DEPARTAMENTO DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Q.F.B Adalberto Gómez Cruz, fue revisada y aprobada

por

el jurado examinador abajo

indicado, y aceptada como requisito parcial para obtener el titulo de :

Presidente:

Secretario:

vocal:

Suplente:

INGENIERO AGROINDUSTRIAL

u

Q.F.B Adalbeio Góme Cruz

B

0.B.P Salvador Márünez Romero

Ing. Félix Esparza Torres

//

Ing. V&r BolRHernández

Suplente:

...,...

-

A G R A D E C I M I E N T O S

Al

QFB

Adalberto G 6 m a Cruz por su dirección tan acertada y el apoyo brindado en todo momento. Gracias por su paciencia.

Al Ing.

Victor Bolaños Hemández por su participación y apoyo en la presentación de la tesis.

Al

Dr. Ramiro García Chávez por su confianza, lo que impuls6 a

realizar este trabajo.

A la profesora Patricia D'sposito por su colaboración en la traducción del resumen.

Al

personal tanto del laboratorio de fisiología postcosech laboratorio de control de calidad (especialmente a Don t su apoyo y confianza.

Al Q.B.P.

Salvador Martinez Romero y al Ing. Félh por sus correciones en la presente tesis.

A los profesores que compartieron sus conocimi

si

A Dios por darme la vida y permitir seguir viviendo.

A mis padres: Isidro Silva Gallardo y Maria Ruiz Ruiz, por sus consejos y su apoyo, por que a pesar de todas las circunstancias siempre estuvieron conmigo.

A mis hermanos: Eleazar (Chayote), Miriam (La negrita), Isidro A. (Chiro), por todos los grandes momentos de alegría, tristaa y enojos que pasamos juntos y por todo lo que han compartido conmigo.

A mi hermano Guadalupe: Por los inolvidables momentos de nuestra n i h z y que en dónde quieras que estés que Dios te cuide y me permita algún día volver a verte.

A mi bisabuela Victorina Matus M. (Q.P.D): Por todo su

gran

amor y apoyo que siempre me brindó, por estar siempre conmigo en los momentos más crítico de mi vida, por todo eso y más. Gracias, jamás te olvidaré.

A mis abuelos: Euseblo Ruiz Triste y Refugio Ruiz Matus, por su compresión y amor que siempre me brindaron y me

siguen

brindando. Que Dios los mantenga con vida.

A mis tíos, Moisés y Eliseo: Porque de alguna manera siempre han participado en mi vida, por sus consejos y su

gran

ayuda incondicional..

A mis tíos: Juan, Sara, Albina: Por toda su conflanza y consejos, en especial a mi tía Sara.

A Rocío, Eva y Alma: Por todos los buenos ratos que hemos pasados juntas.

A mis amigos (as): Lupita, Argelia, Alma, Esther,

Ricardo

y Juiián: Por todas sus locuras,

que hicieron mi instancia en Chapingo más placentera. Especialmente a Juiián por ser un

gran amigo.

A Juan Jos& Por haber compartido gran parte de mi vida y ser el mejor aliciente para terminar mi carrera, por todo su apoyo y compresi6n y por los buenos ratos que hemos pasados juntos.

L o s q u i e r e

C O N T E N I D O

Página

...

LISTADETABLAS

...

111

LISTADEFIGURAS

...

111

RESUMEN

...

V

SUMMARY

...

...

1

I

.

INTRODUCCION 11

.

JUSTIFICACION

...

3

111

.

OEUETIVOS 4

...

...

IV

.

REVISION D E LITERATURA 5 4.1 Antecedentes

...

5

...

4.2 Composición de la caña de azúcar

...

6

Aplicaciones de la fermentación sólida

...

10

4.3.2 La fermentación sólida en México

...

10

4.3.2.1 LaindustnaAgroalimentaria

...

10

4.3.2.2 Productos farmaceúticos y bioquímicos

...

12

4.3.3 Comparación entre fermentación sólida y líquida

...

12

4.3 Fermentación sólida

...

₉

4.3.1 4.3.4 La actividad de agua en la fermentación sólida

...

14

Un microorganismo: Aspergillus

niger

...

15

4.4.1 Estnicturasómatica 16 4.4

...

4.4.2 La influencia de factores externos

...

17

4.4.2.2 Oxígeno

...

17

4.4.2.3 Temperatura

...

17

4.4.2.5

pH

18 4.5 Crecemientomicrobiano

...

19

4.6 Trabajos realizados sobre fermentación sólida

...

22

4.4.2.lAgua

...

17

4.4.2.4 Luz

_...

17

...

. .

4.5.1 Curva de crecimiento

...

20

-111-"

.

.

.

-5.1 Microorganismo

...

23

..

5.2 Preparacion de espora

...

24

5.3 Materia prima utilizada en la fermentación sólida

...

24

.,

. .

5.4 Fermantacion en estado solido

...

25

5.5 Métodosutilizados

...

26

VI

.

RESULTADOS Y DISCUSION

...

28

6.1 Proteína

...

28

6.2Azúcares

...

31

6.4Fibra

...

31

VIL

CONCLUSIONES

...

41

6.3 Humedad

...

34

6.5Temperatura

...

39

LISTA

DE

TABLAS

Página

Tabla 1

.

Composición de la caña de azúcar en su estado natural

...

7

Tabla 2

.

Composición ñsica de residuos de caña de azúcar quemada

...

7

Tabla 3

.

Composición entre el cogollo y el napier

...

8

Tabla 4

.

Porcentaje promedio de proteína

(Bs)

...

28

Tabla 5

.

Porcentaje promedio de azucares

(Bs)

...

31

Tabla 6

.

Porcentaje promedio de humedad

...

34

Tabla 7

.

Porcentaje promedio de fibra

(Bs)

...

37

Tabla ₈

.

Condiciones usadas y resultados finales enelexperimento

...

40

[image:8.634.122.561.133.301.2]

LISTA

DE

FIGURAS Figura 1

.

Curva de crecimiento logarítmica típica de una bacteria en

un

cultivo sumergido

...

21

Figura 2

.

Esquema del proceso de fermentación sólida en residuos de cosecha de caña de azúcar, usado en el experimento

...

26

Figura 3

.

Gráfica de comportamiento de la proteína

...

30

Figura

4

.

Gráfica de comportamiento de la relación proteína-azúcares

...

33

Figura ₅

.

