UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON
F A C U L T A D D E C I E N C I A S Q U I M I C A S
DIVISION DE ESTUDIOS SUPERIORES
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T E S I S
Q U E P A R A O B T E N E R E L GRADO D E
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D I R E C T O R :
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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS DIVISION DE ESTUDIOS SUPERIORES
Producción de cepas n a t i v a s de B a c i l l u s thuringiensis_
y su a c t i v i d a d en Aedes aegypti Linnaeus y Culex - —
pfpiens quinquefasciatus Say.
TESIS COMO REQUISITO PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRIA
EN CIENCIAS C ESPECIALIDAD EN MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL)
QUE PRESENTA: Q.F.B. Catalina Rivas Morales
SEPTIEMBRE Dr 1 Q Q O
SECRETARIO
PRESIDENTE: ,
\ \
A G R A D E C I M I E N T O S
A MIS PADRES:
Sr. Ignacio Rivas Flores (+)
Sra. Justina Morales de Rivas
Con amor y etema g r a t i t u d .
A MI ESPOSO:
Q.F.B.^ Manuel Leos Leos
Con amor.
A MIS HIJOS:
Manuel, Catalina y Francisco Fernando
Con c a r i ñ o .
A MIS HERMANOS:
Ignacio, Dolores, Francisco, Mercedes, Eguenia, Rocío y
J u s t i n a .
Al M.C. Luis J. Galán Wong
Por su d i r e c c i ó n , o r i e n t a c i ó n y asesoría para el
presente t r a b a j o .
A mis sinodales:
Dr. Gabriel Gojón Z o r r i l l a y M.C. J . Manuel Cuevas
Martínez por su acertada r e v i s i ó n .
A mi maestro:
Dr. Jorge Valenzuela Pérez. Por sus enseñanzas
Al B i o l . Ma. Luisa Rodríguez Tovar
Por l a r e a l i z a c i ó n de l o s bioensayos
A 1* Dra. C r i s t i n a Rodríguez P a d i l l a
Por l a c l a s i f i c a c i ó n s e r o l ó g i c a
Al Laboratorio de M i c r o b i o l o g í a I n d u s t r i a l y Suelo
Q.B.P. Marivel Gómez T re v i ño, M.C. Gabriel Gallegos
Morales y Q.B.P. Lucía L e t i c i a Palacios Cortéz, por
su apoyo y colaboración.
Al Dr, Salvador Contreras B, a l a Dra. J u l i a Verde Star
a l Q.F.B. Azucena Oranday C, al Q.B.P. Eduardo Martínez
V, por su amistad y estímulo para culminar el presente
t r a b a j o .
Al Ing. Jorge A. Rivera C.
Por l a reproducción de ésta t é s i s
A l a Sra, Yolanda C a s t i l l o de Hernández
por l a mecanografía
Al Personal del Depto. de Bioquímica
por su compañerismo
Mi sincero agradecimiento a :
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
U. A. N. L.
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
I N D I C E
RESUMEN 1
INTRODUCCION 2
ANTECEDENTES 3
METODOLOGIA 19
RESULTADOS 25
DISCUSION 28
CONCLUSIONES 31
RECOMENDACIONES 32
TABLAS:
INDICE DE TABLAS
V
1 INGREDIENTES EN MEDIOS USADOS EN EL ESTUDIO DE B a c i l l u s
t h u r i n g i e n s i s var. i s r a e l e n s i s . 35
2 CARACTERISTICAS DE LAS CEPAS UTILIZADAS DE B a c i l l u s
-t h u r í n g i e n s i s . 36
3 PROCEDENCIA DE LAS CEPAS UTILIZADAS DE B a c i l l u s
t h u r i n g i e n s i s .
* »
4 CLASIFICACION SEROLOGICA PARA LAS SIGUIENTES CEPAS DE
-B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s . 38
5 PRUEBAS BIOQUIMICAS REALIZADAS PARA LA IDENTIFICACION
-DE LAS CEPAS -DE B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s . 39
6 MEDIOS DE CULTIVO UTILIZANDO MELAZA COMO FUENTE DE
CAR-BONO PROBADAS CON LAS CEPAS DE B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s . 43
7 MEDIOS DE CULTIVO UTILIZANDO GLUCOSA COMO FUENTE DE CAR
BONO PROBADAS CON LAS CEPAS DE B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s ^ 44
8 MEDIO DE CULTIVO Y TIEMPO DE FERMENTACION UTILIZADOS PA
RA LAS CEPAS DE Bac-\Tlus t h u r i n g i e n s i s . 45
9 CINETICA DE FERMENTACION DE B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s . 46
10 RELACION DE CEPA, MEDIO DE CULTIVO, VOLUMEN FINAL, PESO
EXTRACTO Y CUENTA VIABLE DE FERMENTACION DE B a c i l l u s ~
t h u r i n g i e n s i s , 47
11 PORCENTAJE DE MORTALIDAD Aedes a e g y p t j CON B a c i l l u s
12 PORCENTAJE DE MORTALIDAD EN Culex pipiens quinquefascjatus
CON B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s . 49
13 CONCENTRACION LETAL MEDIA ( LC5Q ) DE B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s
PARA Aedes aegypti. 50
14 CONCENTRACION LETAL MEDIA ( LC5Q ) DE B a c i l l u s , thuringiensi_s
PARA Cu!ex pipiens quinquefasciatus. - 50
FIGURAS:
1 FERMENTACION Y RECUPERACION DEL COMPLEJO ESPORA-CRISTAL DE
B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s 23
2 BIOENSAYOS DE LOS EXTRACTOS DE B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s CON
-LARVAS DE MOSQUITO. 24
3 CINETICA DE FERMENTACION DE B a c i l l u s _thuringiensi_s GM-49 IV 33
A B R E V I A T U R A S \
LC50 dosis l e t a l medía
RNA ácido r i v o n u c l é i c o
DNA ácido desocirribonucléico M
rpm revoluciones por minuto
P/V peso/volumen
g/cra3 gramos/centímetro cúbico
partes por m i l l ó n
rag/1 miligramos por l i t r o
mg miligramos
esporas/mi esporas por m i l i l i t r o
9/1 gramos por l i t r o
VVH volOrnen a volumen de medio
ül/mg unidades internacionales por miligramos
Ug/ml raicrogramos por m i l i l i t r o
°C grados centígrados
% por c i e n t o
rain. minutos
h r . hora
Std. estándar
R E S U M E N
Siete cepas nativas de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s fueron aisladas de muestras de
suelo o mosquitos muertos, t r e s de e l l a s GM-7, GM-49 y GM-50 pertenecientes
a l a v a r . aisawal, serotipo 7 , mostraron d i f e r e n c i a s en sus pruebas bioquimi.
cas y t o x i c i d a d , indicando que el serotipo no está relacionado con l a toxici_
dad. Los aislados se propagaron en once medios de c u l t v i o d i s t i n t o s con la
f i n a l i d a d de seleccionar las cepas y medios de c u l t i v o que favorecieran l a
t o x i c i d a d . Solamente exhibieron t o x i c i d a d las cepas GM49 y GM50 al c u l t i
-varse en l o s medios a base de melaza, harina de soya, agua de cocimiento de
levadura; al medio IV se adicionó carbonato de c a l c i o . Los bioensayos con —
Aedes aegypti presentaron una dosis l e t a l media de 102.1 mg/1, 69.68 mg/1 y
8,05 -x 10 mg/1 para GM-49 y GM-50 y el estándar 1PS-82 respectivamente, pa^
ra Culex pipiens quinquefasciatus fué de 50.04 mg/1, 102.48 mg/1 y 1, 5 x
I N T R O D U C C I O N
Los mosquitos Aedes aegypti Linneaeus y Culex>pipiens guinquefasciatus
Say, transmiten las enfermedades de Dengue y F i l a r i a s i s , respectivamente;
-13,534 casos de Dengue c l a s i c o se presentaron en el país, en 1985, según
repor-tes realizados por l a Secretaría de Salubridad y A s i s t e n c i a ; 130 millones de ca.
sos de F i l a r i a s i s se presentaron a n i v e l mundial, en 1982, reportadas por l a or.
ganizacióri mundial de l a salud.
»»
Los datos a n t e r i o r e s muestran l a importancia de encontrar una medida
efec-t i v a y complemenefec-taria, para c o n efec-t r o l a r los vecefec-tores que efec-transmiefec-ten esefec-tas enferme^
dades. Estos mosquitos son plagas domésticas; se c r í a n en cisternas y todo t i p o
de r e c i p i e n t e s , que se encuentran al rededor de donde vive el hombre. Los m o s
-quitos presentan r e s i s t e n c i a a d i f e r e n t e s i n s e c t i c i d a s químicos, cuyo
almacena-miento y uso inadecuado de e l l o s , son f a c t o r e s que bajan su e f i c i e n c i a , surgien.
do problemas ecológicos ( 7 , 6 5 ) .
