Efecto inhibitorio in vitro del aceite esencial de shinus molle l “molle” sobre streptococcus mutans atcc 25175

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ESCUELA DE POST GRADO. PO. SG. RA DO. SECCIÓN DE POSTGRADO EN CIENCIAS MÉDICAS. EFECTO INHIBITORIO in vitro DEL ACEITE ESENCIAL DE Shinus molle. DE. L. “molle” SOBRE Streptococcus mutans ATCC 25175. : Ms. CD. ITALO WILFREDO CEDAMANOS GUTIÉRREZ. IO. AUTOR. TE. CA. TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE DOCTOR EN ESTOMATOLOGÍA. BI. BL. ASESORA : Dra. ELVA MANUELA MEJÍA DELGADO. TRUJILLO – PERÚ 2013. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. SG. Dra. Rosa Basauri Esteves. RA DO. JURADO DICTAMINADOR. DE. PO. PRESIDENTE. CA. Dr. Julio Hilario Vargas. BI. BL. IO. TE. SECRETARIO. Dra. Elva Manuela Mejía Delgado MIEMBRO. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. PO. SG. RA DO. AL SER SUPREMO QUE POR DARNOS LIBERTAD DE PENSAMIENTO Y SIEMPRE OBSERVA NUESTRO DESEMPEÑO ANTE SU CREACIÓN.. IO. TE. CA. DE. A MIS PADRES (MAURICIO Y CATALINA), ESPOSA (ROSA LIDIA) Y AMIGO ELMO PALACIOS G., EJEMPLOS Y APOYOS QUE MOTIVAN E INCENTIVAN MI FORMACIÓN PROFESIONAL Y HUMANÍSTICA.. BI. BL. A LAS AUTORIDADES ESTATALES QUE CON SUS COMPETENCIAS, DIGNO E INTEGRO EJEMPLO BUSCAN EL DESARROLLO DEL PAIS. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RA DO. AGRADECIMIENTO. PO. SG. A mi asesora por su comprensión, sutileza, dedicación y apoyo en la realización y conducción de la tesis.. CA. DE. A mi esposa, Rosa Lidia Mantilla Laguna por comprender la necesidad social y personal en seguir capacitándose.. BI. BL. IO. TE. Al docente, Mayer Luis Ganoza Yupanqui de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo por su apoyo voluntario e incondicional durante el proceso de la realización de la tesis.. Al alumno Geard Alvarado Gil de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo por su sincero, real y digno apoyo voluntario e incondicional durante el proceso de la tesis.. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. INDICE. I. RA DO. Carátula Contracarátula. II. Dedicatoria. III. Agradecimiento. IV. V. SG. Índice de contenidos Índice de gráficos, tablas e ilustraciones. PO. Resumen Abstracto. BI. BL. IO. TE. CA. DE. I. Introducción 1. Realidad observable 2. Justificación 3. Problema 4. Marco Teórico 5. Hipótesis 6. Objetivos II. Material y métodos 1. Material 2. Métodos Proceso de Captación de información (fotografías) III. Resultado Fotografías de la obtención de resultados IV. Discusión V. Propuesta VI. Conclusiones VII. Recomendaciones VIII. Referencias bibliográficas. VI IX X 01 01 01 02 02 11 12 13 13 13 53 19 56 27 35 38 39 40. Anexos. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE DE GRÁFICO, TABLAS E ILUSTRACIONES a) INDICE DE GRÁFICOS Y TABLAS. Tablas. RA DO. RESULTADOS. III-1. Efecto inhibitorio de la concentración mínima inhibitoria (CMI) in vitro del aceite esencial de Shinus molle L. “molle” sobre Streptococcus. SG. mutans ATCC 25175. Pág. 20-21.. III-2. Efecto inhibitorio de la susceptibilidad bacteriana in vitro del aceite. 25175. Pág. 23-24.. DE. Cuadro. PO. esencial de Shinus molle L. “molle” sobre Streptococcus mutans ATCC. III-1. Efecto inhibitorio in vitro del aceite esencial de Shinus molle L. “molle”. TE. CA. sobre Streptococcus mutans ATCC 25175. Pág. 26.. Gráfico 1. IO. III-1. : Efecto inhibitorio de la concentración mínima inhibitoria (CMI) in vitro. BL. del aceite esencial de Shinus molle L. “molle” sobre Streptococcus. BI. mutans ATCC 25175, según media aritmética del N° de unidades formadoras de colonias. Pág. 22.. III-2. : Efecto inhibitorio de la Susceptibilidad bacteriana in vitro del aceite esencial de Shinus molle L. “molle” sobre Streptococcus mutans ATCC 25175, según media aritmética del diámetro del halo en milímetros. Pág. 25. 6. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. b) INDICE DE ILUSTRACIONES PROCESO DE LA CAPTACIÓN DE LA INFORMACIÓN -. Fotografía 01. : Streptococcus mutans. Pág. 53.. Fotografía 02. : Shinus molle L. Pág. 53.. RA DO. ANEXO 04. Fotografía 03 y 04 : Turbidez semejante al tubo N° 0.5 del Nefelómetro de Mac. SG. Farland. Pág. 53.. : Recolectando hojas de Shinus molle L. Pág. 54.. Fotografía 06. : Destilación. Pág. 54.. Fotografía 07. : Separación del aceite con una micropipeta de la fracción. PO. Fotografía 05. DE. acuosa. Pág. 54.. : Plantones de Shinus molle L. Pág. 54.. Fotografía 09. : Residuos de Shinus molle L. en pozo orgánico. Pág. 54.. Fotografía 10. CA. Fotografía 08. : Tubos conteniendo aceite esencial o Bencilpenicilina diluido. TE. con medio Tioglicolato conteniendo Streptococcus mutans. IO. conforme la turbidez de Mac Farland. Pág. 55.. Fotografía 11. : Tubos preparados para incubarlos en estufa. Pág. 55.. BL. FOTOGRAFIA DE LA OBTENCIÓN DE RESULTADOS -. BI. ANEXO 05 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA Determinación de las unidades formadoras de colonias (UFC). 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Fotografía 12. : Colocando 0.1 mL de los tubos diluidos después de mantenerlos en microanaerobiosis sobre las Placas Petri. Pág. 56. : Placas Petri después de incubarlos en estufa. Pág. 56.. RA DO. Fotografía 13. Fotografía 14-17: Observamos pocas UFC de Streptococcus mutans en las concentraciones del aceite esencial de Shinus molle L. Pág. 57.. SG. Fotografía 18 : Ausencia de unidades formadoras de colonias de. 58.. PO. Streptococcus mutans al 100% del aceite esencial. Pág.. Fotografía 19 : Se observa pocas UFC de Streptococcus mutans en la. Fotografía 20. DE. bencilpenicilina. Pág. 58. : Se observan UFC de Streptococcus mutans en placas Petri. CA. del grupo control bacteriano. Pág. 58.. TE. DETERMINACIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA Determinación diámetro del halo de inhibición. BL. IO. Fotografía 21. BI. Fotografía 22. : Realizando cultivos de Streptococcus mutans en placas Petri. Pág. 59.. : Colocando discos de papel filtro en Placas Petri. Pág. 59.. Fotografía 23-28: Halo de inhibición según concentración del aceite esencial es no mayor a 8 mm, contrario a la bencilpenicilina, mostrando la diferencia significativa entre ellos. Pág. 60.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN Efecto inhibitorio in vitro del aceite esencial de Shinus molle L.. RA DO. “molle” sobre Streptococcus mutans ATCC 25175. : ITALO WILFREDO CEDAMANOS GUTIÉRREZ. Asesora. : Dra. ELVA MANUELA MEJÍA DELGADO. SG. Autor. Se determinó el efecto inhibitorio in vitro del aceite esencial de hojas del Shinus molle L. PO. “molle” sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 para contribuir en el tratamiento y prevención de patologías médicas, realizando 32 repeticiones de prueba de sensibilidad a. DE. antimicrobianos por dilución (concentración mínima inhibitoria) y difusión (susceptibilidad bacteriana) del aceite esencial a concentraciones 0, 25, 50, 75 y 100%, y grupo control con. CA. Bencilpenicilina procaínica 1000000 UI, aplicando y procesando resultados mediante análisis de varianza y prueba de Duncan. Encontrando efecto inhibitorio positivo de las. TE. concentraciones sobre Streptococcus mutans, la concentración mínima inhibitoria fue 25%. IO. y no hubo diferencia significativa entre 25, 50, 75 y 100%; y en susceptibilidad bacteriana. BL. no se observaron halos de inhibición en las concentraciones. Concluyéndose que las concentraciones del aceite esencial de hojas del Shinus molle L. sobre Streptococcus. BI. mutans ATCC 25175 tienen efecto inhibitorio y la concentración mínima inhibitoria es 25%.. Palabra Clave: Shinus molle L., Streptococcus mutans, Concentración mínima inhibitoria y Susceptibilidad bacteriana. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT In vitro inhibitory effect of essential oil of Shinus molle L.. RA DO. "molle" on Streptococcus mutans ATCC 25175 : ITALO WILFREDO CEDAMANOS GUTIÉRREZ. Adviser. : Dra. ELVA MANUELA MEJÍA DELGADO. SG. Author. The in vitro inhibitory effect of essential oil of leaves Shinus molle L. "molle" on. PO. Streptococcus mutans ATCC 25175 was determined to assist in the treatment and prevention of medical conditions, performing 32 repetitions of the test antimicrobial. DE. susceptibility by dilution (minimum inhibitory concentration) and diffusion (bacterial susceptibility) of essential oil at concentrations of 0, 25, 50, 75 and 100%, and control. CA. group with procaine benzylpenicillin 1000000 IU, applying and processing the results using analysis of variance and Duncan test. Finding positive inhibitory effect in concentrations on. TE. Streptococcus mutans; the mean minimum inhibitory concentration was 25% and significant difference between 25, 50, 75 and 100%; and on bacterial susceptibility were. IO. not observed inhibition halos in concentrations. Concluding that the concentrations of. BL. essential oil from Shinus molle L. on Streptococcus mutans ATCC 25175 have inhibitory. BI. effect and the minimum inhibitory concentration is 25%.. Key word: Shinus molle L., Streptococcus mutans, minimal inhibitory concentration and. bacterial susceptibility.. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Efecto inhibitorio in vitro del aceite esencial de Shinus molle L. “molle” sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 INTRODUCCIÓN. RA DO. I.. 1. Realidad observable 1.1.. Realidad Problemática. En el ámbito académico - investigativo están presentándose estudios. SG. multidisciplinarios con temas relacionados a la farmacognosia, microbiología y estomatología, como determinar efectos de extractos de plantas sobre microorganismos que. PO. desequilibran al sistema estomatognático al ser causantes directos o indirectos de ciertas enfermedades; pero no hay estudios in vitro según la literatura revisada que determinen el. DE. efecto inhibitorio del aceite esencial del Shinus molle L. sobre Streptococcus mutans, incluso conociendo que algunas enfermedades han sido tratadas, aliviadas o prevenidas por. CA. la medicina tradicional, como al establecer que al masticar las hojas frescas o una infusión concentrada de hojas trituradas como enjuagatorio del Shinus molle L. disminuye la. TE. movilidad dental, trata la enfermedad periodontal, evita la halitosis y desinflama la boca. IO. (encía)1.. 2. Justificación. BL. Ante la necesidad de aplicar tratamientos alternativos a la medicina alopática. BI. e existiendo indicios en la medicina tradicional del efecto del Shinus molle L. sobre el Streptococcus mutans, sumado a que el Shinus molle L. es accesible económicamente y geográficamente al ser originario y abundante en el Perú como en América Latina; su uso como ingrediente en medicamentos estomatológicos reduciría los altos costos en los tratamientos de prevención y rehabilitación contra las patologías y/o infecciones producidas 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. en el hombre por el Streptococcus mutans; por lo que el propósito de la investigación es conocer el efecto inhibitorio in vitro del aceite esencial de Shinus molle L. “molle” sobre Streptococcus mutans ATCC 25175. Además, al verificar el efecto inhibitorio del Shinus. RA DO. molle L. sobre el Streptococcus mutans ATCC 25175, la investigación pretende emplear la medicina natural al utilizarla como Tratamiento y prevención de patologías médicas estomatológicas causadas por esta bacteria.. 3. Problema. PO. “molle” sobre Streptococcus mutans ATCC 25175?. SG. ¿Cuál es el efecto inhibitorio in vitro del aceite esencial de Shinus molle L.. 4. Marco Teórico. DE. El conocimiento y la utilización de la fitoterapia es más frecuente, incluso, está profundamente difundida y arraigada en las distintas regiones del Perú, por ejemplo el. CA. Shinus molle L. se aplica en el tratamiento de las enfermedades relacionadas al Streptococcus mutans. Además, los españoles en el Perú encontraron que Shinus molle L.. TE. ha sido utilizado en diferentes patologías en la medicina indígena y su efecto terapéutico se debe al contenido de componentes químicos (metabolitos primarios y secundarios). BL. IO. denominados Principios Activos de los Vegetales1. Los principios activos que contiene el Shinus molle L. son: 1) monoterpenos;. BI. 2) triterpenos; 3) sesquiterpenos; 4) lípidos; 5) enzimas; 6) alcaloide; 7) flavonoides; y 8) alto porcentaje de tanino; 9) sustancia de estructura química no bien determinada que ha sido llamada "Sustancia Shinus molle L." con C24H4802 como fórmula global1; 10) betasistosterol (fitosterol)2; 10) productos de terpenos (saponinas esteroidales y esteroles); y 11) ácidos grasos3. 12. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Por lo expuesto, para entender el efecto del aceite esencial del Shinus molle L. sobre el Streptococcus mutans in vitro, se analiza desde el enfoque de la farmacognosia general, que permitirá comprender que principios activos causan el efecto.. RA DO. El aceite esencial es miscible en disolventes orgánicos habituales4,5; algunos solidifican a bajas temperaturas6; solubles en alcoholes a alta concentración y poco en agua4,6; no tóxicos, aunque pueden provocar alergias en personas sensibles a determinados. SG. terpenoides; se degradan químicamente en presencia de luz solar, aire, calor, ácidos y álcalis fuertes, generando oligómeros de naturaleza indeterminada7; y se oxidan con. PO. facilidad y polimerizan dando productos resinosos6.. El aceite esencial varía cualitativa y cuantitativamente, dependiendo del. DE. origen botánico, del procedimiento de obtención6, del ciclo vegetativo del vegetal en que se procede a su recolección y las características edáfilas y climáticas de la zona5,6; es obtenido. CA. principalmente mediante destilación por arrastre con vapor de agua al procesar material. TE. vegetal fresco4,6; pueden estar ubicados en diferentes partes de la planta6,8, contiendo en mayor riqueza las hojas y flores; y siendo el tiempo requerido, generalmente, cuatro horas. IO. que varía según la naturaleza de la droga y su grado de pulverización5.. BL. El aceite esencial natural contiene sustancias responsables del aroma de las. plantas5,6,8 y es una mezcla compleja de sustancias cuyos componentes mayoritariamente. BI. son dos grupos, derivados terpénicos (monoterpenos y sesquiterpenos) y de los derivados aromáticos fenilpropánicos, menos abundante que los anteriores. Presentan otro grupo de compuestos de bajo peso molecular como: carburos, ácidos comprendidos entre C3 y C10,. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. alcoholes, aldehídos, ésteres y en algunos casos cumarinas (herniarina)5. Además, ácidos orgánicos, lactonas, anhídridos, éteres y fenoles4. El aceite esencial del Schinus molle L. tiene como punto de ebullición de. RA DO. 150 - 300 °C9 y está constituido por veinte o más compuestos como salicina, alcanfor y linalol10. Además, Zegarra VG (2010) la obtiene por destilación por arrastre a vapor, considerándolo un líquido incoloro con densidad relativa de 0,869 g/cm (20 ºC), encontró. SG. compuestos mayoritarios en monoterpenos (90,2%) [α-felandreno (33,5), β-mirceno (25,7), silvestreno (23,5), ρ-cimeno (4,8) y α-pineno (2,7%)]11.. PO. Terpenos son solubles en solventes orgánicos12; típicos constituyentes del aceite esencial13; los terpenos y derivados terpénicos son relativamente volátiles. DE. produciendo atractivos olores que pueden depender de la luz y de la temperatura13; e incluye compuestos con actividades farmacológicas importantes como esteroles, saponinas,. CA. glucósidos cardíacos y terpenos modificados5,8. Saponinas poseen elevado peso molecular1,. TE. causan hemolisis en soluciones muy diluidas8, al ser heterósidos son solubles en agua y tienen efecto antimicrobiano debido mayoritariamente a las saponinas triterpénicas. Los. IO. glucósidos cardíacos en general son bastantes solubles en agua6. Las lactonas. BL. sesquiterpénicas son de escasa presencia al extraerlos por hidrodestilación y algunas son antimicrobianas (frente bacterias Gram (-))5 e inhibidores del crecimiento de bacterias,. BI. etc5,8.. Destacan por su actividad antimicrobiana los derivados terpénicos oxidados,. representados en primer lugar por derivados fenólicos, como timol y carvacrol, los cuales modifican la permeabilidad de la membrana bacteriana ocasionando su muerte. Los. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. derivados alcohólicos y cetónicos, tales como linalol, geraniol, citral, alcanfor, etc., poseen igualmente propiedades antibacterianas, si bien menos marcadas que el timol y carvacrol5. Además, tienen mayor actividad antimicrobiana conforme se mencionan son: derivados. RA DO. alcohólicos, aldehídicos y cetónicos14. Polifenoles, según su estructura química básica son: flavonoides, taninos, cumarinas, ácido fenólico, ligninas5,8, cromenos y benzofuranos, xantonas y quinonas;. SG. tienden a ser solubles en agua8; y desarrollan efectos farmacológicos que grosso modo vendrían de poder absorber la luz ultravioleta, las posibilidades redox del agrupamiento. PO. fenólico o la capacidad quelante de ciertos cationes5 que dañan la pared celular bacteriana, requiriendo más investigación para reforzar su efecto antibacteriano15.. DE. Los flavonoides son de bajo peso molecular16; antimicrobianos (como flavonoides prenilados5,8); existe una base común entre investigadores que explican sus. CA. efectos farmacológicos, estableciendo la actividad antioxidante como la más probable; y al. TE. extraerlos por agua a ebullición se obtiene a las flavanos como las catequinas, poliglicósidos y flavandioles; y al extraerlos por agua se obtiene heterósidos y geninas más. IO. polares, como flavonas hidroxiladas, flavonoles, auronas y chalconas. Los heterósidos y. BL. geninas son compuestos cristalinos5. Los taninos vegetales son sustancias generalmente amorfas5 de alto peso. BI. molecular que se caracterizan por formar complejos estables con las proteínas5,17; describiéndose más de treinta taninos que pueden inhibir bacterias18 y considera como pseudotaninos al ácido gálico, catequinas o ácido clorogénico, etc5. El Shinus molle L. pertenece a la familia anacardiaceae19, aislándose en su familia dépsidos producidas por. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. taninos gálicos o galotaninos. Además, la extracción con agua caliente origina ácido gálico, ácido elágico y otros fragmentos que se forman de la descomposición de los taninos elágicos o elagitaninos. La unidad estructural de los taninos condensados o. RA DO. proantocianidinas es la catequina de comprobado efecto hacia Streptococcus mutans5. Las cumarinas son de color blanco o amarillento6; muchas han demostrado efecto antibacterial, como el dicumarol y la acción antibiótica de la novobiocina8,10; se. SG. presentan a menudo como mezclas, en forma libre o como glicosidos8; las cumarinas libres se pueden extraer, si está en forma de heterósido son más o menos solubles en agua5,8; y la. PO. herniarina (7-metoxicumarina) es extraíble por hidrodestilación5.. Los lignanos son dímeros de unidades fenilpropano, ampliamente. DE. distribuidos en la naturaleza que dentro de ellos tenemos a los hibridos (lignoides), como:. CA. flavanolignanos, cumarinolignanos, etc5.. Cromenos y benzofuranos están presentes generalmente en hojas que se. TE. extraen por destilación con poca efectividad comparado con solventes orgánicos8. Además, algunos son bacteriostáticos como el toxol y dehidrotrementona y existen algunos. IO. fototóxicos a varias bacterias como el encecalin, el 7-hidroxiencalin y la 6-. BL. metaoxieuparina8,10.. BI. Los alcaloides presentes en especies vegetales se encuentran en estado de. sales (de ácidos minerales u orgánicos)5 y habitualmente contiene varios y sustancias. relacionadas6; la presencia de oxígeno en la molécula de los alcaloides confiere a éstos propiedades físicas particulares: los que carecen de oxigeno se obtiene por destilación con arrastre de vapor (conina, nicotina, esparteína, etc5), los oxigenados generalmente son 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. incoloros y blancos5,6 y algunos en que la proporción de oxigeno es baja y su peso molecular poco elevada aparecen al estado líquido o cristalizan con dificultad (arecolina, peletierina, pilocarpina, higrina)5; en forma libre, las base xántinas y las sales de amonio. RA DO. cuaternarios son solubles en agua6; En forma de sal, generalmente son solubles en agua5,6; a pH ácido predomina la forma protonada soluble en agua6; a pH básico los alcaloides están mayoritariamente en forma libre (no salina)6. El alcaloide quinina es antiséptico y los encontrados recientemente muestran diversas acciones, como la carpaina que es. SG. antibacterial8,10. Su mecanismo de acción parece ser mediante intercalación entre la pared. PO. celular y el DNA del microorganismo18.. Además, entre las quinonas se tiene a las benzoquinonas y naftoquinonas por. DE. ser sustancias altamente reactivas y arrastrables en corriente de vapor de agua. Las naftoquinonas tiene como principales compuestos a la yuglona empleada en afecciones de. CA. la cavidad bucal y faringe5 y al lapachol como bacteriostático8. El mecanismo de acción de las quinonas se debe a su alta reactividad, formando complejos con aminoácidos. TE. hidrofílicos de las proteínas, mayormente al inactivar las proteínas y anulando su función, ocasionándole un amplio potencial antimicrobiano, como la hipericina (antraquinona)18. La. IO. antraquinona, reina, tiene actividad bacteriostática frente a S. aureus5.. BL. El aceite esencial del Schinus molle L. se encuentra principalmente en hojas. BI. hasta 2% e in vitro son antibacterianos Gram (+) y Gram (-)11. Finalmente, para determinar su efecto in vitro existen distintos métodos de pruebas de sensibilidad a los. antimicrobianos, los más importantes son difusión (susceptibilidad bacteriana) y dilución (concentración mínima inhibitoria)20.