Gráfica de comportamiento de la relación proteína-humedad

...

36

FERMENTACION FUNGICA

(

A

s

-

n@r)

Ciabnela Siva Ruiz

',

Adalberto Gómez C m

*

Universidad Autonoma Chapingo

RESUMEN

Durante la cosecha y el proceso tecnológico de la caña de azúcar, se obtiene una

gran cantidad de subproductos.

Los

residuos de cosecha se queman desaprovechando una gran cantidad de biomasa,

estos residuos pueden ser utilizados como materia prima para la alimentación del ganado; de esta manera se permitiría liberar grandes volúmenes de alimentos a la población

humana y que es acaparado por la industria de alimentos balanceados.

Pero estos residuos de cosecha (cogollo y hojas verdes) contienen poca proteína (insuficiente para requerimientos de los rumiantes).

Por esta razón, la presente investigación se realizó con la finalidad de evaluar el nivel de,enriquecimiento protéico en residuos de cosecha de caña de azúcar, aportado por Aspergillus niger. Se llevaron a cabo 6 experimentos los cuales fueron realizados con 250 g de cogollo

y

hojas verdes desfibradas, los experimentos se realizaron bajo condiciones no

asépticas manteniéndolos a una temperatura de 25-30 "C.

De los experimentos realizados, se tomaron 4 para el análisis ya que estos

presentaron una cinética de crecimiento similar, en estos se encontró que a partir de las

E

l

contenido de azúcares fue consumido por

las

esporas en un 75% entre las 24-48

h, llegando al final del experimento con el agotamiento de éstos.

La humedad del substrato se comportó de una manera decreciente teniendo al final un residual de 46.52%. La disminución en el contenido de fibra no fue significativa (3.2%).

En conclusión, Aspergillus ni@ incrementó el contenido protéico en los residuos de cosecha de caña de azúcar, sin embargo la degradación del contenido de fibra fue insignificante.

niger).

Gabnela Siva Ruiz', Adalberto Gómez Crus

Universidad Autonoma Chapingo

Summary

During the haivest and the process technologic of the sugar cane, can to get big quantity of sugar cane by-products.

The residues of sugar cane harvest are burned, wasteful big quantity of biomass, that can be used as raw material for feeding of cattle; of this mode will can liberate big volumens of food to the people and that are monopolize by the Industry Food Balance.

But these residues of sugar cane harvest (heads and green leaves) contain few protein (insufficient for requirement of the cattle).

For is reason, the purpose of this study was to evaluate the level of protein

enrichment in residues of sugar cane harvest produced byhpergdlw niger.

Six

experiment

were carried out, using 250 grams of defibered heads and green leaves in non-aseptic conditions, maintained at temperature between 25 and 30 "C.

Only

4

of the experiments carried out were analyced because they presented

The moisture level of the culture lessened reaching the end of the experiments a final 46.52%. The decrease in fiber content was not significant (3.2 %).

In conclusion, Aspergillus nzger incrased the protein content in the harvest residuos

of sugar cane, however the decrease of the fiber content was insignificant.

Key

words: Solid fermentation, Aspergillus niger, Sugar cane.

‘

Autor del ani& O c n t i f i ~ mmo quiriio p”ra obtener el título & lopnicm Agmindustnd

Pmfesor Investigador del DIA. ,

I. INTRODUCCION

Hoy existe la necesidad de producir grandes cantidades de proteína para consumo humano y animal, pues

las

fuentes convencionales -agricultura, ganadería y pesca- no

satisfacen totalmente la demanda, y se considera que probablemente el problema se

agudice

a

medida que la población mundial aumente.

Han

surgido varias opciones para la solución de este problema; de ellas, la proteína unicelular se ha convertido en una de las fuentes no convencionales más importantes.

El término proteína unicelular significa o se identifica con alimentos protéicos derivados de microorganismos unicelulares crecidos en cultivos sumergidos

o

sólidos en diversas fuentes o esquilmos. También se le

conoce

como proteína microbiana, biomasa

o

SCP

(single cell protein).

Hasta el presente, la caña de azúcar se cultiva con un objetivo fundamental que es la producción de azúcar, no obstante, como consecuencia de esta producción se obtiene una enorme cantidad de subproductos concentrados en un solo lugar, lo cual permite que entre otras aplicaciones, se destaque su utilización en la alimentación de ganado.

-

como fuente de producción independiente del suelo y de las condiciones agncolas; esta proteína presenta las siguientes ventajas:

a) Los microorganismos no dependen de las condiciones agrícolas o del clima, si no que son cultivados en grandes fermentadores.

b)

Los

tiempos de duplicación de la masa son cortos.

c) Posibilidad de experimentación genética para mejorar el contenido proteico; puede efectuarse en poco tiempo.

d)

La

producción no está limitada por superficie o luz solar.

Los tiempos de duplicación de la proteína unicelular son del orden de minutos

comparados con periodos de días para plantas y de semanas para animales. Otra característica muy importante es la eficiencia de conversión. Si se considera el contenido protéico la relación favorecería aún más a la proteína unicelular (Quintero,l981).

11. JUSTIFICACION

La competencia nutricional entre el humano y animales es un típico ejemplo de distorsión, en el desarrollo de la tecnología inadecuada en el tercer mundo. (Viniegra- Gónzalez, 1982a).

La

industria de alimentos balanceados acapara gran parte de la

producción de granos como son: sorgo, soya, maíz, y frijol, la cual debería destinarse en su totalidad a la alimentación humana.

Durante la cosecha y el proceso tecnólogico de azúcar es posible obtener por cada 100 Ton de caña, 12 Ton de azúcar, 8.9 Ton de cogollo y 10.2 Ton de hojas verdes

(ICIDCA-

MINAZ-

1984).

Por

io tanto, como consecuencia de la producción de azúcar se obtiene una cantidad enorme de subproductos, los cuales pueden ser utilizados como materias primas para la alimentación del ganado.

La cantidad de hojas verdes y cogollos que se obtienen, una parte es destinada a la alimentación animal como consumo directo adicionada con un suplemento de proteha o de nitrógeno no predecía, estos residuos de cosecha presentan un problema que es el contenido de proteína, ya que es muy poca.

La fermentación sólida ha sido propuesto como una alternativa para el enriquecimiento protéico de la yuca (Deschamps et ni., 1982) y que puede probarse en

residuos de cosecha de caña de azúcar.

In.