Los problemas anteriores despiertan un gran i n t e r é s en u t i l i z a r
microorga-nismos, para control b i o l ó g i c o de insectos plaga. Los b i o i n s e c t i c i d a s de - - —
B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s presentan grandes ventajas, respecto a los i n s e c t i c i d a s
-químicos, como: e s p e c i f i c i d a d , e f e c t i v i d a d , s e l e c t i v i d a d e -inocuidad para e l h\¿
mano. B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s produce una delta endotoxina o c r i s t a l que se u t i
-l i z a como agente entomopatógeno ( 7 ) .
El l a b o r a t o r i o de Microbiología I n d u s t r i a l , FCB-UANL cuenta con un cepario
de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s , del cual se seleccionaron s i e t e cepas, para el p r e
-sente t r a b a j o . La t o x i c i d a d y forma de l a toxina de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s de—
penden de l a variedad y medio de c u l t i v o ; debido a e s t o , se considera de v i t a l
importancia, determinar que variedad y medio de c u l t i v o producen mayor t o x i c i
-dad.
Objetivo General: Producir y determinar l a t o x i c i d a d de s i e t e cepas de B a c i l l u s
t ^
t h u r i n g i e n s i s , crecidad en once medios de c u l t i v o d i f e r e n t e s , probándolas en —
A N T E C E D E N T E S
HISTORIA: ^
Las primeras observaciones de una b a c t e r i a , con las c a r a c t e r í s t i c a s de —
B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s , se r e a l i z a r o n por Ishiwata en 1901-1902, quien a i s l ó
l a bacteria de una oruga enferma del gusano de seda ( Bombyx mori ) , denominan^
dola B a c i l l u s s o t t o ( 31 ) .
B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s se a i s l ó originalmente en B e r l i n en el d i s t r i t o de
Thuringen, de orugas enfermas de l a p a l o m i l l a del Mediterráneo Anagata —
-k u n n i e l l a , por B e r l i n e r , en 1909-1912, quién descubrió el b a c i l o y su patogeni_
cidad ( 41 ) .
B e r l i n e r , en 1911, a i s l ó una b a c t e r i a de p a l o m i l l a s enfermas de l a harina
Ephestia k u h n i e l l a ; a . l a cualdenominó B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s en 1915, ésta bac.
t e r i a l a d e s c r i b i ó como: un b a c i l o esporulado, Gram ( + ) , f l a g e l a r ; observó que
el b a c i l o en esporulación, contenía una i n c l u s i ó n , aparte de l a espora,
desig-nándolo como Restkorper o cuerpo de desecho; s u g i r i ó que este cuerpo, está f o £
mado por m a t e r i a l , el cual no es u t i l i z a d o en el proceso de esporulación, este
cuerpo de desecho primero es e s f é r i c o , luego cambia a forma romboidal. Mattes,
en 1922, confirma esta observación, agregando que l a posición de l a espora cam
b i a con el crecimiento del cuerpo ( 12,30 ) .
Metalnikov y Chorine, en 1929, reportaron que B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s es
-fuertemente patogénico para l a p a l o m i l l a gitana ( P o r t h e t r i a dispar ) y larvas
de Aporia erataegi y Vanessa u r t i c a e ; los mismos investigadores observaron que
su patogenicidad era e s p e c í f i c a para larvas de lepidópteros ( 63 ) .
Smith y c o l . , en 1946, describieron a B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s como una
va-riedad de B a c i l l u s cereus por su e s p e c i f i c i d a d para c i e r t o s i n s e c t o s , así como
su morfología ( 1,28,29 ) .
Steinhaus, en 1951, reportó por primera vez, el uso exitoso de B. —
-t h u r i n g i e n s i s en Es-tados Unidos, con-tra l a oruga de l a a l f a l f a Colias pf-til'ódi;ce
eurytheme Boisduval. Realizó aplicaciones en campo con B.. t h u r i n g i e n s i s ,
Hannay, en 1953-1956, encontró en esporulados de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s ,
c r i s t a l e s l i b r e s en forma de diamante, denominándolos cuerpos paraesporales,
los cuales estaban c o n s t i t u i d o s químicamente de proteínas. S u g i r i ó que los
-c r i s t a l e s , probablemente se rela-cionaran -con una substan-cia t ó x i -c a , indu-ctora
de l a septicemia de orugas de insectos ( 1 1 , 2 9 ) .
Angus, en 1954-1956idemostró que e l c r i s t a l contenía una t o x i n a soluble
en á l c a l i y t ó x i c a para l o s i n s e c t o s , probándolo experimental mente ( ) .
Steinhaus, en 19511956, motivó con sus publicaciones el uso y e x p l o t a
-ción comercial de 13. t h u r i n g i e n s i s , como agente microbiano, contra algunas —
plagas de lepidópteros en Estados Unidos. La P a c i f i c Yeast Products en 1957
fué l a primera, en producir preparaciones comerciales a base de B a c i l l u s
-t h u r i n g i e n s i s ( "3").
»
En l a actualidad varios países elaboran productos a base de B a c i l l u s
-t h u r i n g i e n s i s (. 4 9 )•
Barjac y Bonnefoi, en 1962-1973, propusieron que B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s
fuera c l a s i f i c a d o en variedades de acuerdo a las reacciones antigénicas del
f l a g e l o ( Antígeno "H" ) , éste l o presentan las células vegetativas móvil e s ,
-de estas especies; este antígeno es estable y e s p e c í f i c o , en algunos casos se
complementa con pruebas bioquímicas e s p e c í f i c a s . Los aislados de B a c i l l u s
-t h u r i n g i e n s i s son llamados Serovariedades ( 2 3 ) .
H A B I T A T
B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s es un p a r á s i t o f a c u l t a t i v o de i n s e c t o s , se encuen^
t r a también como s a p r o f i t o en suelo, sus endoesporas permanecen l a t e n t e s en
condiciones adversas, por años; si este encuentra un medio p r o p i c i o , germi
-na cuando el huésped es un i n s e c t o , favorece su m u l t i p l i c a c i ó n y al esporular
produce el cuerpo paraesporal, el cual r e s u l t a t ó x i c o ( 1 ) .
Smirnoff y Mac Leod, en 1961, demostraron que t h u r i n g i e n s i s no presen^
t a efectos tóxicos en aves y mamíferos. La ausencia de t o x i c i d a d en estos ani_
males, confiere a l a bacteria importancia como i n s e c t i c i d a b i o l ó g i c o y l a
Tony de Lucca y col« en 1981, r e a l i z a r o n un e s t u d i o , sobre la p e r s i s t e n
c i a de B^ t h u r i n g i e n s i s en el medio ambiente de suelos agrícolas de U.S.A.,
-estos no habían estado en contacto con formulaciones de este t i p o y en suelos
que se encuentran l e j o s de criaderos de insectos lepidópteros o granos almace
nados; de 46,373 colonias de bacilos que encontraron solo 250 (®.G5%)
pertenecían a B. t h u r i n g i e n s i s , de las variedades que e x i s t e n , a i s l a r o n 5 de e l l a s :
-g a l l e r i a e , k u r s t a k i , i n d i a n a , damstadiensis y dakota t ) .
Samples y Buettner, en 1983, descubrieron una cepa de B^. t h u r i n g i e n s i s ,
aislada de una ulcera de córnea humana, que presenta t r e s cuerpos
paraespora-les y una espora, manifestando un desacuerdo con las publicaciones realizadas
anteriormente ( 5 7 ) .
AISLAMIENTO:
a) Método f í s i c o .
b) Método químico
a) Método f í s i c o :
Aizawa y c o l . , en 1961, d e s a r r o l l a r o n un método basado en la " Termo
r r e s i s t e n c i a 11 de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s , el cual consiste en suspender
un gramo de t i e r r a en 10 mi de agua e s t é r i l , agitando por 5 min; e l s o
-brenadante se t r a n s f i e r e a tubos que se c a l i e n t a n a 65°C, por 30 min, se
r e a l i z a n d i l u c i o n e s en agua d e s t i l a d a o solución s a l i n a , se sembró en —
agar n u t r i t i v o ( pH 7.4 ) , se incubó de 4-7 días a 28°C y se r e a l i z a r o n
observaciones microscópicas de las colonias (48,50).
b) Método químico:
Saleh y c o l . , en 1969, u t i l i z a n l a s e l e c t i v i d a d de l o s a n t i b i ó t i c o s , en
placas de agar n u t r i t i v o , que contienen s u l f a t o de polimixina B (5ppm)
y p e n i c i l i n a G (4ppm), se inoculó con una s e r i e de diluciones y se i n
-cubó a 37°C, por 48 h r s . ; se confirma con microscopía, l a presencia del
c r i s t a l paraesporal c a r a c t e r í s t i c o t 56 ) .
Una combinación de ambos métodos fué realizada por Ohba y c o l . , en 1980,
quienes a i s l a r o n dos nuevas subespecies, B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s subsp. - - —
kumamotoensis ( Serotipo 18 ) y B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s subsp. t o c h i g i e n s i s —
TOXINAS:
B a d i l u s t h u r i n g i e n s i s produce varios "metabolitos tóxicos a c t i v o s :
5 e x o t o x i n a . Es una protefna, t e r m o l á b i l , producida por
B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s y B a c i l l u s cereus, en l a fase l o g a r í t m i c a de su c r e c i
-miento a pH 6.0 - 9 . 0 , esta enzima actúa afectando los f o s f o l í p i d o s de l a mem
brana, causando l í s i s o necrosis.
