étnico tarahumara del Estado de Chihuahua. Se identificó inicialmente

como

un

hc.fobucil/us

sp. bajo la clave 10 B (Escamilla-Hurtado, 1990).

C ) ~3 cepa de la especie

Lacrobacillus

acidophilus

(Hansen No. 1738), que fue identificada como una

bacteria en forma de bacilo, con crecimiento relativamente lento, Gram-positivo y que carecía de la

enzima catalasa por lo tanto, no era capaz de descomponer el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. Su temperatura óptima se encontró entre 37

a

40 ‘C.

Esta cepa inicialmente present6 una alta actividad amilolítica en placa de almidón y la prueba de Voges-

Proskauer, empleada para detectar la capacidad de producción de diacetilo y acetoína, fue reportada

como negativa, es decir, no fue productora de aromas (Escamilla-Hurtado, 1990). De esta cepa solo

se

(13)

11.- OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

Caracterizar taxonómica y fisiológicamente tres cepas seleccionadas de bacterias lacticas de impomcia para la obtención de aromas a partir de la fermentación de sustratos amiliceos.

2.2. OBJETIVOS PARTICULARES.

a) Identificar y caracterizar una cepa aislada por este grupo de trabajo que fue presuntamente identificada

como

Iacrococcus

sp., y denominada con la clave 27

B,

productora de aromas

y

aisida previamente del atole agrio

kul-chi,

elaborado por el grupo étnico Tzotzil de Chiapas.

b) Identificar

y

caracterizar una cepa denominada como 10 B aislada por este grupo de trabajo a partir del tesgüino, bebida fermentada elaborada por el grupo étnico tarahumara del Estado de Chihuahua.

c) Aplicar a la cepa de

Lacrobacillus

acidophilus,

de la colección Hansen, número de catálogo 1749, ciertas pruebas bioquímicas complementarias que permitan conocer algunas caracterfsticas fisiológicas particulares de interés.

d) Determinar cualitativamente la capacidad amilolítica de las cepas en estudio. -

e) Determinar cualitativamente la capacidad de producción de diacetilo y compuestos de acompaiíamiento de las tres cepas de bacterias Iácticas indicadas.

111. OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS.

(14)

iV.

METODOLOGIA Y ACTIVIDADES REALIZADAS

3.1. REVISION BIBLIOGRAFICA.

F U ~ realizada una revisión directa del Manual de Bergey’s (Krieg y Hod, 1984) y de ariículos específicos

sobre bacterias lácticas en general, así coin0 de las características particulares de los dos generos de bacterias involucradas en este estudio. También se efectuó una revisión en libros y artículos sobre los fundamentos y metodologías de las pruebas fisiol6gicas para la caracterización de

las

cepas, al igual que para las pruebas de determinación cualitativa de la producción de diacetilo y de la actividad amilolítica.

.

3.2 CEPAS EN ESTUDIO.

Las tres cepas de bacterias Iácticas estudiadas fueron:

a) Luczobacillus

acidophilus,

de la colección Hansen con número de catálogo 1748 adquirida por un

proveedor comercial.

b) Cepa presumiblemente del género

Lacrobacilfus

sp. Aislada del tesgüino, elaboradopor el grupo étnico tarahumara de la comunidad de Churo, Municipio de Uzique, Estado de Chihuahua. Previamente ha sido señalada por el grupo de trabajo que la ais16 bajo la clave 10

B.

c) Cepa presumiblemente del género

Lactococcus

sp. Aislada del atole agrio, elaborado por el grupo

étnico Tzotzil de San Cristóbal de

Las

Casas, Chiapas. Previamente ha sido señalada por el grupo de trabajo que la aisló bajo la clave 27

B.

En base

a

los resultados de caracterización de bacterias Iácticas obtenidos de los trabajos anteriormente

realizados en este laboratorio, se selecionaron tres cepas que hubieran presentado una alta capacidad para hidrolizar el almidón (capacidad amilolftica) ylo la habilidad para producir compuestos aromáticos

como

el diacetilo y el acetaldehido.

Desde su aislamiento o adquisición (aproximadamente 5 años), las cepas permanecían conservadas

en

tubos de ensaye

a

una temperatura de 4OC con resiembras trimestrales

en

medio de agar de microinoculación modificado (Cuadro 3), hasta antes de

dar

inicio este estudio.

3.3 PURIFICACI~N DE CEPAS

(15)

las seleccionadas empleando la tLLcnica de siembra por esm’a cruzada en cuatro cuadrantes (Collins.

1989).

se

incubaron a una temperatura de 35-37’C, durante 24 a

48

horas, de manera que se obtuviera

un n1áxim» crccimiento. De las colonias aisladas se observó la morfología colonial

Y

la morfología

microscópica empleando para esto Último la tinción de Gram (Collins, 1989).

resembrarse varias veces las Colonias aisladas en Otras placas de este mismo medio y observar que las características microscópicas y ia morfología colonial permanecían constantes y coincidiendo con las

caracteríszicas de las bacterias lácticas, las cepas purificadas fueron entonces sembradas en tubos de ensaye con agar de microinoculación (Cuadro 3) e incubadas

a

35-C durante 24 a 48 horas. Luego se almacenaron bajo refrigeración hasta antes de realizarse las pruebas de identificación y caracterización.

Otra vez se flamea el asa, se enfría y se sigue el mismo procedimiento para el tercer y cuarto cuadrante con la precaución de evitar el contacto de las últimas em‘as (cuarto sector)

con

el primer cuadrante.

