Establecimiento y validación de metodologías para el análisis de nitrógeno, fósforo y potasio en tejidos vegetales foliares

(1)

UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA

La Universidad Católica de Loja

ÁREA BIOLÓGICA

TITULACIÓN DE BIOQUÍMICO FARMACÉUTICO

“

Establecimiento y validación de metodologías para el análisis de

nitrógeno, fósforo y potasi

_{o en tejidos vegetales foliares”}

AUTOR:

Silva Silva, Romina de los Ángeles

DIRECTOR: Capa Mora, Edwin Daniel

LOJA

–

ECUADOR

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iv

APROBACIÓN DEL DIRECTOR DEL TRABAJO DE FIN DE TITULACIÓN

Ingeniero.

Edwin Daniel Capa Mora

DOCENTE DE LA TITULACIÓN

De mi consideración:

El presente trabajo de fin de titulación: “Establecimiento y validación de metodologías para el análisis de nitrógeno, fósforo y potasio en tejidos vegetales foliares”, realizado por Silva Silva Romina de los Ángeles, ha sido orientado y revisado durante su ejecución, por cuanto se aprueba la presentación del mismo

Loja, 28 de febrero de 2014

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v

DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS

Yo, Silva Silva, Romina de los Ángeles declaro ser autora del presente trabajo de fin de titulación “Establecimiento y validación de metodologías para el análisis de nitrógeno, fósforo y potasio en tejidos vegetales foliares”, de la Titulación de Bioquímico

Farmacéutico siendo Edwin Daniel Capa Mora director del presente trabajo; y eximo expresamente a la Universidad Técnica Particular de Loja, y a sus representantes legales de posibles reclamos o acciones legales. Además certifico que las ideas, conceptos, procedimientos y resultados vertidos en el presente trabajo investigativo, son de mi exclusiva responsabilidad.

Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposición del Art. 67 del Estatuto Orgánico de la Universidad Técnica Particular de Loja que en su parte pertinente que textualmente

dice: “Forman parte del patrimonio de la Universidad la propiedad intelectual de

investigaciones, trabajos científicos o técnicos de tesis de grado que se realicen a través, o con el apoyo financiero, académico o institucional (operativo) de la Universidad”.

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DEDICATORIA

Esta tesis se la dedico a Dios y a la Virgen del Cisne, quiénes supieron guiarme por el buen camino, darme fuerzas para seguir adelante y no desmayar en los problemas que se presentaron, enseñándome a enfrentar las adversidades para no desfallecer en el intento.

A mi mamá Marcia, que hace todo en la vida para que pueda conseguir mis sueños y objetivos planteados, y que hoy gracias a ella puedo ver alcanzada esta meta.

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vii

AGRADECIMIENTOS

Hago llegar mi profundo agradecimiento a la Universidad Técnica Particular de Loja, especialmente a la Titulación de Bioquímica y Farmacia, por haberme brindado una sólida formación universitaria.

Al Departamento de Ciencias Agropecuarias y de Alimentos, en especial al laboratorio de Suelos Agrícolas; también al laboratorio de Química Analítica e Industrias de la UTPL, por su apoyo en proporcionarme todo lo necesario para la ejecución del presente trabajo.

De manera especial, mi sincero agradecimiento a Daniel Capa M., por haberme guiado y orientado en el cumplimiento de este trabajo investigativo, además por haberme brindado su confianza, tiempo, y por compartir sus conocimientos profesionales para mi formación.

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viii

ÍNDICE DE CONTENIDOS

CARATULA

iii

CERTIFICACIÓN

iv

DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS

v

DEDICATORIA

vi

AGRADECIMIENTOS

vii

ÍNDICE DE CONTENIDOS

viii

ÍNDICE DE FIGURAS

x

ÍNDICE DE TABLAS

xi

ABREVIATURAS

xii

RESUMEN

xiv

ABSTACT

xv

INTRODUCCIÓN

xvi

CAPÍTULO 1. MARCO TEÓRICO

1 1.1. Análisis foliar

2 1.1.1. Importancia de los análisis foliares

2 1.1.2. Utilidad de los análisis foliares

2 1.2. Nutrientes en las planta

3 1.2.1. Nitrógeno

3 1.2.2. Fósforo

4 1.2.3.Potasio

5 1.3.Métodos usados para la determinación de análisis foliares

5 1.3.1.Digestión y determinación de nitrógeno por destilación y

titulación manual

5 1.3.2.Calcinación y determinación de potasio por Espectrofotometría de

absorción y emisión atómica

6 1.3.3.Calcinación y determinación por calorimetría del

fosfo-vanadomolibdato

6 1.4. Validación de métodos analíticos

6 1.4.1. Validación

6 1.4.2. Clasificación de métodos de validación

6 1.4.3. Linealidad

7 1.4.4. Límite de cuantificación

7 1.4.5. Límite de detección

8 1.4.6. Exactitud

8 1.4.7. Precisión

8 1.4.8. Repetibilidad

8 1.4.9. Reproducibilidad

8 1.4.10. Incertidumbre

9

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ix

1.4.12. Coeficiente de variación

9 1.5. Especie considerada para la validación de los métodos

10 1.5.1. Tomate de árbol

10 CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS

11 2.1. Ubicación y descripción de la zona de estudio

12 2.2. Recolección de muestras foliares y de suelos

12 2.3. Análisis de tejidos vegetales foliares

13 2.3.1. Preparación de la muestra

13 2.3.2. Análisis de nitrógeno por método de micro-Kjeldhal.

Espectrofotometría de UV. V.

15 2.3.3. Análisis de fósforo por el método de molibdato vanadato de

amonio por Espectrofotometría de UV. V.

19 2.3.4. Análisis de potasio por el método de Espectrofotometría de

Absorción Atómica

24 2.4. Análisis de suelos

28 2.5. Análisis estadísticos y de validación

31 CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

33 3.1. Resultados validación de nitrógeno

34 3.2. Resultados validación de fósforo

41 3.3. Resultados validación de potasio

47 3.4. Resultados de análisis de suelos y foliares

54 3.5. Resultados de análisis foliares

55 3.6. Correlaciones entre nitrógeno, fósforo y potasio de la planta y

suelo

58 CAPÍTULO 4. CONCLUSIONES

62 CAPÍTULO 5. RECOMENDACIONES

64 CAPÍTULO 6. BIBLIOGRAFÍA

66

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x

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.

Deficiencia de nitrógeno en solanáceas

4 Figura 2

.

Deficiencia de fósforo en solanáceas

4 Figura 3

.

Deficiencia de potasio en solanáceas

5 Figura 4

.

Mapa de la Estación Agroecológica de la UTPL

12 Figura 5

.

Muestreo de hojas en el cultivo de tomate de árbol (muestreo

al azar)

13 Figura 6

.

Diseño experimental de bloques completos

31 Figura 7

.

Curva de calibración de nitrógeno

35 Figura 8

.

Gráfico control para nitrógeno

39 Figura 9

.

Diagrama causa y efecto para fuentes de incertidumbre de

nitrógeno

39 Figura 10

.

Curva de calibración de fósforo

42 Figura 11

.

Gráfico control para fósforo

45 Figura 12

.

Diagrama causa y efecto para fuentes de incertidumbre de

fósforo

46 Figura 13

.

Curva de calibración de potasio

48 Figura 14

.

Gráfico control para potasio

52 Figura 15

.

Diagrama causa y efecto para fuentes de incertidumbre de

potasio

53 Figura 16

.