S r e x o t o x i n a . - Es un n u c l e ó t i d o , termoestable, producido por c i e r t a s va—
riedades de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s ( Serotipo 1, 4a, 4c, 8, 9 y 10 ) , durante
l a fase vegetativa y soluble en agua. Farkas y c o l . , en 1969, determinan su
-e s t r u c t u r a química, compu-esta por ad-enina; r i b o s a ; glucosa y ac. a l á r i c o con
un grupo f o s f a t o , t s t e nucleótido produce deformación y muerte durante l a f a
-se pupa; actúa i n t e r f i r i e n d o l a RNA-polimerasa dependiente del DNA,
bloquean-do l a formación del RNA ( 26 ) .
y - e x o t o x i n a . - Es una enzima no i d e n t i f i c a d a , responsable del
aclaramien-to del agar yema de huevo; su t o x i c i d a d no está determinada ( 2 6 ) .
6endotoxina. Es un c r i s t a l p r o t e i c o , que proporciona l a p r i n c i p a l a c
-t i v i d a d i n s e c -t i c i d a a l o s ex-trac-tos de B a c i l l u s -t h u r i n g i e n s i s , es formada en
el proceso de esporulación, se deposita en forma c r i s t a l i n a , dentro del
espo-rangio. Es una c a r a c t e r í s t i c a que permite d i f e r e n c i a r a B a c i l l u s thuringíen—»
sis ( 29 ) .
El c r i s t a l de l a 6-endotoxina al ser i n g e r i d o , se h i d r o l i z a por enzimas
p r o t e o l í t i c a s , que actúan en e l proceso de d i g e s t i ó n .
Efectos de l a 6endotoxina, Esta cuando es ingerida por larvas de l e p i
-dópteros, mosquito y mosca negra, produce t o x i c i d a d (6,12 ) .
El c r i s t a l protéico es una p r o t o x i n a , que es h i d r o l i z a d o por enzimas que
i n t e r v i e n e n en el proceso de d i g e s t i ó n , en combinación con el pH a l c a l i n o del
La acción e s p e c i f i c a de 1a 6-endotoxina de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s depende
de:
a) La variedad de E[. t h u r i n g i e n s i s , la^cual produce c i e r t o t i p o de c r i s —
t a l .
b) La a c t i v a c i ó n por proteasas del jugo i n t e s t i n a l .
c) El t i p o de células e p i t e l i a l e s del i n t e s t i n o donde actúa l a t o x i n a
ac-t i v a d a ( 40 ) .
Cooksey y c o l . , en 1969, reportaron que l a conducción nerviosa es bloquea_
da por los c r i s t a l e s de protefna en Periplaneta americana, produce un rompi
miento en la regulación del ión potasio en l a s i n á p s i s , afecta l a conducción
-de impulsos. Estos investigadores s u g i r i e r o n que el c r i s t a l actúa disminuyendo
l a permeabilidad de l a membrana, por rompimiento en l a regulación del ión pota
sio C 10,53 ) .
Harvel y Wolfersberger, en 1979, demostraron en larvas de Manduca sexta,
dos mecanismos de acción propuestos para l a t o x i n a , estos pueden o c u r r i r simul_
táneamente; encontraron un p o l i p é p t i d o , proveniente de l a h i d r ó l i s i s de l a —
t o x i n a capaz de i n h i b i r el t r a n s p o r t e de p o t a s i o , provocando desacoplamiento
-primario en l a f o s f o r i l a c i ó n o x i d a t i v a C 34 ) .
De B a r j a c , en 1978, r e a l i z ó un estudio histopatolÓgico en larvas e x p u e s
-tas a l a t o x i n a ; observó que el e p i t e l i o del i n t e s t i n o medio es afectado,
pre-sentando hinchamiento t í p i c o y seguido de una destrucción del t e j i d o ( 31 ) .
BIOSINTESIS:
Hannay, en 1953, estudió l a formación de esporas en B a c i l l u s s o t t o , por
-medio de Microscopio E l e c t r ó n i c o , observó un cuerpo paraesporal, el cual es un
pequeño c r i s t a l en forma de diamante, c o n s t i t u i d o de p r o t e f n a , presentó aten—
ción a su naturaleza e importancia como agente microbial ( 47 ) .
N o r r i s , en 1969, observó el c r i s t a l de p r o t e í n a , por microscopía e l e c t r ó
t i z a en forma soluble antes de l a c r i s t a l i z a c i ó n , originalmente el c r i s t a l se
empieza a formar inmediatamente después que se presentan las proteínas en l a
-c é l u l a en esporula-ción ( 53 ) . x
Betchel y B u l l a , en 1976, estudiaron la esporulación y formación del
-c r i s t a l paraesporal, en-contraron que no e x i s t e r e l a -c i ó n del exporium -con el
c r i s t a l p r o t é i c o , se determinó que el c r i s t a l , es formado durante el e n v o l v i
-miento de l a espora, concluyeron que el c r i s t a l de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s se
forma en e1 citoplasma, s i n intervención de los mesosomas, septo de l a f o r e s
-pora o exosporium ( 4 ) .
Mikkola, en 1982, determinó que los serotipos 5, 10, 11 y 14, presentan
inclusiones pleomórficas, ausentes de t o x i c i d a d sobre l e p i d ó p t e r o s ; estas
cepas empiezan a formar sus i n c l u s i o n e s , antes de l a formación del septum, en
el estado I de l a esporulación, durante l a formación del filamento a x i a l y
-cerca de la membrana c e l u l a r ; se sugiere que B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s se
subdivida en 2 grupos entomopatógenos y l a t o x i c i d a d se relacione con l a m o r f o l o
-gía de las i n c l u s i o n e s , resultando inadecuado asociar l a t o x i c i d a d con
sero-t i p o s a base del ansero-tígeno "H" ( 4 3 )*
METODOS PARA ESTUDIAR EL CRISTAL:
a) Microscopía de luz
b) Microscopía e l e c t r ó n i c a
c) D i f r a c c i ó n de rayos "X"
a) El c r i s t a l se observó fácilmente con microscopio de l u z , mediante l a f i j a
ción con c a l o r y teñido con colorantes fuertes como fuchsina, negro de
-n a f t a l e -n o , giemsa, c r i s t a l v i o l e t a , azul v i c t o r i a ; los c r i s t a l e s se t i —
ñen y las esporas quedan l i b r e s de pigmentos.
Hannay, en 1953, u t i l i z ó microscopía de fases, con nigrosina para f a c i l i
-t a r l a observación den-tro del esporangio ( 28 )•
Hannay, en 1953, observo que los c r i s t a l e s de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s
__;son b i p i r a m i d a l e s , con estriaciones prominentes en l a s u p e r f i c i e de 2.9
-nm aproximadamente. v
Labaw, en 1964, u t i l i z ó una técnica de r é p l i c a al carbón, indicó que l a
subunidad de proteína básica t i e n e 8.7 nm ( ) .
c) Holmes y Monro, demostraron por d i f r a c c i ó n de rayos "X", que el c r i s t a l es
una subunidad p r o t e o l í t i c a c i l i n d r i c a o bola acampanada de 4.7 nm de ancho y
11.8 nm de l a r g o aproximadamente ( 47,53 ) .
METODO DE PURIFICACION:
En B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s r e s u l t a d i f i c i l separar espora y c r i s t a l , por
su s i m i l i t u d en tamaño .y c a r a c t e r í s t i c a s s u p e r f i c i a l e s ( 45 ) .
Para estudios a n a l í t i c o s del c r i s t a l se requiere a l t a pureza. Cuatro pro
piedades se u t i l i z a n en l a separación de espora y c r i s t a l que son: densidad
-r e l a t i v a , p-ropiedades de s u p e -r f i c i e , s o l u b i l i d a d y ge-rminación de l a espo-ra
(54,58). Los primeros métodos probados para separar el c r i s t a l , se basan en
-sistemas d i f á s i c o s , empleando varios solventes orgánicos y polímeros de a l t o
peso molecular ( 4 5 ) .
Angus, en 1954, d e s a r r o l l ó un método para separar espora y c r i s t a l , en
-una fase l í q u i d o - l í q u i d o , dando origen a muchas variaciones. Hannaig u t i l i z a
un método para l a separación de esporas y c r i s t a l e s , combinando carga de s u
-p e r f i c i e y densidad con e l e c t r o f o r é s i s continua ( 10 )
Vanková, en 1957, u t i l i z ó c e n t r i f u g a c i ó n con gradientes de densidad de
sucrosa [ 45 ) . Pendleton y Marrison, en 1966,propusieron un método que se
-basa en 1a h i d r o f o b i c i d a d de l a s esporas, l a s cuales son separadas por espuma
y f l o t a c i ó n , removiendo 60% de esporas y recuperando 76% de c r i s t a l e s ( 52 ) .
Fast, en 1972, p u r i f i c ó el c r i s t a l con u l t r a c e n t r i f u g a c i ó n i s o p í g n i c a ,
-u t i l i z ó gradientes de CsCI a -una conc. 40% p/v v 50,000 rpm, d-urante 16 h r s .
poras 1.35 g/cm .