De esta manera se puede ir “diluyendo” el cultivo y obtener colonias totalmente aisladas en el tercer y i 3.4 CARACTERILACIÓN MORFOLÓGICA MACROSCOPICA

Y

MICROSCÓPICA.

Las pruebas aplicadas

a

las tres cepas para esta actividad fueron:

3.4.1. Morfología colonial. Para describir las características coloniales, cada cepa fue sembrada por

hiplicado mediante la técnica de

esm‘a

cruzada en cuatro cuadrantes en placas

con

agar de microinoculación (Cuadro 3) y placas con agar M.R.S. (Cuadro 4).

-

Las condiciones empleadas para la incubación fueron:

Lactobacillus acidophilus. Colección Hansen No. 1748.. .

. . .

...

Durante 24 horas

a

35- C-37O C.

Cepa 27

B.

Atole agrio.

kul-chi.

San Cristobal de las Casas

...

Durante 48 horas

a

30eC. Cepa 10 B. Tesgüino. Chihuahua

...

;..Durante 48 horas a 35aC-37aC.

La temperatura de incubaciún corresponde a la temperatura óptima para su crecimiento de acuerdo al Manual de Bergey‘s (Krieg y Holt, 1984); en el

caso

de la segunda y tercera cepa se utilizó la temperatura de fermentación usual de los alimentos en los cuales son empleados como iniciadores.

(16)

3.4.2. Tinción de Gram. La tincicín de Gram divide a las bacterias según fijen a no al colorante inicial. en Gram ( + ) en Grani ( - ) . Esta división se úehe a las diferencias en la estructura de SU pared celular v

a que 10s Gram ( + ) presentan una estructura multilaminar muy coinpkja, mientras que en las Gram (-).

esta suele ser mucho más delgada.

La

adición de 10s colorantes sobre un frotis del microorganismo fijado a] calor fue la siguiente: sol. de lugol, lavado, decoloración con sol. alcohol-cetona por 10 segundos, lavado y adición de sol. de safranina por 30 scgundos (Collins, 1989).

1 min. sol. de cristal violeta, lavado, 1 min.

3.4.3. Tinción de cápsula.

La

formación de una capa mucosa o cápsula, muchas veces estA determinada por las condiciones del medio.

En

el caso de algunas bacterias Iácticas que forman polímeros extracelulares, lo hacen solo a partir de sacarosa, por eso a l crecer en un medio rico en este disacárido, las coloriias aisladas se verán de mayor tamaiio y con aspecto mucoso debido

a

la síntesis masiva de los polisacáridoc que se depositan alrededor de las células en comparación al crecimiento en presencia con

o r o

azúcar (Stainer, 1990).

La

cápsula puede visualizarse con gran claridad examinando al microscopio ordinario una suspención de células en tinta china

o

nigrosina (Tinción negativa), esparcida sobre un portaobjetos limpio como una capa delgada y secada al aire. Las partículas carbonadas de la

tinta

china no pueden penetrar

a

la cápsula

por io que su entorno se destaca nítidamente (Stainer, 1990).

Para este análisis, las cepas fueron sembradas por triplicado

por

medio de la técnica de estría

en

cuatro cuadrantes

en

placas

con

agar M.R.S. (Cuadro 4) sustituyendo

a

la glucosa por un 5 % de sacarosa. Fueron después incubadas la cepa de Lactobacillus

acidophilus

y cepa 10 B

a

35 OC, mientras que para la

cepa 27 B

se

empled una temperatura de 30'C. El tiempo de incubation varió de manera que se pudieran visualizar colonias aisladas. Posteriormente se aplicó la tinción con

tinta

china. Se comparó l a morfología colonial y microscópica de estas cepas

con

las observadas cuando

se

cultivaron en agar M.R.S, sin ninguna modificación (Cuadro 4).

-

3.4.4 Tinción de

gránulos.

Los

gránulos

y otras inclusiones observadas dentro de las células tienen generalmente la función de almacenar energía (Brock, 1990).

La

visualización de estas estructuras se puede realizar empleando el colorante azul de metileno, preparado según Loffel. Se disuelven 0.30 gramos de azul de metileno en 30 mi. de etanol, se mezclan con 100 mi. de solución de

KOH

al

0.01 %

y

se

tiñe un frotis del microorganismo por 1 minuto (Collins, lY89).

Las

cepas fueron previamente sembradas por duplicado en agar M.R.S. con glucosa (Cuadro 4) y en agar M.R.S. con 5 % de sacarosa, e incubadas a las mismas temperaturas ya indicadas en el punto 3.3.3. Se

(17)

3.5. PRUEBAS FISIOLÓGICAS.

Las pruebas fisiológicas aplicadas fueron:

3.5.1 Crecimiento a distintas temperaturas.

Objetivo. Se realiza para determinar si un mkoorganismo

es

capaz de crecer

a

temperaturas por debajo

o

por encima de la cíptima.

Un

cambio en el color del medio específico para bacterias lácticas ( Caldo

M.R.S. Cuadro 4) de verde a amarillo es producido debido

a

la formación y, acumulación del ácido láctico a partir de la fermentación de la glucosa 10 cual provoca la caída del pH y por lo tanto el viraje

del indicador presente (verde de bromocresol). Para esta prueba se incubaron las cepas de

Lacrobacillus

ucidophilus

y 10 B por triplicado a 15, 30, 35, 40 y 45-C en condiciones de anaerobiosis y aerobiosis mjentras que la cepa de 27 B a 10, 15, 30, 35, 40 y 45 OC (Sharpe, 1979).

Medio. Caldo M.R.S (Cuadro 4)

con

2 ml. de verde de bromocresol al 0.2 % por cada 100 ml. de

medio.