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El Streptococcus mutans produce mayor cantidad de ácido a partir de hidrato de carbono que otras bacterias bucales porque pueden fermentar una amplia variedad de azúcares y tolerar más ácido que otros estreptococos bucales21; es coco Gram positivo;. RA DO. anaerobio facultativo; sus colonias en agar sangre son alfa [α] y gamma [γ] hemolíticos y excepcionalmente, beta [β] hemolíticos; patógeno primario de la caries dental22 que por predominar en lo profundo de la cavidad cariosa es uno de los responsables de la lesión inicial de la pulpa23; causante importante de endocarditis subagudas22,23; uno de los. SG. principales microorganismos aislados en abscesos cerebrales24; es uno de los dos causantes. PO. de la estomatitis sub-protésica25; y aumentan en la placa durante el tratamiento ortodóntico activo26. Para cultivarlo se inocula en placas Petri enriquecidas que permita la obtención de la unidad formadora de colonias (ufc) -punto donde se deposita una bacteria dará lugar,. DE. después a su multiplicación20, que al pertenecer al Género Streptococcus, la colonia es convexa o pulviniforme, translúcida, de tamaño puntiforme, mantecosa21, su crecimiento y. CA. la hemolisis se favorecen por incubación en 10% de CO227.. TE. El efecto de Shinus molle L. sobre el Streptococcus mutans, es establecida por la medicina popular al demostrar que la masticación de sus hojas frescas o infusión. IO. concentrada de hojas trituradas como enjuagatorio disminuye la movilidad dental, trata la. BL. enfermedad periodontal, evita la halitosis y desinflama la boca (encía)1. Estos efectos no. BI. son por un sólo principio activo, sino que existe una acción sinérgica o antagónica entre varias sustancias, dificultando la valoración terapéutica y en otros casos corresponde a un principio activo no conocido5. La mayoría de compuestos antimicrobianos en el Shinus molle L. son terpenos y flavonoides28 y en ocasiones diferentes partes de una planta tienen principios activos distintos5. Finalmente, el efecto del Shinus molle L., bacteriostático o 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. bactericida, sólo en un estudio in vitro se indicará con certeza cuál es su comportamiento real sobre el Streptococcus mutans 22.. RA DO. Marco Filosófico. El Streptococcus mutans afecta al diente que es importante en la masticación y la mucosa oral, al recibir directamente las cargas de la masticación de alimentos y tener receptores al tacto y dolor. Actualmente, el aumento de Streptococcus. SG. mutans es por focos infecciosos como caries dental y remanentes radiculares que al entrar. PO. al sistema circulatorio es necesario eliminarlos con antibacterianos, que en algunos casos presentan efectos colaterales. Finalmente, existe necesidad de mayores investigaciones para buscar tratamientos y formas preventivas con menos efectos colaterales y más accesibles. DE. económica y geográficamente a la población.. los. tratamientos. y. formas. preventivas. para. CA. Posiblemente,. enfermedades causadas por Streptococcus mutans en el futuro, será el uso de la medicina. TE. tradicional al tener menos efectos colaterales, ser accesibles económica y geográficamente, por ejemplo al usar Shinus molle L. cuyos principios activos posiblemente tienen efecto. IO. sobre Streptococcus mutans. Precisamente, la motivación del estudio es pretender encontrar. BL. un agente que produzca efecto antibacteriano sobre Streptococcus mutans, argumento que. BI. se orienta en el marco del positivismo empírico, descrito por primera vez por el filósofo y matemático francés del siglo XIX, Augusto Comte. Además, la tesis principal es verificacionista al sostener que una proposición es significativa sí, puede ser verificada empíricamente29.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La verificación fue realizada in vitro al aplicar aceite esencial en cultivos de Streptococcus mutans diluidos sobre placas Petri con medio Agar Mueller Hinton más 5 % de sangre de conejo, entonces se basó en la categoría filosófica de. RA DO. causalidad (del latin “causa”: causa). Categoría que indica la conexión necesaria de fenómenos, uno de los cuales (denominado causa) condiciona a otro (denominado efecto). La causa absoluta es el conjunto de circunstancias cuya presencia determina necesariamente el efecto y la causa específica es el conjunto de circunstancias que existen. SG. en la situación dada, antes del efecto. La causa absoluta es el aceite esencial de Shinus. PO. molle L. en cinco concentraciones: 0, 25, 50, 75 y 100% aplicado (causa específica) al cultivo de Streptococcus mutans en placas Petri con medio Agar Mueller-Hinton más 5 %. DE. de sangre de conejo.. Para Hurtado y Toro (1998) la investigación cuantitativa, tipo de. CA. investigación de la presente tesis Doctoral, debe tener una concepción lineal y claridad entre elementos que conforman el problema, limitarlos y saber con exactitud el inicio del. TE. problema. En la investigación, se realizaron procedimientos para aplicar el método de prueba de sensibilidad a los antimicrobianos por dilución y difusión, con los datos. IO. obtenidos se aplicaron pruebas estadísticas30 para conocer el efecto inhibidor del aceite. Según Whewell (1986), filósofo inglés, el paradigma cuantitativo es a. BI. BL. esencial de hojas del Shinus molle L.. su vez deductivo, donde se recolectan datos para evaluar modelos, hipótesis preconcebidas, controlando situaciones intervinientes para finalmente establecer una observación estable, objetiva y repetible. Coincidiendo con Smith (1983), quien afirma que los enunciados serán verdaderos o no en función de que puedan ser verificados31. Las pruebas realizadas en el 20. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. estudio fueron repetidas y verificadas al realizar treinta y dos repeticiones por prueba, para obtener el promedio y la significancia estadística que finalmente confirme la hipótesis al deducir que el efecto inhibitorio in vitro del aceite esencial de Shinus molle L. “molle”. RA DO. sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 es positivo. La tesis Doctoral, es relevante al basarse en los principios de la microbiología y farmacognosia con el propósito de conocer el efecto inhibitorio in vitro del. SG. aceite esencial de Shinus molle L. “molle” sobre Streptococcus mutans ATCC 25175. Efecto que podría ocurrir en el hombre, pero debe determinarse la concentración o dosis. PO. adecuada, que según el presente estudio el efecto inhibitorio fue a partir del 25%. Entonces, el S. molle, podría servir para el tratamiento y prevención de caries dental, pulpitis,. DE. abscesos cerebrales, estomatitis sub-protésica y endocarditis subaguda, posiblemente con menos efectos colaterales comparado con las drogas utilizadas actualmente. Además, es. CA. importante porque abre nuevas líneas de investigación en el uso de la medicina no tradicional y estomatológica en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el. TE. Streptococcus mutans.. IO. 5. Hipótesis. BI. BL. 5.1.. 