Inhibidores de enzimas microbiales en la biodegrabilidad de detergentes

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. en ier ía. Qu. ím. ica. Escuela de Ingeniería Química. UN T. Facultad de Ingeniería Química. TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO DE INGENIERO QUÍMICO. AUTORES:. de. In g. “INHIBIDORES DE ENZIMAS MICROBIALES EN LA BIODEGRABILIDAD DE DETERGENTES”. APONTE ZAVALETA CYNTHIA STEFANIE. ec. a. DIAZ REYNALTE GLORIA LUCIANA. Msc. WALTER MORENO EUSTAQUIO. Bi. bli. ot. ASESOR:. TRUJILLO – PERÚ 2011. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN. UN T. En el presente trabajo se hace un estudio del rendimiento de la proteasa de. diferentes cultivos de cepas proteolíticas usando como muestra el afrecho del. ica. trigo.. Los cultivos se obtuvieron de muestras promedio de afrecho de trigo con el fin. ím. de obtener cepas de mayor rendimiento en la producción de proteasas. Qu. tomando como patrón el BACILLUS SUBTILIS, la proteasa se somete a la acción hidrolítica lo que desnaturaliza las proteínas, esta acción es muy usada. en ier ía. en detergentes de allí su estudio para la producción industrial de la enzima proteolítica.. En total se sembraron cien muestras en veinticinco placas petri, obteniéndose inicialmente veintinueve cultivos y posteriormente se seleccionaron tres cepas. In g. en base a su mayor producción de enzimas, terminando con una cepa a la. de. cuál denominamos convencionalmente como cepa C-l. Con la cepa c-l se evaluó la influencia del pH, requerimiento de nutrientes,. a. concentración de proteínas, concentración de células, y factores de. ec. crecimiento, como principales factores que influyen en el proceso fermentativo. ot. semisólido.. bli. Se investigó su actividad enzimática de acuerdo a su concentración así como. Bi. se evaluó con la temperatura y el pH para obtener valores óptimos; también se evaluó su acción frente a la enzima comercial que poseen los detergentes.. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. UN T. In this paper a study of the performance of different cultures protease proteolytic strains using as wheat bran sample is made.. ica. Cultures were obtained from average samples wheat bran in order to obtain higher yielding strains in the production of proteases using as pattern Bacillus. ím. subtilis, protease undergoes hydrolytic action which denatures proteins, this. Qu. action is very there detergents used in his study for the industrial production of proteolytic enzyme.. en ier ía. Altogether hundred twenty five samples were seeded in petri plates, initially yielding crops and subsequently twenty three strains were selected based on their increased production of enzymes, ending with a strain to strain which. In g. conventionally call C-l.. With strain c-l the influence of pH, nutrient requirement, protein concentration,. de. concentration of cells, and growth factors, as major factors influencing the semisolid fermentative process was evaluated.. ec. a. its enzymatic activity according to their concentration was investigated and evaluated with temperature and pH for optimal values; their action was also. Bi. bli. ot. evaluated against the commercial enzyme possessing detergents.. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE. UN T. Dedicatoria. Resumen .........................................................................................................i. ica. INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 1 CAPÍTULO I FUNDAMENTO TEÓRICO. ím. 1.1.- LAS PROTEÍNAS................................................................................... 4. Qu. 1.1.1.-Generalidades y Características .......................................................... 4 1.1.2.-Clasificación ......................................................................................... 5. en ier ía. 1.1.3.-Proteínas de las semillas de cereales .................................................. 6 1.1.4.-El Substrato........................................................................................ 10 1.2.- PRINCIPIOS GENERALES SOBRE FERMENTACIÓN SEMISOLIDA ............................................................................................... 13. In g. 1.3.-PREPARACIÓN Y PRODUCCIÓN DE ENZIMAS PROTEOLITICAS POR EL MÉTODO DE FERMENTACIÓN ....................................................................................... 15. de. SEMISOLIDA. 1.3.1.-Elementos nutricionales para la enzima ............................................. 17. ec. a. 1.3.2.-Rendimiento de la enzima .................................................................. 18 1.3.3.-Eficiencia de la fermentación ............................................................. 18. ot. 1.4.- ENZIMAS PROTEOLITICAS................................................................ 18. bli. 1.4.1.-Variedades de proteasas microbiales ............................................... 20. Bi. 1.4.2.-Características generales .................................................................. 21 1.5.- PRINCIPIOS GENERALES DE LA DESNATURALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS ......................................................................................... 21. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.5.1.-Generalidades .................................................................................... 21. UN T. 1.5.2.-Degradación hidrolítica de las proteínas ............................................ 24 1.5.3.-Reacción enzimática proteolítica en detergentes ............................... 24. 1.5.4.-Mecanismo de hidrólisis de proteínas ............................................... 26. ica. 1.5.5.-Cinética de la desnaturalización......................................................... 29 1.6.- OBJETIVO DE LA TESIS ..................................................................... 30. ím. 1.6.1.-Aislar cultivos microbianos productores de proteasas alcalinas ....... 30. Qu. 1.6.2.-Optimizar las condiciones de fermentación para la producción de proteasa alcalina por el cultivo microbiano más eficiente ....................... 31. en ier ía. 1.6.3.-Evaluar el rol de la proteasa alcalina del cultivo seleccionado en la formulación de detergentes comerciales .................................................. 31. CAPÍTULO II. In g. PARES EXPERIMENTAL. 2.1.-EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS ............................................ 32 ................................................................................. 32. de. 2.1.1.- Equipos. ................................................................................. 33. 2.1.3.- Reactivos. ............................................................................... 34. a. 2.1.2.- Materiales. ec. 2.2.-MÉTODOS. .................................................................................... 35. ot. 2.2.1.- Aislamiento y selección de las cepas ............................................. 