Procedimiento. Se inocularon 3 tubos de ensaye por cada cepa, conteniendo 7 ml. de

medio.

Para la condición aerobia

se

usaron tubos de 16 x 125

mm

con

tapón de algodbn, mientras que para la

condición anaerobia fueron tubos de 13 x 100 mm con taparosca. Se añadieron

a

estos últimos varios mililitros de parafma esteril

a

cada tubo después de ser inoculado, para eliminar el contacto con el aire.

Se incubaron junto con blancos para cada tipo de condición y temperatura durante-un tiempo de

incubación entre las 24

a

48 horas

o

hasta los 7 días, de manera que se presentra un cambio permanente de color (Collins, 1989).

1

3.5.2 Tolerancia a altas concentraciones de NaCI.

Objetivo. Esta prueba se lleva a cabo para determinar la habilidad de un microorganismo para crecer

a

altas concentraciones de NaCI.

Medio. Caldo

M.R.S.

(Cuadro 4) adicionado con 4 % y 6.5 % de NaCI, respectivamente.

Procedimiento. Se inocularon por triplicado

tubos

de ensaye. de 13 x 100. mm con taparosca conteniendo 5 ml. de caldo

M.R.S.

con 4 % y 6.5 % de NaCI, respectivamente. Se incubaron

a

35*C

(18)

3.5.3. Crecimiento a pH=9.2 y pH=9.6.

Objetivo. Sugerida por Krieg y Hod (1984). esta pnieba demuestra la capacidad de un microorganismo

para crecer a un pii alcalino.

Medio. Caldo M.R.S (Cuadro 4) ajustando el pH a valores de 9.2 y 9.6, respectivamente

procedimiento. Se prepararon tubos de ensaye

de

13 x 100 mm con taparosca conteniendo 5 ml. de

caldo M.R.S. y tres matnces con 50 ml. del mismo ai pH normal del medio (pH= 6.5) y se esterilizaron.

El ajuste a pH alcalino fue realizado primero en los matraces, para ello se ajustó el pH del medio con solución de NaOH al 10 % hasta llegar a un pH de 9.2, registrando el volumen utilizado y se continuó la titulación hasta un pH de 9.6, registrando nuevamente la cantidad de NaOH gastada. En base a los

resultados anteriores, se calculó el volumen NaOH necesario para ajustar el pH de los tubos de ensaye, añadiendo la solución de NaOH en condiciones asépticas. Luego se agitaron, se inocularon por triplicado y se incubaron a las misma temperaturas indicadas previamente hasta observar crecimiento.

3.5.4. Motilidad.

Objetivo. Determinar la existencia de organelos de locomoción. -

Medio. Agar M.R.S. semisólido con 4 g. de agar y 0.05 g. de cloruro de 2,3,5 trifenil tetrazolium

por

cada

lo00

mi. de medio.

Principios y metodología. Los principios

y

metodologfa de esta prueba son indicados por Mc Faddin (1980), sin embargo el medio empleado se modificó dadas las exigencias nutncionales de estos

microorganismos, utilizándose agar h4.R.S (Cuadro 4) adicionado con 0.05 gramos de cloruro 2,3,5- trifenil tetrazolium (TTC) por cada litro de medio. También fue disminuida la cantidad de agar-agar (4 gramos por cada

lo00

mi. de medio) para obtener

un

medio semisólido.

El

crecimiento se comparó con el presentado en agar

M.R.S.

(Cuadro 4) con la misma cantidad de agar-agar pero

sin

TTC,

con

el fin de

comprobar la capacidad que pudiesen presentar estos microorganismos para reducir las sales de tetrazolium ,ya que estas al pasar a un estado reducido presentan un color rojo que será observado a lo

largo de la lfnea de punción.

3.5.5 Prueba de Rojo de Metilo.

Objetivo. Determinar cualitativamente la producción de ácido cuando

un

microorganismo fermenta la

glucosa.

(19)

Principios Y metodología. Mc Faddin (1980) indica los principios y metodología para

em

prueba.

E]

medio sugerido. (caldo RM-VP), fue enriquecido como se muestra en el Cuadro 5.

inocularon por mplicado tubos de ensaye de 13 x 100 mm, con taparosca, que contenían 5 ml. del

inedia 5' se incubaron en las mismas temperaturas ya indicadas para cada género, durante 96 horas.

3.5.6 Prveba del citrato.

Objetivo. Se utiliza para comprobar si un microorganismo puede utilizar el citrato como única fuente de

carbono.

Medio. Agar citrato de Simmons (Cuadro 6).

Principios y metodología. Los principios y metodología son indicados

en

Mc Faddin (1980). sin embargo, el medio sugerido (agar Citrato de Simons), fue enriquecido

como

lo

muestra

el Cuadro 6

dadas las exigencias nutricionales de las bacterias Iácticas. Se incubaron en las condiciones ya indicadas, durante 48 horas a 120 horas, hasta observar crecimiento.

3.5.7 Requerimientos nutricionales. -

Objetivo. Se aplicó para observar modificaciones en el desarrollo ai hacer

crecer a

los

microorganismos en

un

medio específico para bacterias Iácticas

pero

limitado en

ciertos

componentes. Por esta prueba no se identificica que cofactor en especial exigían

las

bacterias para

un

desarrollo óptimo, pero al mostrar deficiencia

o

disminución en el crecimiento manifestado como

una

menor

turbidez del medio, di6 indicios de que el microorganismo presentaba exigencias nutricionales complejas, característica del grupo de las bacterias Iácticas.

