PROYECTO TERMINAL DE LA~ICENCIATURA

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(1)

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abierta

aliiernpo

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METRLPOLITANA

Unidad Iztapalapa

DEPARTAMENTO DE QU~MICA

'DMSIÓN DE CIENCIAS BÁSICAS E INGENIE&

/

Estudio de Desnaturalización de

quimopapaína

por

medio de fluorescencia

PROYECTO TERMINAL DE LA~ICENCIATURA

EN QUIMICA

PRESENTA

'JOSE ARELLANO COBIAN

(2)

Este trabajo se realizó,

bajo la dirección de la Dra. Silvia Solís

Mendiola, en el &ea de Biofisicoquímica, Departamento de

(3)

1. INTRODUCCION 1.1 Estructura Nativa 1.2 Desnaturalización

1.3 Dicroísmo circular 1.4 Fluorescencia

1.5 Estabilidad de proteínas y la radiación UV 1.6 Quimopapaína

1.7 Objetivo

2. METODOS EXPERIMENTALES 2.1 Materiales

2.2 Dicroísmo circular

2.3 Emisión de fluorescencia

3. RESULTADOS Y CONCLUSIONES

3.1 Constantes de velocidad 3.2 Fotooxidación

3.3 Conclusiones

(4)

1. INTRODUCCION

1 .l Estructura nativa

La función biológica de una proteína está determinada por su

estructura, en la cual se definen cuatro niveles o tipos de organización: primaria. secundaria, terciaria y cuaternaria.

La estructura primaria

se

refiere

a

la secuencia de aminoácidos en la cadena polipeptídica. Puesto que el número de aminoácidos diferentes que

pueden aparecer en dicha cadena es de 20, el número de posibles

combinaciones en una secuencia lineal es extremadamente elevado. Estos

aminoácidos tienen en su cadena lateral diversos grupos funcionales, que

pueden diferir en su carácter aromático o alifático, así como en su carga eléctrica, volumen y polaridad (Lehninger et ai., 1993; Bohinski, 1978).

La estructura secundaria consiste en conformaciones regulares y

repetitivas de aminoácidos en distintas secciones de la cadena, en donde los ángulos diedros de la cadena principal tienen valores bien determinados. Los enlaces de hidrógeno entre los átomos de los grupos

amida y de los grupos laterales pueden hacer que la cadena de

aminoácidos se pliegue en el espacio y adopte configuraciones estables. Las estructuras secundarias más comunes son las hélices a y las hojas

p.

En la primera de éstas, la cadena se enrolla en sentido dextrógiro y los

grupos laterales se colocan en el exterior de la hélice. En la segunda, la

cadena de aminoácidos adopta una conformación en zig-zag, debido a los

puentes de hidrógeno que se establecen entre secciones distintas de la

cadena principal. Si bien son posibles otros tipos de estructura secundarias

(como los giros), las dos mencionadas anteriormente son las más comunes,

ya que, por una parte, son estabilizadas por puentes de hidrógeno y por

(5)

La estructura terciaria se refiere a la manera en que la cadena

polipeptídica se pliega en el espacio tridimensional, acomodando las

estructura secundarias y las secuencias aleatorias que las unen en una

configuración estrechamente plegada y, en el caso de las proteínas

globulares, compacta. La mayoría de los residuos hidrofóbicos se orientan hacia el interior de la proteína y la mayoría de los polares hacia el exterior, es decir, hacia el solvente acuoso La estructura cuaternaria se refiere al modo en que se ubican en el espacio la cadenas polipeptídicas de las proteínas que constan de más de una cadena entre dichas cadenas puede

no haber enlaces covalentes. Las estructuras terciaria y cuaternaria se

estabilizan por enlaces químicos, fundamentalmente de naturaleza no

covalente.

Las proteínas tienden a adoptar, bajo ciertas condiciones, una

estructura específica singular, llamada estructura nativa, aunque, en

principio, sea posible un número muy elevado de configuraciones

tridimensionales para una secuencia determinada de aminoácidos. La

información codificada en dicha secuencia y en las condiciones del solvente son suficientes para dirigir el plegamiento de la cadena polipeptídica

(Jaenicke, 1993).