\
Sharpe y c o l . , en 1975, encontraron que los c r i s t a l e s , pueden separarse
de las esporas a velocidades moderadas de c e n t r i f u g a c i ó n ( 10,000-12,000 rpm ) o
en gradientes de r e n o g r a f i n , presentó para esporas 1,30 g/cm y para los c r i s -3 -3 -3 t a l e s 1,27 g/cm , en d i a t r i z a t o de sodio 1.32 g/cm y 1.27 g/cm , para esporas
y c r i s t a l e s respectivamente ( 45, 58 ) .
Ang y Nickerson, en 1978, u t i l i z a r o n c e n t r i f u g a c i ó n zonal con gradientes
3 3 de NaBr, encontraron banda de c r i s t a l e s 1.32 g/cm y de esporas 1.38 g/cm . La
producción de c r i s t a l e s tuvo un rango de 15-20%, l a densidad d i f i e r e de l a
ob-servada en CsCl y r e n o g r a f i n , aunque l a s densidades no son comparables en di fe
rentes t i p o s de gradientes ( 45 ) . * *
N i s h i t s u t s u j i - V w o Makisaka, en 1975, probaron con mutantes no esporulados
para f a c i l i t a r l a p u r i f i c a c i ó n ( 45, 66 ) .
Rao y Shethna u t i l i z a r o n una t é c n i c a , basada en l a propiedad p r e f e r e n c i a l
de agregación de c r i s t a l e s y subsecuente separación de esporas, en columna con
' MEDIOS DE FERMENTACION:
La a c t i v i d a d i n s e c t i c i d a de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s se determina por l a pre
sencia de 1a 5-endotoxina producida d u r a n t e ^ a fase de esporulación, su
produc-ción y t o x i c i d a d dependen del medio de c u l t i v o en que es producido.
Dubois, en 1968, c u l t i v ó B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s mediante un procedimiento
Batch de l a b o r a t o r i o en un medio c o n s t i t u i d o p o r : glucosa 2.0g; Bactopeptona —
( Difeo ) 2.0g; ( NH4>2 S04 3.0mg; KgHPO^ MgS04 0.03g; CaClg. H^O 18 mg; FeS04.
7H20 0.75mg; CuS04. 5 H20 7.5mg; ZnS04- 7 H20 7.5mg; MnS04. 4 H20 40.0mg; por
-l i t r o de agua d e s t i -l a d a ; de este medio obtuvo 2 x 10® esporas/m-l (. 2 x 10^ espo
ras/mi termorresistentes ) ( 16, 27 ) .
Pendleton, en 1969, probó un medio a base de 2% de harina de pescado; 1%
-de almidón; 0.1% CaC03; 0.001% de niacina y mezcla de sales ( 51
Dulmage, en 1970, a i s l ó B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s v a r . kurstaki y obtuvo
con-centraciones a l t a s de -endotoxina, en un medio a base de t r i p t o n a 1 0 . 0 g / l ; áex_
trosa 5 . 0 g / l ; almidón 5 . 0 g / l ; extracto de levadura 2 . 0 g / l ; 1 . 0 g / 1 ; KH2P04
1 . 0 g / l . Este investigador recomienda u t i l i z a r sustratos baratos, como: harina
de soya t 15g/l ) y harina de semilla de algodón ( 10g/l } ( 20 ) .
N o r r i s , en 1971, comprobó que B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s , se d e s a r r o l l a en
medios específicos y esporula en presencia de sales ( Singer 1966 ) , su produc
-ción es mejorada por l a adi-ción de aminoácidos en un medio c o n s t i t u i d o por: glj¿
cosa 0.1%; e x t r a c t o de levadura 0.2% (_ NH4 )2 S04 0.02%, KH2P04 0.05% y sales
-minerales, l a glucosa se u t i l i z a en l a primera fase exponencial cuando se produ.
ce ácido acético y p i r O v i c o , los cuales producen un descenso en el pH 5 . 0 ; el
-ácido acético posteriormente se metaboliza y eleva el pH 7.0 ( 2-3 hr ) ; algu—
nos agentes que i n t e r f i e r e n en el metabolismo del acetato previenen l a esporula^
ción de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s e inhiben l a s í n t e s i s del c r i s t a l , un ejemplo es
el f l u o r o a c e t a t o , el cual impide el metabolismo del a c e t a t o , por i n h i b i c i ó n ; l a
aconitato hidratasa es un i n h i b i d o r e f e c t i v o de formación de esporas y c r i s t a l ;
otro i n h i b i d o r es el acido p i c o l í n i c o t Yousten 1969 ) , La e r i t r o m i c i n a a bajas
concentraciones inhibe el crecimiento de b a c t e r i a s , impide el d e s a r r o l l o de
El esporangio no se l i s a en presencia de a n t i b i ó t i c o s y el c r i s t a l
perma-nece en e l i n t e r i o r de las paredes celulares ( Arescaldino 1969 ) . La s í n t e s i s
de una enzima p r o t e o l í t i c a extra c e l u l a r , es i n d i c i o de l a i n i c i a c i ó n en l a es_
porulación ( 47 ) .
Goldberg y c o l . , en 1980, optimizaron l a producción del complejo espora
--endotoxina de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s , a escala p i l o t o ( 500:1 ) , en un medio
de: glucosa 30.0 g; peptona de soya 2.0 g ; e x t r a c t o de levadura 4.5 g; l í q u i d o
de remojo de maíz 5.0 m i ; ( 76% de sólidos ) ; KC1 3.0 g; {_ NH^ )2 S04 3.0 g ;
-H3P04 7 mi; MgS04 2,0 g; CaCl2. H20 36.0 mg; FeS04- 7 HgO 13.5 mg; CuS04
-5 H20 7.5 mg; ZnS04. 7 H20 7.5 mg; MnS04. 4 H^O 40 mg por cada l i t r o de agua
-d e s t i l a -d a ; incubó a 32°C, con aereación -de 0.3 VVM a g i t a c i ó n -de 120-150 rpm, a
pH 6.2 - 7 . 4 , de donde obtuvieron 4 x 106 UFC/ml en 60 h r s . aproximadamente —
( 2 6 ) .
Dulmage, en 1971, recuperó l o s complejos de 6endotoxina de 16 aislados
-de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s var. al e s t i C s e r o t i p o 3a ) y 2 aislados -de B a c i l l u s
t h u r i n g i e n s i s v a r . k u r s t a k i ( s e r o t i p o 3a, 3b ) , los cuales fueron producidos
en 3 medios a base de sales minerales, d i f e r e n t e s fuentes de carbono y n i t r ó g e
no, t a l e s como: t r i p t o n a , p r o f l o , harina n u t r i s o y a , almidón de maíz, e x t r a c t o
de levadura y bactopeptona. Con esta i n v e s t i g a c i ó n se r e e n f a t i z a que l a produc^
ción de l a 6endotoxina, es un problema de fermentación; para medir l a p o t e n
-c i a de l a S-endotoxina, se r e a l i z ó una -cuenta de esporas viables presentes en
la preparación, para determinar l a a c t i v i d a d i n s e c t i c i d a . La cuenta v i a b l e de
esporas se generalizó como método para medir l a potencia de l a s formulaciones
de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s , esta determinación r e s u l t ó inadecuada ( 20
1-Scherrer y c o l . , en 1973, c u l t i v a r o n B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s , en d i f e r e n t e s
concentraciones de glucosa determinaron que a mayor concentración de glucosa,
se obtiene cantidades mayores de la 6 e n d o t i x i n a , con a l t o contenido de p r o t e í
-na y a c t i v i d a d i n s e c t i c i d a . La máxima producción de 6-endotoxi-na, se obtuvo en
un medio s e m i s i n t é t i c o con 6-8 g/1 de glucosa; a esta concentración de glucosa
los c r i s t a l e s alcanzaron un tamaño de 2.0 ym de l o n g i t u d aproximadamente; a nive
les mayores de glucosa l a producción de la S-endotoxina aumenta; se requiere de
9,000 c r i s t a l e s para i n h i b i r l a alimentación de l a l a r v a ; en ausencia de
gluco-sa, esta se redujo a 8,000 c r i s t a l e s en un medio que contenía 1.0 g de glucosa
y se r e q u i r i ó de 2,200 c r i s t a l e s para f r e n a r l a toma de alimento del insecto
-{ 2 ) .
\
Gouch y Ross, en 1980, recomendaron fuentes naturales de nitrógeno, t a l e s
como: harina de pescado, harina de s e m i l l a de algodón, l i q u i d o de remojo de —
maíz, harina de soya, levadura autolisada y caseína. Entre las fuentes de
carbono se incluyen productos de maíz h i d r o l i z a d o s : almidón y dextrosa; éstas
-fuentes permiten bajar los costos ( 11 ) .