OBJETIVOS

OBJETNO GENERAL

- Incrementar el contenido protéico en residuos de cosecha (cogollo y hojas verdes) de la

caña de azúcar

_(Saccharum

ofiinarum) por medio de fermentación microbiana (Asoerdlus nieer).

OBJETIVOS PARTICUL4RES

- Determinar en el reactor las condiciones óptimas para el desarrollo del microorganismo

( Asoerdlus ni&.

- Evaluar el nivel de enriquecimiento proteico del sustrato, aportado pOrASDe~d¿W niPer durante la fermentación.

N . REViSlON

DE

LITERATURA

4.1

ANTECEDENTES

La producción azucarera ha demostrado que es capaz de contribuir a la

alimentación animal.

Sin

embargo, los residuos agrícolas resultantes de la cosecha cañera

son empleados de manera insuficiente a pesar de representar una formidable fuente de alimentación animal y generación de energía. A modo de ejemplo se puede señalar que estos subproductos, constituidos principalmente por paja y cogollo representan

a

escala mundial una disponibilidad que supera los 50.0 millones de toneladas. Si se considera su aprovechamiento en su forma más simple de alimentación animal directa, con un consumo

promedio de 5.0 kg/res/d, y una ganancia conseivadora de 60 gr de carne diarios se obtendrían teóricamente, 600 mil toneladas de carne, sin incluir en el análisis los componentes minerales y protéicos de los piensos tradicionales (ICIDCA,

1970).

Con un nivel medio de producción de caña (80 ton de tallo/ha/año) se pueden

engordar anualmente en una Ha 40 cerdos (desde 30 hasta 90 kg en peso vivo) y 10

novillos (desde 200 hasta 450 kg en peso vivo), este nivel de producción animal por unidad

de superñcie y tiempo está por encima de io que

se

logra en

los

países industrializados con

el uso de cereales.

por esta razón se separa del tallo durante la cosecha.

Las fermentaciones microbianas, cuya función en procesos domésticos es muy antigua, representa una proporción importante de los procesos biotecnolópicos de la utilización de microorganismos, cuyo metabolismo y capacidad de bioshtesis están orientados hacia la producción de determinadas sustancias.

La fermentación en estado sólido (ensilaje) del cogollo de caña con la adición de urea o excreta de gallina fue estudiada por Carone (1960), Kutty y Prassad (1980), Reddy y Prassad (1982), quienes obtuvieron mejores resultados con la adición de esas fuentes nitrogenadas.

L a caña de azúcar posee propiedades excepcionales para su utilización como forrajes. Su concentración energética aumenta según se incrementa su madurez y la mejor caña para ser utilizada como pienso en la alimentación animal es la que reúne las mejores condiciones para la industria azucarera.

Sherrod, Ishizaki y Coob (1968), encontraron que la caña de azúcar disminuye los nutrientes digestibles totales (NDT) durante el período de crecimiento joven, se incrementa con el estado de mayor madurez cuando el azúcar es más alto. Similares resultados fueron obtenidos por Olbrich, koshi y Wayman (1973).

Sin embargo, la presencia de hojas, cogollo y paja de la planta completa incrementan apreciablemente el contenido de fibra y disminuye la concentración de carbohidratos de fácil fermentación, (Rev. cubana cienc. agric. 1990 242).

4.2 COMPOSICION

DE

LA

CAÑA

DE AZUCAR

A continuación se presenta la composición aproximada de la caña de azúcar en su estado natural en la plantación :

TABLA

1.

Composición de la caña de azúcar

en

su estado natural

Partes de la cana Porcentaje

Cogollo y hojas verdes 8%

Vainas y hojas secas 20%

Tallos limpios 72%

Total 100%

Fuente: . I- 1Y77

E n un centro de acopio típico que procese 680 toneladas de caña diana quemada

y cortada a máquina, se obtienen aproximadamente 35 toneladas de material fibroso cuya composición física se muestra a continuación:

TABLA 2. Composición física de residuos de cosecha de caña quemada.

Cogollo, hojas verdes y renuevos Paja

Otras

Caña limpia Total

59% 28%

4%

9% 100%

La morfología del cogollo es bastante variable según la variedad de la caña cosechada, el alto porcentaje de cogollo y caña limpia de los residuos agrícolas le confieren un potencial energético de alto valor; el cogollo presenta características nutncionales muy similares a la de las plantas forrajeras (ICIDCA, 1977).

En la tabla 3, se presenta una comparación entre el cogollo

y

_{el napier (Pennisetum} purpureum), que es un forraje común en países tropicales:

TABLA _3. Comparación entre el cogollo y el napier.

w

ateria ateria roteína rasa n1zas

seca (%) bruta (% MS) bruta (%) (%) (% MS) (%MS)

Cogollo 20-25 5.4 34.5 1.0 5.9 53.2

Napier 18-20 6.9 32.1 2.1 11.1 41.8

Fuente: _{ICIDCA, 1977}

Como se puede obsewar, el cogollo tiene un bajo contenido de proteína(

5.4%

) y

un alto contenido de fibra( 34.5%); por lo tanto se hace necesario bajar el contenido de fibra e incrementar el contenido protéico, esto puede ser logrado utilizando procesos fermentativos bajo condiciones controladas con ayuda de microorganismos como son: hongos, algas, bacterias y levaduras.

Al

considerar la producción de proteína microbiana a partir de subproductos de industrias agropecuarias y su empleo en la alimentación conviene definir los diferentes términos involucrados en esta actividad. Se entiende por la producción de proteína microbiana, proteína de microorganismos unicelulares o monocelulares u otro nombre

análogo, el crecimiento controlado de uno o vanos microorganismos en un fermentador que puede operar en formas de tandas, semicontínuo o continuo; la separación parcial o

total de la masa celular de los residuos o productos del crecimiento y su posterior preseivación (

Rolz,

1977).

4.3 FERMENTACION SOLIDA

La fermentación en estado sólido (FES), puede definirse como aquella en la que los microorganismos crecen sobre la superficie de un substrato sólido, que sólo contiene agua retenida en su matriz y es la que permite las funciones vitales del microorganismo (Córdova et

al,,

1993).