Resultados de las absorbancias de nitrógeno en análisis

foliares

56 Figura 17

.

Resultados de las absorbancias de fósforo en análisis foliares

57 Figura 18

.

Resultados de las absorbancias de potasio en análisis foliares

57 Figura 19

Suelo desprovisto de materia orgánica en la plantación de

tomate de árbol. Estación Agroecológica UTPL

59 Figura 20

Deficiencias de macronutrientes en el cultivo de tomate de

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xi

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1

.

Reactivos utilizados para la determinación de nitrógeno

15 Tabla 2

.

Reactivos utilizados para la determinación de fósforo

20 Tabla 3

.

Reactivos utilizados para la determinación de potasio

25 Tabla 4

.

Valores de nitrógeno para la curva de calibración (linealidad)

34 Tabla 5

.

LDD Y LDQ para nitrógeno

35 Tabla 6.

Repetibilidad para nitrógeno

36 Tabla 7.

Reproducibilidad de nitrógeno. Prueba F para varianza

37 Tabla 8

.

Reproducibilidad de nitrógeno. Prueba T para 3 variables

37 Tabla 9

.

Recuperación de nitrógeno

38 Tabla 10

.

Incertidumbre nitrógeno

40 Tabla 11

.

Valores de fósforo para la curva de calibración (linealidad)

41 Tabla 12.

LDD y LDQ para fósforo

42 Tabla 13

.

Repetibilidad para fósforo

43 Tabla 14

.

Reproducibilidad de fósforo. Prueba F para varianza

43 Tabla 15

.

Reproducibilidad de fósforo. Prueba T para variables

44 Tabla 16

.

Recuperación para fósforo

44 Tabla 17

.

Incertidumbre fósforo

46 Tabla 18.

Valores de potasio para la curva de calibración (linealidad)

48 Tabla 19

.

LDD y LDQ para potasio

49 Tabla 20

.

Repetibilidad de potasio

50 Tabla 21

.

Reproducibilidad de potasio. Prueba F para varianza

50 Tabla 22

.

Reproducibilidad de potasio. Prueba T para variables

51 Tabla 23

.

Recuperación para potasio

51 Tabla 24.

Incertidumbre potasio

53 Tabla 25

.

Porcentajes de nutrientes en el suelo del cultivo de tomate de

árbol

54 Tabla 26

.

Interpretaciones de los resultados obtenidos en suelos

55 Tabla 27

Porcentajes de nutrientes en la planta del cultivo de tomate de

árbol.

55 Tabla 28

Interpretaciones de los resultados obtenidos en foliares

55 Tabla 29

Correlaciones de Pearson para nitrógeno, fósforo y potasio

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ABREBIATURAS °C = Grados centígrados

% CV = Porcentaje de coeficiente de variación % K = Porcentaje de potasio

% N = Porcentaje de nitrógeno % P = Porcentaje de fósforo Abs = Absorbancia

Ca = Calcio

Cf = Concentración final obtenida de la curva de calibración cmol/Kg = Centimol por kilogramo

Cu = Cobre cm = Centímetro

EAA = Espectrofotómetro de absorción atómica exp = Exponente

Fe = Hierro

Fd = Factor de dilución g = Gramo

g/l = Gramo por litro ha = hectáreas K = Potasio Kg = Kilogramo

LDD = Límite de detección LDQ = Límite de cuantificación Mg = Magnesio

mg/Kg = miligramo por kilogramo mg/l = Miligramo por litro

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nm = Nanómetro P = Fósforo

ppm = Partes por millón r2_{= Coeficiente de correlación}

S = Desviación estándar U = Incertidumbre

Wm = Peso de la muestra V = Volumen

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xiv

RESUMEN

El trabajo se desarrolló en los laboratorios de suelos agrícolas de la UTPL. Se estableció y validó metodologías para el análisis de nitrógeno, fósforo y potasio en tejidos foliares (cultivo de tomate de árbol), además se realizó una correlación entre contenido de nutrientes suelo - planta. Se hizo un muestreo inicial de hojas y suelo. Para validar las metodologías de análisis foliares se usó: Nitrógeno por micro-Kjeldahl y Espectrofotometría de Ultra Violeta Visible (UV-V.), Fósforo por Espectrofotometría de UV-V. y potasio por Espectrofotometría de Absorción Atómica (AA). Los análisis de suelos fueron: Nitrógeno, fósforo y potasio. El diseño experimental fue de bloques completos, y los estadísticos usando Tukey (p<0,05) con SPSS Statistics 17.0; además se evaluó los parámetros de validación: límite de detección, repetitibilidad, reproducibilidad recuperación e incertidumbre. Los resultados indican que la validación para nitrógeno, fósforo se han cumplido, no mostrando diferencia significativa en los análisis realizados; mientras que para el potasio pese a que se cumplió la validación, se han presentado inconvenientes a la hora de realizar los análisis, sin embargo no existió diferencia significativa entre las repeticiones.

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xv

ABSTRACT

This research work was developed in the agricultural soils laboratories from UTPL. In order to do this investigation were established the most suitable methodologies for the analysis of nitrogen, phosphorus and potassium in plant leaf tissues (crop tree tomato); furthermore, a correlation between nutrient content was performed soil – plant. An initial sampling of leaves and soil was done. To support the analysis foliar methodologies was used: Nitrogen by micro-kjeldahl and UV-V. Spectrophotometry, phosphorus by UV-V. Spectrophotometry and potassium AA Spectrophotometry. Also, analysis to soils: Nitrogen, phosphorus and potassium was accomplished. An experimental design of complete block was raised, and statisticians with Tukey test (p <0.05) using the SPSS Statistics 17.0; furthermore, the validation parameter were fulfilled: detection limit, repeatability, reproducibility uncertainty recovery among others. The results point out the validation for nitrogen, phosphorus were accomplished with total normality, there is not significance difference among the process done; meanwhile for potassium despite that it met necessary for validation, there have been drawbacks when taking readings in the AA spectrophotometer, although there has been no significant difference between the repetitions performed.

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xvi

INTRODUCCIÓN

El análisis de tejidos vegetales, consiste en la determinación de la composición química de la planta. Actualmente se considera como una referencia indispensable para saber los requerimientos nutricionales de plantaciones así como los estados carenciales de elementos nutritivos (Legaz et al., 2005).

El análisis foliar da una indicación precisa de la absorción de los diferentes nutrientes por la planta, debido a que las hojas son muy sensibles a los cambios de la composición del medio nutritivo (Valenzuela et al., 2000). De los resultados obtenidos dependerán las medidas a tomar para controlar los factores que limitan la absorción de macro y micro nutrientes en el cultivo y así optimizar su nutrición (Gadahía, 2008).

Las dosificaciones acertadas de fertilización mineral u orgánica permitirán el adecuado desarrollo de los cultivos agrícolas, lo cual se logra mediante un análisis físico - químico de suelos y de tejidos vegetales (Legaz et al., 2005).

El laboratorios de suelos agrícolas de la UTPL tiene desarrollado las metodologías para análisis físico químicos de los suelos, sin embargo se cree conveniente la implementación de los análisis foliares, para brindar un mejor servicio de recomendaciones de fertilización, ya sea en las investigaciones del Departamento, trabajos de consultorías o asesoramiento a pequeños y grandes productores agrícolas.