5.2.. Hipótesis alterna: El efecto inhibitorio in vitro del aceite esencial de. Shinus molle L. “molle” sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 es positivo. Hipótesis nula: El efecto inhibitorio in vitro del aceite esencial de Shinus molle L. “molle” sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 es negativo.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 6. Objetivos 6.1.. General Conocer el efecto inhibitorio in vitro del aceite esencial de Shinus. 6.2.. Específicos . RA DO. molle L. “molle” sobre Streptococcus mutans ATCC 25175.. Determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) in. vitro del aceite esencial de Shinus molle L. “molle” sobre Streptococcus mutans ATCC. SG. 25175, entre las concentraciones de 00, 25, 50, 75 y 100%. . PO. Determinar la susceptibilidad bacteriana in vitro del aceite. esencial de Shinus molle L. “molle” sobre Streptococcus mutans ATCC 25175, a las concentraciones de 00, 25, 50, 75 y 100%.. DE. . Determinar el efecto inhibitorio in vitro del aceite esencial de. Shinus molle L. “molle” sobre Streptococcus mutans ATCC 25175, a las concentraciones. BI. BL. IO. TE. CA. de 00, 25, 50, 75 y 100%.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II.. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Material 1.1. Material Biológico. RA DO. Cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175 mantenida en el cepario de la Sección de Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo, Perú.. SG. Para obtener la CMI y la susceptibilidad bacteriana se trabajó al Streptococcus mutans en 32 repeticiones de Placas Petri con medio Agar Mueller Hinton. PO. más 5% de sangre por concentración obtenidos por el método no probabilístico. Además, por cada método de prueba de sensibilidad a los antimicrobianos se adicionaron el grupo. DE. control bacteriano y con penicilina. 1.2. Material Botánico. CA. Hojas de Shinus molle L., recolectadas en el Jardín Botánico – Plantas medicinales Rosa Elena de los Ríos Martínez de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de. TE. la Universidad Nacional de Trujillo. En el laboratorio de Métodos Instrumentales de la Facultad de Ingeniería química de la Universidad Nacional de Trujillo se seleccionaron las. IO. hojas que no tenían daño alguno; quedando aptas para su procesamiento.. BI. BL. 2. Métodos 2.1 Métodos Científico Método empírico: Experimentación explicativo. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2 Variables y sus escalas de medición. (concentración). naturaleza. 25 Aceite. 50. esencial. 75. Escala de INDICADORES. medición. Cuantitativa. 00. su. Vial ámbar de vidrio, de 1,5 mL para análisis. Menor concentración del aceite esencial de Shinus molle L., referido en porcentaje, que inhibe el crecimiento visible de Streptococcus mutans expresado en unidades formadoras de colonias (UFC).. por. conteniendo. la. SG. Cualitativa. Streptococcus. rotulado. concentración correspondiente.. 100 Concentración mínima inhibitoria (CMI). hplc. RA DO. Por. De razón. Dimensión. Nominal. VARIABLE. mutans. Diámetro de la zona clara o halo de inhibición después de la incubación, que rodea al papel filtro (que contiene aceite esencial de Shinus molle L. a una concentración expresa en porcentaje) que se coloca sobre Agar Mueller Hinton sembrado con Streptococcus mutans expresada como medida inhibitoria el no crecimiento de Streptococcus mutans dentro del halo de inhibición.. CA. DE. PO. Susceptibilidad Bacteriana. TE. 2.3 Operacionalización de Variables VARIABLE. DEFINICIÓN CONCEPTUAL. Producto farmacéutico no artesanal obtenido de hojas. principalmente. mediante. frescas de Shinus molle L. mediante destilación por. destilación por arrastre con vapor de. arrastre con vapor de agua, disuelto con Alcohol etílico. agua al procesar material vegetal. 96° GL y obteniendo las concentraciones (grupo. fresco, líquido volátil a temperatura. experimental): 00, 25, 50, 75 y 100%.. BL. IO. Producto farmacéutico no artesanal ,. ambiente. 4. obtenido. que. se. degradan. Su efecto Inhibitorio sobre el Streptococcus mutans, se. químicamente al contacto directo de la. basó en los métodos de prueba de sensibilidad a los. luz7 y solubles en alcoholes a alta. antimicrobianos: concentración mínima inhibitoria y la. BI. Independiente. DEFINICIÓN OPERACIONAL 1. Aceite esencial. 4. concentración y poco en agua .. susceptibilidad bacteriana, se consideró: -. Positivo= Inhibición en ambas métodos o en uno. hubo no inhibición. -. Negativo= Ambos métodos hubo no inhibición.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Streptococcus mutans es coco Gram. Streptococcus mutans, expresado visiblemente como una. con 0,5 a 0,75  de. colonia convexa o pulviniforme, translúcida, de tamaño. diámetro; anaerobio facultativo33; su. puntiforme y mantecosa ante los métodos de prueba de. nombre deriva porque las células. sensibilidad a los antimicrobianos y es hemolítico.. positivo. Streptococcus mutans. pueden perder su morfología coccal y aparecen como bastones cortos o. RA DO. Dependiente. 22,32. cocobacilos34; sus colonias en agar sangre son alfa [α] y gamma [γ] hemolíticos y excepcionalmente, beta. 2.4 Métodos procedimentales:. PO. 2.4.1. Preparación del inóculo. SG. [β] hemolíticos22.. Cada cepa se diluyó en Tioglicolato estéril hasta obtener turbidez. DE. semejante al tubo N° 0,5 del Nefelómetro de Mac Farland, el cual indica 108 UFC/mL. 2.4.2. Obtención del aceite esencial y concentraciones. CA. Se preparó aceite esencial de hojas del Shinus molle L., siguiendo el procedimiento:. TE. Primero se recolectó y escogió las hojas de “molle”,. considerando las nociones generales para no alterar los componentes de las plantas (Anexo. IO. N° 01) en dos días hasta almacenar un promedio de 6,35 kilos, posteriormente en el. BL. laboratorio como máximo en dos días se cortaron las hojas con guillotinas de fácil manejo y corte preciso lo más pequeño posible para colocarlo en el molinillo de la licuadora Imaco. BI. Modelo BL 75 e inmediatamente con un equipo de destilación por arrastre con vapor de agua (con la técnica de inyección de vapor de agua6) de 1 kilo se destiló por 30 minutos desde que hierbe el agua. Obteniéndose una mezcla heterogénea de agua y aceite,. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. inmediatamente se separó el aceite con una micropipeta de la fracción acuosa con ayuda de cloruro de sodio. Para obtener las concentraciones del aceite esencial se utilizó una. RA DO. micropipeta para vaciar el volumen de alcohol y/o aceite esencial puro dependiendo de la concentración (00, 25, 50, 75 y 100%) a obtener, dentro de un Vial ámbar de vidrio de 1,5 mL para análisis por Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) que fue rotulado según concentración.. SG. Para mejorar el impacto ambiental se sembraron dos plantones. PO. en la Institución Educativa Experimental Rafael Narváez Cadenillas y los residuos fueron depositados en una poza para obtener abono orgánico.. 