Hasta la fecha no se ha comprendido a un nivel molecular la relación precisa entre secuencia y estructura tridimensional. Se sabe, sin embargo,

que el proceso de plegamiento debe estar unívocamente definido, pues sólo

un sistema con una conformación tridimensional claramente definida -y, a la

vez, flexible- la estructura nativa, puede desempeñar funciones tan

delicadas y específicas como las de las proteínas (Schmid, 1992).

El estudio de las interacciones intramoleculares puede conducir a la comprensión de la estructura de la proteína y de la forma en que los

componentes

de

un polipéptido se ensamblan en la proteína nativa. Este

último sistema ha sido definido como el estado de energía libre mínima (esto

(6)

que los estados desplegado y nativo existen en equilibrio termodinámico

dentro de la transición de desdoblamiento, este estado nativo

es

el mismo que se encuentra en condiciones fisiológicas, como temperatura cercana a

la ambiente, pH neutro y ausencia de agentes desestabilizantes. Por otra

parte, se ha argumentado que, desde un punto de vista biológico, es

importante alcanzar la estructura nativa en un tiempo relativamente corto.

Ambos puntos de vista pueden ser conciliadas si se toma en cuenta la posibilidad de que haya procesos de plegamiento ordenados que, por una

sucesión de estados intermedios específicos, conduzcan a la formación

rápida del estado nativo termodinámicamente más favorecido. De acuerdo

con lo que se ha llamado "principio de consistencia cinética" (Go, 1983), las

rutas de plegamiento favorecidas cinéticamente conducen al estado de

energía libre mínima. Estos procesos ordenados garantizan la formación rápida de la estructura nativa y provocan la aparición de barreras

energéticas más grandes para los procesos que llevan a estructuras no

funcionales que para los que llevan a la estructura nativa (Schmid, 1992).

1.2 Desnaturalización

Se da el nombre de desnaturalizaci6n al proceso por el cual la proteína pierde sus estructuras cuaternaria, terciaria y secundaria y se

transforma en una distribución de conformaciones aleatorias de

aminoácidos. La secuencia primaria permanece inalterada. Sin embargo,

las propiedades físicas y químicas cambian y, en particular, se pierden las

propiedades enzimáticas. Una consecuencia de la desnaturalización es la

disminución en la solubilidad de la molécula, pues los grupos hidrofóbicos

ubicados en el interior quedan expuestos al solvente acuoso. La

disminución en la solubilidad puede facilitar la interacción entre grupos no

polares de diferentes cadenas conformadas

al

azar, lo que puede provocar,

(7)

El proceso de desnaturalización de una proteína puede ser

desencadenado por un cambio en las condiciones del entorno de la

molécula, como un aumento en la temperatura, un aumento o disminución del valor del pH o la presencia de algún agente desnaturalizante (como urea o clorhidrato de guanidina) (Privalov, 1979; Timasheff, 1993). Se tiene

evidencia de que el grado de desdoblamiento que puede alcanzar una proteína es independiente, desde un punto de vista termodinámico, del

método de desnaturalización (Privalov, 1979). Una proteína en condiciones

de disolución extremas no necesariamente estará completamente desplegada, es decir, desprovista de cualquier estructura residual ni será capaz de comportarse como una cadena aleatoria. Tampoco se tendrán

necesariamente formas similares al final de procesos de desnaturalización

diferentes, pues la naturaleza heteroghnea de las secuencias de

polipéptidos hará que, bajo condiciones de desnaturalización semejantes,

los segmentos se comporten como si estuvieran en solventes distintos. Sin embargo, no es sencillo decidir cuán cerca de la cadena aleatoria se halla la conformación desplegada obtenida. En consecuencia,

es

necesario

suponer, al menos inicialmente, que el proceso de desnaturalización

idealizado no es sino la transición

a

un estado desplegado con estructura

próxima

a

la de la cadena aleatoria (Privalov, 1979).

Los estudios sobre el desplegamiento de las proteínas pueden permitir

obtener información acerca de los mecanismos de plegamiento. En general,

bajo condiciones de plegamiento, las proteínas desnaturalizadas llegan

rápidamente al replegamiento completo pasando por una serie de equilibrios

entre conformaciones intermedias (Creighton, 1988). La velocidad de

reacción de desnaturalización cambia uniformemente con el cambio de las

condiciones ambientales; por el contrario, como la naturaleza del estado

desplegado difiere de acuerdo con las condiciones de desnaturalización

(8)

no uniforme. En consecuencia, es más sencillo analizar la cinética del

desplegamiento (Fersht et al., 1990).