Para asegurar la calidad de la implementación de un análisis foliar, es preciso la validación de los métodos analíticos, siendo requisito indispensable en la práctica de los análisis químicos; en estos procesos se evaluará si el método o métodos aplicados cumplen con los requisitos necesarios; después de todo este proceso se verificará si el método (s) serán idóneos y fiables para su aplicación (Duffau et al., 2010).

Para validar el proceso químico analítico es necesaria la asignación de responsabilidad a un analista o laboratorista, este proceso debe ser efectuado de forma metódica, ordenada, trazable y confiable. El método únicamente será validado cuando cumpla con los parámetros de linealidad, precisión, exactitud y sensibilidad; lo que va a ayudar a concluir que el método o métodos seleccionados son los correctos (Mínguez et al., 1991 y Duffau et al., 2010).

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xvii

Para poder cumplir con el desarrollo de este trabajo se ha planteado los siguientes objetivos.

Objetivo general

Establecer y validar los métodos para el análisis de nitrógeno, fósforo y potasio en tejidos vegetales (cultivo de tomate de árbol Solanum betaceum Cav.).

Objetivos específicos

1. Establecer metodologías adecuadas para el análisis de nitrógeno, fósforo y potasio en tejidos foliares.

2. Validar los procesos metodológicos establecidos para los análisis foliares.

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1

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2

1.1. Análisis foliar

El análisis foliar es un método de diagnóstico que hace uso del análisis químico aplicado a partes representativas de la planta, para cuantificar las cantidades de nutrientes que ha absorbido; y supone es una de las mejores formas de conocer las características de los cultivos (Carvajal, 1978). Las partes a muestrear pueden ser secciones específicas de la planta, como los peciolos, las raíces y las hojas siendo éstas las que mejor reflejan el estado nutricional de la planta ya que ahí se efectúa la elaboración de las sustancias para el crecimiento (Laboratorio A-L de México, 2011).

La composición mineral de las plantas dependerá de muchos factores como: de la especie que se trate, de la edad, de la parte de la planta analizada, del clima, estación en que se realice el muestreo y del suministro de nutrientes del suelo (Rodríguez, 1990).

1.1.1. Importancia de los análisis foliares

Son una referencia indispensable para determinar tanto las necesidades de abonado de las plantaciones como los estados carenciales de macro y micro elementos. Esto se debe a que los análisis foliares dan una indicación precisa de la absorción de los diferentes elementos por la planta, ya que las hojas son muy sensibles a los cambios de composición del medio nutritivo (Legaz et al., 1995).

Un análisis completo del tejido puede detectar una deficiencia nutricional antes de que los síntomas aparezcan en la planta. El diagnóstico de "hambre oculta" a menudo le proporciona al productor la oportunidad de corregir el problema durante la etapa de crecimiento (Laboratorio A-L de México, 2011).

1.1.2. Utilidad de los análisis foliares

Las deficiencias nutricionales en la planta puede ser detectada a tiempo; en primera instancia se lo realiza por la sintomatología observada, sin embargo es necesario la confirmación de la deficiencia mediante análisis de planta (Barbazán, 1998).

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3

Los análisis pueden ser útiles para aclarar o interpretar una situación dada en los sistemas productivos, o para ajustar las dosis de fertilizante a usar en las diferentes etapas fenológicas del cultivo (Barbazán, 1998 y Legaz et al., 2005).

En la actualidad el análisis foliar es básico, de manera especial en los casos que se trabaja con fertirrigación, ya que permite actuar de inmediato para corregir los desequilibrios nutritivos que la planta pueda presentar, incorporando los nutrientes a través del agua de riego, ya que de esta forma son rápidamente absorbidos por los cultivos (INEA, s/f).

1.2. Nutrientes en las plantas

Son los elementos esenciales para el crecimiento de la planta, la cual los toma del suelo o del agua. Los nutrientes primarios (nitrógeno, fósforo y potasio) son consumidos en cantidades relativamente grandes; otros tres nutrientes secundarios (calcio, magnesio y azufre) son tomados en menores cantidades, sin embargo pese a ser requeridos en menores cantidades son esenciales para su crecimiento. Los micronutrientes o elementos trazas son requeridos en cantidades muy pequeñas, pero igual que los anteriores son importantes para el metabolismo vegetal (Dirección de Fomento de Tierras y Aguas, 1999).

1.2.1. Nitrógeno (N)

Este nutriente juega un rol esencial en el crecimiento del vegetal, ya que es constituyente de moléculas como clorofila, aminoácidos esenciales, proteínas, enzimas, nucleoproteínas, hormonas, y trifosfato de adenosina (ATP). Además, el N es esencial en muchos procesos metabólicos (Reali, 2000).

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4

Figura 1. Deficiencia de nitrógeno en solanáceas.

Fuente. http://blog.agrologica.es, consultado en noviembre del 2013

1.2.2. Fósforo (P)

Esencial para el crecimiento de las plantas, ya que desempeña un papel importante en la fotosíntesis, la respiración, el almacenamiento, transferencia de energía y crecimiento celular. Además ayuda a la rápida formación y crecimiento de raíces, y mejora la calidad de la fruta, hortalizas y granos (Cevallos, 2008).

La primera señal de falta de P es una planta pequeña con hojas distorsionadas, cuando la deficiencia es severa se desarrollan áreas muertas en la hoja, el fruto y el tallo. Las hojas viejas se afectan antes que las jóvenes y retarda la madurez del cultivo. Los síntomas visuales de la deficiencia de P no son tan claros como los de N y K. En muchos cultivos, la deficiencia de P es difícil de detectar en el campo y en ciertas etapas de crecimiento la carencia de P causa que el cultivo presente un color verde oscuro (Cevallos, 2008).

Figura 2. Deficiencia de fósforo en solanáceas.

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5

1.2.3. Potasio (K)

El K es un nutriente esencial en la planta, es vital para la fotosíntesis, la síntesis de proteínas, ayuda a controlar el balance iónico, es importante en la translocación de metales pesados como el hierro (Fe), permite a la planta resistir los ataques de enfermedades, es esencial en la formación de la fruta y mejora la resistencia de la planta a las heladas (Cevallos, 2008).

Cuando existe deficiencia de K, la fotosíntesis se reduce y la respiración de la planta se incrementa. Estas dos condiciones reducen la acumulación de carbohidratos, con consecuencias adversas en el crecimiento y producción de la planta. La sintomatología de la deficiencia de K se manifiesta porque las hojas se enrollan y se arrugan, apareciendo unas zonas amarillas difusas en el limbo de las bandas transversales. La aparición de nuevos brotes hace que esta sintomatología aparezca más en las hojas viejas, ya que el K emigra de ellas hacia los nuevos órganos. Los brotes son débiles con hojas de tamaño inferior al normal que caen con facilidad, los frutos son pequeños con corteza suave que tienden a colorar prematuramente (Legaz et al., 2005).

Figura3. Deficiencia de Potasio en solanáceas.

Fuente. http://blog.agrologica.es, consultado en noviembre del 2013.

1.3. Métodos usados para la determinación de análisis foliares

1.3.1. Digestión y determinación de nitrógeno por destilación y titulación manual

El principio de este método consiste que del filtrado resultante del “Método de Digestión

[image:20.612.200.413.378.536.2]

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6

1.3.2. Calcinación y determinación de potasio por Espectrofotometría de absorción y emisión atómica

Este método consiste en la determinación por calcinación en mufla a un temperatura de 500 ºC, el filtrado proveniente de la calcinación es el que se va a utilizar para determinar la concentración de K por Espectrofotometría de absorción y emisión atómica (EAA) con llama de aire - acetileno y agregando solución de lantano para minimizar las interferencias (Sadzawka, 2004).