2.4.3. Determinación de la concentración mínima inhibitoria. DE. Se utilizó y vació 0,8 mL de la mezcla de Bencilpenicilina procaínica de un millón UI con agua destilada (grupo control con penicilina) o aceite. CA. esencial de cada concentración en tubos de ensayo de 13x100 mL rotulados según. TE. concentración o Bencilpenicilina, a los cuales se adicionó 0,2 mL del cultivo de Streptococcus mutans diluido, posteriormente los tubos fueron colocados en Jarra de. Se utilizaron placas Petri con medio Agar Mueller Hinton más 5. BL. IO. Gaspack para incubarlos a 37 °C por 24 horas en microanaerobiosis21.. % de sangre de conejo, en los cuales se colocó 0.1 mL de cada tubo procesado. BI. anteriormente dispersándolo con un asa de Drigalsky (siembra en placa por dispersión35), se dejaron reposar por 10 minutos y luego se colocaron en Jarra Gaspack para incubarlos a 37 °C por 24 horas en microanaerobiosis. Finalmente, se realizó el conteo de las UFC (Anexo N° 02) de los grupos de trabajo, considerándolo: - Inhibición: Menor de 30 UFC. 26. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. - No inhibición: Mayor de 30 UFC. 2.4.4. Determinación de la susceptibilidad Bacteriana Se utilizó el método de Difusión con la técnica de Kirby y. RA DO. Bauer36, utilizando discos de papel filtro estériles de 6 mm de diámetro. Los discos fueron sumergidos en cada concentración de aceite esencial, luego con una aguja estéril fueron colocados sobre los cultivos de Streptococcus mutans en placas Petri con medio Agar. SG. Mueller Hinton más 5 % de sangre de conejo (No deben situarse a menos de 15 mm del borde de la placa y debe asegurase que contacten perfectamente con la superficie del agar). PO. rotuladas según concentración y en placas Petri destinadas al grupo control bacteriano se utilizaron discos embebidos con Bencilpenicilina procaínica de un millón, los. DE. procedimientos se realizaron dentro del diámetro de 10 cm de la llama de un mechero. Posteriormente las placas Petri se incubaron a 37 °C por 24 horas en microanaerobiosis. CA. utilizando la Jarra Gaspack .. TE. Finalmente, se midieron los halos de inhibición del grupo. experimental y control con penicilina, incluyendo el área del disco de papel filtro, con un. BL. IO. pie de rey manual para vaciar los datos en el anexo N° 03; considerando: -. Resistencia o no inhibición: Diámetro inferior a 8 mm el halo. -. Sensibilidad o inhibición: Diámetro de 8 a más mm el halo de. BI. de inhibición.. inhibición37.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.5 Ética Se tuvo en cuenta la manipulación y desecho de las muestras de las cepas del Streptoccocus mutans ATCC 25175 de acuerdo a la Serie de Normas Técnicas de. RA DO. bioseguridad en laboratorios de ensayo, biomédicos y clínicos, elaborado por Instituto Nacional de Salud Peruano durante la ejecución del trabajo, previas autorizaciones38. 2.6 Evaluación estadística de los datos. SG. Se utilizó el estadístico estadistico versión 18 y los resultados se presentan en tablas y gráficos estadísticos de acuerdo a los objetivos planteados. El efecto. PO. de ambos métodos a las 24 horas fue evaluado usando el análisis de varianza (Anova) y prueba de Kruskal-Wallis, adicionalmente la prueba de comparaciones múltiples o Prueba. BI. BL. IO. TE. CA. DE. de Duncan; ambas consideradas con significación estadística de 5% (p< 0,05).. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III.. RESULTADOS. Al realizar los métodos de prueba de sensibilidad a los antimicrobianos para conocer el. RA DO. efecto inhibitorio in vitro del aceite esencial de Shinus molle L. “molle” sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 y posteriormente utilizar el test de normalidad, se determinó la utilización del ANOVA, prueba de Kruskal-Wallis y DUNCAN.. Resultando en la concentración mínima inhibitoria in vitro que en cada concentración del. SG. aceite esencial de Shinus molle L. hubo inhibición sobre Streptococcus mutans ATCC 25175, estableciéndose que la concentración mínima inhibitoria fue 25%, a pesar que no. PO. hubo diferencia significativa entre las concentraciones de 25, 50, 75 y 100% (Tabla 01 y Gráfico 01).. DE. Asimismo, en la susceptibilidad bacteriana del Streptococcus mutans ATCC 25175 in vitro no se observaron halos de inhibición en ninguna de las concentraciones del aceite esencial. CA. de Shinus molle L. contrario al grupo control con penicilina, a pesar que hubo diferencia significativa entre el grupo de concentraciones 0, 25, 50 y 100%, Grupo control y la. TE. concentración al 75% y (Tabla 02 y Gráfico 02).. IO. Finalmente, el efecto inhibitorio in vitro del aceite esencial de Shinus molle L. “molle” sobre Streptococcus mutans ATCC 25175, a las concentraciones de 00, 25, 50, 75 y 100%,. BI. BL. es positivo (Cuadro 01).. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TABLA 01. RA DO. EFECTO INHIBITORIO DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) in vitro DEL ACEITE ESENCIAL DE Shinus molle L. “molle” SOBRE Streptococcus mutans ATCC 25175 Tabla 01 – A: Datos de la concentración mínima inhibitoria (CMI) CONCENTRACIÓN. CONTROL. DATOS 25%. 50%. 75%. 100%. BENCILPEN. Inhibición. Inhibición. Inhibición. Inhibición. Inhibición. Inhibición. +- ES. 05.31 +-12.31. 0.47+-1.04. 00.156+-0.45. 00.00+-0.0. 00.00+-0.0. 4.09+-6.72. DATOS. N° Placas Petri. N° de placas sin inhibición. 2. 00. N° de placas con inhibición. 30. 32. CUALITATIVA. N° Placas Petri N° Placas Petri N° Placas Petri N° Placas Petri N° Placas Petri 00. 00. 00. 00. 32. 32. 32. 32. DE. X. PO. CUANTITATIVO. SG. 0%. TE. CA. Fuente: Obtenido por el autor mediante examen microbiológico. X : Media aritmética. ES: Desviación estándar. BENCILPEN: Bencilpenicilina procaínica de 1 millón UI.. IO. Tabla 01 – B: Análisis de varianza para determinar el efecto del aceite esencial sobre S. mutans medida en número de unidades formadoras de colonias (UFC) Suma de cuadrados (SC). Grados de libertad (gl). Cuadrado medio (CM). Prueba F. 910.546875. 5. 182.109375. 5.5150684 1. 6141.78125. 186. 33.0203293. BI. BL. FUENTE DE VARIACIÓN Concentracione s Error. Significanci a (P) 9.25832E05. Total 191 P: Indica que existe diferencia significativa entre las concentraciones al aplicar la prueba paramétrica.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TABLA 01. RA DO. EFECTO INHIBITORIO DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) in vitro DEL ACEITE ESENCIAL DE Shinus molle L. “molle” SOBRE Streptococcus mutans ATCC 25175. SG. Tabla 01 – C: Prueba de Kruskal-Wallis para número de unidades formadoras de colonias (UFC). 43.9762. Grados de libertad (gl). PO. Chi-cuadrado. 5. CA. DE. Significancia (P) 2.3421E-08 P: Indica que existe diferencia significativa entre las concentraciones al aplicar la prueba no paramétrica.. TE. Tabla 01 – D: Prueba de Duncan. IO. Grupo de Investigación. Grupo para Alfa 0.05 Grupo 1. 75%. 32. 0. 100%. 32. 0. 50%. 32. 0.15625. 25%. 32. 0.46875. Penicilina Grupo Control. 32. BL BI. N. Grupo 2. 4.09375. 0% 32 5.3125 Grupos en la misma columna no difieren estadísticamente. Además, las concentraciones del grupo 1 que son al 25, 50, 75 y 100% tienen estadísticamente mejor inhibición que la concentración de del grupo 2 que son al0% (alcohol etílico 96° GL) y bencilpenicilina.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. GRÁFICO 01. RA DO. EFECTO INHIBITORIO DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) in vitro DEL ACEITE ESENCIAL DE Shinus molle L. “molle” SOBRE Streptococcus mutans ATCC 25175, SEGÚN MEDIA ARITMÉTICA DEL N° DE UFC. SG. Media aritmética del N° de UFC 35. PO. 25. Media aritmética del N° de UFC. DE. 20. 