Procedimiento y medio. Se inocularon por triplicado, tubos de ensaye de 13 x 100 mm

con

taparosca,

conteniendo 5 ml. de caldo M.R.S estéril (Cuadro 4) en tres modalidades: a) Caldo M.R.S. sin modificación alguna. Empleado

como

control.

b) Caldo M.R.S excento de extracto de levadura.

c) Caldo M.R.S sustituyendo las fuentes orgánicas de nitrógeno

por

(",)$O,. Las hientes de nitrógeno orgánico

en

el caldo M.R.S son mostradas en el Cuadro 2.

(20)

3.5.8 Hidrólisis de la arginina.

Objetivo. Se aplica para investigar si las bacterias tienen la capacidad enzimática para descdrhoxilu la

Xgrnina y formar una amina, produciendo alcalinidad en el medio y COZ.

Medio. Caldo M.R.S modificado para prueba de hidrólisis de la arginina (Cuadro 7)

principios y metodología.

Los

principios y metodología se indican en Mc Faddin (1980).

El

medio basal empleado fue caldo

M.R.S.,

modificado de acuerdo a las recomendaciones y precauciones que se especifican en él como se muestra en el Cuadro 7. Los tubos

se

inoculan por triplicado y

se

cubrieron con 3 mililitros de parafiia estéril. Se incubaron a: I

-Cepa 27 B. Atole agrio o

hl-chí.

San Cristobal de las Casas, Chiapas

...

30eC, 48 a 72 horas.

Cepa 10 B.Tesgüino.Chihuahua..

...

.35- C, 48 a 72 horas.

Lactobacillus acidophilus.

Hansen 1748..

...

.35OC, 24 a 48 horas..

3.5.9 Sobrevivencia durante 30 minutos

a

60'C.

-

Objetivo. Esta prueba fue sugerida por Sharpe (1979) como una característica para diferenciar

a

los

estreptococos del

grupo

entérico, quienes a diferencia de otros estreptococos

dan

positivo este examen.

Sin

embargo, fue aplicada para ambos géneros ya que resulta de interés para el proyecto de investigación del cual forma parte este servicio social, investigar esta capacidad.

Procedimiento. Fue necesario

tener

un cultivo puro y reciente del microorganismo, por lo cual las cepas fueron resembradas

en

piacas con agar de microinoculación (Cuadro 3) por estría

cruzada

en

cuatro cuadrantes.

La

cepa 27B fue incubado

a

30'C de 24 a 48 horas y las cepas de

Lactobacillus acidophilus

y cepa

10

B a 35'C de 24 a 48 horas. Después se hizo un frotis de

las

colonias aisladas,

ai

que se le aplicó la tinción de Gram para verificar su pureza. De estos cultivos se inocularon por triplicado tubos de ensaye de 13 x 100

mm

con taparosca, conteniendo 5 mi. de Caldo M.R.S. (Cuadro 4).

Los

tubos

se

introdujeron en un baño a temperatura controlada hasta que el medio contenido en estos alcanuira

una

temperatura de 60°C, durante 30 minutos. Se incubaron posteriormentea la temperatura óptima para cada género hasta observar crecimiento por un tiempo que varió de 48 a 120 horas. .

3.5.10 Desarrollo y actividad en leche tornasolada.

Objetivo. Por este examen se diferencia al microorganismo en base a sus múltiples reacciones

(21)

a) Ferinentacidn de la IactOSa.

h) Reduccih del indicador.

c) Digestión de proteínas. d) Formación de cOiggul0. e) Formación de CO,

Medio. Leche Tornasolada enriquecida para bacterias Iácticas (Cuadro 8).

principios y metodologla.

Los

principios y metodología se indican en Mc Faddin (1980). Se inocularon por triplicado tubos de ensaye de 16 x 125 mm conteniendo 10 ml. de medio de Leche tornasolada enriquecida (Cuadro 8).

3.5.11 Crecimiento

en

4% de bilis.

Objetivo.

La

prueba, sugerida por Sharpe (1979) y Kneg y Holt (1984), fue utilizada para diferenciar presuntivamente

a

los estreptococos del grupo entérico del resto de los estreptococos, quienes pueden crecer en estas condiciones.

Medio. Agar M.R.S. modificado

con

4 % de bilis (Cuadro 9)

-

Procedimiento. Se esterilizaron

a

121’C por 15 minutos tubos de ensaye de 13 x 100 mm con taparosca, conteniendo 5 mi. de agar M.R.S. modificado con 4 % de bilis. Se dejaron enfriar en posición inclinada.

se

inocularon por triplicado y se incubaron

a

309C durante 5 días hasta observar crecimiento. Los tubos se compararon

con

un testigo positivo (Sneprococcusfeucul).

3.5.12 Prueba de la Catalasa.

Objetivo. Investigar l a presencia de la

enzima

catalasa.

Principios y metodología.

Los

principios y metodología de esta prueba

se

encuentran reportados en Mc Faddin (1980). Se observó el comportamiento de los microorganismos para

esta

prueba

en

dos

medios:

a) Agar M.R.S (Cuadro 4). Se analizaron las características morfológicas de las colonias desarrolladas

en

este medio y se tomaron asadas de las colonias aisladas a las que se les aplicó la metodologla indicada por Mc Faddin (1980) para determinar la presencia de la catalasa.

(22)

La solución de

H,O,

h e preparada al 1 '% en agua v / v .

3.6

acompañamiento. Determinación cualitativa de la capacidad de producción de diacetilo y compuestos de

Objetivo: Determinar cualitativamente la capacidad de un rnicrocrganismo de producir diacetilo apartir del metabolismo de la glucosa.