35. bli. 2.2.2.- Selección de la cepa con mayor capacidad fermentativa ................. 36. Bi. 2.2.3.- Estudio general de las cepas seleccionadas y de la cepa Patrón .......................................................................................................... 37 2.2.4.- Efectos del pH .................................................................................. 38. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.5.- Efectos del requerimiento de nutrientes .......................................... 40. UN T. 2.2.6.- Efecto de la concentración de proteínas ........................................... 40 2.2.7.- Efecto de la concentración de la célula ............................................. 41 2.2.8.- Efecto del requerimiento de factores de crecimiento ...................... 41. .......................................................... 42. 2.2.11.-Análisis después de fermentar. ..................................................... 47 .................................. 47. Qu. 2.2.12.-Acción hidrolítica de la enzima proteolítica. ím. 2.2.10.-Análisis antes de fermentar. ica. 2.2.9.- Determinación del pH en la fermentación ....................................... 42. en ier ía. 2.2.13.-Evaluar la proteasa en la formulación de detergentes ................... 48. CAPÍTULO III. RESULTADOS ............................................................................................. 53. In g. CAPÍTULO IV. de. DISCUSIÓN ................................................................................................. 79. CAPÍTULO V. ec. a. CONCLUSIONES......................................................................................... 83. ot. CAPÍTULO VI. Bi. bli. RECOMENDACIONES ................................................................................ 85. VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................... 86. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. INTRODUCCIÓN. UN T. La producción de enzimas microbiales a escala industrial fue iniciada por la TAKAMINA Japonesa que en 1890 se estableció en U.S.A e inició la. producción de enzimas TAKADIASTAZA, este producto fue hecho por. ica. fermentación semisólida de ASPERGILLUS ORIZAE y se basó en la. ím. tecnología tradicional japonesa, mejorada por un nuevo desarrollo importante que introducía la TAKAMINA especialmente con el uso de la cascara de trigo. Qu. en lugar de arroz como principal medio componente (TAKAMINA 1894).. en ier ía. La Takadiastasa fue principalmente una preparación de α-amilasa y fue comercializada como tal, pero contenía una cantidad sustancial de proteasa y pronto. fue. recomendada. para. diversas. aplicaciones. proteolíticas,. principalmente como ayuda digestiva.. In g. Los métodos usados al principio no han cambiado mucho, a pesar que se han introducido nuevas especies y composiciones medias, en este caso se hace. de. posible desarrollar productos que contengan predominantemente la proteasa.. a. En 1913 en Francia se concedió una patente a la BOIDIN Y EFFRONT sobre. ec. un proceso para la producción de una preparación de enzimas a partir del. ot. BACILLUS SUBTILIS, la bacteria creció en un cultivo tranquilo como una. bli. película superficial de una solución preparada de masa de granos. Las. Bi. enzimas fueron segregadas en la solución y pudieron recuperarse fácilmente, esta preparación de enzimas contenía α-amilasa pero al igual que la. Takadiastasa presentaba una actividad proteolítica sustancial. La preparación. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. de la enzima fue primeramente usada como sustituta para la amilasa de. UN T. cerveza y pancreática en el secado de textiles, ejemplo la remoción de almidón aplicando las curvas para protegerlo, durante el tejido. Menos uso se hizo del componente proteolítico en la composición, a pesar que se probaron. ica. muchas ideas en los próximos años.. Las aplicaciones más importantes estuvieron en la industria del curtido, donde. ím. se usó" la proteasa en encebado y en pequeñas cantidades en el trasquilado. Qu. de pieles de carnero.. Después de la segunda guerra mundial, se adoptó el desarrollo de la. en ier ía. tecnología de fermentación sumergida para la producción de antibióticos por la industria de enzimas y durante los años 50 tuvo lugar un giro del aún antiguo cultivo de la fermentación sumergida, junto con un desarrollo modesto de especies y medios, de tal modo que se hizo posible preparaciones con un. In g. contenido predominante de proteasas; sin embargo las ventas de las proteasas microbiales fueron limitadas hasta que se introdujo su uso en. Bi. bli. ot. ec. a. de. detergentes alrededor de 1960.. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UN T. Los objetivos trazados en esta tesis son: 1.. Aislar los cultivos microbianos productores de proteasas alcalinas. 2.. Optimizar las. condiciones de fermentación para la producción de. Evaluar el rol de la proteasa alcalina del cultivo seleccionado en la. Bi. bli. ot. ec. a. de. In g. en ier ía. Qu. formulación de detergentes comerciales.. ím. 3.. ica. proteasas alcalinas por el cultivo microbiano más eficiente.. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UN T. CAPITULO I 1. FUNDAMENTO TEÓRICO 1.1. LAS PROTEÍNAS. 1.1.1. GENERALIDADES Y CARACTERÍSTICAS. ica. La palabra proteína deriva del grupo proteíos que significa de primer. ím. rango o importancia.. Qu. Las proteínas son polímeros de elevado peso molecular de un grupo de monómeros de bajo peso molecular llamados aminoácidos. Existen. en ier ía. más de 80 aminoácidos que han sido aislados de las proteínas, estos son ácidos orgánicos que contienen ya sea un grupo amino o un imino. In g. en el átomo de carbono (α) α — CH2 — COOH l NH2. Bi. bli. ot. ec. a. de. La fórmula general de la proteína es:. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El valor de n=51 para la hormona insulina, alrededor de 100 para. UN T. proteínas simples como la pepsina y alrededor de 150,000 para nucleoproteínas complejas, su enlace peptídico es considerado como enlace fundamental en la molécula.. ica. La mayoría de proteínas son moléculas de gran tamaño, complejidad y. diversidad, cada tipo de proteínas parece estar estructurado con alta. ím. especificad para realizar un trabajo determinado en la célula viva ya. Qu. sea de origen animal o de microorganismos y vegetal; esta especificad se logra por el plegamiento de la cadena polipeptídica de la proteína en. en ier ía. una configuración única.. Cuando ésta configuración se cultiva, la proteína rinde su actividad biológica y funcional con la célula.. In g. Las proteínas reaccionan en forma anfotérica, es decir, reaccionan. de. tanto como ácido así como base. 1.1.2. CLASIFICACIÓN. ec. a. Aunque las proteínas varían mucho en composición y estructura pueden dividirse arbitrariamente en varias clases que difieren en. ot. solubilidad, estado de conjugación y naturaleza de las sustancias. Bi. bli. formadas en su desnaturalización.. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. FIG. Nº 1 Clasificación de las proteínas. ím. ica. A-SIMPLES. UN T. 1-ALBÚMINAS 2-GLOBULINAS 3-GLUTENINAS 4-PROLAMINAS 5-ALBUMINOIDES 6-HISTONAS 7-GLOBINAS 8-PROT AMINAS. Qu. 1-FOSFOPROTEINAS 2-NÜCLEOPROTEINAS 3-GLUCOPROTEINAS 4-LIPOPROTEINAS 5-METALOPROTEINAS 6-GROMOPROTEINAS. In g. en ier ía. B-CONJUGADAS. 2-SECUNDARIAS. 1-PROTEASAS 2-PEPTONAS 3-PEPTIDOS. ec. a. de. C-DERIVADAS. 1-PRIMARIAS. 1-PROTEASAS 2-METALOPROTEINAS 3-COAGULADAS. ot. 1.1.3. PROTEÍNAS DE LAS SEMILLAS DE CEREALES. bli. Estas proteínas sobre todo del trigo se estudian las del gluten; la que. Bi. está formada por dos fracciones: la glutelina; que es soluble en álcalis diluidos y la gliadina que es una prolamina soluble en disolución alcohólica. Además contiene globulina, albúmina, leucosina.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TABLA N° 1 FRACCIÓN PROTEICA DEL TRIGO PESO SECO %. PRIMAVERA. INVIERNO. GLUTELINA. 4.68. 4.17. GLIADINA. 3,96. GLOBULINA. 0.62. LEUCOSINA. 0.39. ica. UN T. FRACCIÓN PROTEINICA. 0.63. 0.36. en ier ía. Qu. ím. 3.90. aminoácidos. In g. Las fracciones del trigo a su vez presentan una diversidad en composición de. GLIADINA DEL. GLUTELINA. CEINA DEL. TRIGO (%). DEL TRIGO (%). MAÍZ (%). ARGININA. 3.2. 4.7. 1.6. ot. de. TABLA N° 2 AMINOÁCIDOS DE VARIAS PROTEÍNAS DE CEREALES. LISINA. 0.6. 1.9. -. HISTIDINA. 2.1. 1.8. 0.8. TIROSINA. 3.1. 5.1. 5.9. TRIPTOFANO. 0.9. 1.8. 0.2. Bi. bli. ec. a. AMINOÁCIDOS. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) 2.5. 2.0. 6.6. CISTINA. 2.3. 1.7. 1.0. METIONINA. 2.3. -. SERINA. 0.1. 0.7. TREONINA. 3.0. -. LEUCINA. 6.0. 6.0. VALINA. 3.0. 1.0. ACIDO GLÜTAMICO. 46.0. 27.2. 35.6. ACIDO ASPÁRTICO. 1.4. GLICINA. 1.0. PROLINA. TOTAL. -. 2.5. Qu. ím. 3.0 3.0. 3.4. 1.0. -. 2.5. 4.4. 9.9. 13.2. 4.4. 9.0. 5.1. 4.0. -. 98.3. 69.8. 85.0. In g. AMONIACO. 2.5. 2.1. en ier ía. ALANINA. UN T. FENILALANIÑA. ica. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. de. De aquí se puede observar que se tiene un elevado porcentaje de. ec. a. ácido glutámico.. ot. El trigo muestra pues una cantidad considerable de fracción proteínica este cereal corro. bli. respecto al resto de cereales por eso escogemos a. Bi. el guía para nuestro estudio. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TABLA N° 3 CONTENIDO DE PROTEINA EN LOS CEREALES. TOTAL. EN 8. NAS. NAS. NAS. (TRIGO). 10-15. 3-5. 6-10. 40-50. 30-40. TRITICUM DURUM (TRIGO DURO). 12-1B. C. C. B. A. SÉCALE CEREALE (CENTENO). 9-14. 5-10. 30-50. 30-50. HORDEUM VULGARE (CEBADA). 10-16. 3-4. 10-20. 35-45. 35-45. 8-14. INDICIOS. -80. 10-15. -5. 8-10. INDICIOS. (2-8)’. (l-5)’. 85-90. 7-13. D. 5-6. 50-55. 30-45. C. C. >60. B. 7-16. 10-11. 57. 30. 10-11. 13-14. 48. 57. (AVENA) ORYZA SATIVA (ARROZ) ZEA MAYS (MAÍZ) SORGHUM VULGARE (SORGO). 9-13. de. PANICUM. 5-10. In g. en ier ía. AVENE SATIVA. ica. NAS. SECA TRITICUM VULGARE. ALBÚMI- GLOBULI- PROLAMI- GLOTELI-. ím. SOBRE MATERIA. Qu. NOMBRE. FRACCIÓN PROTEICA. UN T. PROTEINA. MILIACEUM (HIJO) SETARIA ITÁLICA. ec. a. MIJO (ITALIANO). ot. A = Fracción principal. bli. B = Cantidad considerable. Bi. C = Pequeña cantidad D = Muy pequeña cantidad E = Valores dudosos. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Substrato. : Proteína. Materia prima. : Afrecho de trigo. UN T. 1.1.4. EL SUBSTRATO. Comp. de afrecho de trigo :. ica. Cantidad respecto al trigo bruto = 15 % : Triticum Vulgare. Híbrido. : PITIC-62. Zona do cultivo. : (6). Departamento. : La Libertad. Provincia. : Santiago de chuco. Qu. :Julcan. Sectores: - Carabamba - Calamarea - Huaso. : 200 - 300 hectáreas.. In g. Área de cultivo Clima. en ier ía. Distrito. ím. Especie. : Frio. de. Temperatura media anual = 15-26°c = Marzo. a. Mes más húmedo. ec. Radiación solar promedio anual : Longitud Oeste: 35° 45' 30' – 36° - 38'. ot. Latitud. Bi. bli. Longitud Sur: 6° 52' 30" – 7° 35' 45". Altura (m). : 1000 (sobre el nivel del mar). MJ / m2. = 17.2. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TABLA N° 4 COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL AFRECHO DEL TRIGO (7) (8). 8.2 gr. PROTEÍNAS. 12.7 gr. GRASA. 1.7 gr. FIBRA. 2.2 gr. TOTAL DE HIDRATOS DE C.. ím. ica. HUMEDAD. CENIZAS. 2.1 gr. Ca. 46 mgr. P. 392 mgr. Fe. 3.4 mgr. TIAMINA. 0.55 mgr. RIBOFLAVINA. 0.15 mgr. NIACINA. 4.4 mgr. en ier ía. 344 cal. In g. Qu. 75.3 gr. VALOR CALÓRICO cal/100gr. Bi. bli. ot. ec. a. de. UN T. BASE: 100 gr.. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Bi. bli. ot. ec. a. de. In g. en ier ía. Qu. ím. ica. UN T. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.2.. PRINCIPIOS GENERALES SOBRE FERMENTACIÓN SEMISOLIDA.. de sustancia. seca,. el cual es humedecido a 50. %. UN T. El medio más común es afrecho de trigo,. inoculado con esporas y dejado a 30-40 % bajo. aireación.. ica. La razón para establecer fermentación semisólida para estos productos es. ím. que se obtienen mayores rendimientos y la composición más adecuada que. Qu. con un cultivo sumergido.. Las diferencias bioquímicas entre el cultivo semisólido y sumergido no han. en ier ía. sido estudiados minuciosamente, pero diferentes efectos indican que estas diferencias son profundas y fundamentales. Básicamente,. hay una diferencia en la concentración del agua, opera. generalmente con al redor del 50% de sustancia seca. Pero otra importante. In g. diferencia es que el micelio en la fermentación semisólida está expuesta a la atmósfera y es permitida que se desarrolle sin obstáculos hasta su forma una condición que permite el desarrollo de esporas y cuerpos. de. natural,. frutosos en una extensión mayor que en una fermentación sumergida; es. ec. a. conocido que en la fermentación semisólida el rango de enzimas producidas al mismo tiempo por un hongo. simple es más. amplio que el rango de. bli. ot. enzimas producidas por un cultivo sumergido. Por ejemplo en la producción de α-Amilasa por Aspergillus Orizae en el. Bi. proceso del afrecho,. hay una producción concomitante sustancial de. proteínas y aminopeptidasa,. esta producción está casi totalmente ausente. del cultivo sumergido para el mismo género. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Muchas. de. las. sus. extracelulares. componentes. con. de. Aspergillus. menos. Oryzae. carbohidratos. o. son sin. UN T. glucoproteínas,. enzimas. carbohidratos son formados en cultivos semisólidos, este cultivo tiene la desventaja de que es casi imposible de agregar ingredientes al medio durante. ica. el cultivo, esto significa que los cambios de valores de pH y concentración de. carbohidratos están predeterminados cuando el medio es inoculado. Por otro. ím. lado parece que la fermentación se desarrolla más regularmente si solamente. Qu. se resuelve el problema importante de control correcto de la humedad del medio.. en ier ía. La recuperación de las enzimas preparadas por fermentación semisólida es generalmente simple. La masa fermentada es extraída con agua o buffer a un valor adecuado de pH preferentemente en un sistema a contracorriente de tal modo que la concentración de enzimas en el extracto es tan alta como es. In g. posible. El extracto es filtrado y concentrado por ultracentrifugación o evaporación y este concentrado es usado como una preparación enzimática. de. después de la estandarización y adición de preservativos, o la enzima es. a. precipitada con solvente o más raramente con sales fflg^'. ec. El biorreactor o encebadora es un cuerpo herméticamente cerrado que tiene. ot. bandejas longitudinales. La temperatura de incubación de los moldes de. bli. afrecho tiene que ser controlado por una continua circulación de humidificación del aire sobre e inferior de las bandejas, estas contienen. Bi. cuentagotas.. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.3.. PREPARACIÓN Y PRODUCCIÓN DE ENZIMAS PROTEOLITICAS. UN T. POR EL MÉTODO DE FERMENTACIÓN SEMISOLIDA En el proceso, el afrecho de trigo es alimentado a un reactor batch, de allí es cocinado (1 hora) y mezclado; por la parte inferior de la cocina se monta un. ica. aparato de agitación y se agrega 0.2 N de HCL, siendo la proporción de 2.4 de afrecho y ácido respectivamente y se produce una masa conteniendo 50%. ím. de humedad; este afrecho se esteriliza en la misma cocina por inyección. Qu. directa de vapor en la masa por 30 minutos con constante agitación, inmediatamente se pasa a un batch para enfriar con aire, con agitación; luego. en ier ía. es secado por evaporación al vacío, la muestra debe estar con una temperatura de 35"C, se cierra el aire y se inocula la cepa como alimento, a continuación se introduce al biorreactor de incubación para su crecimiento manteniendo la temperatura en 26°C durante 4 días, el cultivo del molde es. In g. separado para desarrollarlo en la recámara, es secado en una centrífuga o bandeja desecadora después la masa es separada por pulverización y poder. de. ser marcado como tal o procesado.. a. Se separa para la producción de enzimas concentradas para este objetivo y el. ec. molde de afrecho es extraído con agua, filtrado y la enzima precipitada para el. ot. filtrado por sucesivas adiciones de etanol; el precipitado es luego separado. Bi. bli. desde el líquido por centrifugación y así obtener el producto deseado.. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Bi. bli. ot. ec. a. de. In g. en ier ía. Qu. ím. ica. UN T. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La zona activa o grupo activo de la enzima es una pegue la región de su. de. In g. en ier ía. Qu. ím. ica. FIG. N 4 REPRESENTACIÓN DE LA ENZIMA. UN T. superficie cuya forma se amolda precisamente a un substrato determinado.. ec. a. 1.3.1. ELEMENTOS NUTRICIONALES PARA LA ENZIMA Las bacterias contienen substancias minerales tales como fósforo,. ot. calcio, magnesio, azufre, hierro, potasio, sodio y cloro por lo tanto el. Bi. bli. substrato nutritivo también debe contener estas sustancias; en el agua de pozo se encuentran en cantidad suficiente y no se precisan añadirle otras sales. El afrecho de trigo es rico en estos elementos nutricionales por lo que la adición de fuentes nitrogenadas es mínima; toda enzima 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. es proteína.. La. cantidad. de. enzima. que. puede. producir. UN T. 1.3.2. RENDIMIENTO DE ENZIMA teóricamente. la. fermentación semisólida del afrecho de trigo es muy importante para el. ica. cálculo del rendimiento.. ím. Tomando como base 1 kg. de afrecho de trigo : 1000 gr. nos da 12,6. Qu. gr. de proteína.. Para obtener glutelina nos representa del 4.17% a 4.68% del total de. en ier ía. proteína en el afrecho de trigo, esto nos da 0.52542 - 0.58968 gr. o 525 - 589 mgr. de enzima proteolítica.. In g. 1.3.3. EFICIENCIA DE LA FERMENTACIÓN. La eficiencia de la fermentación en porcentaje se calcula de acuerdo. de. con la siguiente relación:. bli. ot. ec. a. Enzima producida actúa % Efic. de la fermentac. = ---------------------------------------- * 100 Enzima teórica fermentada. Bi. 1.4 ENZIMAS PROTEOLITICAS GENERALIDADES ENZIMA.-. Son sustancias. de naturaleza proteica que actúan como 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. agentes catalíticos elaborados por la célula viva.. Son catalizadores. UN T. específicos. PROTEASAS MICROBIANAS.- Son enzimas capaces de hidrolizar algunos dipéptidos sintéticos y sus derivados.. ica. Contienen cantidades apreciables de aminopeptidasa, carboxipeptidasa y. ím. dipeptidasa.. Qu. La actividad microbiana de estas proteasas se determina empleando caseína, hemoglobina, gelatina o cualquier otra proteína natural como. en ier ía. substrato.. LOS USOS DE LA PROTEASA MICROBIANA.- Se emplean para:. In g.  Curtir cueros.  Quitar manchas en tintorería. de.  Recuperar la plata en películas fotográficas  Después de haber hidrolizado la cepa de gelatina. a.  Fotosensible con una proteasa bacteriana adecuada. ec.  En la industria de alimentos. ot.  En la industria papelera. bli.  En la industria textil. Bi.  Elaborar las pastas dentífricas  En farmacias para el tratamiento de ciertas heridas, en depilatorios, etc..  Las proteasas también se emplean en la elaboración de cervezas, para. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. restablecer carnes, como aditivo en panadería (restablecer la masa así. UN T. como darle propiedad elástica) etc.. 1.4.1. VARIEDADES DE PROTEASAS MICROBIALES. ica. Tenemos: Especies de Pseudomas. -. Semejantes a pseudomas. -. Putida y Psaeruginosa. -. Especies de bacillus. -. Semejantes al bacillus subtilis. -. Muchas esporulaciones anaerobias. -. Semejantes a el Sporogens. -. C1. histolycticum. -. C1. Perfringens. In g. en ier ía. Qu. ím. -. de. DIVERSAS ESPECIES DE BACTERIAS IGUAL A: -. La Serrati Marcesuns. Bacillus prodigiosus. ec. -. Proteus vulgaris. a. -. ot. -. Bacillus Prumi. Bi. bli. -. Bacillus Proteus. OTRAS ESPECIES MEZCLADAS LICUADAS SON: -. Aspergillus Niger. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) -. Aspergillus Orizae. -. Aspergillus Flavus. -. Penicillium Roquefortii. El microbio proteasa es raramente una única. UN T. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. enzima proteolítica. ica. (Proteasa) la cual incluye proteínas sobre enzimas capaz de romper bajo la intacta molécula proteica en largo fragmento,. en ier ía. 1.4.2. CARACTERÍSTICAS GENERALES. Qu. pocos aminoácidos.. molecular proteica y romper los. ím. único la mayor o menor degradación. con ataque. Forma : esférica, bastones, alargados Tamaño. : 1-9 mieras de ancho. 2-20 mieras de longitud. Esporas. In g. Moléculas proteicas: 4-9 mu.. : Redondas o semiformes. de. Composición química:. a. Agua = 85%. -Hidratos de carbono = 10 -30% -Substancias minerales = 3 - 30%. ot. ec. Sustancia seca = 15%<. -Proteína = 40 - 70%. PRINCIPIOS GENERALES DE LA DESNATURALIZACIÓN DE. Bi. bli. 1.5.. LAS PROTEÍNAS. 