Salama y c o l . , en 1981, u t i l i z a r o n varios subproductos i n d u s t r i a l e s y —
a g r í c o l a s , como: harina de pescado, harina de s e m i l l a de algodón, levadura de
f o r r a j e , sangre de r e s , subproductos secos de ave, l í q u i d o de remojo de
maíz,-suero de queso, l í q u i d o de l a c e n t r i f u g a c i ó n f i n a l en l a producción de almidón
de maíz; leguminosas como: habas, f r i j o l de soya, garbanzo, j u d í a s , cacahuate
y l e n t e j a s ; estas se incorporaron a un medio a base de glucosa 6 . 0 g / l ; e x t r a c
-t o de levadura 2.0 g / í ; I^H P04 4 . 3 g / l ; CaC03 2 . 0 g / l , y sales minerales 2 . 0 g / l .
Estos medios se u t i l i z a r o n para producir B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s , variedades —
k u r s t a k i y entomocidus; se encontró que l a producción de esporas en estos
pro-ductos, es d i f e r e n t e en ambas variedades, se obtuvo que las mezclas con levadu^
ra de f o r r a j e , dieron cuentas mas a l t a s , cuando se añade sangre de r e s ; tuvo
-a c t i v i d -a d i n s e c t i c i d -a -apreci-able contr-a H e l i o t h i s -armíger-a y l -a v-aried-ad
ento-mocidus presentó buena a c t i v i d a d sobre Spodoptera l i t t o r a l i s ( 48 ) .
Maldonado, en 1981, reportó l a a c t i v i d a d i n s e c t i c i d a de B a c i l l u s
t h u r i n g i e n s i s GM-1, en un medio c o n s t i t u i d o p o r : jugo de agave, harina de soya
al 1%; presentó una potencia de 10,900 Ul/mg; Dulmage, en 1970, reportó para —
B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s HD1, una potencia de 18,000 Ul/mg, l a de mayor a c t i v i
-dad hasta l a fecha C 42 ) .
Smith, en 1982, determinó el efecto de l a cepa y v a r i a c i ó n del medio de
c u l t i v o , en l a producción de toxina por B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s variedad i s r a e
l e n s i s ( s e r o t i p o H14 ) , observó v a r i a c i ó n en l a producción de l a t o x i n a , l e
-t a l en larvas de mosqui-to, dependien-te de l a cepa y medio de crecimien-to ( com
posición de medios, Tabla 1 ) . En medios amortiguados no se observó mejor toxi_
cidad, que en medios s i n amortiguar; el rango de pH 5 . 7 - 8 . 1 en el c u l t i v o . Cor^
t e r i o s cuando se valoran nuevas cepas, donde el producto de i n t e r é s es una
toxina para el i n s e c t o ; el indicador p r i n c i p a l de t o x i c i d a d es l a h a b i l i d a d
-de causar la muerte a la l a r v a . Es interesante señalar que l a v a r i a c i ó n -de l a
producción de toxina es una respuesta a l a composición del medio por aislados
n a t u r a l e s ; consideró que l a producción i n - v i t r o de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s v a r .
i s r a e l e n s i s ( serotipo 14 ) es prometedora ( 62 ) .
ESTANDARIZACION:
Dulmage y c o l . , en 1971, propusieron una estandarización de bioensayos
para las formulaciones de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s , basada en unidades i n t e r n a
cionales u t i l i z a n d o el r i z a d o r de c o l i f l o r ( T r i c h o p l u s i a n i ) , el producto
-es incorporado a una d i e t a a base de harina de a l f a l f a , para larvas de 15-25
mg; se alimentan por 5 d í a s ; se determinó L C ^ de l a formulación a prueba, se
compara con una preparación estándar, l a t o x i c i d a d se expresa en Ul/mg. En e l
Coloquio Internacional de Patología de Insectos y Control Microbial en Wege—
ningen, en 1966, los Paises Bajos recomendaron que E-61, una formulación del
I n s t i t u t o Pasteur, Francia, se adoptará como estándar i n t e r n a c i o n a l ,
asignándole una potencia de 1,000 IU/mg. S u g i r i e r o n , preservar el mantenimiento de
-la E-61 y que cada l a b o r a t o r i o prepare sus propios estándares secundarios; de_
terminar l a potencia en IU/mg en bioensayos comparados con E-61 y u t i l i z a r —
este estándar secundario para todos los bioensayos de r u t i n a ( Burges 1967 )
C
19 } .Dulmage, en 1973, obtuvo una formulación de 5endotoxina producida por
-B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s v a r . k u r s t a k i aislado HD-1, este fué adoptado como el
estándar primario de referencia en Estados Unidos, se determinó HD-l-S-1971,
asignándole una potencia de 18,000 IU/mg comparado con el estándar i n t e r n a c i o
nal E-61 C 22 1.
. BIOENSAYO:
El hombre desea c o n t r o l a r las plagas de i n s e c t o , s i n riesgo de
envenena-miento del c u l t i v o y o t r a s especies o causar daños secundarios. Los insectici_
das químicos carecen de estas c a r a c t e r í s t i c a s . El uso y almacenamiento
conta-mi nación ambiental, de agua y alteraciones ecológicas ( 6,8 ) .
Los mosquitos son insectos-plaga abundantes, se alimentan de sangre calier^
t e , causan molestias al hombre y otros animales; además, son vectores de muchas
enfermedades; entre e l l o s se encuentra Aedes aegypti Linneaeus, comunmente con£
cido como Mosquito T i g r e , transmisor de l o s v i r u s del Dengue y f i e b r e a m a r i l l a
y Culex pipiens quinquefasciatus Say, denominado Mosquito casero del n o r t e ,
es-te último se alimenta de sangre de aves, ocasionalmenes-te pica al hombre, l a
hem-hra de este mosquito puede t r a n s m i t i r el v i r u s de E n c e f a l i t i s y Tas f i l a r i a s —
Wuchereria b a n c r o f t i y D i r o f i l a r i a t i f f i t i t j s C 9,33,36 1.
Debido a estos problemas, se buscan a l t e r n a t i v a s para c o n t r o l a r los
vectores transmisovectores de estas enfermedades. Los i n s e c t i c i d a s biológicos a base de
b a c t e r i a s , producen»enfermedad y muerte de l o s i n s e c t o s , logrando as? el con
-t r o l de dichas plagas. Las bac-terias formadoras de esporas -t i e n e n ven-taja sobre
otro t i p o de b a c t e r i a s , debido a que producen esporas, que sobreviven en a l m a «
namiento por largo tiempo y tienen larga vida después de l a a p l i c a c i ó n .
Las enfermedades son mas e f e c t i v a s contra insectos que vtven bajo s t r e s s ,
como alimentación pobre o condiciones de sobrepoblactón*
B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s produce una protoxina que se d i v i d e en fragmentos
tóxicos por proteasas en el i n t e s t i n o medio del i n s e c t o , i n t e r v i e n e n i m p o r t a n
-tes factores como: proteasas presen-tes en i n t e s t i n o y pH.
Los i n s e c t i c i d a s de contacto matan todos los estadios de un insecto por
-contacto con sus s u p e r f i c i e s corporales, a d i f e r e n c i a de los i n s e c t i c i d a s b i o l ó
gicos a base de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s ; l a i n f e c c i ó n se presenta principalmente
en el estadio l a r v a l , por ingestión con el alimento. Los c u l t i v o s esporulados
de b a c t e r i a s , pueden ser secados y formar un polvo f i n o durable, que es a p l i c a
-do como suspensión; se u t i l i z a n técnicas desarrolladas para químicos, como api
cación con adhesivos, agentes humectantes, emulsificadores diluyentes y acarrea
dores, l o s cuales están l i b r e s de efectos b a c t e r i c i d a s y b a c t e r i o s t á t i c o s . Se
-encontraron compuestos s a t i s f a c t o r i o s para l a a p l i c a c i ó n de los i n s e c t i c i d a s —
biológicos t a l e s como: leche en polvo descremada, lacas de v i n i l , mezclas de —
Para el diagnóstico de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s se u t i l i z a n 3 métodos que
-son:
1) Pruebas bioquímicas
2) Pruebas serológicas
3) A n á l i s i s de estearasas de las células vegetativas por e l e c t r o f o r é s i s en
gel de almidón ( 7 ) .
«*
Dulmage, en 1970, recuperó el complejo espora c r i s t a l , de caldos p r o d u c i
-dos por 12 variedades de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s , se encontró que es inadecuado
predecir l a a c t i v i d a d por: variedad, cantidad de crecimiento del organismo y —
medio de fermentación. La cantidad de sendotoxina y concentración depende de
-la variedad y los dos medios u t i l i z a d o s .
\ »
Para determinar Ta potencia de las formulaciones de 6-endotoxina, se r e —
quiere de un bioensayo; s e r o t i p o , medio de fermentación o cuenta de esporas.
Los primeros t r a b a j o s de Stemohous y J e r r e l , en 1950, e n f a t i z a n que se —
considere l o s i g u i e n t e :
1 . - Especificar l a variedad y aislado usado como las condiciones de produc
ción de l a 6-endotoxina.
2 . - Medir l a a c t i v i d a d por medio de un bioensayo, es inadecuada l a cuenta
de esporas, por l o tanto es inconveniente hacer estandarizados por
-cuenta de esporas.