Medio. Caldo R.M.V.P. enriquecido para bacterias Iácticas (ver Cuadro 5).

Principios. Mac Faddin (1980) propone para dicho objetivo la realización de la prueba de Voges- Proskauer. Esta prueba está basada en la detección de acetoína, un producto neutral derivado del metabolismo de la glucosa.

,

-La

glucosa es metabolizada al ácido pinívico el cual tomará parte de la glucólisis. Sin embargo el ácido pinívico

se

puede partir

a

otras muchas vías metabólicas como es aquella en la cual se producen compuestos que recuerdan la nota láctea como es

el

diacetilo el cual proporciona el olor característico a la mantequilla, de ahí la importancia de este

tipo

de metabolismo.

Por medio de esta

ruta

la glucosa

es

metabolizada a ácido pinívico y después

a

acetoha y CQ,.

La

acetoína puede

a

su vez ser metabolizada en dos formas: por reducción

como

2,3 butanodiol y como diacetilo por medio de la oxidación. Se ha comprobado que la acetoína

y

el 2,3 butanodiol

en

presencia de oxígeno atmosférico y en álcali

son

oxidados

a

diacetilo.

La

prceba de Voges-Proskauer propuesta por Mac Faddin se basa en la detección del diacetilo, la forma oxidada de la acetoína por medio de una reacción de color. P z a ello

se

sugiere el empleo de alguno de

los tres reactivos siguiente:

- Reactivo de Barfit. - Reactivo de Coblentz.

-

Reactivo de O'Meara.

En este estudio fue utilizado el reactivo de Coblentz por ser el que más intensifica la reacción de color permitiendo una mejor interpretación de los resultados. Este reactivo está constituido por dos soluciones:

'

I:

- Sol. alcohólica de alfa-naftol al 5 %.

- Sol. de

KOH

al 40 % con 0.3 % de creatinina.

11

-

Procedimiento. Se incubaron por mplicado tubos de ensaye de 13 x 100 mm con taparosca conteniendo

II

I 5 ml. de Caldo RMVP ennquecido (Cuadro 5 ) y se incubaron

a.

(23)

Cepa 27

B..

... .30 'C por 48 horas hasta una semana.

-

Lepa 10

B

... 35 "C por

48

horas hasta una semana.

E

g[:

K.

a;-

E

F

K

1c

Transcurrido este tiempo y en condiciones asépticas St: adicionaron 10s reactivos en el siguiente orden y

!

cantidad:

1 _ - sol. alcohólica de alfa-naftol al 5 %

...

. . I .5 ml.

2.- Sol. de

KOH

al 40 % con 0.3 % de creatinina..

...

0.5 ml.

Se agitó ligeramente el medio después de la adición para exponerlo al oxígeno atmosférico

y

se lleve a

cabo la oxidación de la acetotna. t .

,

El alfa-naftol actúa como un intensificador y estabilizador de la reacción incrementando su sensibilidad I

sin perder la especificidad de la misma.

El segundo reactivo ayuda

a

la absorción del CO, y oxida de la acetoína hasta diacetilo.

El

diacetilo formado

se

condensa entonces

a

un núcleo de yanina presente en la peptona del medio.

El

reactivo de Coblentz incorpora otra fuente adicional de guanina, la creatinina (

KN-C(NH)-N(CH,)-(CK)-COCH)

lo cual intensifica aún más el desarrollo del color en un tiempo más corto.

El

rango de color desarrollado (rojo) depende también de la cantidad de acetoína producida y

se

logra un máximo color

en

una hora. Después de este tiempo no debe de interpretarse los resultados-debido

a

que

el alfa-naftol

y

el

KOH

pueden reaccionar produciendo un compuesto

rojizo.

1

I

I

I

I

3.7 DETERMINACION CUALITATIVA DE LA CAPACIDAD AMILOLITICA

Objetivo. Determinar la capacidad de un microorganismos para hidrolizar el almidón enzimdticamente.

Medio. Agar M.R.S. modificado para la hidrólisis del almidón (ver Cuadro IO).

Principios.

El

almidón es una clase de carbohidrato de alto peso molecular compuesto

a

su vez por una mezcla de dos polisacáridos de la glucosa, la amilopectina y la alfa-amilosa.

I[

La

alfa-amilosa

es

un poiisacárido compuesto por millares de unidades de glucosas unidas

por

medio de

un

enlace 1,4 alfa-glucosídico. Este tipo de enlace proporciona a la amilosa una estructura en forma de espiral lo cual dificulta la formación de puentes de hidrbgeno.

Por

lo tanto los'gnipos

OH

pueden

I[

interactuar fácilmente con otras moléculas como

es

el

caso del iodo

con

quien forma

un

compuesto colorido (ami violeta) (Mac Faddin, 1980).

En

tanto, la amilopectina

es

un polímero más grande que la amilasa compuesto por unidades de glucosa

Ir

unidas bajo enlaces 1,4 y 1,6 ALFA-glucosídicos.

Es

precisamente por la presencia de este Último tipo

"

-

de enlace que puede reaccionar con el almidón dando lugar a un compuesto rojo oscuro (Mac Faddin,

(24)

l.a amilasa e5

la

erizimlt específica que digiere al almidón. Presenta un

pH

óptimo entre 6.9-7.2 perk, puede variar de 5.5 a 6.5 con diferentes sustratos.

su

temperatura óptima es de 50-55 "C aunque ¡;I

reacción parece satisfactoria a los 37 "C. L a hidrólisis dcl almidón por acción de ebta enzima Ocurre

]<)s enlaces alfa-1-4 y alfa-1-6 atacando las cadenas interiores tanto de la amilosa como de la amilopectina para dar lugar a la formación de cadenas cortas de polímeros de glucosa de bajo peso molecular a las que st: les llama dextrinas. También

se

forma el disacárido maltosa. Estas dextrinas pueden tamhien reaccionar con el iodo para

dar

las coloraciones que varían del azul violeta hasta rojo oscuro, sin

embargo, conforme progresa la hidrólisis el color deja de aparecer debido a la formación de

acrodexmnas que no pueden reaccionar ya con el iodo (Mac Faddin, 1980).