4.3.1 APLICACIONES DE

LA

FERMENTACION SOLIDA

Los ejemplos típicos de FS son fermentaciones tradicionales tales como:

-

Los japoneses con el llamado "koji" en el cual se usa arroz cocido como substrato sólido

inoculado con hongos del género AsDem'iiw .-o

-

En Indonesia el "tempeh" o en la India

con

"ragi" en donde se usa semillas de leguminosas desquebrajadas o cocidas como substrato y una variedad de hongos no tóxicos como semilla microbiana.

-

En Francia el "blue cheese", en donde se perfora el queso fresco y es usado como substrato e inoculados con hongos seleccionados del género

Penicülium

roauefortii

.

-

Las

compostas de fibras lignocelulósicas, naturalmente contaminadas por una gran

variedad de organismos, incluyendo bacterias ceiulolíticas y hongos como Strentomices 9..

cítrico e itáconico (Viniegra-González, 1983).

4.3.2 LA FERMENTACION SOLIDA EN MEXICO

El

Gobierno Mexicano en 1983 con el Pian Nacional de Desarrollo proponen tres

principales temas para el desarrollo de la biotecnología: Industria Agroalimentaria, Producción de Farmacéuticos y la Protección del medio Ambiente. Con estas referencias la Fermentación Sólida está dentro de las principales líneas de investigación y desarrollo para futuras aplicaciones.

4.3.2. I La industria agroalimentaria

La

situación Mexicana ha tenido muchos cambios y principalmente la investigación

ha tenido que ajustarse a tales cambios. Antes de 1982 hubo un incremento en la demanda de productos animales tales como carne, derivados lácteos y huevo. El consumo anual fue incrementándose en un rango de 8 a 9%/año y tales incrementos dieron como resultado una gran importación de sorgo y soya.

Pero después de 1982, los salarios fueron reducidos en su poder de adquisición a

menos de la mitad que en años anteriores y el consumo neto de carne bajó y los derivados lácteos se usaron para producción de penicilina a través de fermentación sólida en medios no estériles.

La

nueva situación económica y del mercado han hecho que algunas

compañías desarrollaran nuevos productos utilizando materiales vegetales como materias primas y derivados de biotecnologia tales como glutamato, levaduras, ácido glúconico y

Más allá de los problemas legales y éticos, por destacar los alimentos adulterados, hay razones para apoyar la parcial sustitución de productos animales: Una es la economía que se usa ya que se destina pocos recursos para la alimentación de animales, por lo cuál se tiene una ineficiente transformación de la escasa alimentación. Se ha demostrado que

por cada kilogramo de came (base seca) sustituida, se tiene un potencial ahorrado de más o menos 20 a 40

Kg

de cereales (sorgo/soya). Afortunadamente, la tecnología para el uso

de condimentos como materia prima, está avanzando rápidamente.

Las

enzimas y las transformaciones microbianas han hecho posible el desarrollo de muchos nuevos sabores de una amplia variedad de materiales sin muchas limitaciones legales y comerciales para usarlos como aditivos alimenticios. Una estimación general del potencial de los procesos microbianos para producir aditivos alimenticios (masa microbiana, ácidos orgánicos, enzimas y especies aromáticos), en México es alrededor de 10,000 a 20,000 ton/aiio, basadas en el gran volumen de productos cámicos (chorizos y salchichas) y lácteos (quesos

Y Yogu-).

El

aspecto interesante de este campo es el precio relativamente alto de los

productos microbianos (800

a

1,500 dólares por ton) comparado con el bajo precio de la soya (250 a 300 dólares por ton). Esto nos indica la importancia de su valor en el mercado, recordemos que en México se ha venido importando cerca de 100,000 ton de leche en polvo anualmente durante cinco años y ésto puede ser parcialmente sustituida en las industrias lecheras.

nivel inicial.

La producción de alimentos puede ser incrementanda, de tal manera que se reduzcan los costos en la agricultura, usando efectivos biopesticidas ecólogicos. Una

específica e interesante línea en

la

Fermentación sólida, es la producción a gran escala de

esporas de hongos que ayudan al control de enfermedades de las plantas. (Viniegra- González,

1983).

4.3.2.2 Productos Farmaceúticos y bwquímicos

La Fermentación Sólida fué considerado para la producción de antibióticos durante

su primera fase, pero fue descartada y sustituida por los sistemas de gran escala de fe'mentación líquida. Hay sin embargo, espacio para mejorar el proceso de este campo y

desarrollar nuevas técnicas para la producción de metabolitos secundarios, especialmente para materiales que toleren la contaminación con bacterias y levaduras.

La industria química farmaceútica puede producir enzimas por fermentación sólida,

especialmente si se usan sin purificación. En este sentido, una interesante aplicación es el uso de hidrolasas para mejorar el proceso de separación, tal como, el uso de pectinasas para mejorar la extracción de jugo de manzana y mango

(Viniegra-González,1983).

4.3.3

COMPARACION ENTRE FERMENTACION SOLIDA Y LIQUIDA

Actualmente la industria de los fermentos usa la fermentación líquida (FL) para la

producción de biomasa, enzimas y metabolitos.

Este tipo de procesos fue desarrollado para incrementar la rapidez del tiempo de

consumo en el proceso de fermentación.

-

En la Fermentación líquida el medio contiene más agua (90-95 %), la cuál más tarde se

separa debido a la baja cantidad de productos microbianos, generalmente las concentraciones son inferiores a 50 g/l (5%).

- El

agua residual es tratada algunas veces, ya que el tratamiento es costoso para la planta de fermentación.

-

La

contaminación de levaduras y bacterias han sido evitadas por costosas técnicas de

esterilización y aireación ya que existen metabolitos interesantes, tales como antibióticos, que son producidos por el lento crecimiento de hongos en medios ricos que son fácilmente usados por microorganismos contaminantes.

-

La

concentración del producto en el reactor es más baja, el proceso de recuperación es

costoso y éste es un factor clave en la economía del proceso.

- La solubilidad del oxígeno en el agua es muy baja y se hace necesario el uso de una compleja y costosa maquinaria de agitación por aire forzado con gastos de energía.

Sobre otros aspectos, la fermentación sólida al parecer tiene ventajas sobre la fermentación líquida, tales como:

-

Una gran fracción de agua residual puede ser evaporada con un tambor rotatorio, obteniéndose volúmenes más pequeños para tratarla en _las plantas.