1.3.3. Calcinación y determinación por calorimetría del fosfo-vanadomolibdato Del filtrado proveniente de la calcinación según el método de calcinación en mufla a 500 °C, se determina la concentración de P por colorimetría del complejo fosfo-vanadomolibdato (Sadzawka, 2004).

1.4. Validación de métodos analíticos 1.4.1. Validación

Es la evaluación estadística de los resultados obtenidos en la aplicación de técnicas analíticas, mediante pruebas convenientemente documentadas y demostrativas de que un método es lo suficientemente fiable a fin de producir el resultado previo bajo condiciones definidas (Pérez et al., 2007). Para la validación de los métodos se requiere que los parámetros de desempeño se realicen usando equipos que cuenten con las especificaciones técnicas correctas, y que estén calibrados adecuadamente. Así mismo, el operador que realiza los estudios debe ser técnicamente competente en el campo de estudio y debe poseer suficientes conocimientos sobre el trabajo a realizar, con el fin de que sea capaz de tomar decisiones apropiadas a partir de las observaciones hechas mientras avanza el estudio (Centro Nacional de Metrología, 1998).

1.4.2. Clasificación de métodos de validación

Los métodos se pueden clasificar de distinta forma, pero se debe establecer una diferencia clara entre los métodos cualitativos y los cuantitativos.

Los métodos cualitativos exigen la definición de una serie de parámetros cuyo cumplimiento es necesario para la validación:

 Especificidad/selectividad

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7

 Precisión (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio)

 Estabilidad.

Cuando se trate de métodos cualitativos en los que sea necesario establecer un nivel de concentración definido (un umbral) para reflejar resultados, deben determinarse los tres parámetros adicionales siguientes:

 Linealidad

 Exactitud (sesgo) (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio) en el umbral de concentración

 Precisión (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio) en el umbral de concentración.

Los métodos cuantitativos exigen, para su validación, que se determine las siguientes series de parámetros que han de cumplirse:

 Especificidad/selectividad

 Límite de detección

 Precisión (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio)

 Linealidad y rango de trabajo

 Exactitud (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio)

 Recuperación

 Incertidumbre de la medición

 Estabilidad.

1.4.3. Linealidad

Es la capacidad del método analítico para obtener resultados directamente proporcionales a la concentración o cantidad del analito en un rango definido. Se determina mediante el tratamiento matemático de los resultados obtenidos en el análisis del analito a diferentes cantidades o concentraciones. La selección del rango y del número de puntos experimentales están estrictamente relacionados con la aplicación del método (Velasteguí, 2011).

1.4.4. Límite de cuantificación

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8

niveles bajos de compuestos en matrices de muestra y se usa particularmente para impurezas y productos de degradación. Se expresa como concentración del analito (Guía de Validación de Métodos Analíticos, 2009).

1.4.5. Límite de detección

Cantidad más pequeña de analito en una muestra que puede ser detectada por una única medición, con un nivel de confianza determinado, pero no necesariamente cuantificada con un valor exacto. Es comúnmente expresado como concentración del analito (Guía de Validación de Métodos Analíticos, 2009).

1.4.6. Exactitud (sesgo)

Medición de la diferencia entre los resultados previstos del análisis y el valor de referencia aceptado, debido a un error sistemático del método y del laboratorio. Normalmente se expresa en porcentaje. La exactitud y la precisión determinan el error total del análisis (Centro Nacional de Metrología, 1998).

1.4.7. Precisión

Es una medida de cuán cerca están los resultados unos de otros, y generalmente se expresa por medidas como la desviación estándar, que describe la dispersión de los resultados (Velasteguí, 2011).

1.4.8. Repetibilidad

Precisión en condiciones de repetibilidad, es decir, condiciones según las cuales los resultados independientes de una prueba se obtienen con el mismo método, sobre objetos de prueba idénticos, en el mismo laboratorio, por el mismo operador, usando el mismo equipo y dentro de intervalos de tiempo cortos (Centro Nacional de Metrología, 1998).

1.4.9. Reproducibilidad

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9

1.4.10. Incertidumbre

La incertidumbre de una medición es el parámetro asociado al resultado, es decir, caracteriza la dispersión de los valores que razonablemente pueden ser atribuidos al mesurando (Instituto de Salud Pública, 2010).

Las fuentes asociadas a la incertidumbre puede deberse a los siguientes factores:

 La naturaleza de la magnitud que se mide.

 El instrumento de medición.

 El observador.

 Condiciones externas.

Cada factor constituye una fuente de incertidumbre, la que contribuirá en mayor o menor grado a la incertidumbre total o universal.

Detectar y evaluar las incertidumbres no es simple e implica conocer diversos aspectos de la medición como:

 Errores accidentales o aleatorios que aparecen cuando las mediciones repetidas de la misma variable dan valores diferentes, con igual probabilidad de estar por arriba o por abajo del valor real. Cuando la dispersión de las medidas es pequeña se dice que la medida es precisa.

 Errores sistemáticos que son una desviación constante de todas las medidas ya sea siempre hacia arriba o hacia abajo del valor real y son producidas, por ejemplo, por la falta de calibración del instrumento de medición.

Con todas las incertidumbres de los diferentes factores ya mencionados antes se calcula la incertidumbre expandida, la cual contribuye a dar una incertidumbre total.

1.4.11. Sensibilidad

La sensibilidad es el cociente entre el cambio en la indicación de un sistema de medición y el cambio correspondiente en el valor de la cantidad objeto de la medición (Instituto de Salud Pública, 2010).

1.4.12. Coeficiente de Variación

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10

Siendo:

S= desviación estándar de las lecturas

X= promedio de la totalidad de la muestra

1.5. Especie considerada para la validación de los métodos 1.5.1. Tomate de Árbol

El tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.) es originario de la región andina,

posiblemente de Bolivia (Bohs y Nelson, 1997). Los frutos de esta especie son comestibles, de sabor agradable, ligeramente ácidos y con un alto contenido de provitamina A, vitaminas C y B6 y minerales como el hierro y potasio (Chalampunte et al., 2005 y Vasco et al., 2009). Es además una importante alternativa en la producción, diversificación y mercadeo de productos no tradicionales, los cuales son una opción importante en la comercialización (Hallam et al., 2004).

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11

CAPÍTULO 2

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12

2.1. Ubicación y descripción de la zona de estudio

Para el establecimiento y validación del proyecto de “Metodologías de análisis de tejidos

vegetales foliares” se utilizó como referencia el cultivo de tomate de árbol, dicha plantación está situada en la Estación Agroecológica de la UTPL (Figura 4), la que se encuentra ubicada en el sector sur oriental de la hoya de Loja, y cuenta con una superficie de 17,2 ha. Y dentro de las siguiente coordenadas UTM (Municipio de Loja, 2006).

E: 702050 – 702700 N: 9527600 – 9558400

Figura 4. Mapa de la Estación Agroecológica de la UTPL. Fuente. Servicios Agropecuarios, 2006.

La clasificación climática de esta zona según Koppen, 2005 corresponde: templado lluvioso, mesotérmico frío e isotermal, con temperatura media de 15,4 °C, precipitación media de 780 mm por año y una altura de 2160 m s.n.m.

2.2. Recolección de muestras foliares y de suelos

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Figura 5. Muestreo de hojas en el cultivo de tomate de árbol (muestreo al azar).