1.5.1. GENERALIDADES La desnaturalización puede definirse como cualquier cambio de una 21. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. proteína globular que disminuye su solubilidad en el punto isoeléctrico.. UN T. La estructura rígida de una proteína molecular se mantiene en su forma mediante 3 tipos principales de enlaces cruzados. S-S; Ditio. 2.. Puentes de sal (Entre ácido aspártico y glutámico, lisína y. ica. 1.. Enlaces de hidrógeno (Entre enlaces peptídicos -C=O, H-N y grupos polares semejantes). Qu. 3.. ím. arginína). en ier ía. Cuando se desnaturaliza una proteína, algunos o todos estos enlaces cruzados se rompen y la estructura interna específica de la proteína natural se pierde.. bli. ot. ec. a. de. In g. FIG Nº 5- DESNATURALIZACION ROMPE LOS ENLACES. Bi. Según KLOTZ, la desnaturalización reduce la cantidad de agua retenida en forma de cristal de hielo en la proteína natural. Cuando las cadenas peptídico, fuertemente plegadas, de una proteína. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. globular. se. desdoblan. en. un. grado. notable. debido. a. la. proteína insoluble de tipo fibroso TABLA Nº 5.- AGENTES DESNATURALIZANTES. ÁCIDOS, MINERALES Y ÁLCALIS. ica. Ruptura de los puentes de sal Ruptura de los enlaces de hidrógeno Ruptura de los enlaces de hidrógeno Ruptura de los enlaces de hidrógeno Ruptura de los puentes de sal. en ier ía. ACETONA. ím. CALOR. Causas probables de desnaturalización Ruptura térmica de los puentes de sal, fusión del agua retenida como cristal de hielo. Qu. AGENTE. UN T. desnaturalización, la proteína globular soluble se transforma en. ALCOHOLES UREA. de. In g. ACIDO TUNGTICO, PICRICO, TRICLOROACETICO TRITURACIÓN VIGOROSA. a. BATIDO O AGITACIÓN. Bi. bli. ot. ec. LUZ VISIBLE MÁS SENSIBILIZADOR ONDAS ULTRASÓNICAS. LUZ ULTRAVIOLETA, RAYOS X. Desconocido Desplazamientos de las cadenas peptidicas Desconocidos Agitación mecánica, efectos térmicos, liberación de oxigeno del agua Absorción de energía, ruptura de los enlaces. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UN T. 1.5.2. DEGRADACIÓN HIDROLITICA DE LAS PROTEÍNAS Las proteínas pueden descomponerse por hidrólisis en sus elementos constitutivos: dipéptidos, péptidos o aminoácidos.. El Ion Hidroxilo. c). Las Enzimas Proteolíticas. ím. b). Qu. El Hidrogenión. en ier ía. a). ica. Los catalizadores importantes que llevan a cabo estos cambios son:. 1.5.3. REACCIÓN ENZIMATICA PROTEOLITICA EN DETERGENTES Los procesos de lavado de ropa son realizados para extraer el sucio de la ropa en la forma más simple posible, en muchos procesos se usa un. In g. agente de lavado; esta forma consiste de uno o más agentes con superficie activa (Surfactantes), agentes. secuestradores,. álcali y. de. otros materiales de confección. Es común inducir per borato el cuál actúa como agente blanqueador separadamente en forma de. ec. a. hipoclorito después de los procesos de lavado. se ensucian absorbiendo partículas o soluciones. ot. Las ropas. bli. circundantes como las expulsadas por el cuerpo. La naturaleza de la. Bi. suciedad es. tan variada como circundante, pero en general puede. clasificarse como tierra, partículas inertes,. lípidos, carbohidratos,. proteínas y tintes. En el proceso de lavado,. el calor, las condiciones. alcalinas,. la presencia de surfactantes y el agente blanqueador 24. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. descompondrá el tinte no disuelto. El sucio proteináseo no siempre. UN T. será extraído en este proceso y la proteína remanente en la tela podrá retener otros componentes de suciedad. proteínas. forma que no son disueltas. pueden coagular en la tela, de tal. al valor de PH. (9-10) del proceso de. ica. La razón es que las. lavado. Esta coagulación puede ser causada por un valor alcalino de. ím. pH, Temperatura, Proceso enzima tico, tal como la coagulación de la. Qu. sangre y por acción de agentes oxidantes tal como el peróxido de hidrógeno que se desarrolla en los detergentes con contenido de. en ier ía. perborato alrededor de los 50°C. Esta última acción es de particular importancia ya que el sucio proteínico no extraído de la tela cuando la temperatura alcance los 50 en el proceso de lavado será precipitado en la tela y será difícil de extraer.. In g. El uso de enzimas proteolíticas en los detergentes puede resolver este problema. Las enzimas hidrolizadas disueltas o proteínas coaguladas y. a. tela.. de. los productos de degradación soluble son fácilmente enjuagados en la. primeros. ec. Los. ot. principalmente. detergentes a. la. de. limpieza. enzimas de. ropa. estuvieron. destinados. de. ensuciada. trabajo. bli. excesivamente tales como aquellas de la industria del pescado,. Bi. mataderos o camales, panaderías y hospitales. Manchas de este tipo de lavado contienen un alto porcentaje de proteínas.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Las. manchas. con. contenido. de. proteínas. también. ocurren. UN T. frecuentemente en lavanderías domésticas ordinarias. La naturaleza Catalítica (Independiente del tiempo) de la reacción de la. enzima podría indicar que las enzimas serían más efectivas en un. ica. proceso de remojo, dejando el tiempo suficiente para que las enzimas actúen. Sin embargo, la experiencia ha demostrado que en muchos. ím. casos la ligera digestión de la proteína es suficiente para hacer que la. Qu. mancha se disuelva fácilmente y que las enzimas disponibles para un eficiente y moderno lavado sean capaces de producir este efecto sin el. en ier ía. tiempo disponible en un ciclo normal de una lavadora. La reacción enzimática tiene lugar en una máquina lavadora y en un reactor que puede ser cualquier recipiente cualquiera de fondo, la tendencia para lavar a baja temperatura, esto provoca un ahorro de. In g. energía, en ambos casos las enzimas han demostrado ser muy útiles y han hecho lo posible para lograr igualmente buenos resultados a los. de. conseguidos con el lavado normal a alta temperatura. Concentración =. ec. a. 0.3 UA/mgr. ot. 1.5.4. MECANISMO DE HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS. bli. Las bacterias, mohos y actinomicetos son los principales causantes de. Bi. esta hidrólisis, la capacidad de un determinado microorganismo para hidrolizar un compuesto orgánico nitrogenado depende si produce o no la enzima hidrolítica extracelular que puede catalizar la hidrólisis específica. 26. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En condiciones anaeróbicas, las bacterias son las principales causas. UN T. de la hidrólisis, en condiciones aerobias; los mohos, así como las bacterias aerobias y actinomicetos La reacción general es:. ica. Proteasa PROTEÍNAS + H2O --------------> POLIPEPTIDOS. 2.. Metaproteína. 3.. Proteosas. 4.. Peptonas. 5.. Polipéptidos. 6.. Dipéptidos. 