Se ha comprobado que, para proteínas pequeñas de un solo dominio y

con masas moleculares inferiores a 35,000 Da, la desnaturalización es un

proceso completamente reversible, de modo que, en principio, es posible

aplicar la termodinámica de

los

sistemas en equilibrio al estudio de la

desnaturalización a través de la determinación de

los

cambios de entalpía,

energía libre, entropía y capacidad calorífica (Labhardt, 1982; Sturtevant,

1987). Con este enfoque del problema se ha encontrado que la

desnaturalización de las proteínas es un proceso altamente cooperativo,

que involucro a toda la macromolécula y que está acompañado por un

enorme incremento en la entalpía y en la entropía (Privalov, 1979; Ptitsyn,

1994). La estabilidad de la proteína se define como

el

trabajo requerido

para

el

rompimiento cooperativo de toda la estructura de la molécula. Para una proteína en solución, este trabajo corresponde a la diferencia de

energía libre de Gibbs entre los estados nativo y desnaturalizado (Privalov,

1979).

Para proteínas mayores o de varios dominios, con una masa molecular

superior

a

los

35,000 Da,

el

proceso de desnaturalización

es

más complejo,

ya que puede haber especies intermediarias estables (Hernández-Arana y

Soriano-Garcia, 1988). Hay proteínas multidominio cuyo desplegamiento es

reversible (Dill, 1990). Sin embargo, el desplegamiento suele ser

irreversible, es decir, la molécula no recupera totalmente su estructura ni

sus propiedades nativas al volver a someterla a las condiciones iniciales: un

ejemplo de este comportamiento se encuentra en la termolisina (Sánchez-

Ruiz et ai, 1988). Se ha sugerido que la desnaturalización irreversible

puede ajustarse a dos modelos de primer orden distintos: el de dos estados

(9)

1.3 Dicroísmo circular (DC)

El dicroísmo circular (DC), es un método espectroscópico que mide la

actividad óptica de moléculas asimétricas en solución (las proteínas son

estructuras asimétricas). Las proteínas en DC presentan señales en dos regiones espectrales: el UV-lejano (170-250 nm) donde podemos encontrar

predominantemente la contribución de los enlaces peptídicos; y el UV

cercano (250-300 nm) donde se muestran bandas ocasionadas

principalmente por la presencia de aminoácidos aromáticos.

En esta técnica, es generalmente aceptado que los espectros de DC de una proteína son un reflejo directo de su estructura secundaria

(Hennessey and Johnson 1981), por lo que se utiliza ampliamente para

monitorear la transición cinética desde un estado nativo a un estado

desnaturalizado, ya que las diferencias estructurales en DC entre ambos

estados son muy notables (Creighton 1989).

Esta técnica se utilizó en un trabajo de Solis-Mendiola y

colaboradores [Q], en donde encontraron evidencias experimentales

suficientes, que determinaron que la desnaturalización térmica de la

quimopapaína implica un proceso irreversible y que además sigue un

mecanismo de dos estados N -z D. Este paso se lleva a cabo bajo una cinética de primer orden, donde la rapidez de la reacción -en este caso la

desnaturalización de la proteína- es directamente proporcional a una sola

(10)

1.4 Fluorescencia

Es conveniente probar otra técnica alternativa, aparte de dicroísmo circular que nos permita verificar el mecanismo de desnaturalización térmica

de la quimopapaína.

La fluorescencia es una técnica muy sensible a los cambios que

suceden

en

la conformación estructural de las proteínas, teniendo como

ventaja que permite trabajar a concentraciones de muestra muy bajas. De

esta técnica, se obtiene información acerca de parámetros termodinámicos y

cinéticos relacionados con el proceso de plegamiento y desplegamiento de las proteínas y está directamente relacionada con la población de

macroestados en una transición de desplegamiento (Eftink 1994)

Las señales de fluorescencia de las proteínas están determinadas principalmente por la presencia de los aminoácidos aromáticos, como son:

el triptófano, la tirosina y la fenilalanina, por lo que las transiciones de

desplegamiento/plegamiento que son inducidas por agentes químicos, por temperatura y pH, se ven reflejadas en el tipo de señales que dichos

aminoácidos muestran. Por otro lado, es importante tener muy en cuenta

que la señal de fluorescencia es dominada predominantemente por la

presencia del triptófano (Creighton 1989).