Fuente. La Autora.

Las cuatro hojas de las plantas que conformaron la muestra, también fueron tomadas al azar (Apéndice 1), pero asegurándonos que éstas pertenezcan a las que se han desarrollado por completo y que no presenten algún tipo de daño causado por ataque de plagas o enfermedades. Para el muestreo se utilizó una podadora manual y luego de cada corte se realizó la respectiva desinfección.

Así mismo se recogió tres muestras de suelo de la parcela tomate de árbol, cada una de 1 Kg de peso, el muestreo se lo hizo una sola vez al inicio del proyecto. La recolección de la muestra se la hizo con una barrena (20 cm de profundidad por 5 cm de ancho) a una profundidad de 20 cm (horizonte mineral) que es donde se encuentra la mayor parte del sistema radicular.

Las muestras tanto foliares como de suelos fueron trasladadas al Departamento de Ciencias Agropecuarias y Alimentos (Laboratorios de Suelos Agrícolas), para sus respectivos análisis.

2.3. Análisis de tejidos vegetales foliares 2.3.1. Preparación de la muestra

Las muestras foliares colectadas se sometieron al siguiente proceso de preparación (Apéndice 1):

 Limpieza de la muestra: La muestra fresca se lavó con abundante agua destilada para eliminar polvo o rastros de contaminación.

(29)

14

 Molienda: Una vez que la muestra estuvo seca, se trituró con un mortero homogenizando en su totalidad, seguido se pasó por un tamiz de 2 mm.

 Almacenamiento: Las muestras se almacenaron en bolsas plásticas libres de humedad, para sus respectivos análisis de N, P y K (Calderón y Pavlona, 2001). Apéndice 1. Procedimiento de recolección limpieza, secado, triturado y almacenado de la muestra foliar.

(30)

15

2.3.2. Análisis de nitrógeno por método de micro-Kjeldhal. Espectrofotometría de UV-V.

Campo de aplicación

Este método tiene como objeto determinar el contenido de nitrógeno total en tejidos vegetales. Por micro Kejldhal. Espectrofotometría de UV-V.

Principio

La determinación de N en foliares se basa en la digestión de la muestra foliar para destruir compuestos no nitrogenados en un medio ácido (H2SO4) y en presencia de selenio y sulfato de potasio como catalizadores a 350 ºC en el equipo micro-Kjeldhal. El producto de esta reacción se lo llevó a un aforo de 50 ml, y se tomó una alícuota la cual se mezcla con reactivo de color que está compuesta por fenol e hidróxido de sodio hasta que genere color azul, posteriormente se leyó en el Espectrofotómetro UV-V. a una longitud de onda de 660 nm (Bremmer, 1982).

Condiciones ambientales

Las condiciones ambientales en las que normalmente se trabajó son:

 Temperatura media: 20 °C con mínimas de 17 °C y máximas de 24 o _C

 Humedad relativa: 45 – 75 % Reactivos

Tabla 1. Reactivos utilizados para la determinación de nitrógeno.

Reactivo Fórmula Marca

Hidróxido de sodio NaOH MERCK

Selenio Se ALDRICH

Fenol C6H5OH MERCK

Hipoclorito de sodio. NaClO MERCK Ácido sulfúrico

concentrado H2SO4 MERCK

Sulfato de amonio (NH4)2SO4 MERCK Sulfato de potasio K2SO4 MERCK

(31)

16

Preparación de Reactivos

a. Mezcla catalizadora.- se pesó 100 g de sulfato de potasio y 2 g de selenio en polvo, se agitó hasta que haya una homogenización total.

b. Solución de fenol.- se pesó 10 g de hidróxido de sodio, luego 13 g de fenol (se usó las cámaras extracción y equipo de protección ya que desprende olores fuertes y tóxicos), los dos reactivos se los disolvió en aproximadamente 80 ml de agua destilada, y se aforó a 100 ml.

c. Solución de hipoclorito de sodio.- se tomó 10 ml de hipoclorito de sodio (5,25 %) y se aforó a 100 ml con agua destilada.

d. Estándar de calibración de nitrógeno.- se pesó 4,714 de sulfato de amonio (NH4)2SO4, y se aforó a 1000 ml con agua destilada.

De la solución estándar madre que contiene 1000 ppm de nitrógeno, se preparó un estándar de 100 ppm en un balón de 50 ml, a partir del cual se realizó los estándares de 25, 50, 75 y 100 ppm tomando alícuotas de 12,5; 25; 37,5 y 50 ml respectivamente ,y se aforó en balones de 50 ml.

Materiales y Equipos

 Balanza analítica

 Balones de aforo

 Celdas plásticas para lectura en el Espectrofotómetro

 Embudos

 Espátula

 Espectrofotómetro UV-V. con longitud de onda 660 nm.

 Estufa con circulación de aire

 Lunas de reloj

 Digestor TECATOR

 Papel filtro

 Pera de succión

 Pipetas

 Tubos de ensayo

 Tubos de vidrio pared gruesa

(32)

17

 Varillas de agitación Preparación del Material

Todo el material que se utilizó para la determinación fue lavado con jabón líquido, para evitar posibles adherencias de residuos al material.

Determinación

La metodología utilizada fue en base a Cadahia (2008). Digestión

 Se pesó 0,10 g de muestra seca y triturada dentro de un tubo de ensayo de 100 ml de aforo.

NOTA: Se debe pesar tanto las muestras con y sin recuperación y también se hace un blanco.

 A las muestras y al blanco, se adicionó 0,50 g de mezcla catalizadora y 5 ml de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4).

 Se encendió y precalentó el micro-Kjeldahl a una temperatura de 100 o _C.

 En el micro-Kjeldahl se colocó los tubos de ensayo con la muestra para realizar la digestión. Los primeros 10 minutos se colocó a 100º C, luego se fue subiendo la temperatura paulatinamente hasta llegar a los 350 °C. Aproximadamente luego de haber transcurrido alrededor de cinco horas la muestra quedó transparente e incolora (sin presencia de humos blancos).

 Se dejó enfriar los tubos por aproximadamente 30 minutos.

 Una vez fríos se añadió aproximadamente 25 ml de agua destilada.

 Se dejó enfriar nuevamente y se aforó a 50 ml, se tapó con parafina y se agitó para que se homogenicen los compuestos presentes, posterior a esto se colocó los tubos verticalmente para que se precipiten todos los sólidos existentes. Generación de color

 De la digestión se tomó aproximadamente 10 ml y se filtró en tubos de ensayo.

(33)

18

 Se encendió el Espectrofotómetro y se calibró a una longitud de onda de 660 nm.

 Una vez generado el color y pasado el tiempo de reposo de las muestras, se procedió a leer la absorbancia de las muestras en el Espectrofotómetro UV-V. (Las celdas no deberán presentar mal estado, ya que las lecturas posiblemente varían y los resultados serán incorrectos).

 Los resultados obtenidos se registraron en la hoja de cálculo para la realizar las regresiones lineales (Bremmer, 1982) (Ver Apéndice 2)

Cálculos de los resultados

Siendo:

Cf: Concentración final obtenida de la curva de calibración FD: Factor de dilución

Wm: Peso de la muestra Expresión de los resultados

 Los resultados se expresaron con tres cifras significativas.

 En el informe del análisis, se indica el método usado y el resultado obtenido. Además de mencionar cualquier condición no especificada en esta norma o considerada como opcional, así como cualquier circunstancia que pueda haber influido sobre el resultado.