3 . - Estudiar l a producción de l a 6-endotoxina de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s —
Hall y c o l . , en 1977, probaron 127 extractos de 16 variedades r e
-p r e s e n t a t i v a s , mas dos extractos sin i d e n t i f i c a r , todas fueron cultivadas en
un medio estandarizado y probadas contra larvas de mosquito Aedes a e g y p t i , A*
t r i s e r i a t u s , Culex t a r s a l i s , Cu!ex pipiens y Culex quinguefasciatus. La
mayo-r í a de l o s extmayo-ractos fuemayo-ron modemayo-radamente patogénicos a una concentmayo-ración —
1,100 vg/ml. Formulaciones de 26 extractos presentaron efecto con
A . t r i s e r i a t u s , Culex t a r s a l i s y A. aegypti^ con LC^q b a j a / 1 yg/ml; l a s
formu-laciones mas patogénicas comparadas, HD-169/R-567B y HD-96/R547D,„ presentaron
una LCj-q de 0.04 y 0oQ6 -pg/ml, respectivamente, contra A. t r i s e r i a t u s , Culex
pipiens y Cujex quinguefasciatus; 23 formulaciones causaron 50% de mortalidad
a concentraciones entre 4 y 10 ug/ml ( 22 ) .
Kornby y c o l . , en 1981, estudiaron l a p e r s i s t e n c i a y a c t i v i d a d larvi_
cida de B a c i l l u s spháericus 1593, se comparó el h l b i t a t natural del mosquito,
en agua dulce y varias, concentraciones de agua de drenaje; los niveles i n i c i a
4 5 ~~ les de B a c i l l u s spháericus f l u c t ú a n entre 4.0x10 a 7.1x10 esporas/ml en
-agua d u l c e , con 100% en e l c o n t r o l de larvas de Culex quinguefasciatus Say; y
Culex ni g r i p a l pus Theobald por 30-50 días en agua de drenaje, 100% de c o n —
t r o l por 80-90 d í a s , a una concentración de esporas de B a c i l l u s spháericus de
7.5x10^ esporas/ml. El estadio de pupa se presentó cuando l a concentración de
esporas, era de 100 esporas/ml o menor. Por medio de estos resultados
conclu-yeron que l a a c t i v i d a d l a r v i c i d a de B a c i l l u s spháericus, depende de l a concen
t r a c i ó n de esporas y su persistencia se relacionó con l a calidad del agua —
( 32 ) .
Klowden y c o l . , en 1983, estudiaron l a t o x i c i d a d de B a c i l l u s
t h u r i n g i e n s i s var. i s r a e l e n s i s , sobre mosquitos adultos Aedes_ a e g y p t i ; d e t e r
minaron que l a hembra adulta de mosquito Aedes a e g y p t i , muere por l o s c r i s t a
-les paraespora-les de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s var. i s r a e l e n s i s ( 0 NR-60A ) , es^
tos c r i s t a l e s se introducen por drenado i n t e s t i n a l , l a dosis l e t a l media
para c r i s t a l e s i n t a c t o s fué de 0.021 yg/mg de mosquito ( peso húmedo ) y para
c r i s t a l e s s o l u b i l i z a d o s 0.04 ug/mg., estos valores se compararon con larvas
-de mosquito -de alimentación l i b r e , con dosis -de 0.018 yg/ml y 1.28 yg/ml para
c r i s t a l e s i n t a c t o s y c r i s t a l e s s o l u b i l i z a d o s , respectivamente. Demostraron —
que las preparaciones probadas resultan i n f e c t i v a s para larvas y mosquitos
-como medio d i r e c t o para seleccionar l a potencia que c o n t r o l e los mosquitos —
( 37 ) .
\
\
Cheung y Bruce, en 1985, observaron que el c r i s t a l de l a 5-endotoxina, —
producido por B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s v a r . i s r a e l e n s i s , es mas t ó x i c o sobre l a r .
vas de Anopheles f r e e b o r n i , que en larvas de Aedes a e g y p t i , cuando el c r i s t a l
se s o l u b i l i z ó ; las larvas de ambas especies mostraron s e n s i b i l i d a d s i m i l a r , —
consideraron que este e f e c t o , se debe a d i f e r e n c i a s entre el comportamiento de
alimentación de l a s larvas de los 2 mosquitos. La t o x i n a fué emulsificada con
un adyuvante completo de Freund, este s o l u b i l i z ó l a toxina a bajo n i v e l , de na_
nogramos, posteriormente se fracciona l a t o x i n a con material l i p o l i t i c o , a l t e
rando l a f l u c t u a c i ó n de l a t o x i n a , respecto a l a s e n s i b i l i d a d de l a larva de
-1os 2 mosquitos; esta d i f e r e n c i a en suspensión, fué determinada por una enzima
inmunoabsorbente específica para péptidos t ó x i c o s . Los resultados obtenidos i j i
dtcaron que económicamente es f a c t i b l e d e s a r r o l l a r formulaciones de
suspensio-nes de c r i s t a l e s de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s v a r . i s r a l e l e n s i s (. 13 } .
Mulla y c o l . , en 1985, experimentaron con larvas del 42 estadio de Aedes
aegypti y Anopheles albjmanus, y demostraron que B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s v a r .
-i s r a e l e n s -i s , puede crecer vegetat-ivamente, esporular y produc-ir t o x -i n a ; en - -«
Aedes aegypti l a cuenta de esporas fué de 2 x 10 por cadáver, en 4 hr y en —
Anopheles albimanus de 2.2 x 103 por cadáver, en 4-24 ftr, incrementándose a —
3.2 x 10 por cadáver, en 72 hr p o s t - t r a t a m i e n t o . Estos resultados demostraron
que bajo condiciones apropiadas B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s v a r . i s r a e l e n s i s , puede
M E T O D O L O G I A
1 . - AISLAMIENTO:
Se recuperaron 3 cepas nativas de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s de muestras de
-suelo; l a s cuales se i d e n t i f i c a r o n con l a s claves GM-7, GM-18 y GM-20; las dos
primeras provienen de Guanajuato y la o t r a de Nuevo León; las 4 cepas r e s t a n
-tes se a i s l a r o n de cadáveres de mosquito Aedes a e g y p t i , las cuales se i d e n t i f i _
carón con las claves GM47, GM48 y GM50 C c a r a c t e r í s t i c a s de las cepas. T a
-bla 2 ) . Las cepas fueron serológica y bioquímicamente i d e n t i f i c a d a s (..Ta-bla 3)
l a i d e n t i f i c a c i ó n serológica se r e a l i z ó mediante pruebas inmuno!ógicas, u t i l i
zando antígeno f l a g e l a r H con sus respectivos antisueros (. 38 ) . Las pruebas
-bioquímicas, Tabla 5, se l l e v a r o n a cabo por l a metodología t r a d i c i o n a l amplia_
mente conocida ( 5 ) . Estas determinaciones se efectuaron en el Depto. de M i
-crobiología e Inmuhología, en el Laboratorio de Inmunología de l a Facultad de
Ciencias Biológicas,UANL.
2 . - CONSERVACION DE LA CEPA:
Se c u l t i v ó en tubos inclinados de agar n u t r i t i v o , se incubó a 32-34°C, por
72 h r , fueron posteriormente almacenados a 4°C, se r e a l i z a r o n resiembras para
-su conservación.
3 . - PREPARACION DEL INOCULO;
a) De l a s cepas conservadas en agar i n c l i n a d o a 4°C, se toma una asada que
se t r a n s f i e r e a una caja p e t r i , con agar n u t r i t i v o , se d i s t r i b u y e en 3
campos, se incuba a 30-32°C, por 24 h r ; de una colonia aislada se reali_
zó un f r o t i s , posteriormente se u t i l i z a l a misma colonia para preparar
el i n o c u l o .
h) En matraces Erlenmeyer de 250 mi se depositan 50 mi de caldo t r i p t o s a
-f o s -f a t o (. Di-fco ) , e s t e r i l i z a d o s a 121°C, por 15 min, se inocula con —
una asada de l a colonia a i s l a d a , en agar n u t r i t i v o , se incuba a 30-32°C,
4 . - FERMENTACION:
En este t r a b a j o se probaron 11 d i f e r e n t e s medios de c u l t i v o , cuya composi^
cion en g/1 se encuentran reportados en las Tablas 6 y 7. Las fermentaciones
se r e a l i z a r o n a n i v e l de matraz Erlenmeyer de 500 m i ; se colocaron 100 mi de
medio de c u l t i v o ( I al XI ) , e s t e r i l i z a d o s a 121°C por 15 m i n . , se a d i c i o n a
-ron 0.5% del i n o c u l o , previamente preparado en caldo t r i p t o s a f o s f a t o t Difco)
se incubaron a 30-32°C, por 40-72 h r , a 250 rpm, durante el período de
fermen-t a c i ó n , se fermen-tomaron muesfermen-tras a d i f e r e n fermen-t e s períodos de fermen-tiempo 12, 24, 36, 4Q, 48
y 72 h r , para determinar l a c i n é t i c a de fermentación.