Metodología. Se sembraron por mplicado placas con agar M.R.S. modificado para dicha prueba (Cuadro IO) por la técnica de estría cruzada en cuatro cuadrantes,

se

incubaron

a

las mismas temperaturas ya mencionadas para cada especie y por

un

tiempo suficiente hasta observar crecimiento. Este tiempo varió entre las 48 horas hasta los

7

días (Mac Faddin, 1980).

Después de este periodo se verificaron tres parámetros:

a)

Morfología colonial y tinción de gram. Se verificó la correspondencia de las microscópicas y microscópicas

con

las de las bacterias Iácticas.

características

b) Crecimiento en medio de almidón. Se verificaba la presencia de colonias crecidas en a t e medio ya que el hecho de que pudiesen desarrollarse en estas placas no necesariamente significaba que

era

consecuencia de la hidrólisis del almidón sino existía la posibilidad de que metabolizaran otro componente del medio como es la pectona

o

el extracto de !evadura

o

de carne.

c) Hidrdlisis del almidón. Para comprobar que efectivamente el crecimiento era debido

a

la hidrólisis del almidón, cada placa fue expuesta a los vapores de iodo por un tiempo de 1 minuto. Se interpret6

como positiva la prueba si alrededor de la colonia

se

observaba un halo blanco que significaba la presencia de unidades más simples y sencillas de glucosa. Si el medio permanecía completamente de color azul-violeta se tomaba como negativa.

3.8 APLICACION DEL KIT

DE

PRUEBA API-20A

Los principios de este kit ya han sido mencionados anteriormente en este reporte. El Cuadro 1 1 muestra las 21 pruebas que constituyen este kit así como sus principios bioquímicos.

La

metodologfa estuvo basada en las indicaciones del fabricante (Shenvood Medical, 1988) con las siguientes modificaciones:

(25)

Cepa 27

B.

Atole Agrio. San Cristóbal de las Casas..

...

.30 OC, 48 horas.

Cepa 10

B.

Tesb"iIlo. Chihuahua

...

35 OC,

48

horas.

h) Se preparó una solución estandar con una densidad óptica de 0.3 la cual

sirvió

como patrón de

comparación para la obtención de la suspención pura del microorganismo con la turbidez requerida de acuerdo a las indicaciones dei fabricante (no mayor

a

0.3 de densidad óptica).

Para prepararlo se disolvieron 3 grs. de Caldo de Microinoculación en 20 ml. de. agua de manera que el

color de esta solución fuera igual al del medio basal API-20A.

Se tomaron varias asadas en condiciones no asépticas de una cepa inutilizada y se disolvieron es este

caldo hasta obtener una densidad óptica de 0.3.

c)'La inoculacidn

se

hizo conforme

a

las instrucciones del fabricante sin embargo, se inoculó otra tira

solo con medio basal estéril API-20A la cual también fue incubada

a

las

mismas

condiciones para servir como blanco de comparación.

.

d) l a s condiciones de incubación

fueron:

Lactobacillus

acidophilus.

Colección Hansen

No.

1748..

...

.35 OC, 24 horas.

-

Cepa 27

B.

Atole Agrio. San Cnstdbal de las Casas

...

30

OC, 48-horas. Cepa 10

B.

Tesgüino. Chihuahua..

...

.35 OC, 48 horas.

No

se

requirió una cámara de anaerobiosis como lo sugiere el fabricante porque las bacterias Iácticas

se

(26)

,I-

CUADRO 2

CALDO DE MICROINOCULACION. (Manual Difco,1960)

/COMPONENTE

1

gl

lo00

ml de medio

1

I

I

Extracto de levadura

Ipeptona ~

1:

.

Dextrosa

Fosfato monopotásico

Tween 80 0.1 ml

pH= 6.7 0.1 a 25 OC.

CUADRO 3

AGAR DE MICROINOCULACION MODIFICADO PARA BACTERIAS LACTICAS.

(Escamilla-Hurtado y col., 1992)

COMPONENTE

!

Caldo de microinoculaci6n

Biotha

Acido fólico

*Soluci6n de vitaminas y minerales.

pH=6.7 3-0.1 25 OC. AgW-AgW

gl

loo0 mi

del medio.

37.00 15.00 4.0

X

10”

5.0 mi. 8.0

x

10’’

*Una cápsula de Calanda (Laboratorios Atlmtis) y U M

cápsula de Viterra Plus (Laboratorios Pfizer), disueltas

en 40 ml de etanol ai 20 % y

filiar

sobre gasa y algodbn.

(27)

CUADRO 4

CALDO M.R.S (Merck, 1988)

Polipectona Glucosa KaHPO,

Extracto de levadura Biotina

Acido fólico

Sol. de vit. y minerales* Agua destilada

COMPONENTE1 gllO00 ml de

1

medio

medio

7.00 5.00 5.00 2.00 4

x

10”

8

X

10.” 5.00 ml.

io00 ml.