 Por otra parte se debe incluir todos los detalles para la completa identificación de la muestra.

Eliminación de residuos

(34)

19

Apéndice 2. Esquema del proceso de determinación de nitrógeno por el método de micro-Kjeldhal. Espectrofotometría de UV-V. (Ver anexo I).

Fuente. La Autora.

2.3.3. Análisis de fósforo por el método de molibdato vanadato de amonio por Espectrofotometría de UV-V.

Campo de Aplicación

Este método tiene como objeto determinar el contenido de fósforo disponible en tejidos vegetales mediante Espectrofotometría de UV-V.

Principio

(35)

20

en el Espectrofotómetro UV-V. a una longitud de onda de 430 nm (Calderón y Pavlona, 2001).

Las condiciones ambientales en las que normalmente se trabaja son:

 Temperatura media: 20 °C con mínimas de 17 °C y máximas de 24 o C

 Humedad relativa: 45 – 75 % Reactivos

Tabla 2. Reactivos utilizados para la determinación de fósforo.

Reactivo Fórmula Marca _sugerida

Vanadato de amonio NH4VO3 Sigma-_Aldrich Molibdato de amonio

heptahidratado (NH4)6Mo7O24.4H2O MERCK

Ácido nítrico 65% HNO3 MERCK

Ácido perclórico HCLO4 MERCK

Potasio dihidrógeno

fosfato KH2PO4 MERCK

Ácido sulfúrico K2SO4 MERCK

Preparación de reactivos

a. Mezcla ácida.- Se mezcló 250 ml de ácido nítrico (HNO3) concentrado al 65 % y 100 ml de ácido perclórico (HCLO4) concentrado al 70 %. Relación de mezcla 2,5:1.

b. Solución molibdato-vanadato de amonio

Molibdato de Amonio (NH4)6Mo7O24 4H2O al 5 % (Solución A).- Se pesó 12,5 g de molibdato de amonio, seguidamente se agregó 150 ml de agua destilada, se calentó suavemente hasta completar la disolución y se aforó a 250 ml.

Vanadato de Amonio NH4VO3 (Solución B).- Se pesó 0,625 g de vanadato de amonio, se agregó 125 ml de agua destilada, se adicionó 62,5 ml de ácido nítrico (NHO3) concentrado, se dejó enfriar y se aforó a 250 ml.

(36)

21

c. Estándar de calibración de fósforo.- Se pesó 0,439 g de potasio dihidrógeno fosfato, se agregó 300 ml de agua destilada y 10 ml de ácido sulfúrico a 10 N, finalmente se aforó a 1000 ml con agua destilada.

De esta solución estándar que contiene 1000 ppm de fósforo se preparó estándares de 3, 5, 8, 10 ppm tomando alícuotas de 1,5; 2,5; 4; y 5 ml respectivamente, y se aforó en balones de 100 ml.

Materiales y equipos

 Celdas para lectura en el Espectrofotómetro UV-V.

 Embudos

 Espátula

 Espectrofotómetro UV-V. con longitud de onda 430 nm

 Lunas de reloj

 Papel filtro

 Pipetas

 Tubos de ensayo

 Varillas de agitación

 Vasos de precipitación

 Digestor TECATOR Preparación del material

Todo el material que se utilizó para la determinación fue lavado con jabón líquido, para evitar posibles adherencias de residuos de material.

Determinación

La metodología utilizada fue en base a Calderón (2001). Digestión

(37)

22

 Se agregó 3 ml de mezcla ácida y se colocó en la placa de digestión, donde la temperatura no debe pasar de 200 o _{C (a mayor temperatura se puede} volatilizar algo de fósforo).

 Se tomó como punto final de la digestión cuando aparecieron humos blancos y el digerido se tornó amarillo transparente, en este punto hubo aproximadamente 0,5 mililitros de solución.

 Se dejó enfriar los tubos por aproximadamente 30 minutos, se agregó agua destilada y se aforó a 25 ml.

 Una vez aforado se filtró la muestra en balones de 25 ml, la cual se encuentra lista para la lectura de P, además de: S, K, Ca, Mg, Mn, Cu, Fe, Zn, Na.

Extracción de fósforo y generación de color.

 Se tomó una alícuota de 0,5 ml del filtrado de la digestión y se coloca en un tubo de ensayo.

 A las muestras y al blanco, se les adicionó 2 ml de agua destilada y 1 ml de solución molibdato-vanadato de amonio, desarrollándose inmediatamente el color amarillo, y se dejó 5 minutos en reposo.

 Se encendió el Espectrofotómetro y se calibró a una longitud de onda de 430 nm.

 Una vez generado el color de las distintas muestras y pasado el tiempo de reposo, se leyó las mismas en el Espectrofotómetro mediante las celdas y se registró los resultados (las celdas no deberán presentar señales de ralladura o estar en mal estado ya que las lecturas variarán y los resultados serán incorrectos).

Los datos obtenidos se registraron en la hoja de cálculo para la regresión lineal. (Calderón y Pavlona, 2001) (Ver apéndice 3).

Cálculos y expresión de los resultados

Siendo:

(38)

23

V = Volumen K = Constante

0,5g = Peso de la muestra 0,25 = Factor de dilución Expresión de los resultados

 El resultado se expresó con tres cifras significativas.

 En el informe del análisis, deben indicarse el método usado y el resultado obtenido. Debe mencionarse, además, cualquier condición no especificada en esta norma o considerada como opcional, así como cualquier circunstancia que pueda haber influido sobre el resultado.

 Se incluyen todos los detalles para la completa identificación de la muestra. Eliminación de residuos

(39)

24

Apéndice 3. Esquema del proceso de determinación de fósforo por Espectrofotometría de UV-V. (Ver anexo II).

Fuente La Autora.

2.3.4. Análisis de potasio por el método de Espectrofotometría de Absorción Atómica

Campo de aplicación

(40)

25

Principio

El método utilizado para la determinación de potasio disponible en tejidos vegetales fue mediante Espectrofotometría AA, el cual se basa en la extracción de potasio mediante la digestión con mezcla ácida (HNO3 concentrado 65 % y HCLO4 concentrado 70%), donde se produce la liberación de los elementos minerales, el producto de esta mezcla ácida se filtra, del cual se toma una alícuota agregando óxido de lantano para minimizar las interferencias (Calderón y Pavlona, 2001).

Las condiciones ambientales en las que normalmente se trabaja son:

 Temperatura media: 20 °C con mínimas de 17 °C y máximas de 24 o _C

 Humedad relativa: 45 – 75 %

Tabla 3. Reactivos utilizados para la determinación de potasio.

Reactivos

Preparación de reactivos

a. Mezcla ácida.- Se mezcló 250 ml de ácido nítrico (HNO3) concentrado al 65 % y 100 ml de ácido perclórico (HCLO4) concentrado al 70 %. Relación de mezcla 2,5:1.

b. Óxido de lantano.- Se pesó 58,64 g de óxido de lantano (La2O3), se agregó 200 ml de agua destilada y 200 ml de ácido clorhídrico concentrado (HCL), se agitó hasta completa disolución se dejó enfriar y se aforó a 1 litro con agua destilada. c. Estándar de potasio.- Se realizó estándar de potasio puro de 0,2; 0,4; 0,7 y 1

ppm tomando alícuotas de 5, 10, 18 y 25 µl respectivamente para cada uno de ellos, y se aforó a 25 ml.