Las propiedades de fluorescencia de los residuos de triptófano son

particularmente sensibles a las perturbaciones estructurales de las

proteínas, lo que además resulta ventajoso, ya que a menudo hay pocos residuos de este aminoácido en las proteínas.

Dependiendo de la longitud de onda de la excitación, podemos

evaluar solo a uno de los tres aminoácidos, por ejemplo para observar solo

fluorescencia del triptófano, la excitación debe ser a 295 nm (Creighton

(11)

1.5 Estabilidad de proteínas y ia radiación UV.

La exposición de las proteínas a la radiación ionizante y no ionizante

(como la radiación

UV)

causa efectos directos en la inactivación de las

proteínas (Methods in Molecular Biology 1995). De acuerdo con varios

trabajos experimentales, se observó que el triptófano tiene un importante

papel en la inactivación de las enzimas por radiación UV, lo que ha llevado

a generalizar que

los

aminoácidos aromáticos son sensibles a la fotólisis en

la mayoría de las proteínas (Sellers,

R.

y Giron 1973). La fotosensibilidad

del triptófano, es determinada más por la naturaleza del aminoácido

adyacente, por su entorno local, así como si esta expuesto o no a un medio acuoso.

Sellers y colaboradores (Sellers,

R.

y Giron 1973), mencionan que a 295 nm aproximadamente el 97 % de la luz absorbida por la P-tripsina (la proteína

con la cual ellos trabajaron), realmente es absorbida por

los

residuos de

triptófano; y que generalmente hay una pérdida de la actividad así como un

aumento en la fotodegradación de

los

triptófanos presentes en la enzima.

Se ve entonces que una buena parte de

los

cambios observados en

absorción y en el espectro de fluorescencia de emisión deben ser atribuidos

a la fotólisis del triptófano, es decir, a la degradación del mismo y/o a la

formación de fotoproductos del triptófano (Pigault 1984), como la N- forinilquinurenina (NFK), el principal fotoproducto en disoluciones acuosas y

en condiciones aeróbicas (Tassin y Birkman 1980). En condiciones de

anaerobiosis el grado de aparición de fotoproductos disminuye.

En revisiones posteriores, se ha comprobado que el indol presente

en la estructura del triptófano, es un fluoróforo cuya fluorescencia, es

altamente sensible al ambiente, haciendo de esto una excelente elección

para reportar los cambios conformacionales en proteínas e interacciones

(12)

Por otro lado, Creed [15] reporta que en presencia de oxígeno, la

irradiación del dipeptido Gly-Trp y Trp-Gly produce N-tormilquinurenina y

quinurenina, mientras que con Trp-Gly y con el triptófano en N-terminal hay

mas resistencia a la oxidación.

De la observación de la secuencia de aminoácidos, podemos ver que hay 4

triptófanos (W). Sus respectivos aminoácidos adyacentes se encuentran

ubicados de la siguiente manera (figura 1.4):

.aminoácidos posición

DWR 6-8

CWA 25-27

GWE 66-68

SWG 180-182

NWG 184-186

Fig. 1.4 Posición de los triptófanos en la secuencia de

aminoácidos

De acuerdo con el trabajo de Tassin y Borkman [131, para una glicina

adyacente antes de un triptófano, no se observará fluorescencia

significativa debido a la degradación del triptófano. Resulto, distinto en el

modelo Trp-Gly, en donde se observó, un incremento en la intensidad de

la fluorescencia después de una irradiación, concretamente se manifiesta

una banda para a aproximadamente 440 nm cuando había una excitación

a 360 nm, lo cual además se debe a la aparición de fotoproductos como

(13)

1.6 Quimopapaína

La familia de enzimas denominadas proteasas sulfhidrílicas vegetales

(PSV) tiene una actividad proteolítica que depende del grupo tiol de un

residuo de cisteína de su secuencia de aminoácidos. La familia de las

proteasas sulfhidrílicas también incluye enzimas análogas que se

encuentran en animales (las catepsínas) y algunos microorganismos

(Kamphuis et ab, 1985a; Moore, 1969). Las PSV pueden obtenerse del

látex, endocarpio y zumo, o bien del tallo, las hojas o las raíces de una gran variedad de plantas. Por ejemplo, en el endocarpio de la piña (Ananas

comosus) y del kiwi (Actinidia chinenis) se encuentran la bromelaína

(Takahashi et ab, 1973) y la actinidina (Carne y Moore, 1978),

respectivamente, y de las hojas de la cebada (Hordeum vulgare) se puede

obtener la aleuraína (Holwerda y Rogers, 1992).