-

Peptona Universal Extracto de carne Extracto de levadura Glucosa (+) D

Fosfato dipotásico Tween 80

Cimto de amonio Acetato de sodio Sulfato de magnesio Sulfato de manganeso

Agua destilada Agar-agar*

pH= 6.5 0.1

a

22

10.00

5 .OO 5.00 20.00 2.00 1 .OO 2.00 5.00

o.

10

0.05

loo0

ml.

15.00

‘C.

*

Solo adicionado para agar M.R.S. CUADRO 5

ib de Nitrógeno orgánico

12.8 7.5 7.5

_____

CALDO RMVP (Merk, 1988) ENRIQUECIDO PARA BACTERIAS LACTICAS

(28)

CUADRO 6

AGAR CITRATO DE SIMMONS (Merk, 1988) ENRIQUECIDO PARA BACTERIAS LACTICAS

.

pH= 6.9

+

0.1 a 25 OC.

(29)

CUADRO 7

CALDO M.R.S. (Merck, 1988) MODIFICADO PARA LA PRUEBA DE HlDROLISlS DE LA ARGININA

1

gl IO00

ml

de medio ~ ~ COMPONENTE

Peptona I 10.00 I

5.00 I

Extracto de carne

Extracto de levadura 5.00

Glucosa 0.50

K,HPO, 2.00

Acetato de sodio 5.00

iSulfato de magnesio

o.

10 Sulfato de manganeso 0.05

Pkidoxal 0.005

Arginina 10.00

I ~

- Púrpura de bromocresol

Biotina 4

x

o.

10 10” Acido fólico

8 X

I O ’ A y a destilada

io00

ml.

pH =

6.5

+-

O.

1 a 25 O C .

CUADRO 8

LECHE TORNASOLADA (Merk, 1988) ENRIQUECIDA PARA BACTERIAS LACTICAS

COMPONENTE gllO00 mi de medio Leche descremada 100.00

deshidratada Indicador tornasol

Acido f6lico

(30)

CUADRO 9

AGAR M.R.S (Merck, 1988) MODIFICADO PARA PRUEBA DE TOLERANCIA EN BILIS

'

! COMPONENTE

1

g/IOOO

ml

de medio

10.00

Extracto de levadura ! 5.00

1 .OO

2.00

.

4

x

IO'

I

pptona Universal 1

Extracto de came 5.00 -

Glucosa

j

20.00

15.00

I

Agar agar

Agua destilada

lo00

ml

pH= 6.5 -

+

0.1 a 25 "C.

(31)

CUADRO 10

Biotina

Acido fólico

Sol. de vit. y minerales*

AGAR M.R.S. (Merck, 1988) MODIFICADO PARA PRUEBA

DE HIDROLISIS DEL ALMIDON.

4

x

10” 8

x

10”

lo00

ml.

1

COMPONENTE

I

gl

loo0

ml

de

medio

Peptona 10.00

Extracto de carne 5.00 ’ .

I

I

Extracto de levadura 5.00

I

Almidón 20.00

(32)

CUADRO 11

PRUEBAS MICROBIOLOGICAS DEL KIT API-20A ( MEDICAL SHERWOOD,

1988)

PRUEBA PRlNCIPIOS BIOQLJIMICOS

FORMACION DEL INDOL El

1

metabolismo del triptofano

da

lugar

a

la formación del indol. El xifeno extrae y concentró

(IND)

al indol formado. el reactivo forma

un

compuestc coloreado (rqjo) con el indol.

HIDROLISIS DE LA UREA

'La

enzima ureasa presente en el microorgankmc

(U=)

libera el amoniaco cuando hidroliza l a

urea,

este

causa por io tanto una elevación del pH y cambic del indicador de un color amarillo a

rojo.

~ R M E N T A C I O N DE L a fermentaci6n del carbohidrato da lugar a la CARBOHI- DRATOS formación del ácido y por conseciuencia la caída

del pH. El indicador púrpura de bromocresol

SLUCOSA (GLU) cambia de púrpura a amarillo. MANITOL (MAN)

LACTOSA (LAC) SACAROSA (SAC) MALTOSA (MAL)

SALICINA (SAL) YILOSA (XIL)

9RABINOSA (ARA) 3LICEROL (GLY)

IELOBIOSA (CEL) MANOSA WNE) MELEZITOSA (MLZ) UFINOSA

(RAF)

SORBITOL (SOR)

ZHAMNOSA (FSIA) REH HA LOSA (TRE)

3ELATINA

iIDROLISIS DE LA ZSCULINA

3ATALASA I

~ I D R O L I S ~ S DE LA

(33)

IV.

RESULTADOS Y

DISCUSIONES.

LOS resultados de las pruebas morfolúgicas se encuentran resumidos en el Cuadro 12

~ o & s las cepas presentaron las características propias más comunes del &nip0 de bacterias lácticas, esto

es, fueron bacterias Gram-positivas en forma de bacilos (Lactobacillus acidophilus) o cocobacilos (Cepa 10 B y Cepa 27

B)

dispuestos en pares y cadenas, no esporulados, carentes de apéndices de locomoción (como flagelos o cilios), catalasa negativa y capaces de fermentar los azúcares en presencia

o

ausencia de oxígeno.

JJ forma de las células coincidió con lo reportado en el estudio anterior (Escamilla- Hurtado, 1990) en el

caso de Lactobacillus acidophilus pero para las otras dos cepas se observaron formas de cocobacilos. Estas formas, sin embargo, son comunes dentro de los géneros Lanobacillus y Sfreprococcus y son

influenciadas por las condiciones del medio a lo largo de sus resiembras,

por

su edad

o

bien

por

una capacidad de pleomorfismo.