5 . - PARAMETROS PARA DETERMINAR LA CINETICA DE FERMENTACION:
a) Medición del pH
b) Observación de c r i s t a l e s . - Para detectar l a presencia de c r i s t a l e s
durante el curso de l a fermentación, se r e a l i z a r o n f r o t i s , tomando una
-asada del c u l t i v o cada 12 hr t posteriormente a las 24 hr ) . , para l a
observación se hizo una t i n c i ó n al Gram.
c) Consumo de azúcares.- De las muestras tomadas cada 12 hr C 5 mi ) , se
c e n t r i f u g a a 3,000 rpm/15 min, en el sobrenadante se determinaron
azú-cares reductores por el método de 3, 5 DNS a c i d , se tomó l a l e c t u r a a
540 nm t 60
d i Cuenta de esporas v i a b l e s . - De los extractos f i n a l e s se tomaron 50 mg,
los cuales se suspendieron en 50 mi de agua destilada e s t é r i l , se pas-?
t e u r i z ó a 65°C, por 10 min; posteriormente se efectuaron diluciones de
1 x 1 0_ i a 1 x l o "7, se tomaron 1 mi de cada d i l u c i ó n , se depositaron
en una caja p e t r i e s t é r i l , se adicionaron 15 mi aproximadamente de
-agar n u t r i t i v o t Merck ) , mezclar en forma de ocho, se s o l i d i f i c a e in^
cuba a 37°C por 24 hr L 20 ) .
6 . - EXTRACCION DEL COMPLEJO ESPORA CRISTAL:
Para obtener este complejo se u t i l i z ó el método de c o p r e c i p i t a c i ó n l a c t o
-sa-acetona propuesto por Dulmage en 1970 ( 2 4 } . De los c u l t i v o s producidos en
los d i f e r e n t e s medios de cultivo»se comprueba que el 80% de c r i s t a l e s son libe^
rados C Observación en fresco ) ; se suspende l a incubación, se mide el volúmen
f i n a l , se ajusta el pH a 7 . 0 , se c e n t r i f u g a a 5,000 rpm por 30 min a 4°C ( Cen_
-al 5%, u t i l i z a n d o un volumen de 10:1, respecto -al volumen f i n a l de l a fermenta
c i ó n , se a g i t a por 30 min, se adiciona 5 v o l . aproximadamente de acetona,
respecto al volumen de l a c t o s a , se agita nuevamente por 30 min, se deja reposar
-por 15 min, se f i l t r a con vacío sobre papel Wathman # 1, se deja reposar toda
la noche, el residuo f i n a l se muele en mortero hasta obtener un polvo f i n o , se
pesa y es u t i l i z a d o para el bioensayo.
7 . - BIOENSAYO:
Se r e a l i z ó con larvas de mosquito del 4* estadio Aedes aegypti y Cu!ex —
pipiens quinquefasciatus
a) Los mosquitos se obtuvieron de l a propagación de l a r v a s , colectadas en
l a región de Nuevo León e i d e n t i f i c a d a s de acuerdo al manual del Depar
tamento de Educación y Salud de los Estados Unidos.
b) Dieta para l a r v a s . - Estas se colocan en un r e c i p i e n t e de 7.5 x 20" con
una solución de agua destilada y agua declorada ( 50% ) , se adicionó
-5,000 ppm de NaCl, l a s larvas se alimentaron con una mezcla de 50% de
levadura en polvo y 50% de kroketas Api can, se coloca una larva por -2
cm de s u p e r f i c i e del r e c i p i e n t e ( 34, 62 ) .
c) I n f e s t a c i ó n . - Las diluciones de los extractos y estándar IPS-82 son —
preparados con solución b u f f e r ( NaCl 0.85%, K2HP04 0.6% KH2 P04 0.3%)
para cada d i l u c i ó n se u t i l i z a n 25 l a r v a s , en recipientes i n d i v i d u a l e s
se i n f e s t a n con una l a r v a de 4 d í a s , de un peso 15-25 mg aproximadamen_
t e , s i l a s muestras son d i f í c i l e s de humectar, se agrega 25 mi de solu^
ción tween 80 al 1% para 10 mi de solución s a l i n a ( 24 ) .
d) Incubación. Después de l a i n f e s t a c i ó n , l o s r e c i p i e n t e s se incuban a
-30°C, con 50-60% de humedad r e l a t i v a .
e) Cuenta de m o r t a l i d a d . - Se toman l e c t u r a s a 0 . 5 , 1, 8 , 12, 24, 48 y 72
h r , se observó durante 5 . d í a s , en caso dudoso de muerte de l a l a r v a ,
-se toca con l a punta de una aguja, s i hay respuesta, por débil que
ést a sea se considera v i v a . Se c a l c u l a el porcienésto de moréstalidad y l a
-potencia para cada extracto a prueba. ( Resultados en Tablas 11-14 ) .
Esta determinación se l l e v ó a cabo en el Departamento de Zoología de
Invertebrados. Laboratorio de Entomología. Facultad de Ciencias B i o l ó
Potencia de l a
Muestra ( Ul/mg 1
LC50 del s t d . X Potencia del s t d .
( UI / mg ) LCcn de l a muestra
U . I a Unidades Internacionales
LC5q = Dosis l e t a l media
s t d . = Estándar
En la f i g u r a 1, se presenta un diagrama de f l u j o de los puntos 2-6 y en l a f i g y .
Fig l.-FERMENTACION Y RECUPERACION DEL COMPLEJO ES P O R A - C R I S T A L DE Baci Hu» 1huringi>n»t»
CONSERVACION OC LA CEP*
INOCULA CON . 5 % RES PCS TO A EL VOLUMEN
INCUBAR A 9 0 * C y ESO r . p - n .
4 0 - 7 1 * .
§
AJUSTAN pH 7 . 0CALDO DE FERMENTACION pH S.9 - 6 . 8
c
(SOBRENADANTE) (DESCARTADO)
SEDIMENTO
ABITAR 9 0 ABITAR 904
RE POSAR IO
ADICIONAR LENTAMENTE 9.9 v. ACETONA
RESUSPENDER CON LACTOSA AL S % l : i ' 7 v / v
O
SECAR A TEMP. AMBIENTE SEDIMENTO LAVARCON ACETONA.
PULVERIZAR EL COMPLEJO ESPORA-CRISTAL Y PESARLO FILTRAR CON VACIO SOBRE
Fiq. 2.-BIOENSÄYOS DE LOS EXTRACTOS DE Bacillus t h u r i n q i s n s i s CON
LARVAS DE MOSQUITOS.
m
SOLUCION CONC. SONICA OA S'
• COMPLEJO ESPORA' CRISTAL
w
• B &OILUC IONES
INCUBACION POR
7 OIAS
TOMA DE OATOS
• Z D Z D
BI0EN9AY0S
MEZCLAR
R E S U L T A D O S
AISLAMIENTO:
Las cepas de B a c i l l u s thurírigiensis que se u t i l i z a r o n tienen d i f e r e n t e —
procedencia; dos de las cuales provienen de I r a p u a t o , Guanajuato, o t r a de
Gua-dalupe Nuevo León y las t r e s restantes de Tapachula, Chiapas (. Tabla 3 ) . Estas
cepas se a i s l a r o n de d i f e r e n t e s fuentes: GM-7, GM-18 y GM-20, a p a r t i r de mues_
tras de suelo; GM-47, GM-48, GM-49 y GM-50 de larvas de mosquito muertas.
V
Las c a r a c t e r í s t i c a s generales de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s , respecto a morfó
l o g i a , c i t o l o g í a , colonia y metabolismo, son iguales para todas las cepas en
-e s t u d i o , -exc-epto -en tamaño, bord-e y susp-ensión d-e l a c o l o n i a ; -el tamaño d-e l a
colonia para GM-7 y GM-18 es de 5-12 rmi; para GM-20 es de 3-7 mm; para GM-47 y
GM50 es de 35 mn\y finalmente para GM48 y GM49 es de 23 ntn; el borde de
-l a co-lonia es crenado para todas -las cepas a excepción de GM-20 que es ondu-la-
ondula-do; l a suspensión de l a colonia es d i f í c i l para todas las cepas además es
gra-nular para GM-20 ( Tabla 2 ) .
La c l a s i f i c a c i ó n serológica de l a s cepas en estudio se reporta en l a T a
-bla 4 ; t r e s de e l l a s pertenecen a l a variedad aizawai y serotipo 7.
Las pruebas bioquímicas realizadas para l a i d e n t i f i c a c i ó n de las cepas,
-se muestran en l a Tabla 5. Las cepas GM-7, GM-49 y GM-50 pertenecen a l a misma
variedad y s e r o t i p o ; en e l l a s e x i s t e d i f e r e n c i a en sus pruebas bioquímicas: al_
gunos azúcares son metabolizados solamente por alguna de las cepas, x i l o s a por
GM-49; celobiosa por GM-50; s o r b i t o l por GM-49; m-1nusitol por GM-50; fructosa
por GM-49 y en GM-7 no se determino; l a caseína es desdoblada por todas las «
pas, esta es mayor en GM47 y GM48; l a arginina y s a l c i ñ a solo se determinó
en GM7, l a cual es p o s i t i v a ; l a esculina es desdoblada por todas l a s cepas,
-es mayor en GM-20, GM-7 y GM-50;'la p r o t e o l í s i s se produce en todas las cepas,
es mayor en GM-20, GM-47 y GM-48; treosa y maltosa son metabol izadas por todas
las cepas, en GM-7 no se determinó; l a amilasa es producida por todas las ce—
pas, es mayor en GM18, GM20, GM47 y GM48, es media en GM50 y menor en
-GM-7 y GM-49; l a o m i t i n a y q u i t i n a solo se determinó en -GM-7, es p o s i t i v a ; l a
formación de p e l í c u l a es p o s i t i v a en todas las cepas excepto en GM7; l a l e c i
-tinasa es producida por todas las cepas excepto por GM-20; Voges Poskrawer es
tantes son iguales en todas e l l a s .