La quimopapaína, la papaína y la caricaína se extraen del látex de

papaya (Carica apava) (Baker y Drenth, 1987). Si bien se obtienen de una

misma fuente vegetal, son tipos particulares de proteínas que pueden ser

identificados tanto por su secuencia de aminoácidos como por sus

propiedades fisicoquímicas. Tienen una elevada homología en sus

secuencias de aminobidos; al comparar pares de proteínas se encuentra

que el porcentaje de residuos idénticos va del 40 al 90 % (Padilla-Zúñiga, 1993).

La quimopapaína es una de las PSV más ampliamente estudiadas. Su

secuencia de aminoácidos ha sido completamente determinada (Watson et

ai., 1990); se sabe que consta de 218 residuos, con una masa molecular de 24,000 Da (Solís-Mendiola et ai., 1989) y un punto isoeléctrico entre 10.1 y

10.6 (Brocklehurst et ab, 1981). La proteína consta de 68 grupos

(14)

1 10 20 30

Y P Q S I D W R A K G A V T P V K N Q G A C G S C W A F S T I

A T V

40 50 60

E G I N K I V T G N L L E L S E Q E L V D C D K H S Y G C K G

G Y Q T 7 0 80 90

1

O0

T S L Q Y V A N N G V H T S K V Y P Y Q A K Q Y K C R A T D K

P G P

K V K I T G Y K R V P S N C E T S F L G A L A N Q P L S V L V E

A G

G K P F Q L Y K S G V F D G P C G T K L D H A V T A V G Y G T

S

170 180 190

200

D G K N Y I I I K N S W G P N W G E K G Y M R L K R Q S G N S

Q G T

C G V Y K S S Y Y P F K G F A

110 120 130

140 150 160

210 218

FIGURA 1 . 1 Secuencia de aminoácidos de la quimopapaína (Watson et

al.,

(15)

Tipo de residuo

Tyr: N-ter (+)

Ala: C-ter

Arg (+)

LYS

(+I

His (+)

ASP

(-1

GIU (-)

CYS (-1

TYr

(4

Número de residuos

1 1 5 21 3 7 7 8 75 PK,

9.1 1

2.34 12.48 10.79 6.00 3.65 4.25 8.35 10.13

TABLA

1.

1 Residuos protonables de

la

quimopapaína. Se indica el valor

de pKa para residuos aislados en agua.

También se tiene información acerca de la actividad catalítica de la

quimopapaína (Buttle y Barret, 1984),

su

topografía (Watson

et

al., 1990; Dubois et

a/., 1988; Carey et a/., 1983), reactividad (Enzyme Handbook, 1991), contenido de

estructura secundaria (Solís-Mendiola et ai., 1992) y estabilidad termodinámica

(Solís-Mendiola et

ai,

1993).

Se ha determinado por difracción de rayos X la estructura tridimensional de tres

PSV: papaína (Kamphuis

et

aL, 1985b), actinidina (Baker, 1980) y caricaína (Pickersgill et a/., 1991). De la estructura de estas tres proteínas es posible deducir

algunas características estructurales comunes, probablemente comparadas por

otras PSV, entre ellas la quimopapaína. Se sabe que constan de dos dominios estructurales de aproximadamente 100 residuos cada uno, es decir, unos 200 por

cadena polipeptídica. El sitio catalítico, que se localiza en la hendidura

interdominio, está formado por tres aminoácidos: cisteína del primer dominio, e

(16)

interacciona fuertemente con el imidazol de la histidina, que a su vez se relaciona

con el carbonilo de la cadena lateral de la asparagina (Padilla-Zúñiga, 1993).

1.7 Objetivos

Un objetivo de este trabajo consiste en determinar, por medio de estudios de cinética de desnaturalización de la quimopapaína a diversas temperaturas, los

valores de la entropía y la entalpía de activación por la técnica de fluorescencia,

observar su posible variación con los valores obtenidos por dicroísmo circular.

de la fotooxidación en la desnaturalización térmica de la quimopapaína.

(17)

2.