- La actividad de agua es más baja en la FS, teniendo ventajas ecológicas por el rápido

-

Los hongos pueden usar y transformar el azúcar impregnada en el material sólido a bajas concentraciones, convenientemente arriba de 50 glL (hasta 400 glL, encontrado por Oriol,

1988) y puede producir concentraciones altas de productos de gran valor, tal como ácido gibérelico (Kuman,1987), penicilina (Bamos,1988), pectinasa (TrejoJ987). Por esta vía los costos de recuperación puede ser reducidos.

- El

oxígeno no es un factor limitante porque es fácilmente soluble en el aire de la mezcla fluida de FS. Aquí en la FS los costos de energía son más bajos que en la

FL.

Sin embargo la Fermentación sólida tiene algunas limitaciones importantes:

-

Los microorganismos aeróbicos tienen limitado su crecimiento con superficies aireadas delgadas y sólo usan el aire intersticial (30 a 50% del volumen del reactor ) y el volumen

exterior del espacio interpartícula (Raimbault,l980). De. este modo, el nivel de concentración microbian0 es muy similar que en la FL.

-

El control del proceso es más difícil en FS, por la heterogeneidad del material fermentado y porque la realización del mezclado es muy lento o no se realiza.

-

La

recuperación del producto puede ser complicado si el producto deseado es absorbido

o contaminado por residuos sólidos (Viniegra-González, 1983).

4.3.4

LA

A C T M D A D DE AGUA EN

LA

FERMENTACION SOLIDA

Como se ha mencionado anteriormente, el contenido de humedad en el substrato es más bajo en la fermentación sólida que en la fermentación líquida, resultando una limitante de crecimiento y metabolismo del microorganismo.

El concepto de agua aprovechable es muy importante. La actividad de agua (aw)

es definida como el equilibrio que hay entre la humedad relativa del gas atmóferico y el substrato.

La

importancia del agua en la fermentación en estado sólido (FES) ha sido

ampliamente estudiado bajo aspectos cuantitativo (Nishio et ~1,1985; Raimbault y Alazard 1980 Hee Kim et ai,1982), pero muy pocos reportes explican el concepto

aw

en el crecimiento de hongos sobre substrato sólido (Narabara et al, 1982).

El contenido de agua en FES está en el rango de 30 a 80%, dependiendo del

material que se usa, pero la capacidad de retención de substrata con almidón (arroz, yuca) es desfavorable y generalmente no excede de 1.0 a 1.2 g aguaíg sólido (50 a 55%). En la producción de proteína en harina de yuca sobre cultivo sólido (Raimbault y Alazard, 1980) el crecimiento de Asperdus niEr es detenido con 30% de humedad en este medio.

4.4

UN

MICROORGANISMO Asprgiüus niger

Aspergillus niger es un bongo ampliamente utilizado en fermentación en estado

sólido, debido a su capacidad para crecer en sistemas de baja actividad de agua

(aw)

y competir ventajosamente con otros microorganismos, haciéndose innecesario mantener condiciones de asepsia en el sistema. Además, han sido identificados numerosos metabolitos de interés comercial (ácido cítrico, pectinasas, probiótios, etc.) producidos por este microorganismo, (Córdova, 1993).

organismos.

Los

Aspergrllus son capaces de utilizar una enorme variedad de sustancias como alimento, dada la gran cantidad de enzima que produce. Resulta difícil encontrar substratos que conteniendo alguna sustancia orgánica y un

poco

de humedad no deje

crecer los Aspergdfus. Aspergillus niger y otras especies se encuentran a menudo sobre los alimentos no protegidos y causan su descomposición; también causan contaminación en cultivos de los laboratorios bacteriológicos y micológicos. Por su potente actividad enzimática los Aspergillus son utilizados en varios procesos industriales. Comercialmente

se produce ácido cítrico y ácido giucónico utilizando Aspergiilm niger. Otros ácidos y diferentes productos químicos se fabrican en pequeñas o grandes cantidades por la acción de miembros de este género.

También comercialmente se preparan productos enzimáticos utilizando estos hongos, y se ha aislado una cantidad de antibióticos de los cultivos de Aspergillus, aunque ninguno en cuanto a _las propiedades terapéuticas, ha igualado a la penicilina, (Alexpoulos, 1977).

4.4. I

ESTRUCTURA

SOMA

TZCA

Las

colonias se desarrollan con rapidez, con micelio al principio blanco, a menudo

con zonas amarillo brillante que se extienden progresivamente; pedúnculos que arrancan

del substrato, con una longitud que varía entre 200 micras y varios milímetros y de unas 10 a 20 micras de diámetro, en su mayoría incoloros, lisos, dividiéndose, cuando se rompen, como si fueran trozos de caña; cabezas globosas, a menudo hendidas en la periferia; vesícula globosa, incoloras o pardo amarillenta, fértiles en toda su extensión, de

hasta 50 micras de diámetro, (Smith,1963).

16

I_

...

...

4.4.2 LA INFLUENCIA DE FACTORES EXTERNOS

4.4.2.1

Agua

Las células vegetativas de las bacterias y el micelio de los hongos filamentosos padecen mucho bajo la carencia de agua y mueren pronto.

4.4.2.2 OxrgenO

El

oxígeno puede actuar sobre el crecimiento de los microorganismos tanto

favoreciéndola como inhibiéndola. Se distingue entre microorganismos estrictamente aeróbicos y estrictamente anaeróbios; los primeros sólo son capaces de crecer en presencia de'oxígeno libre, por ejemplo la mayoría de los hongos filamentosos, bacterias acéticas y

muchos otros más, los últimos no pueden crecer en presencia de oxígeno libre, por ejemplo las bacterias butíricas y muchas putrefactivas. Entre estos extremos se encuentran los microorganismos aeróbicos y anaeróbicos facultativos es decir aquellos que están en condiciones más o menos de vivir en presencia de presiones parciales bajas de oxígeno

(microaerofilios). Los hongos filamentosos son aeróbios, por regla general pero con frecuencia también se pueden desarrollar bajo condiciones anaeróbias o microaerofilicas.

4.4.2.3 Temperatura

En

los hongos muere el micelio cuando la temperatura desciende un par de grados

por debajo del punto de congelación. Los Órganos reproductores son mucho más resistentes contra el frío. Las temperaturas más favorables para el crecimiento, es decir la temperatura óptima, se encuentra para la mayoría de los microorganismos fermentativos entre 20 y 30°C. Para las bacterias acéticas entre los

18

y 33"C, para las bacterias entre los 30 y 50°C y para los bongos filamentosos a 25°C.