La morfología colonial también fue característica de las bacterias Iácticas, es decir, colonias circulares, blancas, de borde entero, lisas, brillantes, convexas

y

pequeiias, observándose un mayor tamaño en las colonias de Lacrobacullis acidophilus en comparación de con las cepas 10

B

y 27 B cuando crecieron en

placas con agar M.R.S (con

o

sin

modificación).

Bajo las condiciones en las cuales se cultivaron

las

cepas no se observa la formación de

gránulos.

Los resultados de crecimiento en funcidn de las condiciones ambientales

y

pruebas fisiológicas se muestran en el cuadro 13.

Para Lacrobmillus acidophiius el tiempo en que

se

observaba el máximo desarrollo de sus colonias, fue

mris corto para Lactobacillus acidophilus que para

las

dos cepas restantes. Lactobacillus acidophilus a 35

O C y en medio

M.R.S.

se desarrolló en un tiempo

máximo

de 24

horas

mientras que las cepas 27 B y 10 B presentaron su máximo desarrollo hasta las 48 horas en estas mismas condiciones.

No se observó alguna diferencia de crecimiento (velocidad

o

turbidez máxima) entre las diferentes temperaturas a las cuales crecieron las cepas.

La

temperatura óptima para el crecimiento osciló entre los 30

y

35 O C

e

incluso fueron capaces de desarollarse a los 40 y 45 O C , sin apreciarse alguna disminución o modificación de la velocidad de crecimiento.

(34)

F-

!'I

LL

3"

1'1

Y,

Ninguna de las cepas fue capaz de producir polisacándos extracelulares a partir de la sacaroca como se ?" apreció por la apariencia de las colonias ya que esta permaneció igual que en el cultivo de agar M.R.s.

IiI

a- ci)n :Iucosa, con la excepción de que fueron más pequeñas las colonias para la cepa 27 B y 10 B.

Tarnhien esto se verificó en el microscopio a través de la tinción negativa pues no fue observada ninguna

11-

Zona desacada alrededor de

las

células. De hecho, SU desarrollo en el medio con sacarosa fue mucho más

~

lento que en medio con glucosa, esto fue, 48 horas para

Lactobacillus acidophilus

y de

7

dfas para las

'- otras dos cepas. Esto puede explicarse por una débil capacidad para fermentar la sacarosa, por lo que las

-

colonias resultan ser más pequeñas en el caso de las cepas 27 B y 10

B.

Para

Lactobacillus acidophilus,

los resultados de API indican que puede fermentar la sacarosa, por eso fue el microorganismo que más

11

I

[

rapihmente creci6 pero es incapaz de producir polisacáridos

a

partir de este compuesto.

I

[

Como ya fue reportado, las bacterias lácticas son microorganismos que presentan exigencias nutricionales

complejas, de ahí la necesidad de que su cultivo se realice

en

un medio bastante rico. Esto quedó demostrado a través de la prueba de requerimientos nutricionales ya que las tres cepas disminuyeron sensiolemente su crecimiento en el medio M.R.S. sin extracto de levadura. Este aditivo es UM rica fuente

de nitrógeno orgánico y otros factores de crecimiento, lo que significa que aunque en el medio M.R.S.

sin levadura existtan otras dos fuentes de nitrógeno orgánico ( peptona y el extracto de came), estos

microorganismos exigen de cierta cantidad de factores de crecimento para un óptimo desarrollo. Pero sus necesidades nutricionales no solo se limitan a que exista una fuente de nitrógeno, sino que forzosamente

csta deberá de ser de origen orgánico, porque son incapaces de utilizar

otro

tipo de compuestos

(como

el sulfato de amonio); por eso no existió crecimiento en caldo M.R.S. con (NH,XSO,, como

única

fuente

Las tres cepas presentaron un metabolismo homofennentativo porque no se produjo CO, al fermentar los

azúcares. Aunque si existió diferencia en cuanto

a

la cantidad de ácido láctico producido ya que por la prueba de Rojo de Metilo se encontró que

Lactobacillus acidophilus

produjo una mayor acidificación del medio RMVP, produciéndose el vire de amarillo a rojo. Las cepas 27 B y 10

B

produjeron una acidificación más ligera, y un vire de amarillo a naranja.

Las

bacterias mostraron una capacidad proteolttica muy ligera en leche tornasolada, siendo mayor para

icrtobaciilus acidophilus.

En este mismo medio se encontró que solo

Lmtobacillus acidophilus

pudo fermentar a la lactosa débilmente aunque en API se observó una fermentación más fuerte de este

I[

compuesto mientras de la cepa 27 B no la pudo

utilizar

en

la leche tornasolada pero s í muy débilmente en API. Esto pudo deberse a las diferencias que existen entre los medios. Asf mismo, las cepas 27 B y IO

B

redujeron débilmente al tornasol, mientras que

hctobaczhs acidophilus

lo hizo

con

mayor

I C

intensidad.

I C

Las

tres cepas toleraron la condición de 4 % de NaCl pero no lograron crecer a condiciones más estresantes como 6.5 7% de NaCI, 4 % de bilis, pH = 9.2 o pH = 9.6. Esto permitió descartar la

posibilidad de que las cepas 27 B y 10

B

pertenecieran al grupo de estreptococos entéricos, quienes

Figure

CUADRO  4  CALDO M.R.S  (Merck,  1988)  Polipectona  Glucosa  KaHPO,  Extracto de levadura  Biotina  Acido fólico

CUADRO 4

CALDO M.R.S (Merck, 1988) Polipectona Glucosa KaHPO, Extracto de levadura Biotina Acido fólico p.27

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