MÉTODOS

EXPERIMENTALES

2.1 Materiales

Se utilizó quimopapaína parcialmente purificada (Sigma Chemical Co., St. Louis,

Missouri, U.S.A.). Se aisló la forma molecular más abundante (SolísMendiola, 1994)

por cromatografía líquida de intercambio catiónico de alta resolución, de acuerdo con

la metodología reportada por diversos autores (Solís-Mendiola et al., 1992). Con el

fin de impedir la autólisis durante los experimentos de desdoblamiento,

el

sitio activo

fue inhibido irreversiblemente con iodoacetamida (Solfs-Mendiola et a/., 1989).

Todos los demás reactivos fueron de grado analítico. La concentración de la proteína

fue determinada por medio del coeficiente de absorción de luz ultravioleta a 280 nm

(o coeficiente de extinción, A'%lcm,-=l 8.3) (Robinson, 1975; Polgár, 198 I).

2.2

Dicroismo circular

Se utilizó un espectropolarímetro JASCO J-500A con celdas de 1 mm y de 1 cm de trayectoria óptica, con chaqueta de circulación de agua conectada a un baño

térmico HAAKE NK-22. La temperatura se registró directamente en la celda óptica

con un termómetro digital COLE-PARMER 8402-20.

Se efectuaron estudios de cinética a diversas temperaturas y a un pH de 2.2. Se colocaron en la celda óptica 2 ml de un regulador de glicina 0.05 M con un valor de pH de 2.2. Se repitió el procedimiento mencionado anteriormente, inyectando 0.2 ml de una solución concentrada de quimopapaína (entre 1.35 y 1.60 mgimi) en el

mismo regulador y se observó la variación de la señal de dicroísmo circular a 220 nm.

2.3 Emisión de fluorescencia

Las determinaciones cinéticac de fluorescencia fueron hechas en un

(18)

concentración espectrofotométricamente. Antes de trabajar se puso en una celda de

trayectoria óptica de un 1 cm, 2000 pl de la misma disolución reguladora con la

finalidad de que se alcanzara el equilibrio térmico a la temperatura elegida, para

luego añadir 200 pI de una disolución de quimopapaína nativa con una concentración de 303 @mi y así obtener una Concentración final en la celda de 16 @mi.

La temperatura fue controlada con un baño de agua Fisher Scientific modelo

90, desde donde circulaba el agua por un sistema de enchaquetado hacia la celda,

obteniéndose una desviación de las lecturas de la temperatura de f

0.65°C. Se

observó en esta técnica, un tiempo muerto de mezclado de 25 segundos, teniendo

una anchura de banda de 16 nm en la excitación y de 4 nm para la emisión. Las

cinéticas de la desnaturalización térmica de la proteína, se realizaron a una longitud

de onda de emisión de 340 nm y 280 nm para la excitación (la

.

,

h

de la proteína

nativa es de 340 nm). En todos los casos se obtuvieron curvas de intensidad relativa

contra tiempo. Después de que las cinéticas concluyeron se obtuvo el espectro de la

muestra desnaturalizada para luego ser enfriada hasta temperatura ambiente y sacar

(19)

-

3. RESULTADOS Y CONCLUSIONES

3.1 Consiantes de velocidad

Las curvas de las cinéticas observadas por monitoreo de la elipticidad

a

220

mn, siguieron un patrón monoexponencial para todas las temperaturas

experimentales, lo cual confirma que por este método, se detecta un modelo de

desdoblamiento de

dos

estados:

N

+

O,

el cual fue analizado con la ecuación (3.1.9)

para calcular mediante una propiedad física que varia con la temperatura a cierto tiempo, las constantes de velocidad.

la quimopapaína en una fase a diferentes temperaturas, monitoreadas por DC:

A la longitud de onda de 280 nm, las constantes de velocidad son

esencialmente idénticas, estos resultados sugieren que no hay intermediarios presentes en la desnaturalización térmica seguida por DC, además el valor de estas constantes determinadas experimentalmente, representan una medida de un

desplegamiento global (Solís-Mendiola, et. a/. 1998).

(20)

DATOS DE QUIMOPAPAINA A pH 2.2 GLlClNA 0.05 M

Tabla

2

Valores de las constantes de velocidad para el desplegamiento de quimopapaína por monitoreo de la elipticidad a 220 nm.