Reactivo Fórmula Marca

(41)

26

Materiales y equipos

 Digestor TECATOR

 Embudos

 Espátula

 Espectrofotómetro AA

 Lunas de reloj

 Papel filtro

 Pipetas

 Varillas de agitación

 Vasos de precipitación Preparación del material

Todo el material que se utilizó para la determinación fue lavado con jabón líquido, para evitar posibles adherencias de residuos al material.

Determinación

La metodología utilizada fue en base a Calderón y Pavlona (2001). Digestión

 Se pesó 0,5 g de muestra seca y molida y se llevó a un tubo de ensayo de 100 ml.

 Se agregó 3 ml de mezcla ácida y se colocó en la placa de digestión, donde la temperatura no debe pasar de 200 o _C.

 Se tomó como punto final de la digestión cuando aparecieron humos blancos y el digerido se tornó amarillo transparente, en este punto hubo aproximadamente 0,5 ml de solución.

(42)

27

 Una vez aforado se filtró la muestra en balones de 25 ml, el cual se encuentra listo para la lectura de K, además de P, S, K, Ca, Mg, Mn, Cu, Fe, Zn, Na.

Determinación de potasio

 Del filtrado de la digestión se tomó una alícuota de 0,5 ml y se colocó en un balón de aforo de 50 ml.

 A las muestras y al blanco, se adicionó 48,5 ml de agua destilada y 1 ml de óxido al 5 %, de esto resultó una relación de dilución de 50/ 0,5.

 Se encendió el Espectrofotómetro de AA y se realizó la curva de calibración.

 Se homogenizaron las muestras y se leyeron.

 Los datos obtenidos se registraran en la hoja de cálculo para la regresión lineal. (Calderón y Pavlona, 2001) (Ver Apéndice 4).

Cálculos de los resultados.

Siendo:

ppm = Partes por millón V = Volumen

ppm K = Partes por millón leídas de potasio 0,5g = Peso de la muestra

0,5 = Factor de dilución Expresión de los resultados

 Los resultados se expresaron con tres cifras significativas.

 En el informe del análisis, se indica el método usado y el resultado obtenido. Además mencionar cualquier condición no especificada en esta norma o considerada como opcional, así como cualquier circunstancia que pueda haber influido sobre el resultado.

(43)

28

Eliminación de los residuos.

Todos los residuos que resulten del análisis deberán ser almacenados en recipientes adecuados, para luego ser enviados al CRA (Centro de Remediación Ambiental), en cartones identificados con hoja técnica adjunta.

Apéndice 4. Esquema del proceso de determinación de potasio por Espectrofotometría de Absorción Atómica.

2.4. Análisis de suelos

Un vez tomadas e identificadas las muestras de suelo fueron llevadas al laboratorios de suelos agrícolas de la UTPL, en donde comenzó su proceso de secado y luego tamizado (tamiz menor a 2 mm).

(44)

29

Nitrógeno

Mediante el método micro Kjeldahl y Espectrofotometría de UV-V. (Bremmer, 1982), que se basa en la mineralización del nitrógeno orgánico del suelo a través de la digestión (Digestor TECATOR), que es ejecutada al calentar la muestra con ácido sulfúrico (SO4H2) concentrado. Y seguido se lee la absorbancia en el Espectrofotómetro UV-V. (Jenway 6400 serie 13309) a una intensidad luminosa de 660 nm (Apéndice 5).

Fósforo

La extracción del fósforo se hizo utilizando el método de Bray y Kurtz. Se emplea la solución de Bray y Kurtz: Ácido clorhídrico (HCL 0,025 N); fluoruro de amonio (NH4F 0,03N a pH 2,6) La lectura se realizó en el Espectrofotómetro UV-V. a 882 nm (Jenway 6400 serie 13309) (Apéndice 6).

Potasio

(45)

30

Apéndice 5. Determinación de nitrógeno en suelos por micro Kjeldahl y Espectrofotometría de UV-V.

Apéndice 6. Determinación de fósforo en suelos por Espectrofotometría UV-V.

(46)

31

Apéndice 7. Determinación de potasio en suelos por Espectrofotometría de AA.

2.5. Análisis estadísticos y de validación

El diseño experimental usado para el análisis de tejidos vegetales foliares fue el de bloques completos (Figura 6). Realizando seis repeticiones para cada parámetro (N, P y K); cada repetición estuvo conformada por diez muestras. Los análisis fueron realizados en fechas distintas para poder cumplir con la validación y verificación de los métodos.

(47)

32

Validación y verificación de los métodos analíticos

Los métodos utilizados fueron evaluados y sometidos a las siguientes pruebas para asegurar que los resultados obtenidos son válidos y coherentes con el objetivo previsto (validación).

Para la validación de los métodos de análisis se realizó las siguientes pruebas:

 Linealidad (Ver anexo IV)

 Límite de detección y cuantificación (Ver anexo V)

 Precisión (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio) (Ver anexo VI y VII)

 Exactitud (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio) (Ver anexo VI y VII)

 Recuperación (Ver anexo VIII)

 Incertidumbre de la medición (Ver anexo IX)

(48)

33

CAPÍTULO 3

(49)

34

Resultados para el primer y segundo objetivo:

 Establecer metodologías adecuadas para el análisis de nitrógeno, fósforo y potasio en tejidos foliares.

 Validar los procesos metodológicos establecidos para los análisis foliares.

3.1. Resultados validación de nitrógeno

Los resultados presentados a continuación muestran la validación del método, en el cual se ha examinado: límite de detección, límite de cuantificación, linealidad, repetibilidad, reproducibilidad, recuperación e incertidumbre.

Título del método analítico

Determinación de nitrógeno por micro Kjendal y Espectrofotometría de UV-V.

Resultados del estudio de validación

 Linealidad

Para determinar la linealidad del método se realizó una curva de calibración con los datos de la Tabla 4, para realizar dicha curva se prepararon soluciones estándar de diferentes concentraciones conocidas con sulfato de amonio.

Tabla 4. Valores de nitrógeno para la curva de calibración (linealidad).

X Concentración (mg/l) Y Absorbancia

25 0,305

50 0,329

75 0,365

100 0,409

125 0,442

(50)

35

rango de concentraciones del analito buscado, y el coeficiente de correlación debe ser mayor a 0,99.

Figura 7. Curva de calibración de nitrógeno Fuente. La Autora.

 Límite de detección (LDD) y cuantificación (LDQ)

Para determinar tanto el límite de detección como el límite de cuantificación de nitrógeno se hizo la lectura de 10 blancos (agua destilada) obteniendo así el límite más bajo en el que puede ser detectado el analito como podemos observar en la Tabla 5 (Anexo V). El análisis se hizo utilizando un Espectrofotómetro UV-V.

Tabla 5. LDD y LDQ para nitrógeno.

N° Ensayos _{Blancos para N}

1 0,072

2 0,066

3 0,069

4 0,064

5 0,07

6 0,068

7 0,068

8 0,061

9 0,063

10 0,068

Media 0,067

S(des stand) 0,003

%CV 0,051

LDD 0,077

LDQ 0,083

(51)

36

Se determinó el límite de detección en la concentración de absorbancia de 0,077, siendo esta la cantidad mínima de nitrógeno en la muestra que puede ser detectada y un límite de cuantificación con concentración de absorbancia de 0,083 la cual consta como la cantidad mínima de nitrógeno en una muestra que puede cuantificarse. De esta forma se determina que el método es capaz de detectar y cuantificar de manera confiable cantidades mínimas de nitrógeno en una muestra. Cumpliendo así lo señalado por el Instituto de Salud Pública (2010) y Herrera et al. (2004) donde nos dice que el LDD debe ser menor al LDQ.