La

temperatura óptima para levaduras

cultivadas se encuentran sobre lo 25 a 32 "C, para las levaduras cultivadas con rastros de fermentación baja a 2°C y para

razas

de fermentación de 25 a 35°C.

4.4.2.4 Luz

La

iluminación influencia el desarrollo de los microorganismo y en la mayoría de

los casos este influjo significa la inhibición del crecimiento y de otras funciones vitales. Se ban estudiado las influencias de las distintas partes del espectro sobre el crecimiento bacteriano, hallándose que los rayos ultravioletas y azul ejercen acción perjudicial mientras que las radiaciones amarillas y rojas es escasa o nula.

La luz moderada no ejerce efecto alguno sobre la levadura pero la luz solar directa actúa en forma inhibitoria. Sobre la mayoría de los hongos filamentosos, la luz solar no tiene ninguna influencia.

4.4.2.5

pH

El crecimiento y desarrollo de los microorganismos depende de la concentración en iones hidrógenos del substrato nutritivo. Generalizando se puede decir que la mayor parte de las bacterias crecen mejor en un substrato neutro o ligeramente alcalino mientras que las levaduras y hongos prefieren un substrato ácido y su pH de crecimiento se encuentra en el rango de acidez.

El crecimiento óptimo de la mayoría de _las bacterias se encuentran en un p de 6.8 a 8.2. Los hongos filamentosos y levaduras varían generalmente; el p de los hongos filamentosos se halla entre 6 y 7, pero después de transcurrir 48 h en líquidos con

cantidades escasas de tampón, el p suele descender hasta 2 aproximadamente (Jorgenson, 1969).

4.5 CRECIMIENTO MICROBIAN0

Una vez que se proveen los outrientes necesarios y el microorganismo, las células empiezan a crecer y/o a producir metabolitos de interés. La transformación de outrientes se denomina metabolismo. La glucosa tiene un doble papel de generador de energía y material de construcción celular. La conversión del substrato a células ha sido motivo de muchas investigaciones, ya que es un factor muy importante que controla, además del rendimiento, la demanda de odgeno y la producción de calor (Quintero,l983).

En cualquier sistema biológico, el crecimiento puede ser definido como el aumento ordenado de todos los componentes químicos. El aumento de masa, por sí sólo, podría no

indicar un crecimiento real, ya que _las células pueden estar incrementando Únicamente su

4.5.1

CURVA

DE

CRECLMIENTO.

En todos los organismos el crecimiento o aumento de la masa tiene una gran importancia pero se presentan algunas dificultades prácticas, cuando se intenta valorar en los microorganismos. Probablemente se obtiene la mejor determinación del crecimiento si se valora el nitrógeno celular total, pero resulta incómodo. Comúnmente se considera adecuado determinar el peso seco de las células, aunque con frecuencia este valor puede resultar demasiado alto debido a la acumulación en las células de productos de reserva. Otra medida de crecimiento que es muy útil es la turbidez de los cultivos unicelulares.

Hay métodos indirectos basados en la determinación de la actividad celular, conteo de células, producción de anhídndo carbónico o ácido, que a veces resultan Útiles pero que pueden inducir al error si se emplean indiscnminadamente.

El logantmo del peso seco en un microorganismo unicelular que crece

en

un cultivo

sumergido (comportamiento semejante del microorganismo en un cultivo sólido) representado frente ai tiempo de cultivo proporciona una curva, que tiene una

característica cuyos detalles particulares depende del tipo de microorganismo y de las condiciones ambientales (figura 1).

I

~ _ _ _ _

Tiempo

I lag iV deaaalerauóo

n

aalerauóo de crecimiento

v

~ C a c i ~ O

iii d m i e n t o uponenaal Vi deciinaciói

[image:33.630.129.538.134.422.2]

Fuentc:Rol& 1977

4.6

TRABAJOS

REAtlzQDOS SOBRE FERMENTACION SOLIDA

Se han realizado algunos trabajos recientes sobre fermentación sólida utilizando materias primas diferentes.

Oriol et, al (1988) realizaron un trabajo sobre la cinética de crecimiento de

Aspergdlus

niger

sobre un soporte sólido, utilizando bagazo de caña impregnada con una

solución de glucosa, bajo diferentes condiciones. La actividad de agua en el medio, la cantidad de esporas inoculadas y el tamaño de la partícula del soporte, son factores críticos que se

presentan en el crecimiento del hongo. El rango de crecimiento elevado fue observado con una concentración alta de substrato, demostrando la facilidad del método para el cultivo de hongos filamentosos.

Existe otro trabajo realizado por Pedro González-Blanco et, al (1990) sobre enriquecimiento proteico de subproductos de la caña de azúcar por fermentación sólida usando un cultivo de

_Aspergiiius

terreus, donde se mezcló

los

residuos fibrosos con melaza

y sales. Satisfactoriamente el contenido de proteína fue de 9-10% en materia seca y _23% de azúcar consumido, esto fue observado cuando la temperatura fue regulada en un rango de _25-35 “C. Algunos otros trabajos se han enfocado a investigar las mejores condiciones para que se desarrolle el hongo en un soporte sólido, en este caso el género

Aspergdlus

ha sido el más estudiado. Oriol et, al (1988) realizó otro trabajo, sobre actividad de agua en una fermentación sólida de harina de yuca

con

Aspergdlus niger.

Durante la fermentación

estimaron la cantidad de agua total, el agua consumida y el agua residual después de ₂₃ horas. Con un cálculo teórico de

Ross,

se encontró que la actividad de agua disminuyó a

0.85 al final de la fermentación y tal valor se tomó como un factor de inhibición del

La

a w del substrato se incrementó cuando se usó bagazo de caña ya que este

soporte tiene una alta capacidad de retención.

Al

usar este sistema el rango de crecimiento se incrementó, confirmando de este modo, que la actividad de agua es un

factor que favorece o puede inhibir el crecimiento del hongo, eo la fermentación sólida usando como substrato harina de yuca.

Córdova et, al (1993) analizó el efecto de la concentración de la glucosa eo el

desacoplamiento metabólico de Aspergzllus

nigr

,

como una consecuencia del incremento

v.

ME TO DO LOG^.

La fermentación sobre un substrato sólido implica diseñar el reactor para el proceso, para este caso se siguió la siguiente metodología:

5.1

MICROORGANISMO:

La cepa que se empleó fue Aswr~&~ n i g i var. hennebergi

" Y 0 descrita por Raimbault y Alazard

(1980),

obtenida en la Universidad Autónoma

Metropolitana unidad Ixtapalapa.