Valores de las constantes de velocidad para el desplegamiento de quimopapaína monitoreado por fluorescencia

(21)

Usando el valor de las constantes de velocidad calculadas

a

partir de los

estudios d dicroísmo circular, hacemos ajustes lineales utilizando la ecuación de

Eyring (para conocer el AH de activación a partir de la pendiente y

AS

de activación mediante la ordenada al origen. La ecuación de Arrhenius para calcular la energía de activación (Solís-Mendiola,

et

ai 1998). Resultando de esto excelentes ajustes para todas las temperaturas. Los ajustes y las gráficas fueron hechas con el

programa Origin 4. 1 (Datos tesis).

Sin embargo, en las cinéticas del desplegamiento para la quimopapaína

monitoreadas por fluorescencia (Fig. 3.1 y 3.2), estas siguen un patrón biexponencial

(Fig. 3.3), del cual se deduce claramente que hay un mecanismo de tres estados:

Se obtienen dos constantes de velocidad, las cuales fueron calculadas de las

curvas de fluorescencia y utilizando la ecuación (3.2.33), dichos resultados se

(22)

IOOOOO

80000

6oooO

40000-

20000

Quirmpnpaino pH 7.0 O 0375 m@hi

I

-1

~~

-

-

-

-

-

-

I I I I

300

320

340

360 380

Longitud de Onda (nm)

400

Fig. 3.1 Gráfica con las curvas de los datos obtenidos variando la concentración de la quimopapaína, a pH 7.0. Donde se eligió la concentración final a la cual se trabajó, siendo esta de 0.0375 mg/mi.

(23)

300 320 340

360

380

400

Longitud de Onda

(nm)

(24)

40000

30000

U

m

W

UJ

c

20000

Ql

c

.-

CI

-

lo000

\

300

320

340

360

380

400

Longitud de onda (nm)

(25)

40000

30000

W R1

T

u>

c

20000

a,

c

w

-

10000

300

320

340

360

380

400

Longitud de Onda (nm)

(26)

35000

3oooo

U

v)

C

Q,

25Ooo

3

20000

-

15000

10000

'

1 I 1 1 1 I I I

I

O

2000

4000 6OOO 8000 loo00 IZO00

14OOO

16000

Tiempo

(seg)

(27)

f

\

35000

30000

25000

20000

15000

~

i Ciiieiica

Quirnopapaina

-

.

-

-

.

-

-

.

TEMPERAiüRA 58'C

1 m o

'

1 I I I I I I I

O

2000

4000 6OOO

8OOO

loo00

12000 14000 16000

(28)

35000

[

ClNETlCAQUlMOPAPAINA

1

30000

35000

[

ClNETlCAQUlMOPAPAINA

1

30000

-

n

üj

8 2 5 0 0 0 -

5 2 o o o o -

z

u

O 2000 4000 8ooo 8Ooo

12000

Tiempo

(seg)

(29)

3.2 Fotooxldación

Espectros

de

Fluorescencia

Los espectros de emisión de fluorescencia de quimopapaina nativa y de quimopapaína irradiada desnaturalizada, se efectuaron a una longitud de onda de

excitación de 325 nm. Tal como se ilustra en la figura 3-6,

los

espectros de

quimopapaina desnaturalizada (a 57, 58, 60 y 62

O C )

revelan la producción de nuevos productos fluorescentes, ya que la quimopapaína nativa no emite en el

intervalo de 360-500 nm. Espectros similares son descritos por Pigault y Gerard [l

21.

La N-formilquinurenina (NFK) y la quinurenina (Kyn) son fotoproductos que pueden aparecer (entre otros) como consecuencia de la fotólisis de los triptófanos

(30)

3.3 Conclusiones

A partir de los resultados obtenidos en DC, se puede confirmar que el modelo de desplegamiento para la quimopapaína a pH 2.2, sigue un mecanismo cinético de

dos estados, y que este es irreversible.

AI analizar los resultados de emisión de fluorescencia se observó un mecanismo cinético de desplegamiento de tres estados, con una constante de

velocidad para cada transición. Si observamos

los

parámetros de activación, se nota

claramente que

los

valores de la segunda fase cinética no corresponden a una

transición de desplegamiento. Además experimentalmente, el método ha hecho notar que hay una reacción de fotólisis donde aparecen fotoproductos (probablemente NFK

y otros productos de fotodegradación), que obviamente reflejan su existencia por

medio de absorción de luz a una longitud de onda donde las proteínas normalmente

ya no absorben y además a través de una transición, la cual seguramente

corresponde a la segunda fase cinética que se observa en la fluorescencia.