CINETICA OE FERMENTACION:
En l a producción de las cepas de B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s , se u t i l i z a r o n on
ce d i f e r e n t e s medios de c u l t i v o , en los cuales se v a r i ó l a fuente de
carbono,-nitrógeno y l a adición de sales; para los medios I - V I I se u t i l i z ó : melaza,
har i n a de soya, l i q u i d o de haremojo de maíz, agua de cocimiento de levaduhara y s a
-l e s ; para -l o s medios V I I I - X I se u t i -l i z ó : g-lucosa, harina de soya, harina de —
maíz, e x t r a c t o de levadura, agua de cocimiento de levadura y s a l e s . La composi_
ción de estos medios se muestra en las Tablas 6 y 7.
De los 77 c u l t i v o s que se r e a l i z a r o n , se obtuvo el complejo e s p o r a c r i s
t a l de 29 de e l l o s , e l r e s t o se descartaron por no l l e g a r a esta fase f i n a l .
En l a Tabla 8, muestrá una r e l a c i ó n de cepa, medio de c u l t i v o y tiempo de f e r
mentación de estos 29 c u l t i v o s ; en 19 de e l l o s se u t i l i z ó melaza como fuente
-de carbono, el tiempo -de fermentación es -de 38-56 h r aproximadamente,
excepto-GM-50 r e q u i r i ó 72 hr en l o s medios I y X I .
El complejo e s p o r a - c r i s t a l se recuperó de todas las cepas de B a c i l l u s —
t h u r i n g i e n s i s , en alguno de los d i f e r e n t e s medios de fermentación a excepción
de V y V I I I .
MEDICION DE pH.
El pH de 7.0 permanece constante durante l a s primeras 12 h r , se
incremen-t a ligeramenincremen-te a 7 . 3 - 7 . 5 a l a s 24 h r , posincremen-teriormenincremen-te sigue aumenincremen-tando a 8.4 —
8.5 a las 38-56 h r , dependiendo de l a cepa y medio de c u l t i v o ; en este tiempo
las cepas l i b e r a n un 80% aproximadamente de los c r i s t a l e s . El comportamiento
en l a v a r i a c i ó n de pH es muy s i m i l a r para todos l o s medios. En l a cepa GM-50
e l tiempo de fermentación se prolongó a 72 hr en los medios I y XI. En l a T a
bla 9 y f i g u r a s 3 y 4 se presenta l a v a r i a c i ó n de tiempo, pH y azúcares r e
-ductores, para las cepas GM-49 y GM-50 en los medios IV y I I , respectivamente
estas cepas presentaron acción t ó x i c a .
OBSERVACION DE CRISTALES:
De l o s c u l t i v o s se toman muestras a d i f e r e n t e tiempo, de las cuales se
s i n t e ñ i r , l o cual f a c i l i t a la observación de l o s c r i s t a l e s , los primeros c r i s
t a l e s se presentan a las 36 hr aproximadamente, para algunas cepas,
continuan-do l a fermentación hasta l a l i b e r a c i ó n de 80% aproximadamente de los c r i s t a l e s
a las 38-72 h r , dependiendo de l a cepa y medio de c u l t i v o .
CONSUMO DE AZUCARES:
La c u a n t i f i c a c i ó n de azúcares reductores se r e a l i z ó en los medios IV y I I ,
donde fueron producidas l a s cepas GM-49 y GM-50, respectivamente; en e l l o s se
u t i l i z ó melaza como fuente de carbono; estas cepas fueron las que presentaron
t o x i c i d a d . En l a Tabla 9 se presenta l a c u a n t i f i c a c i ó n de azúcares de estas c£
pas, y se esquematizan estos datos en las g r á f i c a s I y I I . Para l a cepa GM-49
el consumo de azúcares se incrementan respecto al tiempo, esto se observa de
-0-24 h r , l a concentración de azúcares, baja de 1.35 g/1 a 1.05 g / 1 , después de
este período el consumo es mínimo; en las 12 hr posteriores es de 0.02 g / 1 , —
después de este periodo l o s azúcares no son metabolizados, permanece constante
l a concentración hasta l a fase f i n a l de l a fermentación. En GM-50 el
comporta-miento es s i m i l a r a esta cepa. ( f i g u r a 3 y 4 ) .
CUENTA DE ESPORAS VIABLES:
Esta se determinó en las cepas GM49 y GM50 en los medios IV y I I , r e s
-pectivamente; el número de esporas es de 2.5 x 106 para GM-49 y 2.8 x 106 para
GM-50, que presenta mayor número.
BIOENSAYO:
Las larvas colectadas se propagan bajo las condiciones establecidas en l a
metodología, seleccionando larvas del 42 estadio de mosquitos Aedes aegypti —
y Culex pipiens quinguefasciatus para el bioensayo. El porcentaje de m o r t a l i
-dad en Aedes aegypti es de 60% y 90% con GM-49 y GM-50, en los medios IV y I I
respectivamente, a una concentración de 120 mg/1, a las 48 h r ; para Culex - —
pipiens quinguefasciatus es de 73% y 71% con GM-49 y GM-50 en los medios ya —
mencionados, a una concentración de 120 mg/1 a las 48 hr ( Tabla 12 ) .
La concentración l e t a l media 0-C5 0) de las cepas de B a c i l l u s
-t h u r i n g i e n s i s para Aedes aegyp-ti y Culex pipiens quinguefascia-tus, se repor-tan
en las tablas 13 y 14. La LC5Q para Aedes aegypti es de 102.1 mg/1 y 69.98
-mg/1 para GM-49 y GM-50 en los medios IV y 11, respectivamente, a las 48 h r , y
quinquefasciatus de 50.04 mg/1 y 102.48 mg/1 para GM-49 y GM-50, en l a s medios
ya mencionados, a las 48 hr y de 1.508 x 10~2 mg/1 para el estándar IPS-82, a
las 24 h r . \
DISCUSIONES:
Las cepas GM7, GM49 y GM50 pertenecen a l a misma variedad y s e r o t i p o ,
-sin embargo hay variación en sus pruebas bioquímicas y t o x i c i d a d ; l a cepa GM-7
se a i s l ó de suelo, no presenta t o x i c i d a d , las o t r a s dos se a i s l a r o n de
cadáveres de mosquito, y pcadáveresentan t o x i c i d a d ; l a cepa GM48 también f u é " a i s l a d a de
-cadáveres de mosquito; pertenece a o t r a variedad y s e r o t i p o , l a cual no presen^
ta t o x i c i d a d .
Las cepas en estudio presentan las c a r a c t e r í s t i c a s generales de B a c i l l u s
t h u r i n g i e n s i s , con v a r i a c i ó n en las c a r a c t e r í s t i c a s de sus c o l o n i a s ; GM-20 p r £
sentó mas d i f e r e n c i a s respecto a las demás cepas.
Las pruebas bioquímicas de las cepas de igual variedad y s e r o t i p o , d i f i e
-ren en el metabolismo de algunos carbohidratos, como: x i l o s a , celobiosa, sorbi_
t o l , m i n o s i t o l y f r u c t o s a ; presentaron d i f e r e n c i a en las cantidades p r o d u c i
-das por algunas enzimas para las d i f e r e n t e s cepas; to-das las cepas presentaron
p e l í c u l a a excepción de GM-7
La producción del complejo e s p o r a - c r i s t a l c a r a c t e r í s t i c o de B a c i l l u s - —
t h u r i p g i e n s i sT se logró en todos los c u l t i v o s , excepto en los medios V y V I I ,
estos carecían de harina de soya y/o agua de cocimiento de levadura, en V I I I
-además CaC03; a l a s 72 hr de fermentación, se obtuvo un b a c i l o delgado s i n
es-p o r u l a r , ni formación de c r i s t a l , descartando los c u l t i v o s de estos medios, —
por no l o g r a r l a producción del c o m p l e j o . e s p o r a - c r i s t a l .
La cepa GM20 u t i l i z ó favorablemente 8 de los 11 medios de c u l t i v o ; con
c i c l o s de 38 hr» las otras cepas r e q u i r i e r o n de 4072 h r ; l o s medios I , V y
-V I I I no se logró l l e g a r a l a fase f i n a l ; en los medios I y I I I de igual
compo-s i c i ó n , ademácompo-s CaC03 en el ú l t i m o ; en el medio 1 no se completo el c i c l o , a di_
ferencia del medio I I I , si se concluye su c i c l o . En el medio I I carece de
-CaCO-j» y se logró obtener el complejo espora c r i s t a l ; este medio contiene agua