5.2

PREPARACIÓN

DE

ESPORAS:

La

cepa fue propagada en matraces erlenmeyer de 250 ml un medio de cultivo (papa dextrosa agar), previamente esterilizado a 120°C durante 15 minutos, posteriormente

se encubó a temperatura ambiente durante siete días.

La

cosecha de esporas se

hizo

con una solución de Tween 80 al 0.25%, la

cuantificación de la suspensión de esporas se realizó con una cámara de Neubauer.

_El

tamaño del inóculo fue de 2.7~10'

esporas

por gramo de muestra.

5.3

M4TER.U PRIM4

_UTILIZADA

_{EN FES}

La materia prima utilizada para este experimento fue cogollo de caña de azúcar (Saccharum

ofSlinurum)

obtenidas en el municipio de Casasano, Morelos.

El

cogollo fue

desfibrado en un Molino Standard Modelo

N"

3, Wiley

Hill.

Se tomó 250 g de la muestra y se agregaron las esporas en una cantidad de 2.7~10'

espordg de cogollo y se adicionó 1% de fosfato de potasio (KH,PO,) y sulfato de amonio

(

(NH,),

SO,). El p H inicial fue de 4.5.

5.4 FERMENTACION EN ESTADO SOLIDO

El cultivo fue llevado bajo condiciones no asépticas. El equipo utilizado fue improvisado, tratando de mantener ciertas condiciones descritas

por

Raimbault (1980).

El fermentador utilizado fue un embudo de vidrio cónico con diámetro interno de 13.2 cm y 30 cm de largo, en donde se colocó 250 g de caña previamente desmenuzada e inoculada por Aspergülus niger, éste a su vez fue colocado en un matraz kitasato de

4

litros ambos fueron sostenidos

por

un soporte universal.

Por

otro lado se colocó en la boquiiia de la salida de aire una manguera de latex

conectada a un matraz erlenmeyer de 500 ml que contenía agua regulada a 40 "C a través

[image:38.629.113.562.103.457.2]

Figura 2. Esquema del proceso de fermentación sólida en residuos de cosecha de cana de azúcar.

5.5 MÉTODOS UTILIZADOS

Se obtuvieron inicialmente muestras cada 8 horas; después de 48 horas se acortó el tiempo de muestre0 obteniendo muestras cada 4 horas, hasta llegar al

final

de la

fermentación (72 horas) que es cuando la muestra era cubierta por las esporas en un 40

-

50%.

Los análisis que se realizaron fueron :

Proteína

Se determinó el contenido de proteína mediante el método Macro-Kieldhal, (Método 954.01, AOAC, 1990).

Carbohidratos

El contenido de azúcares totales fue determinado con dos métodos: Felhing y Fenol- Sulfúrico, (Método 974,06, AOAC, 1990).

Humedad

La humedad fue determinada por el método de secado directo en la estufa, ( Método 950.01, AOAC,1990).

F

a

Se determinó el contenido de fibra cruda,

por

el método de digestión ácido-alcalino,

Vi.

RESULTADOS

Y DISCUSION

6.1

PROTEINA

Durante el trabajo, se realizaron 6 experimentos, de los cuales se tomaron 4, ya que

estos presentaron una cinética de crecimiento similar, en la cual se obtuvo un porcentaje promedio para facilitar el análisis. En la tabla 4 se puede observar que el nivel de proteha

comienza a aumentar a las 24 horas de haber iniciado la fermentación, el nivel sigue siendo

notorio hasta las 48 horas; después de este lapso el nivel se mantiene casi constante hasta

las 72 horas, que es cuando se detiene el experimento, esto es cuando la muestra ha sido cubierta por las esporas en un 40 a 50%

,

además en este tiempo los azúcares se han consumido en _su totalidad. En la figura 3, se puede apreciar de mejor manera, la tendencia que siguió el contenido de proteína, que fue de manera ascendente.

TABLA

4. Porcentaje promedio de proteína

(Bs)

Tiempo de fementacibn

(h)

Proteína

(Bs)

O 8 16 24 32 40 48 52 56 60 64 68 72 13.37 13.27 13.49 14.37 14.68 14.83 14.91 15.03 15.04 15.21 15.21 15.34 1534

Bs= Base seca

ci

L

3

u?

U

.-

I . I

-

\

\

'

i

'\

e-

m

Cabe mencionar que se adicionó en la muestra el 1% de sulfato de amonio y fosfato de potasio como nutrientes adicionales

,

ya que en dado caso que el contenido de

nitrógeno en la muestra no satisficiera la necesidades del microorganismo, éste las tomara del suplemento.

Con este trabajo, según la gráfica se tuvo un incremento de 2.07%; sin embargo en cantidades referidas

a

peso seco, el incremento es del 15.59 (0.1559 g de proteína/ g de materia seca)

.

Si se compara con los datos de Huerta et al., (1986) que obtuvo en planta piloto 0.11 g de proteínaverdadedg de materia seca y 0.158 g de proteína / g de muestra

seca a nivel laboratorio, podemos observar que el incremento obtenido a nivel laboratorio casi se iguala ai obtenido por Huerta. Existen otros autores como Auria y col. (1990) que utilizaron también Aspergúius niger con un soporte de resina de intercambio aniónico (amberlita IRA-gOo), obtuvieron un incremento del 12% de proteína, en este caso el incremento obtenido con cogollo de caña de azúcar fue mayor (4.3% más) con la diferencia de que la amberlita IRA-900 es un material no vivo y con problemas de gradiente de absorción.

Se encontraron algunos otros trabajos en los cuales se usaron diferentes cultivos así como soportes. Crawford et aL,(1973, citados por Quintero, 1981) utilizaron

Thermonospora

fusca

y obtuvieron un producto con 30% de proteína; Peiterse (1975, citado por Quintero, 1981) empleó paja de cebada como substrato y con Trichoderma

viride,

al cabo de 4 a 10 días, el contenido de proteína era de 21 a 26%. Se puede apreciar con lo antes mencionado que el rango de proteína producida oscila entre 21 y 30%. que es mucho mayor a lo obtenido en el experimento realizado con Aspergrllus

niger

y cogollos de caña de azúcar.