Se observó que conforme transcurría el tiempo, la especie nativa va

desapareciendo, para dar lugar a un estado desnaturalizado y que al mismo tiempo,

este va siendo fotooxidado. Es importante hacer notar que cuando D esta a un

tiempo máximo, la concentración de DI es pequeña,

lo

cual pudiera deberse a una

ausencia de estructura secundaria y terciaria en D .

Queda bastante claro, que la única fase cinética detectada por DC,

corresponde a la primera fase observada por fluorescencia, es decir que D y DI,

-

dadas las concentraciones utilizadas (1 Sggími), son indistinguibles una de otra por

dicroísmo circular [27].

En investigaciones experimentales previas, donde se trabajó con el método de DC,

utilizando

a

la quimopapaína [26], se encontró que la cinética de desnaturalización se

ajustaba muy bien a una reacción irreversible de primer orden y de dos estados, así

(31)

Evidentemente la desnaturalización térmica de la quimopapaína se ve

afectada por la exposición de la misma a los rayos UV. Así entonces la contribución

de la fotooxidación de la proteína a la desnaturalización de la misma, es digna de

tomarse en cuenta, ya que como se ha visto dependiendo de la cantidad de los

triptófanos y de la posición de estos, será el grado de fotooxidación de la proteína,

lo

cual se verá reflejado en la posible aparición de fotoproductos. Estos a su vez

provocarán la aparición de bandas en los espectros de la proteína ya desnaturalizada

y enfriada a la temperatura ambiente.

AI revisar los parámetros de activación vemos que el efecto de la fotooxidación

se refleja directamente en la segunda fase cinética detectada en fluorescencia, cuyos

valores como ya se dijo antes no son propios de una transición efectiva de

Figure

TABLA 1.  1  Residuos protonables de  la  quimopapaína.  Se indica el valor  de pKa para residuos aislados en agua

TABLA 1.

1 Residuos protonables de la quimopapaína. Se indica el valor de pKa para residuos aislados en agua p.15
Fig.  3.1  Gráfica con  las curvas de los datos obtenidos variando la concentración de la  quimopapaína, a  pH  7.0
Fig. 3.1 Gráfica con las curvas de los datos obtenidos variando la concentración de la quimopapaína, a pH 7.0 p.22
Fig.  3.2.  Grafica con  los  datos obtenidos variando el  pH a la misma concentración
Fig. 3.2. Grafica con los datos obtenidos variando el pH a la misma concentración p.23
Fig.  3.3  Gráfica  representativa de  los  datos  obtenidos  de  la  cinética  seguida  por  fluorescencia: A temperaturas de 58 y 62 OC; respectivamente
Fig. 3.3 Gráfica representativa de los datos obtenidos de la cinética seguida por fluorescencia: A temperaturas de 58 y 62 OC; respectivamente p.24
Fig.  3.4  Gráfica  representativa  de  los  datos  obtenidos  de  la  cinética  seguida  por  fluorescencia:  A  temperaturas de  57  y  60  "C; respectivamente
Fig. 3.4 Gráfica representativa de los datos obtenidos de la cinética seguida por fluorescencia: A temperaturas de 57 y 60 "C; respectivamente p.25
Fig.  3.57  Gráfica  represenftiva  de  I o S a a i o C o b d o s  de  Iá-cin-KcKseguida  por  fluorescencia:  A  temperaturas  de  58  OC
Fig. 3.57 Gráfica represenftiva de I o S a a i o C o b d o s de Iá-cin-KcKseguida por fluorescencia: A temperaturas de 58 OC p.26
Fig.  3.6.  Gráfica  representativa  de  los  datos  obtenidos  de  la  cinética  seguida  por  fluorescencia:  A  temperaturas  de  58  "C
Fig. 3.6. Gráfica representativa de los datos obtenidos de la cinética seguida por fluorescencia: A temperaturas de 58 "C p.27
Fig.  3.7.  Gráfica  representativa  de  los  datos  obtenidos  de  la  cinética  seguida  por  fluorescencia:  A  temperaturas de  60 "C
Fig. 3.7. Gráfica representativa de los datos obtenidos de la cinética seguida por fluorescencia: A temperaturas de 60 "C p.28

Referencias

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