15 10 5 0. 25%. 50%. 75%. Concentraciones. 100%. PEN Límite inferior CMI. IO. TE. 0%. CA. Media de N° de UFC. 30. Límite superior CMI. BI. BL. Fuente: Datos obtenido por el autor. A pesar que la media de las UFC en cada concentración y bencilpenicilina es menor a 30 (inhibición), observamos gráficamente la diferencia significativa entre 25, 50, 75 y 100% con 0% (alcohol etílico 96° GL) y bencilpenicilina. PEN: Bencilpenicilina procaínica de 1 millón UI. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TABLA 02. RA DO. EFECTO INHIBITORIO DE LA SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA in vitro DEL ACEITE ESENCIAL DE Shinus molle L. “molle” SOBRE Streptococcus mutans ATCC 25175 Tabla 02 – A: Datos de la susceptibilidad bacteriana CONCENTRACIÓN. DATOS. CONTROL. 0%. 25%. 50%. 75%. 100%. BENCILPEN. Inhibición. Inhibición. Inhibición. Inhibición. Inhibición. Inhibición. 06 +-0.0. 06.09+-0.29. 06+-0.0. N° de placas sin inhibición. 32. 32. 32. N° de placas con inhibición. 00. 00. CUALITATIVA. +- ES. 06.37+-0.62. 06+-0.0. 44+-0.0. 32. 32. 00. 00. 32. PO. X. SG. CUANTITATIVO. 00. 00. X : Media aritmética. ES: Desviación estándar.. CA. DE. Fuente: Obtenido por el autor mediante examen microbiológico. BENCILPEN: Bencilpenicilina procaínica de 1 millón UI.. Suma de cuadrados (SC) 38320.276 14.719. BL. IO. FUENTE DE VARIACIÓN Concentraciones Error. TE. Tabla 02 – B: Análisis de varianza para determinar el efecto del aceite esencial sobre S. mutans medida en diámetro del halo de inhibición (mm) Grados de libertad (gl) 5 186. Cuadrado medio Significancia Prueba F (CM) (P) 7664.05521 96850.226 0 0.07913. BI. Total 38334.99479 191 P: Indica que existe diferencia significativa entre las concentraciones al aplicar la prueba paramétrica.. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TABLA 02. RA DO. EFECTO INHIBITORIO DE LA SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA in vitro DEL ACEITE ESENCIAL DE Shinus molle L. “molle” SOBRE Streptococcus mutans ATCC 25175. Chi-cuadrado Grados de libertad (gl) Significancia (P). SG. Tabla 02 – C: Prueba de Kruskal-Wallis para susceptibilidad (Diámetro del Halo en mm ). 155.6620121 5. CA. DE. PO. 8.31494E-32 P: Indica que existe diferencia significativa entre las concentraciones al aplicar la prueba no paramétrica.. TE. Tabla 02 – D: Prueba de Duncan para susceptibilidad (Diámetro del Halo en mm ) Grupo de Investigación. Grupo para Alfa 0.05 G1. 32. 6. 50%. 32. 6. 100%. 32. 6. 25%. 32. 6.094. BL. IO. 0%. N. G2. G3. BI. 75% 32 6.375 Penicilina Grupo 32 44 Control Grupos en la misma columna no difieren estadísticamente, pero sólo la penicilina tiene inhibición.. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. GRÁFICO 02. SG. RA DO. EFECTO INHIBITORIO DE LA SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA in vitro DEL ACEITE ESENCIAL DE Shinus molle L. “molle” SOBRE Streptococcus mutans ATCC 25175, SEGÚN MEDIA ARITMÉTICA DEL DIAMETRO DEL HALO EN mm. PO. 45. 40. DE. 35 30. CA. 25 20. 10 8. TE. 15. 25%. IO. 5. Media aritmética del Diámetro del Halo en mm. 50%. Límite inferior susceptibilidad. 75%. 100%. PEN. Concentraciones. BL. Media de Diámetro del Halo en mm. Media aritmética del Diámetro del Halo en mm. BI. Fuente: Datos obtenido por el autor La distancia de la media del diámetro del halo de inhibición de la Bencilpenicilina procaínica de 1 millón UI (PEN) a cada concentración del aceite esencial indica diferencia significativa. Además, sólo la penicilina presenta la media mayor al límite inferior de la susceptibilidad (8 mm).. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. CUADRO 01. RA DO. EFECTO INHIBITORIO in vitro DEL ACEITE ESENCIAL DE Shinus molle L. “molle” SOBRE Streptococcus mutans ATCC 25175 MÉTODO ACEITE ESENCIAL. EFECTO INHIBITORIO. CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA. SUSCEPTIBILIDAD. Inhibición. No inhibición. Positivo. 25%. Inhibición. No inhibición. Positivo. 50%. Inhibición. 75%. Inhibición. 100% Control: PEN. SG. 0%. PO. (alcohol etílico 96° GL). Positivo. No inhibición. Positivo. Inhibición. No inhibición. Positivo. Inhibición. No inhibición. Positivo. CA. DE. No inhibición. TE. Fuente: Obtenido por el autor mediante examen microbiológico e inferenciado mediante evaluación estadística.. BI. BL. IO. El efecto inhibitorio del aceite esencial de Shinus molle L. al 25, 50, 75 y 100% estadísticamente es positivo, semejante a la concentración de 0% (alcohol etílico 96° GL) y bencilpenicilina procaínica de 1 millón UI.. 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV.. DISCUSIÓN Como la medicina alopática es cuantiosamente iatrogénica y por la reducida o. RA DO. inexistente accesibilidad económica a los medicamentos de síntesis, aunada a países en vías de desarrollo (Perú) que no tienen una industria farmacéutica completa e internacional, es que el 80% de la población mundial usa las plantas medicinales39, motivo adicional para la. SG. realización de la investigación.. Las hojas del Shinus molle L. fueron recolectadas cuando hubo el mayor contenido. PO. de principios activos5 que depende de los factores climatológicos del Jardín Botánico de la Facultad de Farmacia y Bioquímica. Además, se determinaron las siguientes características. DE. físico-químicas del suelo y climatológicas: 1) pH ligeramente neutro de 6,5 a 6,8, 2) conductividad eléctrica no salina, 3) textura franco arenosa, 4) densidad aparente 1,7 g/cm3,. CA. presencia de carbonatos, 5) materia orgánica pobre, 6) altitud aproximada de 31 metros sobre el nivel del mar, 7) clima semi-tropical y con precipitaciones pluviales inferiores a 50. TE. ó 20 mm anuales40, 8) recolectadas de 7 a 8 am en Otoño a temperatura de 19 °C y 9). IO. aparentemente el árbol tiene 6 años. De la destilación de las hojas se obtuvo 4,75 mL de aceite esencial, posteriormente a. BL. 20 °C y 01 ATM se prepararon las concentraciones para obtener sus densidades41 mediante. BI. una balanza analítica Sartorius y micropipeta, siendo: 1) La densidad absoluta: al 00% fue 0,81341, 25% fue 0,81267, 50% fue 0,805, 75% fue 0,84533 y 100% fue 0,88038g/mL; 2) densidad de una mezcla: al 00% fue 0,81341, 25% fue 0,8960, 50% fue 0,84707, 75% fue 0,86707 y 100% fue 0,88038 g/mL, 3) la densidad relativa comparándolo con agua destilada (densidad absoluta fue 0,9887) para inyección: al 00% de 0,82271, 25% de 37 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 0,82195, 50% de 0,81420, 75% de 0,85499, 100% de 0,89045g/mL; importante para que sean comparados con otros estudios. Además, se obtuvo 4,18 g de aceite esencial que correspondió a 6,58% de las hojas escogidas.. RA DO. Al aceite esencial del Shinus molle L. se consideró un sistema homogéneo porque no se puede diferenciar la separación de sus componentes; por lo tanto cualquier porción que se tome tendrá la misma composición y propiedades. Además, es una disolución. SG. porque sus componentes pueden separarse mediante procedimientos físicos como la filtración. Los sistemas heterogéneos y las disoluciones reciben la denominación común