Existe un factor importante que cabe mencionar en este trabajo, a diferencia de

los trabajos referidos y éste, es la concentración inicial de azúcares en la muestra; en este

caso fue del 17% (0.17 gr de azúcar por gramo de materia seca ).

6.2

AZUCARES

En

la tabla 5, podemos observar que entre las 24 y 48 horas alrededor del 75% de los azúcares habían sido consumidos, este lapso es el que produce el nivel más alto de proteína, pero el contenido de azúcares sigue bajando, aún cuando el hongo deja de crecer, el consumo de azucares continúa, hasta llegar

a

consumir al final de la fermentación un 95%, esto se debe a que siendo el nivel de azúcar muy bajo

,

sólo permite al

microorganismo mantener su actividad mínima de sobrevivencia, por lo tanto ya no le es posible el crecimiento. En la figura 4, se puede observar la tendencia del contenido de

azúcar.

TABLA

5. Porcentaje Promedio de azúcares totales

(Bs).

Tiempo de fennentación

(h)

Azúcares

(Bs)

O 8 16 24 32 40 48 52 56 60 64 68 72 17.00 16.84 13.53 12.17 8.71 6.32 431 2.69 1.97 1.55 135 0.91 0.83

que los rangos de concentración de glucosa deben estar amba de 50 @I hasta 400 gn, para

que se dé un buen crecimiento del hongo, sin limitaciones.

En este experimento, la concentración que se usó no fue suficiente para que ei hongo creciera más, siendo éste una gran limitante.

Sin

embargo, se decidió utilizar esta

concentración de azúcar

(0.17

g de azúcar/g de materia seca), para determinar bajo estas

condiciones la eficiencia del comportamiento del hongo en el aumento de proteína.

I I

I

-

6.3

HUMEDAD

Con respecto ai comportamiento de humedad, se puede apreciar en la tabla 6, la evolución del contenido, teniendo inicialmente un 74.3% de humedad, confonne transcurn’a el tiempo había una ligera disminución entre las 24 y 32 horas, debido al cambio de temperatura, llegando al final de la fermentación con un 45 a 46% de humedad. Podemos observar en la figura 5, el comportamiento que tuvo el contenido de humedad y las pequeñas oscilaciones.

TABLA 6. Porcentaje promedio de humedad.

Tiempo de fermentación

(h)

humedad

O 8 16 24 32 40 48 52 56 60 64 68 72 73.98 73.89 71.46 72.79 71.37 68.65 63.93 6151 5857 56.08 54.61 50.21 4652

En un estudio realizado por Oriol eí al. (1988) utilizando yuca (Manihot esculenta

var. cubana) y AsperguruS nigw, india que en una aw de 0.85 (aproximadamente un

3w0

de humedad), el crecimiento de Asprgüius niger se inhibe.

También se menciona que un incremento inicial de aw en el substrato causa un

incremento de crecimiento en un rango específico y acorta el tiempo de germinación de las esporas.

Una aw inicial baja da como resultado una baja transferencia de nutnentes y poca

agua aprovechable para el microorganismo y esto se traduce en una conversión incompleta del substrato a biomasa.

En

este caso se coincide con el autor mencionado, ya que el contenido de humedad fue alto ( alrededor de 74%) y al final de la fermentación se obtuvo alrededor de un

46

a 47%, por lo tanto se mantuvo en un rango favorable para el microorganismo, lo cual

/

6.4 FIBRA

En la tabla 7, se puede obsewar que el contenido de fibra disminuyó de una manera insignificante, tan sólo en 3.2% (Bs).

En

la figura 6

,

se observa la tendencia que

siguió el contenido de fibra. Para la realización de este experimento se trabajó con subproductos lignocelulósicos; por lo tanto, se necesitan microorganismos que tengan una mayor actividad celulolítica para poder degradar la fibra.

TABLA

7. Porcentaje promedio de fibra

(Bs)

durante la fermentación.

Tiempo de fermentación

(h)

Fibra

(Bs)

O 8 16 24 32 40 48 52 56 60 64 68 72 3330 3330 33.22 33.68 32.99 3285 32.69 32.48 32.42 3239 3232 32.26 32.22

En

un trabajo realizado por González-Blanco et a1.(1990), en la que se enriqueció

con proteína a subproductos de caña de azúcar usando Aspergillus terreus estima que cerca del 10% de la fibra inicial fue degradada.

m

cu

m-

I

m-

L R d d-

/

’

,

TEMPERATURA

La temperatura se mantuvo en un rango de 25 a 30 "C.

Los

autores Raimbault Y

Viniegra-González (1982), mencionan que una fermentación sólida de yuca porhpergdlm n i p es más forzada por el proceso de calentamiento, ya que el crecimiento del hongo se

inhibe por amba de los 35 "C y el calentamiento está limitado por la baja conductividad térmica del substrato. Por otro lado, González-Blanco et al. (1990) menciona que el efecto

TABLA 8. CONDICIONES USADAS Y RESULTADOS FINALES OBTENIDOS EL EXPERIMENTO.

MICROORGANISMO

TIEMPO DE FERMENTACI~N:

TEMPERATüR4 DEL PROCESO:

HUMEDAD INICIAL:

HUMEDAD FINAL

AZUCAR INICIAL:

AZUCAR FINAL

FIBRA INICIAL: FIBRA FINAL

PROTEINA INICIAL: PROTEINA FINAL

RENDIMIENTO DE PROTEINA

RESPECTO A AZUCARES @’pis):

Asprgüius n&r

72 horas

25-30 ‘C 73.98% 46.52%

0.1700 gig de MS O .o83 gig de M S

0.333 gig de MS

0.322 B/g de MS

0.1327 gig de MS

0.1559 B/g de MS

CONCLUSIONES

Con la realización de este trabajo se obtuvieron las siguientes conclusiones:

- Las condiciones usadas de temperatura (25-30 'C) y humedad (74%) en el fermentador

fueron favorables para que Aspergillus niger creciera sin problemas.

-

El contenido de proteína se incremento de una forma favorable en un 15.59%

(0.1559

g de proteína /g de muestra seca), al usarhpergzílus niger en residuos de cosecha de caña

de azúcar (cogollo y hojas verdes).

-

El

contenido de azúcar inicial ( 17.0%

Bs)

usado en el experimento fue un factor

determinante, desfavoreciendo así, que se diera

un

incremento mayor en el contenido de

proteína.

- Aspergllw niger no fue capaz de degradar de una manera significativa el contenido de

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