7.. Aminoácidos. Qu. Proteína desnaturalizada. In g. en ier ía. 1.. ím. Los productos intermedios liberados durante la hidrólisis son:. péptidos existentes en un. de. El grado y número de complejidad de los. hidrolizado de proteínas depende de la fase a la que llega la hidrólisis.. ec. a. La naturaleza del enlace peptídico que une los aminoácidos para formar péptidos (polipéptidos) y proteínas se ilustra más abajo para el. bli. ot. caso de un tripéptido y sus 3 aminoácidos componentes.. Bi. El grupo carbóxilo de un aminoácido va unido al grupo amino del aminoácido adjunto, con separación de una molécula de agua en cada unión.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Este proceso. se invierte cuando la proteína o el péptido sufren la. Qu. ím. ica. UN T. hidrólisis. PROTEÍNAS. en ier ía. TABLA Nº 6.- AMINOÁCIDOS HALLADOS EN LOS HIDROLIZADOS DE. ASPARAGINA. 15.- LISINA. 2.-. CISTINA. 16.- HISTIDINA. 3.-. LEÜCINA. 4.-. GLICINA. 18.- PROLINA. 5.-. ACIDO ASPÁRTICO. 19.- TRIPTOFANO. 6.-. TIROGINA. 7.-. VALINA. 21.- ISOLEUSINA. 8.-. DEBROMOTIROSINA. 22.- ACIDO α, €-. ec. a. 20.- HIDROXIPROLINA. 9.-. SERINA. DIAMINOPIMELICO 23.- TIROXINA 24.- METIONINA. 11.- FENILANINA. 25.- TREONINA. 12.- GLUTAMINA. 26.- HIDROXILISINA. ot. 10.- ACIDO GLUTAMICO. bli Bi. 17.- DITODOTIROSINA. de. In g. 1.-. 13.- CISTINA 14.- ARGININA. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.5.5. CINÉTICA DE LA DESNATURALIZACIÓN. UN T. La molécula de proteína contiene una configuración en espiral ordenado al azar durante la desnaturalización.. Este evento, suele ir asociado a grandes cambios especiales por los. ica. cuáles las cadenas laterales de los aminoácidos ganan una libertad de movimiento que no tenían en el estado nativo; por lo tanto la. ím. desnaturalización va acompañado de un aumento significativo de. Qu. entropía (+AS). El cambio de entalpia durante el proceso será también grande y positivo, puesto que la enzima debe absorber calor para. en ier ía. romper los numerosos enlaces electrostáticos y puentes de hidrógeno que estabilizan la estructura nativa.. G= H-T S. A temperaturas elevadas el S: grande. In g. => -T S> H —> G=-. ec. a. de. y la desnaturalización es favorable - H > + T S = - G favorable. a temperaturas bajas la reacción será PN == > PD PN = Proteína nativa. bli. ot. PD = Proteína desnaturalizada. Bi. La relación entre la constante de equilibrio y la temperatura viene dada por la ecuación de VAN' HOFF. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UN T. G DT dln K =—— * —— R T2. ica. -AH ln K = —— + CTE RT. Donde la constante es. la intersección en ordenada de la. ím. representación de 1n K frente a 1/T, la pendiente de esa gráfica es Si se conocen las concentraciones de equilibrio entre nativa y desnaturalizada. ecuación sería : 1n K1 K2. H R. -. a diferentes. temperaturas la. en ier ía. proteína. Qu. - AH/R.. .. T2 = T1 T2 * T1. temperatura.. OBJETIVO DE LA TESIS. de. 1.6.. In g. La entalpia de desnaturalización no siempre es independiente de la. Para cumplir plenamente con el presente tema se estructura el orden. ot. ec. a. de trabajo, de acuerdo a los siguientes objetivos:. CULTIVOS. MICROBIANOS. PRODUCTORES. DE. bli. 1.6.1. AISLAR. Bi. PROTEASAS ALCALINAS. Del análisis del suelo se seleccionó la que tiene mayor capacidad de fermentación:. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.6.2. OPTIMIZAR LAS CONDICIONES DE FERMENTACIÓN PARA LA. UN T. PRODUCCIÓN DE PROTEASA ALCALINA POR EL CULTIVO MICROBIANO MAS EFICIENTE. A fin de obtener una representación completa de una fermentación es. ica. necesario estudiar separadamente el efecto de todas las variables. ím. importantes del sistema.. Qu. Las variables serán: Efecto del pH. 1.6.2.2.. Efectos del requerimiento de nutrientes. en ier ía. 1.6.2.1.. A). fuente de nitrógeno. B). fuente de proteínas. Efecto de la concentración de proteína. 1.6.2.4.. Efecto de la concentración de la célula. 1.6.2.5.. Efectos de los factores de crecimiento Análisis de proteínas antes y después de fermentar. de. 1.6.2.6.. In g. 1.6.2.3.. Efectos hidrolíticos de la enzima proteolítica. a. 1.6.2.7.. ec. 1.6.3. EVALUAR EL ROL DE LA PROTEASA ALCALINA DEL CULTIVO. ot. SELECCIONADO EN LA FORMULACIÓN DE DETERGENTES. Bi. bli. COMERCIALES. 1.6.3.1.. Evaluar la concentración de la enzima. 1.6.3.2.. Evaluar la actividad enzimática según el PH, T.. 1.6.3.3.. Evaluar la enzima para uso comercial en detergentes.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UN T. CAPÍTULO II PARTE EXPERIMENTAL. ica. 2.1. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS. ím. 2.1.1. EQUIPOS Cocina eléctrica de 1000 w. -. Congeladora. -. Equipo de esterilización. -. Autoclave. -. Estufa. -. Equipo de baño María. -. Balanza de monoplato mecánica. -. PH metro digital. -. Microscopio binocular con eliminación artificial. en ier ía. In g. de. Cubetas neumáticas. Equipo de destilación simple. ec. -. Cámaras de conteo Newbaner. a. -. Qu. -. Espectrofotómetro 20 D. -. centrifuga. Bi. bli. ot. -. -. Mechero Bunsen. -. Motores de 3 voltios. -. Equipo aireador. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Afrecho de trigo. -. Placas petri de 9 mm de diámetro. -. Mechero de alcohol. -. Pinzas de cultivo. -. Sembrador de vidrio. -. Tapones de algodón. -. Frascos de 5 mi. -. Matraz erlenmeyer de 500 mi. -. Láminas portaobjetos - cubreobjetos. -. Pipetas. -. Goteros. -. Tubos de ensayo. -. Fiola aforado de 1000 mi. -. Frascos de 100 mi. -. Frasco lavador. ím Qu. en ier ía. In g. de. Frascos de precipitación de 100 mi Probetas de 100 mi. ec. a. -. ica. -. UN T. 2.1.2. MATERIALES. Tapones de jebe Nro. 2. -. Tubos de vidrio de 6 mm de diámetro. -. Embudo. -. Buretas de 50 mi. -. Recipientes de plástico. -. Papel de filtro. Bi. bli. ot. -. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Bolsas de polietileno. -. Manguera de conexión de 6 mm de diámetro interior. -. Soportes universales. -. Botellas de suero para diseñar el bioreactor. -. Pegamento.. ica. UN T. -. ím. 1.1.3. REACTIVOS. Bacto agar deshidratado sabourand dextrosa. -. Alcohol absoluto (99°). -. Agua destilada. -. Ron de quemar. -. Sal Yodada. -. Bacto Casamino Acida. -. Azúcar. -. Caseína 1% en buffer fosfato 0.1 M pH=8. -. Buffer fosfato 0.1 M pH=8. en ier ía. In g. de. -. Solución de Ninhidrina al 0.25% Saturado con butanol. Acido trieloro acético al 10%. a. -. KCL 0.154 M.. ec. -. Qu. -. ot. -. Bi. bli. -. Sacarosa 0.25M Reactivo Biuret I: Solución alcalina. -. Reactivo Biuret II: CuSO, 5%. -. Tetracloruro de Carbono. -. NaOH NH2. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Solución Oxihemoglobina. -. Sulfato de Amonio. -. HCL 10 N. -. Agua de Amoniaco.. MÉTODOS. Se seleccionaron muestras de tierras de los campos de cultivos. Qu. 1.. ím. 2.2.1. AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE LAS CEPAS. ica. 2.2. -. UN T. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. de la Cooperativa Cartavio teniendo en cuenta el cuartel de caña. en ier ía. chica, se sacaron muestras de sus 4 lados más uno del centro de 15 cuarteles que hacen un total de 75 muestras de campo Cartavio más 25 muestras que se tomaron de biohuertos que hay en el Colegio Mixto Cartavio; estas muestras de 10 gr más o. In g. menos, se guardaron en bolsas de polietileno. Las muestras se trataron en el laboratorio de Microbiología. En un tubo de ensayo se agrega 3 gr de muestra de tierra más. a. 2.. de. industrial de la U.N.T. ec. 10 ml de agua, numeradas y taponeadas se puso a ebullición. Bi. bli. ot. por 40 minutos para después enfriarse aísla utilizando Bacto Agar deshidratado Sabourand Dextrosa (22), en placas petri previamente esterilizadas, la forma fue tipo estrías, (fig. N° 6). Se colocó las placas en un medio a 35°c de Temperatura, se observó los cultivos las 24 horas hasta la aparición de las. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 3.. UN T. colonias (Tabla Nº 7).. Se analizó la cepa para conocer si era la proteasa requerida mediante la prueba de la caseína, con leche descremada. ica. Carnation, en placas petri de aquí se obtuvo las mejores cepas. 4.. ím. (Tabla N° 8).. Se obtuvieron 12 buenas cepas las cuales se aislaron del cultivo. Qu. de siembra a 12 placas petri para su purificación (Tabla Ne 9). De las 12 placas petri se obtuvo cultivos puros, los cuales se. en ier ía. 5.. aislaron y guardaron en frascos de 5ml, en medio Sobourand dextrosa para su posterior uso en las pruebas fermentativas.. DE. LA. In g. 2.2.2. SELECCIÓN. CEPA. CON. MAYOR. CAPACIDAD. FERMENTATIVA. Se sometieron los 12 cultivos a la prueba del poder fermentativo. de. 1.. usando 2 tipos de substrato. Afrecho de trigo 50% de sustancia. Bi. bli. ot. ec. a. seca y una composición del medio de : gr/cm3 almidón de papa. 40. cebada molida. 100. harina de soya. 30. CaCO3. 5. 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El tiempo fue de 7 días. Tabla N° 10, fig. N° 7. Se descartaron las cepas que no fermentaron. 3.. Se seleccionaron 3 cepas que por su cantidad de producción de. 4.. ica. la enzima fueron las mejores. (Tabla Na 11).. UN T. 2.. Se hizo otra prueba de la capacidad fermentativa de las tres. ím. cepas, esta vez comparándola con el Bacillus subtilis (Tabla N°. 5.. Qu. 12, fig. N° 8 y fig. N° 9). Se usaron las mismas condiciones iniciales de fermentación. en ier ía. usadas en la selección de las cepas y las pruebas químicas de la detención de polipéptidos y péptidos. 6.. Las cepas luego de la prueba del poder fermentativo se. In g. guardaron en la estufa a 25°C para posteriores pruebas.. de. 2.2.3. ESTUDIO GENERAL DE LAS CEPAS SELECCIONADAS Y DE LA. a. CEPA PATRÓN. Las características de las colonias se estudiaron en agar glucosa. ec. 1.. Bi. bli. ot. a 25°c. La forma celular y la reproducción asexual se investigó en caldo sacarosado al 1% observándose a las 48, 72 y 96 horas. El tamaño celular se investigó en agar glucosa a las 48 horas, utilizando para la medición, objeto y ocular micrométrico. 37 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(44) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La formación de cepas proteolíticas se averiguó a los 5 y 6 días.. Se utilizó la cepa bacillus subtilis como cepa patrón. 2.. UN T. Los resultados se observan en la tabla N° 13.. Para investigar la fermentación de proteínas se utilizó la caseína. ica. y agua peptonada en soluciones, la concentración final fue del. La asimilación de proteínas y sustancias nitrogenadas se. Qu. 3.. ím. 1% anotándose los resultados en la tabla Na 14. estudiaron en los medios nitrogenados base. Las sustancias. en ier ía. nitrogenadas fueron KNO3, úrea. Tabla N° 15. Todas las sustancias se usaron en estado puro, cristalizadas en papel filtro watman impregnadas con las respectivas soluciones saturadas. La siembra se hizo según la técnica de estría,. 4.. In g. incubando a 25 SC por 3 días. (22). Para investigar la utilización de la enzima corro fuente de. de. degradación hidrolítica se empleó un medio sintético en tubos de. a. 16 x 150 rrm a los que se le añadió la enzima a la concentración. ec. final del 5%; se usó en la lectura dos testigos uno sin la enzima y. bli. ot. el otro con la enzima sembrada. \gm). Bi. 2.2.4. EFECTOS DEL PH 1.. Se investigó primeramente la variación del pH en función del volumen de agua añadida en porcentajes de 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 90% al medio. 38. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(45) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Para medir el pH se usó el PH - digital y se trabajó con un. UN T. volumen constante de 700 mm para todos los casos. Tabla Ne 16 y figura Nº 10. 2.. Para estudiar el efecto del PH en la fermentación se hicieron. ica. cultivos para las tres cepas seleccionadas y la cepa patrón, las cuales se inocularon cada una, previo conteo en la cámara de. Qu. Se regula con NaCl.. ím. Newbaner, a los sgtes PH : 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 Tabla N° 17. Tiempo de fermentación. : 6 días. b). Concentración de la célula. : 2.4 x 107 cell/ml. c). Volumen del extracto. : 700 ml. Temperatura. : 35°c.. de. In g. a). d) 3.. en ier ía. Las condiciones de fermentación fueron:. La fermentación se detuvo a los 6 días, finalizado para minimizar. a. pequeños crecimientos microbiales y pérdida de enzima. ec. enfriándose hasta 5o en un intercambiador de calor; de aquí se. Bi. bli. ot. lleva al análisis cuantitativo para determinar el contenido de enzima, anotándose los resultados del rendimiento enzimático, para luego determinar el rango de pH más óptimo, después de esterilizar se ajustó el pH a 9.7 con adición del 10% de Na2CO3 1M, las variables y sus resultados se anotan en la Tabla N° 18 y. 39 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(46) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.5. EFECTOS DEL REQUERIMIENTO DE NUTRIENTES. Se usó el pH óptimo 7.5 obtenido del estudio del pH, como. ica. 1.. UN T. en la fig. N° 11.. variable fija y constante para evaluar el efecto de requerimiento. Para evaluar la fuente de nitrógeno se usó úrea a las. Qu. 2.. ím. de nutrientes.. concentraciones 0.010, 0.020, 0.030, 0.040,0.050 gr añadidos a. en ier ía. los 100 ml del medio. Tabla N° 19.En la evaluación de la fuente de proteínas se usó peptona de caseína a las concentraciones de 0.10, 0.20, 0.30 Tabla N° 20.. Las condiciones de operación fueron :. b). In g. 3.. c). Concentración de célula: 2.4 x 107 cell/ml. d). Volumen del extracto : 100 mi. Temperatura. = 25°c. PH. = 7.5. a. de. a). Cultivo empleado : C-ll. 4.. Se graficaron los resultados de enzimas producidas con cada tipo de nutrientes en la Fig. N° 12.. Bi. bli. ot. ec. e). 2.2.6. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEINA 1.. Para evaluar el efecto de la concentración de proteína se usó caseína al 1% en buffer fosfato 0.1M. pH = 8 en volumen de 40. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(47) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 y 4 mi.. a). Temperatura =. b). pH. c). Concentración de células: 2.4 x 107 cell/ml. d). Volumen del extracto : 100 ml. e). Cultivo empleado. :C–1. ica. 7.5. ím. =. 