 Repetibilidad

[image:51.612.84.530.359.437.2]

En la Tabla 6 se presentan los datos obtenidos del análisis de repetibilidad. En el cual se realizó la prueba de varianza ANOVA mostrando resultados satisfactorios y similares para los tres niveles. Se realizó el cálculo de los cuadrados medios y el nivel de significancia respecto a la prueba F con un nivel de confianza del 95 % (Anexo VI).

Tabla 6. Repetibilidad para nitrógeno.

Nivel F experimental F crítico Diferencia Coeficiente de variación %

1 0,951 4,74 NO 3,74

2 0,985 4,74 NO 1,77

3 1,008 4,74 NO 1,22

Se alcanzó un F crítico mayor al F experimental en todos los casos, lo que nos indica que no existe diferencia significativa en el método, cumpliendo con el criterio de aceptación que nos dice que el F crítico debe ser mayor al F experimental y verificando lo establecido por el Department of Health and Human Services Food and Drug Administration (2001) y Arriola (2012) que manifiesta que existe repetibilidad en el método cuando el coeficiente de variación es menor al 15%.

 Reproducibilidad

(52)

37

Tabla 7. Reproducibilidad de nitrógeno. Prueba F para varianza.

Nivel Media F experimental F Crítico Diferencia

1 29,34 1,028 6,38 NO

2 45,82 0,983 6,38 NO

3 103,32 O,998 6,38 NO

La Tabla 8 nos indica la reproducibilidad del método, ya que no existe diferencia estadística significativa debido a que el T crítico es mayor al T experimental, cumpliendo el criterio de aceptación, el cual manifiesta que el T crítico debe ser mayor que el T experimental, confirmando así la reproducibilidad del método.

Tabla 8. Reproducibilidad de nitrógeno. Prueba T para 3 variables.

Nivel T Calculado T Crítico Diferencia

1 0,4 2,35 NO

2 0,6 2,35 NO

3 0,9 2,35 NO

Recuperación

(53)

[image:53.612.79.562.88.317.2]

38

Tabla 9. Recuperación para nitrógeno.

N° Muestra Concentraciones más muestra Recuperación % Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3

1,25 ppm 2,5 ppm 5 ppm

1 0,257 0,303 0,337 0,424 92,00 80,00 83,50

2 0,259 0,307 0,339 0,422 96,00 80,00 81,50

3 0,252 0,305 0,340 0,421 106,00 88,00 84,50

4 0,258 0,307 0,340 0,421 98,00 82,00 81,50

5 0,256 0,305 0,338 0,421 98,00 82,00 82,50

6 0,258 0,307 0,339 0,422 98,00 81,00 82,00

7 0,259 0,305 0,339 0,422 92,00 80,00 81,50

8 0,252 0,304 0,339 0,426 104,00 87,00 87,00

9 0,258 0,303 0,338 0,425 90,00 80,00 83,50

10 0,256 0,306 0,341 0,422 100,00 85,00 83,00

Media 97,40 82,50 83,05

El porcentaje de recuperación esperado debe encontrarse entre un 80 % y 120 %, según la ecuación de Horwitz (Rivera., et al., 2001 y Jurado, 2008). En cada una de las determinaciones de nitrógeno los porcentajes de recuperación se encuentran dentro del rango establecido; como se puede observar en la Tabla 9 ningún valor es mayor al 120 % o menor al 80 %.

 Gráfico control

(54)

39

Figura 8. Gráfico control para nitrógeno. Fuente. La Autora.

Todos los datos obtenidos del análisis de recuperación para nitrógeno están dentro de los puntos máximos y mínimos en el gráfico de control.

 Incertidumbre

[image:54.612.104.511.66.305.2]

En la Figura 9 se muestra la fuente de incertidumbre para nitrógeno que han sido identificadas en el transcurso de la validación (Ver anexo IX).

Figura 9. Diagrama causa y efecto para fuentes de incertidumbre de nitrógeno. Fuente. La Autora.

2. V muestra

U calibración

U temperatura

U repetibilidad

3. U V aforo

U calibración U temperatura

U repetibilidad

4. U concentración

U sol. Trabajo U regresión

5. U repetibilidad

U Tiempo U reacción

U equipo

1. V alicuota

U repetibilidad U temperatura

(55)

40

En la Tabla 10 se presenta la incertidumbre de validación de nitrógeno, los resultados obtenidos se muestran por nivel de trabajo. La incertidumbre expandida reporta un 95% de confianza en el valor del método.

Tabla 10. Incertidumbre nitrógeno

Concentración mg/l U expandida mg/l

25 1,845882

50 1,736126

75 1,697964

100 1,736126

125 1,845882

Discusión del método usado para nitrógeno

El método Kjeldahl ha sido y sigue siendo usado por varios autores; por ejemplo Rodríguez et al. (1997) realiza análisis foliares en un cultivo de tomate de riñón para estimar las concentraciones de nitrógeno y clorofila; mencionando que el método para analizar el N foliar es el de Kjeldahl. El autor da a conocer que los resultados obtenidos tanto en análisis como en correlaciones son satisfactorios. En otro estudio realizado por Alonso et al. (2008) en una población de Laurus nobilis en Galicia también determinan el

N foliar por Kjeldahl en esta especia, mostrando resultados satisfactorios para el método. Por otra parte cabe mencionar y recalcar que la metodología de análisis foliar para N es usada por autores como Calderón y Pavlona (2001), Bremer (1982) y Cadahia (2008), los cuales recomiendan el uso de estas metodologías, ya que ellos han también han validado el método. El método micro-Kjeldahl y Espectrofotometría UV-V. utilizado en este trabajo es una simple variación del método micro-Kjeldahl mencionado anteriormente y certificado por otros laboratorios de análisis químicos en plantas como Panreac de España

(www.panreac.com).

(56)

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3.2. Resultado validación de fósforo

Los resultados presentados a continuación muestran la validación del método, en el cual se ha examinado: límite de detección, límite de cuantificación, linealidad, repetibilidad, reproducibilidad, recuperación e incertidumbre.

Título del método analítico

Determinación de fósforo por el método molibdato vanadato de amonio por Espectrofotometría UV-V.

Resultados del estudio de validación

 Linealidad

Se realizó la curva de calibración del método, para esto se prepararon soluciones de diferentes concentraciones de estándar de fósforo puro, con los valores que podemos observar en la Tabla 11 se pudo determinar la linealidad del método (Ver anexo IV).

Tabla 11. Valores de fósforo para la curva de calibración (linealidad).

X Concentración (mg/l) Y Absorbancia

0,05 0,307

0,1 0,310

0,15 0,314

0,2 0,317

0,25 0,322

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Figura 10. Curva de calibración de fósforo. Fuente. La Autora.

 Límite de detección (LDD) y cuantificación (LDQ)

Se analizaron 10 blancos (agua destilada) obteniendo así el límite más bajo que en el que puede ser detectado el analito. En la Tabla 12 se muestran los resultados obtenidos para el límite de detección y el límite de cuantificación (Ver anexo V).

Tabla 12. LDD y LDQ para fósforo

N° Ensayos Blancos para P

1 0,086

2 0,090

3 0,099

4 0,099

5 0,090

6 0,086

7 0,088

8 0,086

9 0,095

10 0,094