de. PO. mezclas42. Entre sus componentes tenemos a sólidos cristalinos moleculares que tiene las siguientes propiedades físicas: 1) al ser sometidos a presión de vapor son volátiles, 2) tiene. DE. alta facilidad de sublimación y 3) su punto de fusión es bajo41. Sobre el método de la concentración mínima inhibitoria, en la tabla 01, se indica:. CA. según los datos obtenidos (tabla 01 – A) al evaluar las UFC en las placas Petri en cada. TE. concentración, las 32 tuvieron inhibición, excepto al 0% (solo alcohol) que en algunos casos no hubo inhibición; pero al obtener la media aritmética ( X ) y la desviación estándar. IO. (ES), las concentraciones mantenían su inhibición; porque los compuestos antibacterianos. BL. de la mezcla de aceite esencial y alcohol tuvieron contacto directo con Streptococcus mutans 20.. BI. Además, la prueba ANOVA (tabla 01 - B) y de Kruskal-Wallis (tabla 01 - C) indicó. diferencia estadística entre las concentraciones y la placa control (bencilpenicilina procaínica de 1 millón), posteriormente al aplicar Duncan (tabla 01 - D) se encontró diferencia significativa entre el grupo de concentraciones de 25, 50, 75 y 100% y el grupo. 38 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. de la concentración 0% y la bencilpenicilina procaínica; resultando inhibición mejor en el grupo de concentraciones de 25, 50, 75 y 100%, porque: 1) presentan mayor diversidad de componentes, que contribuyen en la actividad frente a bacterias patógenas variadas5 siendo. RA DO. las de mayor efecto antiséptica las moléculas que poseen, conforme se mencionan: grupo fenol, con función alcohol y función cetona6 y 2) hay un efecto sinérgico antibacteriano entre las moléculas del aceite y alcohol porque son solubles mutuamente41 y en el aceite esencial se encuentra moléculas sólidos cristalinas y/o amorfas con enlace intermolecular. SG. débil41 permitiendo formar derivados terpénicos alcohólicos de comprobado efecto. concentración bactericida (60 a 90%)43.. PO. antibacteriano1,4; a pesar que las concentraciones tienen menos alcohol que la. DE. Asimismo, al aplicar Duncan (tabla 01 - D) se encontró que no hubo diferencia significativa entre las concentraciones de 25, 50, 75 y 100% porque: 1) la concentración al. CA. 100% presenta una mezcla compleja de sustancias antibacterianos del aceite esencial, 2) al disminuir la concentración de aceite esencial (de 100 a 25%), por ente disminuyen en. TE. número los compuestos antibacteriano propios de las moléculas del aceite esencial que la conforman42, pero se produce una sinergia antibacteriana entre las moléculas del aceite y. IO. alcohol por ser: a) líquidos miscible (solubles mutuamente) débil41 y b) en el aceite esencial. BL. se encuentra moléculas sólidos cristalinas y/o amorfas con enlace intermolecular débil41. BI. que permiten obtener derivados de moléculas de comprobado efecto antibacteriano como los terpénicos alcohólicos1,4, incluso en la de 25%. Finalmente, se encontró hemolisis de mayor intensidad a medida que aumenta la concentración por la presencia de saponinas3.. 39 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Las concentraciones al diluirlas con tioglicolato sembrado con S. mutan con el método de la concentración mínima inhibitoria, se obtuvo al: 00%, el 00 y 76,8; 25%, 20 y 57,6; 50%, 40 y 38,4; 75%, 60 y 19,2; y 100%, 80% de aceite esencial y 0% de alcohol.. RA DO. A la concentración de 00% hubo inhibición (tabla 01 - A), porque la concentración del alcohol obtenido fue de 76,8%, porcentaje ubicado dentro de la concentración bactericida (60 a 90%)43. Además, no existió diferencia significativa entre la concentración. SG. al 00% y la bencilpenicilina procaínica de 1 millón UI44 (tabla 01 - D), ambas con inhibición, debido a su comprobado efecto antibacteriano. Finalmente, no se encontró. PO. hemolisis en la penicilina y en la concentración de 00%.. Con el método de la susceptibilidad bacteriana, usando la técnica de Kirby y Bauer,. DE. la concentración al 00% impregnada en el papel de filtro, contiene 00 y 96; 25%, 25 y 72;. CA. 50%, 50 y 48; 75%, 75 y 24; y 100%, 100% de aceite esencial y 0% de alcohol. Con la técnica de Kirby y Bauer se debe considerar que a temperatura ambiente el. TE. aceite esencial del Shinus molle L. es un líquido viscoso11 y volátil4,5,6 y el alcohol es un líquido volátil44, que al mezclarlos la concentraciones usadas siguen siendo volátiles y. IO. viscosas, pero al incubarlos a 37 °C la velocidad de volatilización aumenta debido al. BL. incremento de la temperatura41; ocasionando que sus moléculas antibacterianas al estar difundiéndose no tengan el tiempo suficiente para ser efectivos por el aumento de la. BI. temperatura. Además, cuando los taninos se disuelven en agua forman disoluciones. coloidales5,6 que disminuyen su difusión y de moléculas relacionadas. Asimismo, El papel de filtro no actúa únicamente como soporte para el disolvente, sino como agente de separación por adsorción, puesto que retiene a unas sustancias más 40. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. que a otras; sumado a que los procesos de adsorción-desorción y solubilidad diferencial tienen lugar de modo continuo mientras la mezcla se desplaza a través del papel45. La retención se incrementa debido a precipitación de la celulosa (usadas para la elaboración de. sólidos moleculares tienen un enlace intermolecular débil41.. RA DO. papel filtro6) ocasionada por los taninos6. Finalmente, las sustancias se retienen porque los. En la tabla 02, se indica: que los datos obtenidos (tabla 02 - A) al evaluar el halo de. SG. inhibición de las placas Petri en cada concentración, luego al obtener la media aritmética (XX) y la desviación estándar (ES), se confirma la no observación de los halos de. PO. inhibición de las 32 placas Petri según la operacionalización de las variables porque las moléculas que: a) se difunden son volátiles, como: derivados terpenicos relativamente. DE. volátiles13; los cromenos y benzofuranos son polifenoles volatiles8; alcaloides no oxigenados que son líquidos volátiles a temperatura ambiente5,6; el alcohol es volátil cuyo. CA. porcentaje en las concentraciones de 50, 75 y 100% están debajo de la concentración bactericida óptima (60 a 90%)43, contraria a la de 25% que también no tiene efecto; b) no se. TE. difunden son sólidas como: las lactonas sesquiterpénicas al ser generalmente sólidas y cristalinas5; los flavonoides al ser sólidos cristalinos5; los taninos al ser solidos amorfos6;. IO. alcaloides oxigenados al ser generalmente sólidos cristalizables5,6 y aquellos que son. BL. precipitados por los taninos6; celulosa que son precipitados por los taninos6; y cumarinas a. BI. ser sólidos cristalizables6. Además, las 32 placas Petri con bencilpenicilina procaínica de 1 millón UI presentaron inhibición por su comprobado efecto antibacteriano41. Al aplicar la prueba ANOVA (tabla 02 - B) y de Kruskal-Wallis (tabla 02 - C) se obtuvo diferencia estadística entre las concentraciones y la placa control (bencilpenicilina procaínica de 1 millón UI), posteriormente al aplicar Duncan (tabla 02 - D) se encontró 41 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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