25°c. UN T. Las condiciones de operación fueron:. Qu. 2.. Tabla N° 21 y fig. N° 13.. 2.2.7. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA CÉLULA Para evaluar el efecto de la concentración de la célula se usaron. en ier ía. 1.. las siguientes concentraciones: (Tabla N° 22 y fig. N° 14). 2.4 x 107 cell/ml. b). 6.8 x 107cell/ml. c). 12.4 x 107 cell/ml. d). 2.. 24.0 x 107cell/ml. Las condiciones de operación fueron: T. =. 25°c. b). pH. =. 7.5. c). Volumen de extracto :. d). Cultivo empleado. ec. a. a). :. 100 ml C–1. Bi. bli. ot. 18.2 x 107 cell/ml. de. e). In g. a). 2.2.8. EFECTO DEL REQUERIMIENTO DE FACTORES DE CRECIMIENTO 1.. Se usó la solución preparada de vitaminas del complejo B.. 41 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(48) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Se acondicionó el extracto a las concentraciones de:. 1.0,. UN T. 0.5, 0,2, 0.1 y 0.05 ml. Tabla N° 28 y fig. N° 15. 2.- Las condiciones de operación fueron idénticas a las usadas para evaluar los otros efectos: T. 2 5°c. b). pH. c). Concentración de la célula : 2.4 x 107cell/ml. d). Volumen del extracto 100 ml. e). Cultivo empleado C-l. ím. 7.5. en ier ía. =. Qu. -. ica. a). 2.2.9. DETERMINACIÓN DEL PH EN LA FERMENTACIÓN 1.. Para determinar el pH en la fermentación se usó el PH-metro digital (método potenciómetrico), previamente calibrado a la. 2.. In g. temperatura ambiental con una solución buffer adecuada. La lectura se hizo directamente tomando una muestra de 100 ml. de. del fermento en un vaso de 150 ml y luego se introdujo los. a. electrodos leyendo el valor del pH en el PH-metro en forma. ot. ec. directa.. bli. 2.2.10 ANÁLISIS ANTES DE FERMENTAR. Bi. Tabla N° 21,24. A.. PROTEÍNAS TOTALES. A.2.. Procedimiento. 42 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(49) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A.2.1. Obtención do la proteína libra (22). KCl -. 0.15M, en frío,. Pesar 2gr. de perfundido y homogenizarlo en un mortero de. porcelana frío, durante 10 min empleando 8 ml de. sacarosa. 0.25M.. Pasar el homogenizado a un tubo de centrifuga. Lavar el. ím. -. UN T. Perfundir 20gr de muestra a analizar con una solución de. ica. -. con 2 mi más de sacarosa 0.25 M y este. Qu. mortero. líquido agregarle al tubo de centrífuga.. Centrifugar a 10,000 rpm por 15 min o 3,500 rpm por 30 min.. -. en ier ía. -. Separar. el. sobrenadante,. el. cual. constituye. el. In g. homogenizado de proteína libre. A.2.2. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEINA. de. Se utiliza el método de INCHIOSA y MASS que se fundamenta en la reacción de BIURET.. ec. a. Preparar los sgtes sistemas:. Bi. bli. ot. Se utiliza el método de INCHIOSA y MASS que se fundamenta en la reacción de BIURET. Preparar los sgtes sistemas:. -. COMPONENTES (Tubos de ensayo) (B). (I). -. Muestras de proteína libre. -. 0.5. -. Agua destilada mi. 2.5. 2.0. 43 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(50) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Reactivo I Biuret, mi. 2.5. -. Mezclar, dejar en reposo 30 min, leer en fotocolorímetro a 540 nm. -. Reactivo II Biuret, mi. 0.15. -. Mezclar, dejar en reposo 30 min, leer en fotocolorímetro a. ica. 0.15. 2.5. UN T. -. ím. 540 nm. Qu. A.3 CÁLCULOS a). Restar la primera lectura de cada tubo (al final de los primeros. b). en ier ía. 30 min) de su segunda lectura (al final de los últimos 30 min). A la lectura de los tubos I restar la lectura del tubo blanco. (B) Los valores obtenidos son las lecturas reales. c). Expresar la concentración de proteínas utilizando la sgte.. In g. fórmula:. mg de proteína total. del tubo problema. Factor = 0.078 (en Klett de Summerson). ec. a. de. mi de homogeneizado de prot. libre. x factor x lectura real. ot. B.. Bi. bli. 1.. ANÁLISIS DE CENIZA. Tomar 2 crisoles y llevarlos al horno para pre-inflamar a 300°c por un tiempo de 20 minutos. Sacar y ponerlos al desecador por 15 minutos.. 2.. Tarar los crisoles 44. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(51) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. W1 = 34.255. b). W2 = 34.254. 3.. Poner en cada crisol 5 gr aproximadamente de muestra y volver. UN T. a). a pesar: Wi - 39.255. b). W2 - 39.254. 4.. Poner los crisoles al desecador y llevarlos a una cocina eléctrica. ím. ica. a). Qu. en una malla de asbesto, hasta carbonizar las muestras. Luego llevarlas a calcinar a la mufla a una temperatura de 500°o por un. en ier ía. tiempo aproximado de 3 a 4 horas (la ceniza debe ser blanca). 5.. Apagar la mufla u horno y dejar que baje la temperatura a 3 00 °C junto con los crisoles.. 6.. Sacarlas a un desecador hasta que enfríe totalmente, luego. In g. pesar los crisoles con las cenizas para determinar el peso de la ceniza calcinada.. de. W1 = 38.950 W2 = 38.949. ot. ec. a. peso ceniza % CENIZA = ------------------------------------ * 100 peso muestra. Bi. bli. 0.305 gr % CENIZA =-------------------- * 100 = 6.1% 5.0 gr. C.. ANÁLISIS DE HUMEDAD. 1.. Preparar 2 cápsulas petri 45. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(52) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.. Llevarlas a pre-inflamar a la estufa a una temperatura de 105°c. desecador para que enfríe por un tiempo de 15 min. Tarar las cápsulas W1 = 79.704. b). W2 - 79.702. Pesar en cada cápsula una muestra de afrecho de trigo de tal. ím. 4.. a). ica. 3.. UN T. por un tiempo de 20 min, luego sacarlos y colocarlos en un. a) W 1 = 80.558. Qu. manera que cubra la cápsula.. en ier ía. b) W 2 = 80.552 5.. Colocarlos en el desecador y llevarlos a la estufa a una temperatura de 90 - 95°c por un tiempo de 3 a 4 horas para. In g. secar la muestra (Muestra seca más no carbonizada) 6.. Sacar y poner en desecador la muestra y dejar enfriar por 75. de. min, este tiempo tiene que ser el mismo que se tomó para llevarlos al desecador al comienzo, porque si no se corre el. Pesar y anotar. Bi. bli. ot. ec. 7.. a. riesgo de que varíe su peso.. a). W1 = 80.123. b). W2 = 80.107. peso agua evaporada % HUMEDAD =----------------------------------* 100 peso muestra. 46 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(53) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 0.435 gr. UN T. % HUMEDAD =----------------------- * 100 = 50.93% 0.854 gr. DENSIDAD. 1.. Se tara la probeta vacía en la balanza (Pu) y se anota su. ica. D.. ím. resultado.. Se llena la probeta de 100 ml y se pesa en la balanza.. 3.. Se calcula la densidad empleando la fórmula :. en ier ía. D = Peso/Volumen.. Qu. 2.. 2.2.11. ANÁLISIS DESPUES DE FERMENTAR Tabla N° 25,26. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS TOTALES. In g. A.. Se sigue el mismo método descrito para determinar las proteínas totales. ec. a. de. antes de fermentar.. ACCIÓN HIDROLITICA DE LA ENZIMA PROTEOLITICA –. PROCEDIMIENTO. a). Se arma el sgte sistema (26). Bi. bli. ot. 2.2.12. 47 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.